Thesis (Ph. D.)--Cornell University, January, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 138-149).

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2002. / Includes bibliographical references (leaves 153-174). Also available online through Digital Dissertations.

O efeito inflamatório da jararagina, toxina hemorrágica do veneno de Bothrops jararaca, foi avaliado através de um sistema in vitro (células peritoneais murinas-MPACs) e in vivo (coxim plantar de camundongos), onde foi avaliada a produção de mRNA que codifica as citocinas TNF-a, IL-1b e IL-6 por RT-PCR e a liberação destas no sobrenadante de cultura e no local de injeção (ELISA). Além disso, o domínio da jararagina responsável pela liberação local das citocinas foi estudado. Nossos resultados mostram que a jararagina induziu a expressão de mRNA que codifica para o TNF-a, IL-1b e IL-6 em MPACs, 4 horas após o estímulo, entretanto a ação enzimática da jararagina interferiu com a detecção dstas citocinas no sobrenadante da cultura. A jararagina inibida com EDTA induziu a liberação destas citocinas no modelo in vitro (MPACs). No modelo in vivo foi verificada a liberação local de TNF-a, IL-1b e IL-6 no sobrenadante do homogenato do tecido, sendo a IL-6 a citocina liberada em maior quantidade. Tanto o domínio disintegrina/rico em cisteína, como o metaloproteinase, da jararagina, participam desta liberação. Este estudo mostrou o envolvimento direto de citocinas em um modelo inflamatório, liberadas pela metaloproteinase de veneno botrópico, em cultura de células e também no local da injeção. / The inflammatory effect of jararhagin, a haemorrhagic toxin from Bothrops jararaca venom, was evaluated in an in vitro (Murine Peritoneal Adherent Cells-MPACs) and in vivo system (mouse footpad), through the production of TNF-a, IL-1b and IL-6 mRNA (RT-PCR) and the release of these cytokines in the culture supernatant and locally at the site of injection (ELISA). In addition the domain of jararhagin responsible for the local release of cytokines was studied. Our results showed that the jararhagin can induce the mRNA expression for TNF-a, IL-1b and IL-6 in MPACs at 4 hours after treatment, however the enzymatic activity of jararhagin was found to affect the detection of the cytokines in the culture supernatant. The jararhagin inhibited with EDTA was found to induce the release of these cytokines by MPACs. Concerning the in vivo model, the local release of TNF-a, IL-1b and IL-6 was detected in the footpad homogenate. Both of the jararhagin domains, the metalloproteinase and the disintegrin/cystein rich domains play a role in this release. This study showed the direct involvment of cytokines in an inflammatory model, released by snake venom metalloproteinases in the cell culture and also locally at the site of injection.

O efeito inflamatório da jararagina, toxina hemorrágica do veneno de Bothrops jararaca, foi avaliado através de um sistema in vitro (células peritoneais murinas-MPACs) e in vivo (coxim plantar de camundongos), onde foi avaliada a produção de mRNA que codifica as citocinas TNF-a, IL-1b e IL-6 por RT-PCR e a liberação destas no sobrenadante de cultura e no local de injeção (ELISA). Além disso, o domínio da jararagina responsável pela liberação local das citocinas foi estudado. Nossos resultados mostram que a jararagina induziu a expressão de mRNA que codifica para o TNF-a, IL-1b e IL-6 em MPACs, 4 horas após o estímulo, entretanto a ação enzimática da jararagina interferiu com a detecção dstas citocinas no sobrenadante da cultura. A jararagina inibida com EDTA induziu a liberação destas citocinas no modelo in vitro (MPACs). No modelo in vivo foi verificada a liberação local de TNF-a, IL-1b e IL-6 no sobrenadante do homogenato do tecido, sendo a IL-6 a citocina liberada em maior quantidade. Tanto o domínio disintegrina/rico em cisteína, como o metaloproteinase, da jararagina, participam desta liberação. Este estudo mostrou o envolvimento direto de citocinas em um modelo inflamatório, liberadas pela metaloproteinase de veneno botrópico, em cultura de células e também no local da injeção. / The inflammatory effect of jararhagin, a haemorrhagic toxin from Bothrops jararaca venom, was evaluated in an in vitro (Murine Peritoneal Adherent Cells-MPACs) and in vivo system (mouse footpad), through the production of TNF-a, IL-1b and IL-6 mRNA (RT-PCR) and the release of these cytokines in the culture supernatant and locally at the site of injection (ELISA). In addition the domain of jararhagin responsible for the local release of cytokines was studied. Our results showed that the jararhagin can induce the mRNA expression for TNF-a, IL-1b and IL-6 in MPACs at 4 hours after treatment, however the enzymatic activity of jararhagin was found to affect the detection of the cytokines in the culture supernatant. The jararhagin inhibited with EDTA was found to induce the release of these cytokines by MPACs. Concerning the in vivo model, the local release of TNF-a, IL-1b and IL-6 was detected in the footpad homogenate. Both of the jararhagin domains, the metalloproteinase and the disintegrin/cystein rich domains play a role in this release. This study showed the direct involvment of cytokines in an inflammatory model, released by snake venom metalloproteinases in the cell culture and also locally at the site of injection.

As integrinas são proteínas de membrana envolvidas em diversos processos biológicos como embriogênese, inflamação e agregação plaquetária. A alteração de seu padrão de expressão está relacionada com processos patológicos como trombose e câncer, fazendo das integrinas ótimos indicadores da progressão destas doenças. Assim, a integrina α2β1 pode ser considerada como indicadora de angiogênese, sendo expressa nas células endoteliais durante o crescimento de novos vasos. Já a ausência da αIIbβ3 em plaquetas está relacionada com a doença de Glanzmann, caracterizada por uma agregação plaquetária deficiente, e sua presença em outros tipos celulares está relacionada com processos de metástase e invasão de tecidos. Estas integrinas contêm antagonistas naturais nos venenos de serpentes da família VIPERlDAE: As RGD-disintegrinas bloqueiam a integrina αIIbβ3 e as ECD-disintegrinas bloqueiam a integrina α2β1. Estas últimas formam parte de metaloproteinases com múltiplos domínios de aproximadamente 50 kDa. Interessados em desenvolver marcadores moleculares para estas integrinas, direcionamos nossos objetivos para: (1) a elucidação da região mínima das ECD-disintegrinas com atividade biológica e (2) construção de biomarcadores para a integrina α2β1 utilizando a região elucidada, e para a integrina αIIbβ3 utilizando uma RGD-disintegrina. Neste trabalho conseguimos determinar uma região de 49 resíduos na porção C-terminal do domínio ECD-disintegrina da jararagina que reage com um anticorpo neutralizante das atividades hemorrágica e de ligação ao colágeno da proteína. Esta região foi subclonada e expressa em fusão com a fosfatase alcalina de E. colí, mas não teve funcionalidade como marcador. No entanto, a RGD-disintegrina eristostatina em fusão com a fosfatase alcalina mostrou bifuncionalidade, apresentando tanto atividade disintegrina como atividade catalítica. Além disso, verificamos sua seletividade pela integrina αIIbβ3 e padronizamos um ensaio direto de dot blot para a presença dessa integrina em plaquetas, com um único passo de incubação. / Integrins are membrane proteins involved in biological processes such as embriogenesis, inflammation and platelet aggregation. The alteration of their expression pattem is related to pathological disorders such as thrombosis and cancer, making integrins suitable indicators of the progression of these diseases. Thus, the α2β1 integrin, which is expressed in endothelial cells during capillary growth, may be an indicator of angiogenesis. The absence of αIIbβ3 integrin in platelets is related to Glanzmann disease, characterized by defective platelet aggregation and its expression in other cellular types is related with metastasis and tissue-invasion processes. These integrins contain natural antagonists in venoms from the VIPERIDAE snake family: RGD-disintegrins, which block the αIIbβ3 integrin and ECD-disintegrins, which block the α2β1 integrin. The latter forming part of multidomain metalloproteinases of approximately 50 kDa. In order to develop molecular markers for integrins, we have directed our objectives at: (1) determining the minimal region of ECD-disintegrins with biological activity and (2) engineering biomarkers for the α2β1 integrin using the previously determined minimal region and for the αIIbβ3 using an RGD-disintegrin. In this work we have determined a 49-residue region located in the C-terminus of jararhagin ECD-disintegrin domain, which reacts with a neutralizing antibody of hemorrhagic and binding to collagen activities of the protein. This region was subcloned and expressed in fusion with E. coli alkaline phosphatase, but did not present a marker activity. On the other hand, the RGD-disintegrin eristostatin fused to alkaline phosphatase showed bifunctionality, presenting both, disintegrin and catalytic activities. Furthermore, we have characterized its selectivity for the αIIbβ3 integrin and we have standardized a direct dot blot assay with one-step incubation for the presence of this integrin in platelets.

As integrinas são proteínas de membrana envolvidas em diversos processos biológicos como embriogênese, inflamação e agregação plaquetária. A alteração de seu padrão de expressão está relacionada com processos patológicos como trombose e câncer, fazendo das integrinas ótimos indicadores da progressão destas doenças. Assim, a integrina α2β1 pode ser considerada como indicadora de angiogênese, sendo expressa nas células endoteliais durante o crescimento de novos vasos. Já a ausência da αIIbβ3 em plaquetas está relacionada com a doença de Glanzmann, caracterizada por uma agregação plaquetária deficiente, e sua presença em outros tipos celulares está relacionada com processos de metástase e invasão de tecidos. Estas integrinas contêm antagonistas naturais nos venenos de serpentes da família VIPERlDAE: As RGD-disintegrinas bloqueiam a integrina αIIbβ3 e as ECD-disintegrinas bloqueiam a integrina α2β1. Estas últimas formam parte de metaloproteinases com múltiplos domínios de aproximadamente 50 kDa. Interessados em desenvolver marcadores moleculares para estas integrinas, direcionamos nossos objetivos para: (1) a elucidação da região mínima das ECD-disintegrinas com atividade biológica e (2) construção de biomarcadores para a integrina α2β1 utilizando a região elucidada, e para a integrina αIIbβ3 utilizando uma RGD-disintegrina. Neste trabalho conseguimos determinar uma região de 49 resíduos na porção C-terminal do domínio ECD-disintegrina da jararagina que reage com um anticorpo neutralizante das atividades hemorrágica e de ligação ao colágeno da proteína. Esta região foi subclonada e expressa em fusão com a fosfatase alcalina de E. colí, mas não teve funcionalidade como marcador. No entanto, a RGD-disintegrina eristostatina em fusão com a fosfatase alcalina mostrou bifuncionalidade, apresentando tanto atividade disintegrina como atividade catalítica. Além disso, verificamos sua seletividade pela integrina αIIbβ3 e padronizamos um ensaio direto de dot blot para a presença dessa integrina em plaquetas, com um único passo de incubação. / Integrins are membrane proteins involved in biological processes such as embriogenesis, inflammation and platelet aggregation. The alteration of their expression pattem is related to pathological disorders such as thrombosis and cancer, making integrins suitable indicators of the progression of these diseases. Thus, the α2β1 integrin, which is expressed in endothelial cells during capillary growth, may be an indicator of angiogenesis. The absence of αIIbβ3 integrin in platelets is related to Glanzmann disease, characterized by defective platelet aggregation and its expression in other cellular types is related with metastasis and tissue-invasion processes. These integrins contain natural antagonists in venoms from the VIPERIDAE snake family: RGD-disintegrins, which block the αIIbβ3 integrin and ECD-disintegrins, which block the α2β1 integrin. The latter forming part of multidomain metalloproteinases of approximately 50 kDa. In order to develop molecular markers for integrins, we have directed our objectives at: (1) determining the minimal region of ECD-disintegrins with biological activity and (2) engineering biomarkers for the α2β1 integrin using the previously determined minimal region and for the αIIbβ3 using an RGD-disintegrin. In this work we have determined a 49-residue region located in the C-terminus of jararhagin ECD-disintegrin domain, which reacts with a neutralizing antibody of hemorrhagic and binding to collagen activities of the protein. This region was subcloned and expressed in fusion with E. coli alkaline phosphatase, but did not present a marker activity. On the other hand, the RGD-disintegrin eristostatin fused to alkaline phosphatase showed bifunctionality, presenting both, disintegrin and catalytic activities. Furthermore, we have characterized its selectivity for the αIIbβ3 integrin and we have standardized a direct dot blot assay with one-step incubation for the presence of this integrin in platelets.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.