O Diabetes Mellitus tipo I (DM1) é causado pela destruição auto-imune das células β pancreáticas, encontradas na porção endócrina do pâncreas, constituída pelas ilhotas pancreáticas. As células β são responsáveis pela produção e liberação de insulina, um hormônio que promove a internalização da glicose pelas células. Junto com outros hormônios, a insulina é um dos principais reguladores do nível de glicose sanguinea (glicemia). Uma das terapias utilizadas para o tratamento do DM1 é o transplante de ilhotas pancreáticas. Entretanto, um dos maiores problemas em relação a esta terapia é a falta de massa celular adequada para ser infundida no paciente. Uma tentativa para solucionar este problema, é o desenvolvimento de fontes alternativas de células produtoras de insulina, como as células-tronco, que possuem a capacidade de se diferenciarem em diversos tipos de células, inclusive nas produtoras de insulina. Pax4 é um dos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação de células β , sendo essencial para o apropriado desenvolvimento e maturação destas, constitui um bom candidato para induzir a diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina in vitro. Para introduzir o Pax4 nas células-tronco, sem provocar alterações no genoma das células diferenciadas, em virtude dos potenciais efeitos indesejáveis de vetores que se integram ao genoma celular, recorreu-se às proteínas contendo domínio de transdução (PTDs), que são capazes de carregar a proteína Pax4, através da membrana, diretamente para o interior das células. As PTDs são pequenas sequências peptídicas que permitem a translocação de proteínas através de membranas celulares e sua internalização em células-alvo. Uma das PTDs mais comumente estudadas é a VP22, produto do gene UL49 do Herpes Simplex vírus tipo I. Portanto, a proteína de fusão VP22.Pax4 permitiria que o Pax4 fosse inserido em células-tronco, possibilitando que este fator de transcrição ative a transcrição de certos genes que aumentariam a eficiência de diferenciação das células-tronco em células produtoras de insulina. Para tal, amplificamos e clonamos o cDNA do Pax4 a partir do RNA das células RINm5f de insulinoma murino, construímos o vetor pVP22.Pax4, o qual foi transfectado em células CHO, que passaram a produzir a proteína de fusão VP22.Pax4. Após o tratamento de células-tronco com a proteína de fusão VP22.eGFP e análise por microscopia confocal, comprovamos que a VP22 é capaz de tranduzir a proteína de fusão também neste tipo celular. Portanto, incorporamos a um dos passos do protocolo de diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina, utilizado em nosso laboratório, a co-cultura com células CHO produtoras de VP22.Pax4. Observamos que a introdução do Pax4 leva a formação de um número maior de agregados celulares (clusters) produtores de insulina. Concluímos, então, que a utilização da VP22 como ferramenta para internalização de proteínas em células-tronco é viável e que a adição do Pax4 pode trazer melhorias para protocolos que busquem a produção de células produtoras de insulina. / Diabetes Mellitus type 1 (DM1) is caused by an auto-imunne destruction of the pancreatic β cells, found in the endocrine portion of the pancreas, known as pancreatic islets. These β cells are responsible production and release of insulin, a hormone which promotes glucose internalization by cells. Along with other hormones, insulin is a major regulator of blood glucose levels (glycemia). One of the therapeutical strategies used to treat DM1 is pancreatic islet transplantation. One of the major problem related to this therapy is the lack of adequate cell mass to be infused into the pacients. An attempt to solve this problem is the development of an alternative source of insulin-producing cells by differentiation of stem cells, which display this differentiating potential. Pax4 is one of the transcription factors responsibles for β cell differentiation, being essential for its proper development and maturation, therefore being a good candidate to induce stem cell differentiation into insulin producing cells in vitro. A promising alternative to avoid the alterations of the differentiated cells genome due to its undesirable effects of integrating vectors, but yet allowing the Pax4 to act in diferentiation within the cells are the proteins with a transduction domain (PTDs), which would have the ability to lead the Pax4 protein directly into the cells. The Pax4 could thus act in the nucleus and generate specific transcriptional responses. The PTDs are small peptide sequences which allow translocation of proteins across cell membranes and their internalization into target cells. One of the most commonly studied PTDs is the VP22, a product of the UL49 gene from Herpes Simplex vírus type I. Therefore, the VP22.Pax4 fusion protein would transduce Pax4 into the stem cells, thus allowing the transcription activation of certain genes by Pax4, leading to improvement in the process of stem cells differentiation into insulin-producing cells. To this end, we cloned the Pax4 cDNA from RINm5f murine insulinoma cells, constructed the pVP22.Pax4 vector and transfected this construct into CHO cells, which then produced the VP22.Pax4 fusion protein. Upon verifying that VP22 was also able to transduce proteins into stem cells, by confocal microscopy analysis, after the treatment of these cells with the fusion protein VP22.eGFP, we incorporated the fusion protein VP22.Pax4 to one of the steps of the protocol used for stem cells diferentiation into insulin producing cells in our lab, by co-culturing with CHO cells producing VP22.Pax4. We observed that the addition of Pax4 led to the formation of a higher number of insulin producing cell clusters, therefore we conclude that VP22 may be used as a tool to internalize proteins into stem cells, and that the addition of Pax4 may improves protocols seeking the production of insulin-producing cell

O transtorno bipolar (TB) é caracterizado como um grave transtorno psiquiátrico, que apresenta curso crônico com notável prejuízo cognitivo e funcional nos pacientes. Nesta tese, através de duas revisões avaliamos as alterações de marcadores periféricos de estresse oxidativo, neurotrofinas e inflamação presentes em pacientes com TB e discutimos o envolvimento destes na toxicidade sistêmica, bem como uma possível associação destas alterações com as disfunções cognitivas e funcionais apresentadas pelos pacientes ao longo do transtorno. Neste sentido, muitos estudos têm sido realizados buscando compreender a fisiopatologia do TB, no entanto, para o estabelecimento de um modelo in vitro é necessário ter um modelo celular adequado e um desafio que possa mimetizar a fisiopatologia da doença. Neste contexto, não há na literatura, até o momento, um modelo adequado que compreenda toda a complexidade dos sintomas do TB, por isso o objetivo geral desta tese consistiu na caracterização gênica do modelo in vitro de diferenciação celular da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, induzido por ácido retinóico, e a busca por um modelo experimental para a avaliação da toxicidade sistêmica apresentada pelos pacientes com TB. O modelo de diferenciação foi avaliado através da técnica de microarranjo, onde verificamos que nas células diferenciadas há maior expressão de processos biológicos envolvidos no desenvolvimento neuronal, enquanto nas células indiferenciadas observamos maior expressão de processos biológicos relacionados a proliferação e manutenção celular. Ainda, genes relacionados a função sináptica e a síntese dopaminérgica estavam mais expressos nas células diferenciadas. Estes achados contribuem para a validação de um modelo de origem humana, de fácil manuseio e que apresenta perfil neuronal; auxiliando assim no estudo de doenças que acometem o sistema nervoso central, dentre elas o TB. Para avaliar o perfil de toxicidade no soro de pacientes bipolares, tratamos as células SH-SY5Y diferenciadas com soro de pacientes com TB, tanto em estágio inicial quanto avançado do transtorno. Como resultado, verificamos que o soro dos pacientes em estágio avançado apresenta maior toxicidade quando comparado ao soro de indivíduos controles por causar uma diminuição da viabilidade celular e uma diminuição na densidade de neuritos. Analisados em conjunto, os achados desta tese apontam para um novo modelo in vitro para analisar a fisiopatologia do TB, bem como o efeito de medicações e vias metabólicas envolvidas. Além disso, corroboram com dados prévios da literatura de que perifericamente os pacientes apresentam um índice de toxicidade relevante quando comparado a indivíduos controles e que este índice estaria relacionado a progressão do transtorno. / Bipolar disorder (BD) is characterized as a serious psychiatric disorder that presents chronic course with remarkable cognitive and functional impairment. In this thesis, we analyzed in two reviews the changes in peripheral markers of oxidative stress, neurotrophins and inflammation, discussing their involvement in systemic toxicity, as well as a possible association of these changes with the cognitive and functional impairment presented by BD patients throughout the disorder. In this sense, many studies have been performed seeking to understand the pathophysiology of this illness. Moreover, research on BD and drug development is hampered by the lack of suitable in vitro models. To counteract this, many attempts to explore patient-derived samples have been undertaken, resulting in partial reproduction of disease aspects. However, still does not exist in the literature a suitable model to understand the complexity of the BD symptoms. Therefore, the aims of this thesis was to evaluate the differential gene expression of the cell differentiation model of human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, induced by retinoic acid, and the search for an experimental model for the evaluation of systemic toxicity in patients with BD. The differentiation model was assessed by microarray analysis and we found that the differentiated cells had increased expression of biological processes involved in neuronal development, while undifferentiated cells showed higher expression of biological processes related to cellular proliferation and maintenance. Also, genes related to the synaptic function and dopaminergic synthesis were more expressed in differentiated cells. These findings contribute to the validation of a cellular model from human source, easy handling and featuring neuronal profile; thereby aiding in the study of diseases that affect the central nervous system, including BD. In order to evaluate the toxicity profile in serum of bipolar patients, differentiated SH-SY5Y cells were treated with sera of BD patients in early and late stages of the disorder. As a result, for the first time in the literature, it has been verified the potential neurotoxicity of bipolar patients serum directly in human cells with a neuronal profile and we found that the serum of patients at late stage would present higher toxicity when compared to the control sera, causing a decrease in cell viability and a reduced neurite outgrowth density. Taken together, the findings of this thesis point to a new in vitro model to analyze the pathophysiology of BD, as well as the effect of medications and metabolic pathways involved in this disorder. Moreover, corroborate previous peripherally data found in the literature where patients would have a toxicity index compared to control subjects and that this index would be related to the progression of the disorder.

A questão central para a engenharia tecidual é induzir as células a recapitularem o seu fenótipo normal quando integradas a um arcabouço manufaturado. O objetivo deste trabalho foi examinar as variações na diferenciação celular do músculo liso e urotélio durante as etapas de produção de tecidos urinários in vitro. Quinze espécimes cirúrgicos geraram as culturas analisadas e os fenótipos das populações foram verificados por citometria de fluxo, imunofluorescência e expressão gênica. Houve uma associação entre o cultivo em superfícies plásticas e alterações no fenótipo de ambos os tipos celulares, os quais foram restaurados, em alguma extensão, após sua semeadura em matrizes temporárias. Enquanto o músculo liso recuperou o seu marcador contrátil, o urotélio apresentou atributos de uma camada basal. O estudo destacou como a perda da diferenciação secundária à expansão in vitro representa um desafio para a formação de neotecidos funcionais. / The key issue of tissue engineering is how to induce cells to recapitulate their normal phenotype when placed within a scaffold. The aim of this work was to examine the smooth muscle and urothelium differentiation changes during the steps of urinary tissue production in vitro. Fifteen surgical specimens generated the analyzed cultures and phenotypes of cell populations were monitored by flow cytometer, immunofluorescence and gene expression. For both cellular types, there was an association of cell culture on plastic with phenotypic changes, but they were regained to some extent after cell seeding onto scaffolds. Smooth muscle cells restored their contractile marker, while urothelium showed attributes of a basal layer. The study highlights how the loss of differentiation due to propagation of cells in vitro represents a challenge to development of full functional neotissue.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características química e de rugosidade da superfície de titânio sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes aos osteoblastos de rato (Osteo-1), cultivados em meio de cultura adicionado de BMP-7. MATERIAL E MÉTODO: Células Osteo-1 foram cultivadas sobre discos de titânio com superfícies:1) lisa, 2) jateada por areia de grânulos grandes e atacada por ácido (SLA) e 3) rugosa SLA e quimicamente modificada e hidrofílica (SLAactive) na presença ou ausência de 20ng/ml de rhBMP- 7 no meio de cultura. A adesão e viabilidade das células Osteo-1 foram analisadas após 24 horas de contato com as superfícies em estudo. A diferenciação celular foi avaliada através da análise do conteúdo de proteína total (PT), conteúdo de colágeno, atividade de fosfatase alcalina (ALPase), em 7, 14 e 21 dias, e da formação de matriz mineralizada, em 21 dias. Os resultados foram comparados pela análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey. RESULTADOS: A adesão (p=0.3485) e a viabilidade (p=0.5516) celular, o conteúdo de colágeno (p=0.1165) e a formação de matriz mineralizada (p=0.5319) não foram afetados pelas diferentes superfícies ou pela adição de rhBMP-7 ao meio. Células Osteo-1 cultivadas sobre superfície SLA apresentaram um aumento significativo no conteúdo de proteína total aos 21 dias. A relação atividade de ALPase/PT (p=0.0000) foi afetada pelos tratamento e tempo. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que a adição de rhBMP- 7 ao meio de cultura não promoveu efeito sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos nas diferentes superfícies testadas. Todas as superfícies de titânio testadas permitiram uma completa expressão do fenótipo de osteoblasto como a mineralização da matriz pela célula Osteo-1. / The aim of the present study was to assess the influence of the chemical characteristics and roughness of titanium surfaces on the attachment, proliferation and differentiation of osteoblast-like cells cultured in medium supplemented with bone morphogenetic protein-7 (BMP-7). METHODS: Osteo-1 cells were grown on titanium discs presenting the following surfaces: 1) machined surface, 2) coarse gritblasted and acid-etched (SLA), and 3) modified SLA (SLAactive) in the absence or presence of 20 ng/ml rhBMP-7 in culture medium. The attachment and viability of osteo-1 cells were evaluated after 24 h. Cell differentiation was evaluated by analysis of total protein content (TP), collagen content and alkaline phosphatase (ALPase) activity at 7, 14 and 21 days and of mineralized matrix formation at 21 days. The results were compared by analysis of variance (ANOVA) and Tukey\'s test. RESULTS: Cell attachment (p=0.3485), cell viability (p=0.5516), collagen content (p=0.1165) and mineralized matrix formation (p=0.5319) were not affected by the different surfaces or by the addition of rhBMP-7 to the medium. Osteo-1 cells cultured on SLA surface presented a significant increase in TP at 21 days. The ALPase/TP ratio (p=0.0000) was affected by treatment and time. CONCLUSION: The results suggest that the addition of rhBMP-7 to the culture medium did not promote any effect on the adhesion, proliferation or differentiation of osteoblast-like cells grown on the different surfaces tested. All titanium surfaces analyzed permitted the complete expression of the osteoblast phenotype such as matrix mineralization by osteo-1 cells.

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Maikel Petrus Peppelenbosch / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T22:42:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Queiroz_KarlaCristianedeSouza_D.pdf: 5700883 bytes, checksum: 11ab46407bbf600912fa23adf313688d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A eficiência do tratamento do câncer sob vários aspectos, mesmo com os avanços ¿farmacotecnológicos¿, ainda permanece como desafio para a medicina. Diante desse fato, novos agentes que atuem de forma alvo-específico, apresentem poucos efeitos colaterais e possam impedir o ¿escape¿ das células tumorais à indução de morte, são extremamente desejáveis. No presente trabalho, foram abordados 3 aspectos da atividade antitumoral da riboflavina: indução da apoptose das células de câncer prostático, indução da diferenciação de células leucêmicas e aumento da biodisponibilidade intracelular do quimioterápico mitoxantrona. Sob esses 3 aspectos, através do estudo de vias de sinalização, identificamos mediadores moleculares responsáveis pela ação da riboflavina como antitumoral. A atuação da riboflavina irradiada em células de câncer de próstata foi dependente da inibição da PI3K. De forma interessante, observamos uma potencial ação inibitória da metástase, evidenciada pela inibição das metaloproteinases 2 e 9 e da angiogênese pela diminuição da expressão do VEGF. Em relação à diferenciação das células leucêmicas evidenciamos o envolvimento do receptor TNFR1, bem como das proteínas ciclina D, JNK, Src quinase e das proteínas tirosinas fosfatases SHP2 e PTP!. Portanto, proteínas com diferentes localizações celulares foram afetadas, culminando com a diminuição da proliferação, manutenção da sobrevivência celular, interrupção da progressão do ciclo celular e reorganização do citoesqueleto, efeitos metabólicos essenciais para a ocorrência da diferenciação. Esse trabalho de tese também demonstrou a aplicabilidade da técnica do Pepchip para a identificação de diferenças metabólicas entre duas linhagens das células da leucemia eritroblástica, K562 e Lucena. Outra abordagem interessante nesse trabalho foi o uso da riboflavina com a finalidade de aumentar a biodisponibilidade celular de quimioterápicos tradicionais e a utilização de inibidores de proteínas fosfatases como estratégia para reverter a resistência de células tumorais. De acordo com os resultados, esse trabalho aponta de forma inédita uma nova função da vitamina B2 como antitumoral / Abstract: Cancer therapy efficiency, under several aspects, even with the progress of ¿pharmacotechnology¿, remains as a challenge for the medicine. According to this factor, new agents that act on specific target, present low side-effects and prevent cancer cells ¿escaping¿ from death induction, are extremely desirable. In this work, 3 aspects of antitumoral property of riboflavin were evaluated: apoptosis induction of prostate cancer cells, leukaemic cells differentiation and increase of intracellular bioavailability of chemotherapic (mitoxantrone). Under these 3 aspects, and by signal transduction approach, we identified molecular mediators responsible for antitumoral activity of riboflavin. The action of irradiated riboflavin on prostate cancer cells was dependent on PI3K inhibition. Interestingly, we also observed a potential inhibitory action of metastasis, as demonstrated by the inhibition of metalloproteinases 2 and 9 and decreasing of angiogenesis by downregulation of VEGF. In relation to leukaemic cells differentiation we demonstrated the involvement of TNFR1, as well as cyclin D, JNK, Src kinase and protein tyrosine phosphatases SHP2 and PTP!. Therefore, proteins with different cellular localizations were affected culminating in decreasing of cell proliferation, maintaining cell survival, cell cycle arrest and cytoskeleton rearrangement, crucial metabolic effects for the occurrence of differentiation process. This work also demonstrated the applicability of Pepchip technique for identifying the differences between 2 erytroblastic leukaemia cell lines, K562 and Lucena. Other interesting approach, in this work, was the use of riboflavin for improving chemotherapic cellular bioavailability and the strategical use of protein phosphatase inhibitors for reverting tumor cells resistance. According to our findings, this work spotlights the novel function of the vitamin B2 as an antitumoral agent / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Doenças envolvendo órgãos endodermicamente derivados afetam milhares de pessoas no mundo. O sucesso da terapia celular para o tratamento de doenças de órgãos oriundos da mesoderme e ectoderme gera ótimas perspectivas para o uso do mesmo em tratamento de doenças de órgãos de origem endodérmica (tireóide, pulmões, fígado, vesícula biliar e pâncreas). Particularmente, no fígado, ainda que sejam atribuídas propriedades regenerativas em muitas lesões o mecanismo de reparação é insuficiente, tornando o transplante hepático à única opção definitiva. Dentre as células-tronco embrionárias, as células de linhagens hepáticas fetais podem estabelecer-se como fonte importante para a terapia celular em indivíduos com doenças hepáticas, pois possuem um alto índice de diferenciação de hepatócitos e células do ducto biliar in vitro. Evidências apontam a progranulina como um fator de crescimento de grande habilidade para a indução de proliferação celular, uma vez que está envolvida no desenvolvimento embrionário e neonatal. Sendo assim, neste trabalho foram utilizados embriões de ratos Fischer 344 com idades gestacionais 12,5; 13,5; 14,5; 15,5; 16;5 para caracterizar o papel do novo fator de crescimento progranulina na hepatogênese. Foram realizadas análises histológicas, de microscopia eletrônica de transmissão e imuno-histoquímicas nos embriões. Houve expressão de progranulina e Oct-4 (marcador de célula tronco indiferenciada) principalmente nas idades gestacionais de 13,5 a 16,6 dias e 12,5 a 16,5 dias para PCNA (marcador de proliferação celular). Dessa forma acredita-se que, a progranulina atua nos processos de proliferação celular e diferenciação das células-tronco do broto hepático, podendo ser usada como um fator de diferenciação em culturas in vitro visando à diferenciação de células-tronco do broto hepático em hepatócitos funcionais para a terapia celular. / Diseases involving endodermal-derivated organs affect thousands of people all over the world. The cell therapy success for treating diseases of organs originated from mesoderm and ectoderm generates excellent perspectives for its use in treating diseases of organs of endodermal origin (thyroid, lungs, liver, gallbladder and pancreas). Particularly in the liver, although regenerative proprieties are attributed in many lesions, the repairing mechanism is insufficient, making the hepatic transplant the only definitive option. Among the embryo stem cells, the fetal hepatic lineage cells may establish themselves as important sources for cell therapy in individuals with hepatic diseases, since they have high ability in hepatocytes and billiar duct cells differentiation in vitro. However, for the use of hepatic lineage embryo stem cells as a bi-potential source of differentiation, it is necessary the establishment of efficient proliferation methods in this type of cells. Evidences point to progranuline as a growth factor with high capability for the induction of cell proliferation, since it is involved in the embryo and neo-natal development. Thus, this study used embryos of Fischer 344 rats with gestational ages 12.5, 13.5, 14.5, 15.5 and 16.5 to characterize the role of the new growth factor progranuline in hepatogenesis. We conducted histological, transmission electron microscopy and immunohistochemical in embryos. There was expression of progranuline and Oct-4 (undifferentiated stem cell marker), especially at gestational ages 13.5 to 16.5 days and 12.5 to 16.5 days for PCNA (proliferation marker). So it is believed that progranuline acts on cell proliferation and differentiation of stem cells from the liver bud, which can be used as a differentiating factor in order to cultures in vitro differentiation of stem cells from the liver bud into functional hepatocytes for cell therapy.

Monócitos são células hematopoiéticas com função na imunidade inata e adquirida. De acordo com o estímulo que recebem, podem se diferenciar em macrófagos e potencializar suas funções efetoras, modulando a resposta imune e participando de vários processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são muito heterogêneos e capazes de assumir diferentes fenótipos em resposta aos estímulos que recebem do microambiente. Em um ambiente gorvernado por interferon gama (IFN-γ), se diferenciam em células com aumentada capacidade de apresentação de antígenos e síntese de citocinas pró-inflamatórias (macrófagos M1). Por outro lado, quando são estimulados por interleucina-4 (IL-4), eles se diferenciam em um fenótipo antagonista com atividade de reparo (macrófagos M2). Dada a importância destas células no sistema imune, é necessário desenvolver e otimizar técnicas que sirvam de ferramentas para estudar a diferenciação de macrófagos em seus perfis fenotípicos bem como seu papel em doenças humanas. Assim, o objetivo deste estudo foi padronizar e comparar dois diferentes protocolos de isolamento de monócitos descritos na literatura e analisar seu impacto sobre a diferenciação de macrófagos. Isolamos monócitos do sangue periférico de cinco indivíduos saudáveis pelas técnicas de aderência e seleção positiva. Os monócitos foram diferenciados a macrófagos com suplementação de M-CSF. Depois da indução aos perfis M1 e M2, avaliamos marcadores de superfície celular, expressão de mRNA de citocinas, secreção de quimiocinas e fagocitose. Observamos que os métodos utilizados para isolar monócitos possuem diferentes purezas, mas que monócitos isolados por ambos métodos foram capazes de ser diferenciados a macrófagos em seus perfis M1 e M2. Análises de citometria de fluxo mostraram que há uma diminuição da expressão de CD14, principalmente em macrófagos M2, e manutenção (M2) ou aumento (m1) da expressão de HLA-DR. Monócitos (CD80-CD86high) induzidos aos fenótipo M1 são caracterizados pela regulação positiva de CD80 e regulação negativa de CD86 (CD80++CD86+). O perfil M2 foi caracterizado pela expressão de CD206high e ausência de CD163- (CD206highCD163-). A expressão do mRNA revelou que IL-1β e TNF-α foram marcadores de M1 e TGF-β e CCL18 foram marcadores de M2. Além disso, quimiocinas inflamatórias como CXCL9, CXCL10 e CCL5 foram significativamente aumentadas em macrophagos M1. Macrófagos M1 e M2 são ativos e funcionais como demonstrado no ensaio de fagocitose. Embora ambos métodos utilizados para isolar monócitos tiveram purezas diferentes, ambas técnicas forneceram monócitos capazes de serem diferenciados a macrófagos. / Monocytes are hematopoietic cells with a major role in innate and adaptative immunity. According to the stimulus they receive, they can differentiate into macrophages and enhance effector functions by modulating the immune response and participating in various physiological and pathophysiological processes. Macrophages are very heterogeneous and are able to assume different phenotypes in response to the different stimuli they receive from the microenvironment. In a proinflammatory milieu ruled by interferon gamma (IFN-γ), they differentiate into cells with increased capacity to present antigens and synthesis of proinflammatory cytokines (M1 macrophages). On the other hand, when they are stimulated with interleukin 4 (IL-4), they differentiate into an antagonist phenotype with repair activity (M2 macrophages). Given the importance of these cells in the immune system, it is necessary to develop and optimize techniques that serve as useful tools for studying the differentiation of macrophages in their different phenotypic profiles as well as their roles in human diseases. In this regard, the aim of this study was to standardize and compare two different human monocyte isolation protocols described in the literature and analyze their impact on macrophage differentiation. We isolated peripheral blood monocytes from five healthy subjects by the adherence technique and positive selection. Monocytes were differentiated into macrophages with M-CSF supplementation. After M1 or M2 induction, we evaluated cell surface markers, mRNA cytokine expression, chemokine secretion and phagocytosis. We found that the methods used to isolate monocytes have different purities, but monocytes isolated from both methods were able to differentiate into the M1 and M2 profile. The monocyte and macrophage flow cytometry analysis demonstrated that CD14 decreased expression, mainly in M2 macrophages, and maintained (M2) or increased (M1) the HLA-DR expression. Monocytes (CD80-CD86high) induced to an M1 phenotype were characterized by upregulation of CD80 and down regulation of CD86. (CD80++CD86+) The M2 profile was characterized by the expression of CD206high and absence of CD163- (CD206highCD163-). The mRNA expression revealed that IL-1β and TNF-α were M1 markers and TGF-β and CCL18 were M2 markers. Further more, inflammatory chemokines as CXCL9, CXCL10 and CCL5 were significantly increased in M1 macrophages. M1 and M2 macrophages were active and functional as shown in the phagocytic assay. Although methods used for the isolation of monocytes yielded different purities, both techniques provided monocytes able to differentiate to macrophages.

Submitted by João Arthur Martins (joao.arthur@ufpe.br) on 2015-04-08T19:25:32Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO UFPE - THIAGO GOMES DE FIGUEIREDO GONDIM GONDIM.pdf: 1777887 bytes, checksum: 04a3dbfbbbc52b848fcc8cb7fed2ab4f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T19:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO UFPE - THIAGO GOMES DE FIGUEIREDO GONDIM GONDIM.pdf: 1777887 bytes, checksum: 04a3dbfbbbc52b848fcc8cb7fed2ab4f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / CAPES E PROPESQ/UFPE / As células-tronco mesenquimais constituem uma rara população de células progenitoras com capacidade de diferenciação multipotencial e parecem constituir uma ferramenta atrativa no contexto da engenharia de tecidos e da terapia celular. O desenvolvimento de novos materiais pode ser citado como um setor de vanguarda para a engenharia de tecidos; e os biopolímeros despontam como biomateriais inovadores com vasta aplicação na biologia celular, especialmente em função de sua biocompatibilidade. Nesse contexto, temos como principal objetivo estudar a evolução das características morfológicas das células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano quando cultivadas sobre suportes de biopolímero de cana-de-açúcar (gel ou membranas), enfatizando-se a potencial capacidade dessas células diferenciarem-se em queratinócitos. Cordões umbilicais foram obtidos de parturientes do Setor de Obstetrícia do Hospital das Clínicas/UFPE (n=40, com 30 a 40 semanas de idade gestacional). Veias de cordões umbilicais foram preenchidas com colagenase tipo IV e mantidas a 37º C. As células coletadas foram centrifugadas por 10 minutos e ressuspendidas em meio DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, mistura de antibióticos e plaqueadas em garrafas (105 células/mL). Os aspectos morfológicos das células fenotipicamente semelhantes às células-tronco mesenquimais foram avaliados com 3, 5, 10, 14, 28, 40 e 45 dias, através de microscópio invertido com contraste de fase e sistema de captura de imagem. Com 72h de cultivo sobre um suporte comercial, observamos que as células-tronco mesenquimais apresentaram-se com aspecto fibroblastóide difuso e a formação de monocamada ocorreu com cinco dias. Células cultivadas em placas contendo o gel de biopolímero de cana-de-açúcar também apresentaram morfologia semelhante a fibroblastos (72h), porém mais alongadas e dispostas radialmente; com formação de monocamada em torno de sete dias. Quando cultivadas sobre membranas desse biomaterial, notamos com o auxílio de microscópio invertido, células com formato variando de arredondadas a fibroblastóides, e através da microscopia eletrônica de varredura foi possível detalhar essa variação no formato das células e perceber a emissão de finos prolongamentos (nanofibras). Nos ensaios de diferenciação das células-tronco mesenquimais em queratinócitos usando-se o gel de biopolímero de cana-de-açúcar como suporte, observamos que inicialmente grande parte das células conservou a morfologia arredondada e apresentaram-se de forma enfileirada, especialmente em algumas áreas do referido gel, e em torno de 14 dias a típica forma cubóide-arredondada das colônias de queratinócitos pode ser observada. Os resultados do nosso estudo sugerem que os suportes (gel ou membranas) de biopolímeros de cana-de-açúcar foram capazes de favorecer o crescimento e a diferenciação das células-tronco mesenquimais e mais experimentos deverão ser realizados para que o cultivo dessas células nessas condições, possivelmente, possa fornecer uma fonte eticamente não controversa e facilmente acessível de queratinócitos para futuras aplicações experimentais e clínicas.

Orientador : Maria Lucia Furlan Wada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T07:23:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SantosJunior_ArnaldoRodriguesdos_D.pdf: 11814677 bytes, checksum: 2777c85159ecc85a70f9d31eef949284 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Os biornateriais poliméricos são compostos desenvolvidos para serem utilizados como substitutos de tecidos danificados. Urna classe de biomateriais poliméricos utilizados são os bioabsorvíveis, que são compostos que se decompõe tanto in vitro quanto in vivo, e são utilizados em tecidos que necessitam de um suporte temporário até que a recomposição tecidual se concretize. Dentre os vários polímeros bioabsorvíveis, se destacam os dispositivos a base do poli(L-ácido láctico) [PLLA] por apresentar boa biocompatibilidade e os produtos de sua decomposição serem eliminados do corpo por vias metabólicas. Membranas densas de PLLA ou com poros de diferentes diâmetros (> que 451lm, entre 180-2501lm e entre 250-350Ilm) foram avaliadas quanto a adesão, crescimento e diferenciação de células fibroblásticas em cultura. Observamos que as células aderem lentamente às membranas de PLLA. Uma vez aderi das, as células apresentaram variações em seus padrões morfológicos de acordo com as características estruturais do substrato no qual elas cresceram. Em todos os substratos de PLLA estudados, as células não apenas foram capazes de proliferar sobre a superficie dos mesmos como também foram hábeis em produzir uma matriz extracelular rica em colágeno tipo IV e fibronectina. Avaliamos também o comportamento das células fibroblásticas sobre blendas de PLLA com poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) [pHBV] em diferentes proporções (100/0, 60/40, 50/50, 40/60, 0/100). Nas blendas de PLLAlPHBV, também observamos a adesão celular lenta e uma morfologia variável, variando de células arredondadas à completamente achatadas e unidas por prolongamentos, de acordo com as características fisicas e topográficas do substrato. Também observamos que os substratos foram capazes de estimular a proliferação celular e a produção de um matriz extracelular rica em colágeno tipo IV e fibronectina. A análise conjunta dos resultados mostra que os diferentes substratos a base de PLLA estudados não apresentam toxicidade, uma vez que as células são capazes de crescer e proliferar sobre eles. Sobretudo, as células foram capazes de se diferenciarem sobre os diferentes polímeros, uma vez que passam a produzir uma matriz extracelular rica em colágeno IV, comportamento incomum a células fibroblástica / Abstract: Polymeric biomaterials are developed compounds used as substitutes for damaged tissue. A c1ass of biomaterials is the bioabsorbable ones, which are polymers that degrade in vitro as well as in vivo and are used in tissues that need a temporary support until its tissue regeneration happens. Among the several bioabsorbable polymers, the poly (L-acid lactic) [PLLA] based devices are eminent because their decomposition products are eliminated ITom the body by metabolic ways and due to their good biocompatibility. PLLA dense membranes or with different diameter pores (smaller than 45 Ilm, between 180-2501lm and 250-350Ilm) were evaluated by their ability of stimulating adhesion, growth and differentiation of tibroblastic cells in culture. We observed that the cells adhere slowly to the dense and porous PLLA membranes. Once adhered, they presented a differentiated morphological pattern in accordance with the substrate characteristics that they had grown. In ali the PLLA substrates studied, the cells were not on1y capable of proliferating over the substrates but also producing an extracellular matrix, rich in type IV collagen and tibronectin. We also evaluated the tibroblastic cells behavior over the different proportions blends of PLLA with poly(hydroxybutirate-co-hydroxyvalerate) [pHBV] (100/0, 60/40, 50/50, 40/60, 0/100). At the PLLA/PHBV blends, we also noticed a slowly cellular adhesion and a variable morphology according to the physical and surface substrate characteristics. We also observed that the substrate were capable of stimulating cell proliferation and the production of an extracellular matrix rich in type IV collagen and tibronectin. The results analysis show that the different PLLA based substrates studied, do not present toxicity, once the cells could differentiate over the different polymers, which was demonstrated by the production of an extracellular matrix rich in type IV collagen, an uncommon behavior to tibroblastic cells / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural