Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Patrícia Soares Santiago / Banca: Ederlan de Souza Ferreira / Resumo: Devido ao avanço científico e tecnológico, notável sucesso tem sido alcançado na identificação de novos compostos antitumorais. Entretanto, problemas associados à baixa estabilidade e seletividade tem limitado o sucesso da grande maioria destes compostos. Dentre as estratégias para aumentar a estabilidade de moléculas bioativas, a bioconjugação em domínios de ligação a albumina (DLA) tem se mostrado promissor para ampliar o tempo de vida médio de moléculas susceptíveis à degradação proteolítica. Neste trabalho, a estrutura e a atividade de um composto contendo um peptídeo citotóxico, um DLA e um sítio de clivagem específico foram avaliadas. Motivado pela perspectiva do peptídeo melitina apresentar atividade antitumoral, o nosso grupo de pesquisa avaliou a síntese e atividade biológica deste composto com o peptídeo RQKRSLGG-WQRPSSW. O peptídeo obtido foi testado contra tipos de celulas tumorais e não tumorais (linhagem MCF-7 e HaCaT, respectivamente), mostrando-se potente, porém tóxico. Nos estudos de dicroísmo circular, os peptídeos não apresentaram estrutura secundária em solução aquosa. Em presença de miméticos de membrana, os peptídeos adquiriram uma estrutura em α-hélice exceto o peptídeo sítio de clivagem-DLA. Estudos de vazamento de carboxifluoresceína em LUVs (POPC:POPS), através da técnica de espectroscopia de fluorescência, mostraram que o peptídeo completo tem capacidade de permeabilização similar ao da melitina e que é dependente da concentração. Os resultados de f... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Due to the scientific and technological advanced permitted remarkable successful in the field of identification of new antitumour compounds. However, problems associated with low stability and selectivity have been a restriction in the successf ul of majority of this compounds. Inside the strategic for increase the stability of bioactive molecules, bioconjugation with albumin - binding domain (ABD) have been promising for increasing t he lifetime of molecules susceptible for the proteolytic degradat ion. Herein, structure and activity of a compound containing a cytotoxic peptide, ABD, and cleavage site were evaluated. The ABD (WQRPSSW) can give more stability for molecules, while the cle avage site RQKRSLGG can give more selectivity to the peptide. Thi s sequence is degraded for the protease Kallikrein 4 (KLK4), which occurs in elevated quantity in the tumours cells, releasing the cytotoxic compound, especially in the microenvironments of t hese cells, promoting the higher selectivity. Inspired for the pe rspective of Melittin peptide holds a promising antitumour activity, our research group evaluated the synthesis and biological activity with this peptide containing the sequence RQKRSLGG - WQRP SSW. The peptide was evaluated against diversity of tumours and n o tumours cells (MCF - 7 and HaCaT respectively), presenting effective activity but toxic. In circular dichroism studies the peptides did not show second structure in aqueous solution. In the p resence of membrane mimet... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Ana Paula Ulian de Araujo / Banca: Julio Cesar Borges / Resumo: Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo levaram à identificação da proteína RVB-1 de Neurospora crassa como capaz de se ligar a um fragmento de DNA contendo o motif STRE (Stress Responsive Element). Este elemento de DNA, em Saccharomyces cerevisiae, é descrito estar presente na região promotora de genes responsivos a estresse, incluindo o estresse térmico. Uma busca nos bancos de dados de proteínas mostrou que a RVB-1 apresenta homologia estrutural à proteína RuvBL1 de humanos. Além disso, esta proteína é descrita possuir uma proteína paráloga, RuvBL2 ou Rvb2 de humano e S. cerevisiae, respectivamente, cuja proteína ortóloga em N. crassa foi denominada RVB-2. As proteínas RuvBLs foram encontradas estarem associadas a vários processos celulares, muito provavelmente devido as suas capacidades de formar grandes complexos proteicos e possuírem atividade ATPásica. Neste trabalho, estas proteínas foram parcialmente caracterizadas do ponto de vista funcional, bioquímico e biofísico. Os resultados obtidos por microscopia de fluorescência mostraram que ambas apresentam localização nuclear quando o fungo foi exposto a estresse térmico. A análise da expressão da proteína RVB-V5 mostrou estar aumentada, nessa mesma condição ambiental, quando analisada por Western blot. As duas proteínas foram produzidas na forma recombinante em Escherichia coli, tanto isoladamente quanto juntas, e a análise da expressão mostrou alta estabilidade em solução quando ambas foram produzidas em uma me... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Previous work by our group identified the Neurospora crassa RVB - 1 protein as able of binding to a DNA fragment containing the Stress Responsive Element (STRE). In Saccharomyces cerevisiae, this element is present in the promoter region of genes responsive to stress, including heat stress. RVB - 1 shows structural homology to human RuvBL1 protein, and is described to have a paralog, the RuvBL2 or Rvb2 protein in human and S. cerevisiae, respect ively. The N. crassa orthologous protein was identified and named RVB - 2. The RuvBLs proteins have been found to be associated with diverse cellular processes, most likely due to their ability to form large protein complexes and to have ATPase activity. In this work, these proteins were functional, biochemical and biophysically characterized. The fluorescence microscopy results showed that both proteins present nuclear localization in the fungus exposed to heat stress. Analyses of protein expression by Weste rn blot showed an increased expression of the RVB - 1 - v5 protei n in this same condition . The two proteins were produced in Escherichia coli, and expression analyses showed higher stability in solution when both were produced together. Both proteins showed in vitro interaction by pulldown analysis. The RVB - 1/2 complex has the secondary structure mostly formed by α - helices as analysis by CD. The size - exclusion chromatography suggested that the complex present different oligomeric structures when analyzed in the absence a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Estudos anteriores mostram que o polímero Nafion® pode causar deslocamento do equilíbrio conformacional de proteínas em valores de pH que não o fisiológico. Nesse sentido, o Nafion® não só pode ser utilizado como uma sonda interessante para estudos estruturais de proteínas, mas, também, é importante entender seu papel na conformação da proteína. Portanto, a Albunina do Soro Bovino (BSA) foi escolhida como modelo para o estudo dos efeitos do Nafion® na conformação helicoidal de proteínas. A finalidade deste trabalho é entender as alterações na conformação e vizinhanças aromáticas da BSA, na faixa de pH de 2 a 12, na presença e ausência de Nafion®, que pode também revelar o papel do polímero na exposição dos aromáticos e nos processos de transferência de energia. As alterações da estrutura secundária foram medidas por Dicroísmo Circular e os espectros de fluorescência no estado estacionário foram usados para analisar as mudanças nas vizinhanças dos aromáticos. Os resultados mostraram a diminuição discreta do conteúdo helicoidal da conformação da BSA na região extremamente básica, pH 11 em relação à conformação em pH 7. Já na região ácida, pH 2, embora haja considerável diminuição do conteúdo helicoidal, a BSA ainda mantém quase 50% de sua conformação secundária regular. Em relação aos ambientes dos aromáticos triptofano e tirosina, a eficiência quântica da emissão de fluorescência diminui em regiões ácidas e básicas, indicando que, nessas estruturas, os aromáticos encontram-se em restrição conformacional em relação ao observado na proteína nativa. Estes resultados apontam para a mudanças na conformação da BSA em ambas as regiões: ácidas e básicas, incluindo mudanças das estruturas secundárias e nas vizinhanças dos aromáticos. A adição do Nafion®, por outro lado, acentua o deslocamento para o azul e diminuição da exposição dos aminoácidos, tanto em solução quanto em estado sólido. A estrutura secundária da proteína é completamente modificada pelo polímero na região ácida, e esta conformação é mantida nas regiões neutra e básica, sugerindo que o Nafion® não estabiliza estruturas helicoidais / Previous studies have shown that Nafion® can disturb the conformational equilibrium of some proteins when at pH other than physiological ones. In this sense, Nafion® can used to study protein conformation, but is also important to understand its interaction with the proteins. In this work, Bovine Serum Albimun (BSA) was chosen as a model to understand the modifications caused by Nafion® at helicoidal proteins conformation. More specifically, the aim encloses the understanding of changes in BSA secondary conformation and aromatic vicinities, at pH range from 2 to 12, in the Nafion®s presence and absence. Secondary changes were measured by Circular Dichroism and steady-state fluorescence was used to study the aromatic vicinities. Results have shown small differences at helix content in the extremely basic pH (pH 11) when compared to BSA conformation at pH 7 (native one). At pH 2, on the other hand, although a decreasing in helical content was observed, BSA was able to keep almost 50% of secondary regular conformation. Regarding the aromatic vicinities (tryptophans and tyrosines) the fluorescence emission quantum eficience decreased in both regions (acid and basic), suggesting that the aromatics in these conformations are found in a more restrict environment. Nafion®, when added, promoted a decreasing in aromatic exposition, both in solution and solid state, while the secondary structure is completelu modified by its presence in all pH range, suggesting that helical conformations are not stabilized by Nafion®

O produto de redução da nicotinamida adenina dinucleotídio (NADH) foi convertido no seu derivado hidratado NADH-X (6-hidroxi-l,4,5,6-tetraidronicotinamida adenina dinucleotídio) por ação de íons polibásicos tais como: fosfato, arsenato etc, ou por ação enzimática da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD). A cinética da hidratação foi acompanhada pelo aumento de absorbância (ΔA285 nm) e o aparecimento de um efeito Cotton a 285 nm , notando-se que quando se parte do anômero β da coenzima, o efeito Cotton positivo só se desenvolve nos estágios finais da reação na presença de enzima. Com base nesses resultados postulou-se a formação de um intermediário que se transforma num produto final, o qual mostra um efeito Cotton positivo a 285 nm. Supõe-se que essa última transformação seja uma epimerização β→α, de maneira que a adição de água não afeta inicialmente a configuração do átomo C1, da ribose. Contudo, após a hidratação, o produto se transforma no epímero α, que é termodinamicamente mais estável. Na ausência da enzima, o efeito Cotton aparece em estágios anteriores, sugerindo que a hidratação, sendo lenta, dá oportunidade à epimerização. Consequentemente não há tanto acúmulo deste intermediário, que apresenta efeito Cotton praticamente nulo. A hidratação do anômero α-NADH, na presença de GDP, mostrou um aumento de absorbância a 285 nm mais rápido do que para a forma β. Por outro lado, o efeito Cotton positivo só começou a aparecer após desenvolvimento de 60% do ΔA285 nm. Isto indicou que também para α-NADH há formação de um intermediário, o qual apresenta um efeito Cotton nulo. Quando β-NADH foi hidratado na ausência da enzima, observou-se um comportamento semelhante, porém, menos marcante com relação ao aparecimento do efeito Cotton. O fato de GPD e íons polibásicos produzirem efeitos semelhantes sobre os anômeros α e β, sugere que a ação enzimática da GPD não é estereoespecífica, produzindo uma mistura de epímeros em C6. Explica, também, o efeito Cotton nulo quando já se tem grande parte da hidratação efetuada. Desta maneira pôde-se afirmar (i) que o intermediário é uma mistura de epímeros em C6; (ii) que com o tempo predomina o epímero termodinamicamente mais estável. Os mesmos estudos foram desenvolvidos com NADPH, desamino-NADH e NMNH, para esclarecimentos a respeito da influência de grupos fosfato, amino e açúcar na catálise da hidratação e dos centros responsáveis pelo efeito Cotton positivo a 285 nm, nos piridinos nucleotídios. Observou-se que NADPH tem comportamento semelhante ao β-NADH, indicando que o grupo fosfato não tem papel importante nas catálises química e enzimática. No caso do mononucleotídio e desamino-dinucleotídio não houve diferença significativa entre as velocidades de hidratação química e enzimática, o que siginifica ser importante a presença do amino grupo da adenina para catálise enzimática no caso de NADH. Os derivados acima, também, apresentaram efeito Cotton positivo nos estágios finais da reação. Com base no fato, que o mononucleotídio também apresentou efeito Cotton positivo, de mesma intensidade dos dinucleotídios, pôde-se afirmar que o açúcar ligado ao anel da nicotinamida é o responsável pela dissimetria do produto formado. Traçou-se o espectro de absorção circular dicróica do isômero 1,6-NADH, ainda desconhecido, para obter-se informações a respeito da sua estrutura. Através dos valores de elipticidades molares, concluiu-se que é mais rígida do que a do 1,4-NADH, presumivelmente, devido a ligação simples, que une os anéis piridínico e ribosídico, ter rotação mais impedida, como consequência da maior proximidade do par de hidrogênios da piridina, com a ribose. O estudo da adição de CN- aos piridinos nucleotídios e compostos relacionados, usando técnica de dicroismo circular, mostrou haver estereosseletividade na adição. O espectro de absorção circular dicróica do aduto β-NAD+/CN- mostrou uma banda negativa larga com máximo em torno de 330 nm. Esta banda é assimétrica, o que permite um desdobramento em outras duas, com máximos a 325 e a 345 nm, de intensidade semelhantes. Em analogia com a redução dos piridinos nucleotídios, que ocorre nas posições 2, 4 e 6, pôde-se afirmar que a adição de CN-, também, ocorre em outras posições e não exclusivamente em 4. A banda de dicroismo circular na região de 345 nm, pareceu indicar a presença do isômero 1,6. O fato deste estar em concentração baixa a ponto de não ser detectável espectrofotometricamente, indicou que a força rotacional é bem maior do que para o isômero 1,4. Tal fato deve estar relacionado com a maior proximidade do CN- ao anel carboidrático. No aduto da forma α do piridino nucleotídio, o espectro de dicroismo circular apresentou uma banda negativa, com máximo de 342 nm e uma inflexão a 325 nm. Essa assimetria mostrou, claramente, a existência dos dois isômeros e, que a adição de CN- em C6 é bastante estereosseletiva. Além da estereosseletividade, pode estar contribuindo, também a menor mobilidade rotacional do anel diidronicotinamídico, quando se tem aduto em C6. A estereosseletividade da adição de cianeto veio corroborar com a proposição de um equilíbrio rápido entre as conformações aberta e fechada para os piridino nucleotídios. A possível existência de uma transição fraca, associada ao núcleo diidronicotinamídico, foi confirmada detectando-se um efeito Cotton associado a ela. Esse efeito foi observado para α-NADH, β-NADH e seus correspondentes adutos de CN-. Realizando-se o mesmo estudo para o complexo de β-NADH.Cu++, verificou-se que o efeito Cotton é 15 vezes mais intenso, confirmando assim, a detecção pioneira dessa transição fraca, presumivelmente de natureza singlete-triplete. / The reduction product of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is converted into the hydration product NADH-X (6-hydroxy-1,4,5,6-tetrahydronicotinamide adenine dinucleotide) by the action of polybasic ions such as phosphate, arsenate etc., or by enzymatic catalysis with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD). The hydration kinetics were followed by the increase in absorbance at 285 nm. Starting with the β-anomer of the coenzyme, the transition at 285 nm begins to exhibit a positive Cotton effect only in the later stages of the reaction. On the basis of the results, the formation of an interrnediate not exhibiting a Cotton effect at 285 nm is postulated. Since the hydration would not be expected to change the configuration at C1, of the ribose, the appearance of the Cotton effect is presumably due to an epimerization from the β-epimer to the thermodynamically more stabe α-epimer. In the absence of enzyme, the Cotton effect appears at somewhat lower conversions, suggesting that the slower hydration reaction provides greater opportunity for the occurrence of the epimerization. The increase in absorbance at 285 nm is more rapid for the hydration of the α-anomer of NADH than for the β-form in the presence of GPD. A positive Cotton effect is only observed for the forrner after the reaction has gone to about 60% completion. This indicates that an intermediate not exhibiting a Cotton effect is also formed in the case of α-NADH. Similar behavior was observed in the non-enzymatic hydration, however, as in the case of β-NADH, the onset of the Cotton effect occurred at lower conversions. The fact that GPD and polybasic ions produce similar effects on both the α and β anomers suggests that the enzymatic action of GPD is non-stereospecific, producing a mixture of epimers at C6. This also explain the absence of a Cotton effect even though significant hydrations has occurred. Thus we conclude (i) that the intermediate is a mixture of C6 epimers and (ii) that the more thermodynamically stable epimer predominates at long reaction times. The same studies were carried out with NADPH, deamino-NADH and NMNH to clarify the catalytic influence of the phosphate, amino, and sugar groups on the hydration and to identify the centers responsible for the positive Cotton effect at 285 nm in pyridine nucleotides. The observation that the behavior of NADPH is similar to that of β-NADH indicates that the phosphate group does not play an important role in the chemical and enzymatic catalysis. In the case of NMNH and deamino-NADH there is no significant difference between the rates of the chemical and enzymatic hydration, which implies that the presence of the amino group of adenine is important in the enzymatic catalysis of the hydration of NADH. The above derivatives also present positive Cotton effects in the later stages of the reaction. Since that mononucleotide exhibits a positive Cotton effect of intensity equal to that of the dinucleotides, it can be concluded that the sugar attached to the nicotinamide ring is responsible for the assymetry of the product. The previously unknown circular dichroic absorption spectrum of 1,6-NADH was determined in order to gain insight into its structure. From the values of the molar ellipticity it is concluded that the assymetric center of 1,6-NADH is more rigid than that of. 1,4-NADH. This is presumably due to a greater hindrance to rotation about the single bond between the pyridine and ribose rings in 1,6-NADH. A circular dichroic study of the addition of CN- to pyridine nucleotides and related compounds demonstrated the stereoselectivity of the addition. The circular dichroic absorption spectrum of the B-NAD+/CN- adduct exhibits a broad assymetric negative band with a maximum at about 330 nm. This band was interpreted in terms of two bands of similar intensity with maxima at 325 and 345 nm. By analogy with the reduction of pyridine nucleotides,which occurs at position 2,4 and 6, it is concluded that CN- addition also occurs at positions other than C4. The band at 345 nm was attributed to the 1,6-isomer. The fact that this isomer could not be detected by conventional absorption techniques indicates that it is present in low concentrations relative to the 1,4-isomer. It must have therefore has a much greater rotational strength, which is reasonable in view of the proximity of the CN- to the carbohydrate ring. The circular dichroic absorption spectrum of the α-NAD+/CN- adduct exhibited a negative band with a maximum at 342 nm and an inflection at 325 nm. This assymetry clearly demonstrated the presence of two isomers and the stereoselectivity of CN- addition at C6. Although the l,6-adduct could not be detected by conventional absorption techniques, the stereoselectivity of the addition and a large rotational strength contribute to its circular dichroic intensity. The stereoselectivity of the CN- addition corroborates the existence of a rapid conformational equilibrium between the folded and unfolded forms of pyridine nucleotides. A Cotton effect associated with the weak electronic transition attributed to the dihydronicotinamide nucleus was observed for α-NADH, β-NADH, and the corresponding CN- adducts, confirming the existence of the transition. For the β-NADH.CU++ complex, the Cotton effect was found to be 15 times more intense, thus confirming the original detection of this weak transition, which presumably has singlet-triplet character.

Este trabalho trata do estudo de complexos de rutênio contendo antiinflamatórios não-esteróides, com o objetivo de contribuir para ampliar as pesquisas na área de potenciais metalofármacos antitumorais. A partir de reações do precursor dimetálico [Ru2(O2CCH3)4Cl] com os fármacos carboxílicos sulindaco (HSulin) e diclofenaco de sódio (NaDiclofen) foram isolados, respectivamente, os correspondentes complexos [Ru2(Sulin)4Cl] e [Ru2(Diclofen)4Cl]. A reação entre o monômero [RuCl2(dmso)4] e o meloxicam (H2Melox) deu origem ao derivado misto [Ru(dmso)2(HMelox)2]. Os compostos foram caracterizados por meio de análise elementar, medidas de condutância molar, medidas de susceptibilidade magnética, espectroscopia de absorção eletrônica UV-VIS-IR, espectroscopia vibracional FTIR e Raman, e estudos de análise térmica (TG/DSC/MS). As interações da albumina de soro humana HSA, importante proteína do plasma, com os complexos obtidos, com o análogo [Ru2(IBP)4Cl] (HIBP = ibuprofeno) e também com os fármacos orgânicos não-complexados foram investigadas empregando-se dicroísmo circular, SDS-Page e fluorescência. A atividade antitumoral dos metalofármacos foi avaliada, através de ensaios com MTT, com base nos seus efeitos citotóxicos para a linhagem celular de leucemia humana K562. / This work describes the study of ruthenium complexes containing non-steroidal antiinflammatory drugs with the aim of helping to expand the research in the field of potential anticancer metallodrugs. Reactions of the [Ru2(O2CCH3)4Cl] dimetal complex with sulindac (HSulin) and sodium diclofenac (NaDiclofen) carboxylic drugs gave the correspondent complexes [Ru2(Sulin)4Cl] and [Ru2(Diclofen)4Cl], respectively. The reaction between the [RuCl2(dmso)4] monomer and the meloxicam drug (H2Melox) led to the mixed derivative [Ru(dmso)2(HMelox)2]. The compounds were characterized by elemental analysis, molar conductance measurements, magnetic susceptibility, UV-VIS-IR electronic absorption spectroscopy, Raman and FTIR vibrational spectroscopies and by studies of thermal analysis (TG / DSC / MS). The interactions of human serum albumin (HSA), the major plasma protein, with the obtained complexes, the analogous [Ru2(IBP)4Cl] (= HIBP ibuprofen) and also with the noncoordinated organic drugs have been investigated by circular dichroism, SDS-Page and fluorescence. The antitumor activity of the metallodrugs has been evaluated by MTT assays, on the basis of their cytotoxic effects on K562 human leukemia cell line.

O genoma de Xanthomonas citri (Xac) possui mais de 20 tipos de transportadores do tipo ABC incluindo o operon ssuABC associado ao transporte de alcano sulfonatos. Deste operon, escolhemos a proteína periplasmática ligadora de alcano sulfonatos SsuA2, para caracterização e análises espectroscópicas e estruturais. A rSsuA2 foi expressa no citoplasma de células de Escherichia coli e utilizada para a preparação de anticorpos em camundongos, que foram capazes de reconhecer a proteína recombinante, mas não a nativa no extrato de células de Xac. A rSssuA2 apresenta estrutura característica de proteínas alfa-beta, maior estabilidade em pH neutro (7.0), como também foi evidenciado pela obtenção de cristais somente nesta faixa, e pouca flexibilidade ao desenovelamento térmico. Os cristais difratam com resolução de 1.8 Å e pertencem ao grupo espacial de simetria P21. Além do o operon ssu (ssu2) altamente conservado, Xac apresenta o operon tau (ssu1) para captação de taurina. O papel do operon para Xac é discutido. / Xanthomonas citri (Xac) genome has more than 20 different ABC transporters, including the ssuABC operon. In this work, the alkanosulphonate-periplasmic binding protein SsuA2 was chosen for spectroscopic and structural analysis. The rSsuA2 protein was expressed as a soluble form and purified by immobilized metal affinity chromatography. Antibodies produced from the recombinant protein were able to recognize the rSsuA2, but not the native protein in the Xac extract samples. The protein presents secondary structure defined by alfa helices and beta-sheets, high stability in neutral pH and low flexibility to the thermal denaturation. The determination of the optimal pH range was important to produce crystals of high quality diffracting at 1.8 Å with symmetry of the P21 spatial group. Besides the highly conserved operon ssu (ssu2), Xac has the tau operon (ssu1) for taurine uptake.

A estabilidade térmica em função do pH para três formas da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp), monitorada atraves de DSC, CD e absorção óptica, e estudada no presente trabalho. Estes estudos possibilitaram a determinação de parâmetros importantes do processo de desnaturação e dissociação da proteína oligomerica em pH ácido, neutro e alcalino. A HbGp se mostrou mais estável no pH ácido do que em pH neutro e alcalino. No meio alcalino a HbGp sofre dissociação oligomérica gerando subunidades tais como o dodecâmero, o trímero e o monômero. Além disso, as técnicas de DSC, dicroísmo circular (CD) e absorção óptica permitiram o monitoramento da desnaturação da estrutura protéica global, da estrutura secundária e do centro ativo da HbGp, em função da temperatura. Por DSC foi determinado que o mecanismo do processo de desnaturação térmica da HbGp é irreversível. As variações de entalpia calorimétrica, ΔHcal, e de van Hoff, ΔHvH, nas formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp são bem distintas, em todos os pHs estudados, indicando que o processo de desnaturação é bastante complexo, sugerindo que o pico de transição deve ser composto por varias transições. A ordem de estabilidade apresentada pela HbGp em termos dos valores de temperatura de transição (Tm) foi a seguinte: cianometa- > oxi- > meta- no intervalo de pH 5,0 a 8,0. Os valores de ΔHcal no pH 7,0 para a oxi-HbGp, meta-HbGp e cianometa-HbGp foram de 25 ± 4, 20 ± 2 e 56 ± 4 MJ/mol, respectivamente. Os valores de energia de ativação (Ea) obtidos no pH 7,0 para a oxi- e cianometa-HbGp foram de 673 ± 99 e 780 ± 105 KJ/mol, e no pH 8,0 de 897 ± 106 e 850 ± 201 KJ/mol, respectivamente. Esses valores de energia de ativação são condizentes com os reportados na literatura para outras hemoglobinas. Nos estudos realizados por CD a oxi-HbGp forma hemicromo no pH 6,0 e 7,0, em temperaturas superiores a 40 °C, e se dissocia em meio alcalino. A oxi-HbGp apresenta temperatura crítica (Tc) nas regiões das hélices-α e do grupo heme praticamente idêntica nos vários pHs estudados. A cianometa-HbGp possui maior quantidade de estrutura secundária do que a oxi-HbGp, e maiores valores de temperatura crítica (Tc), sendo bem mais estável que a oxi-HbGp, assim como o observado por DSC. Por absorção óptica o comportamento térmico da HbGp é similar ao do CD, sendo observado ainda, além da formação de hemicromo, a presença de espécies pentacoordenadas no pH neutro e alcalino. / The thermal stability as a function of the pH, for three forms of the extracellular giant hemoglobin of the annelid Glossoscolex paulistus (HbGp) was monitored by DSC, CD and optical absorption in the present work. These studies allowed the determination of important parameters characterizing the denaturation and dissociation at acid, neutral and alkaline pH values. HbGp was shown to be more stable in acid pH as compared to neutral and alkaline pH values. In alkaline medium, HbGp presents oligomeric dissociation generating smaller subunits such as the dodecamer, the trimer and the monomer. Besides that, the techniques of the DSC, circular dichroism (CD) and optical absorption spectroscopy allowed to monitor, respectively, the denaturation of the global protein structure, of the secondary structure and of the active center of the hemoglobin, as a function of the temperature. By DSC it was determined that the mechanism of the thermal denaturation of the HbGp is irreversible. The variations of calorimetric and van Hoff enthalpies, in the oxy- and cyanomet-HbGp forms, are quite different, for all studied pH values, indicating that the process of denaturation is complex, characterized by a transition peak composed by several contributions. The order of stability presented by the HbGp in terms of the transition temperature values (Tm) was the following: cyanomet-> oxy- for pH from 5.0 to 8.0. The values of ΔHcal at pH 7.0 for the oxy-HbGp, met-HbGp and cianomet-HbGp were 25 ± 4, 20 ± 2 and 56 ± 4 MJ/mol, respectively. The activation energy values (Ea) obtained at pH 7.0 for the oxy- and cyanomet-HbGp were 673 ± 99 and 780 ± 105 KJ/mol, and at pH 8.0 they were 897 ± 106 and 850 ± 201 KJ/mol, respectively. Those energy values are consistent with data reported in the literature for other hemoglobins. In the studies carried out by CD for oxy-HbGp formation of hemichrome was observed at pH 6.0 and 7.0, at temperatures above 40 °C. In alkaline medium the oligomeric dissociation is observed. Oxy-HbGp presents critical temperatures (Tc), which are practically identical in the spectral regions of the polypeptide and of the heme groups for all studied pH values. The cyanomet-HbGp own larger quantity of secondary structure than oxy-HbGp, and higher values of critical temperatures (Tc), being more stable than oxy-HbGp, in agreemente with DSC data. Optical absorption spectroscopy shows thermal behavior of HbGp similar to that observed by CD. Besides the formation of the hemichrome species upon heating, the presence of penta-coordinate species at neutral and alkaline pH values was observed.

A forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade. / The active form of vitamin B1, Thiamine pyrophosphate (TPP), is an indispensable cofactor for some enzymes that act on carbohydrates and amino acids metabolism. Its biosynthesis requires the independent formation of its compounds, pyrimidine and thiazole. In prokaryotes, the vitamin B1 biosynthetic way has already been elucidated, but in eukaryotes there are some gaps to be filled. In Arabidopsis thaliana, the Thi1 protein is possibly responsible for the synthesis of the thiazole moiety, since a related compound to TPP was found in its structure. In this work, we have investigated Thi1 and its natural mutant Thi1(A140V), which is responsible for the thiamin auxotrophy in A. thaliana mutant line, to identify the role this mutation plays in the structure and activity of Thi1. The proteins were produced in E. coli and the results of biophysical analysis using fluorescence and Circular Dichroism (CD) showed considerable differences in the protein stability. Thermal and chemical unfolding studies have shown a difference in the melting temperature (around 4 ºC higher for Thi1) and concentration of guanidine at which half of the protein had unfolded (0,42 M for Thi1 and 0,24 M for Thi1(A140V)). The fluorescence anisotropy data obtained from thermal unfolding showed Thi1(A140V) is more unstable compared to Thi1. We have also carried out tests of absorption, CD and infra-red to assess the presence and to characterize the possible precursor of TPP in Thi1 (A140V). The results showed that the ligants could have different compositions. However, complementary results from NMR (1D 1H e 2D TOCSY) revealed that the difference observed in the ligant samples from both proteins were actually related to the proportion of four distinct compound population, representing a ligant pool. In the sample from Thi1(A140V), the dominant population corresponded to ADP. Besides, although both samples contained ADT, it was significantly less abundant in that one derived from Thi1(A140V). Concluding, the results demonstrated that the A140V mutation leaded to a more unstable conformation of Thi1 and, additionally, the presence of smaller amounts of ADT in Thi1(A140V) suggests this change might have contributed to reducing its activity.

Este trabalho trata do estudo de complexos de rutênio contendo antiinflamatórios não-esteróides, com o objetivo de contribuir para ampliar as pesquisas na área de potenciais metalofármacos antitumorais. A partir de reações do precursor dimetálico [Ru2(O2CCH3)4Cl] com os fármacos carboxílicos sulindaco (HSulin) e diclofenaco de sódio (NaDiclofen) foram isolados, respectivamente, os correspondentes complexos [Ru2(Sulin)4Cl] e [Ru2(Diclofen)4Cl]. A reação entre o monômero [RuCl2(dmso)4] e o meloxicam (H2Melox) deu origem ao derivado misto [Ru(dmso)2(HMelox)2]. Os compostos foram caracterizados por meio de análise elementar, medidas de condutância molar, medidas de susceptibilidade magnética, espectroscopia de absorção eletrônica UV-VIS-IR, espectroscopia vibracional FTIR e Raman, e estudos de análise térmica (TG/DSC/MS). As interações da albumina de soro humana HSA, importante proteína do plasma, com os complexos obtidos, com o análogo [Ru2(IBP)4Cl] (HIBP = ibuprofeno) e também com os fármacos orgânicos não-complexados foram investigadas empregando-se dicroísmo circular, SDS-Page e fluorescência. A atividade antitumoral dos metalofármacos foi avaliada, através de ensaios com MTT, com base nos seus efeitos citotóxicos para a linhagem celular de leucemia humana K562. / This work describes the study of ruthenium complexes containing non-steroidal antiinflammatory drugs with the aim of helping to expand the research in the field of potential anticancer metallodrugs. Reactions of the [Ru2(O2CCH3)4Cl] dimetal complex with sulindac (HSulin) and sodium diclofenac (NaDiclofen) carboxylic drugs gave the correspondent complexes [Ru2(Sulin)4Cl] and [Ru2(Diclofen)4Cl], respectively. The reaction between the [RuCl2(dmso)4] monomer and the meloxicam drug (H2Melox) led to the mixed derivative [Ru(dmso)2(HMelox)2]. The compounds were characterized by elemental analysis, molar conductance measurements, magnetic susceptibility, UV-VIS-IR electronic absorption spectroscopy, Raman and FTIR vibrational spectroscopies and by studies of thermal analysis (TG / DSC / MS). The interactions of human serum albumin (HSA), the major plasma protein, with the obtained complexes, the analogous [Ru2(IBP)4Cl] (= HIBP ibuprofen) and also with the noncoordinated organic drugs have been investigated by circular dichroism, SDS-Page and fluorescence. The antitumor activity of the metallodrugs has been evaluated by MTT assays, on the basis of their cytotoxic effects on K562 human leukemia cell line.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2017-08-30T18:51:47Z No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T18:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Enzymes of the xylanolytic complex, from microorganisms, have been an increasingly important biotechnological tool mainly in industrial processes that require high temperatures, such as in the baking industry, animal feed, textile, pulp and cellulose. Among the fungi producing thermostable enzymes, Thermomyces lanuginosus has been evidenced as a good producer of xylanases. In this context, xylanase from the recently isolated thermophilic fungus of the Paraná Atlantic Forest, T. lanuginosus, was purified, biochemically characterized, as well as a structureactivity correlation study of the enzyme was investigated through circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Extracellular xylanase was purified after four steps of ion exchange chromatographic columns and molecular filtration. The purity and molecular mass (21.3 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE and MALDI-TOF/MS. The xylanase is highly specific to the beechwood xylan substrate and generated mainly xylobiose (X2) and xylotriose (X3), products characteristic of the action of endoxylanase. The enzyme was able to cleave the xylooligosaccharides xylotetraose and xylopentaose, except xylobiose and xylotriose. It exhibit higher activity at pH 6.5 and temperature of 75°C, with stability between pH 5.0-8.0 for 100 hours and thermostability between 40 and 75°C for 5 hours. The deconvolution of the circular dichroism spectrum (CD) enzyme revealed a secondary conformation rich in β-structures with transition midpoint temperature (Tm) of 73.0  0.2°C. In this structural study, xylanase reveals that to perform high enzymatic activity, it was necessary a conformational change. Its secondary structure is conserved even at pH extremes at temperatures up to 70°C and in the presence of MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) and high concentration of guanidine (6 M). Intrinsic fluorescence reveals that the tertiary structure is influenced by pH, guanidine (1 M) associated with temperature and in the presence of MnCl2 and DTT, whereas extrinsic fluorescence, using the ANS probe, shows changes in pH extremes and in the presence of MnCl2 and DTT. Fluorescence results suggest that both the increased enzymatic activity in the presence of cofactors and the loss of activity at extreme pH values are related to changes in the tertiary structure of the enzyme. Thus, T. lanuginosus xylanase has interesting biochemical characteristics for application in several industrial sectors that mainly use high temperature conditions. / As enzimas do complexo xilanolítico, provenientes de microrganismos, têm se tornado uma ferramenta biotecnológica cada vez mais importante, principalmente em processos industriais que requerem temperaturas elevadas, como na indústria de panificação, de rações animais, têxtil, polpa e celulose. Dentre os fungos produtores de enzimas termoestáveis, Thermomyces lanuginosus tem se destacado como bom produtor de xilanases. Nesse contexto, a xilanase do fungo termofílico recentemente isolado da Mata Atlântica do Paraná, T. lanuginosus, foi purificada, caracterizada bioquimicamente, bem como um estudo de correlação estruturaatividade da enzima foi investigado através das espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. A xilanase extracelular foi purificada após quatro etapas cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica e filtração molecular. A pureza e massa molecular (21,3 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE e MALDI-TOF/MS. A xilanase é altamente específica para o substrato xilano de beechwood e gerou principalmente xilobiose (X2) e xilotriose (X3), produtos característicos da ação de endoxilanase. A enzima foi capaz de clivar os xilooligossacarídeos xitotetraose e xilopentaose, exceto a xilobiose e xilotriose. Exibe maior atividade em pH 6,5 e temperatura de 75°C, com estabilidade entre os pH 5,0-8,0 durante 100 horas e termoestabilidade entre 40 e 75°C durante 5 horas. A deconvolução do espectro de dicroísmo circular (CD) da enzima revela uma conformação secundária rica em estruturas-β, com temperatura do ponto médio da transição (Tm) de 73,0  0,2°C. Neste estudo estrutural, a xilanase revelou que, para desempenhar elevada atividade enzimática, foi necessário ocorrer mudança conformacional. Sua estrutura secundária é conservada mesmo em extremos de pH, em temperaturas até 70°C e na presença de MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) e elevada concentração de guanidina (6 M). A fluorescência intrínseca revela que a estrutura terciária sofre influência do pH, guanidina (1 M) associado à temperatura e na presença de MnCl2 e DTT, enquanto a fluorescência extrínseca, utilizando a sonda ANS, revela mudanças em extremos de pH e na presença de MnCl2 e DTT. Os resultados da fluorescência sugerem que tanto o aumento da atividade enzimática na presença dos cofatores quanto a perda da atividade em valores extremos de pH relacionam-se às alterações da estrutura terciária da enzima. Dessa forma, a xilanase de T. lanuginosus possui características bioquímicas interessantes para aplicação em diversos setores industriais que utilizam principalmente condições de temperatura elevada.