A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

Este trabalho testa a hipótese de que a inibição da enzima conversora da angiotensina (ECA), mesmo em doses baixas que não causam alteração de pressão, é capaz de influenciar nos processos de hipertrofia cardíaca, estresse oxidativo e controle autonômico em animais espontaneamente hipertensos (SHR). Os animais foram tratados com um inibidor da enzima conversora da angiotensina (iECA) e foram quantificados a hipertrofia e o estresse oxidativo cardíacos. Também foi avaliado o controle autonômico através da análise espectral de séries temporais de pressão arterial sistólica e freqüência cardíaca. Além disso, foram investigadas as características não-lineares das series de freqüência cardíaca envolvidas na hipertensão arterial sistemica e o efeito do tratamento sobre estes parâmetros através de um teste de irreversibilidade desenvolvido para detectar dinâmicas não-lineares independentemente da escala temporal de ação. Neste contexto, o primeiro estudo (artigo 1) objetivou o desenvolvimento do novo método para análise de irreversibilidade estatística (IE) capaz de detectar inclusive a presença de dinâmicas não-lineares mais lentas das observadas pelos métodos tradicionais. A nova técnica, denominada irreversibilidade bidimensional múltipla (IBM), foi validada e mostrouse útil quando aplicada a séries fisiológicas exibindo um padrão de não-linearidade aumentado em situações de predominância simpática. No segundo momento (artigo 2) o novo método foi aplicado a séries temporais de freqüência cardíaca em situações em que a ativação simpática foi provocada. Após demonstrar a associação entre a irreversibilidade e a modulação simpática em situação fisiológica, usando um protocolo de estimulação simpática gradual, o método também foi aplicado a uma situação patológica, caracterizada pela hipertensão espontânea em ratos. Nesta situação, houve um aumento da IE e o mecanismo não-linear envolvido na referida patologia possui ação mais lenta, sendo possível de ser detectado apenas com o uso de técnicas de alta dimensionalidade, como a irreversibilidade bidimensional múltipla. Além disso, foi verificado o efeito do tratamento com iECA, que reduziu a modulação simpática e restaurou o padrão de irreversibilidade a percentuais semelhantes aos do grupo controle. O terceiro estudo (artigo 3) teve como objetivo avaliar o efeito da inibição da ECA sobre a hipertrofia cardíaca, estresse oxidativo e controle autonômico em doses não anti-hipertensivas. Os resultados demonstraram uma redução da hipertrofia cardíaca, do estresse oxidativo cardíaco, mesmo sem alterar a pressão arterial. Apesar de não alterar a modulação simpática vascular ou atuar na sensibilidade baroreflexa, o tratamento em baixa dose melhorou o balanço autonômico, em favor da modulação vagal. Tais resultados podem indicar uma ação central que busca restabelecer o equilíbrio cardiovascular, precedente à alteração de pressão. Assim sendo, o presente estudo poderá contribuir no desenvolvimento de novas estratégias que, num futuro próximo, permitirão não só avaliar os efeitos do tratamento, mas principalmente, prevenir o estabelecimento de novos quadros hipertensivos e de insuficiência cardíaca. / This work presents the hypothesis that inhibition of the angiotensin converting enzyme (ACE), even in low doses that do not cause decrease of pressure, is able to alter the cardiac hypertrophy, the oxidative stress and the autonomic control in spontaneously hypertensive rats (SHR). To evaluate cardiac oxidative stress and its hypertrophy, animals were treated with an angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEi). Also the autonomic control was analyzed by the spectral analysis of systolic arterial pressure and heart rate series. Besides, non-linear characteristics present in hypertension and the ACEi treatment effect were also evaluated by an irreversibility test developed to detect non-linear dynamics independently of their temporal scale. The first study (article 1) aimed at developing a new method for analysis of statistical irreversibility (SI) which was able to detect the presence of non linear dynamic including those that were slower than the ones observed by traditional methods. The new technique, called multiple bi-dimensional irreversibility (MBI), was validated and showed to be useful when applied to physiological series, presenting an increased non linear pattern increased in situations with sympathetic predominance. This new method was also applied to time series of heart rate in situations of sympathetic activation (article 2). After the demonstration of an association between irreversibility and sympathetic modulation in a physiological condition, the method was applied to a pathological situation, in SHR. SHR data showed that there was an increase of SI. Furthermore, the non-linear mechanism wrapped in this pathology has slower action, which can be detected only with the use of multidimensional techniques, as MBI. Besides, the ACEi treatment resulted in a reduction of the sympathetic modulation and restored the irreversibility pattern to those similar to control. Finally, the third study (article 3) evaluates the effect of ACEi on the cardiac hypertrophy, oxidative stress and autonomic control in no anti-hypertensive doses. The results demonstrated a cardiac hypertrophy and cardiac oxidative stress reduction, with no alteration of blood pressure. In spite of producing no alteration in the sympathetic vascular modulation or no action in the baroreflex sensibility, the low dose of ACEi treatment improved the autonomic balance, in favour of vagal modulation. Such results can indicate a central action to re-establishing the cardiovascular balance, preceding to the pressure alterations. Thus, the present study may help to the new strategies development to treat and, mainly, to prevent the establishment of hypertension and of heart failure.

A hemostasia envolve diversos eventos fisiológicos desencadeados após a ruptura da integridade vascular. Durante estes processos, os glicosaminoglicanos, incluindo a heparina e o heparan sulfato, desempenham funções fisiológicas fundamentais. Particularmente a heparina, isolada no início do século XX, permanece até os dias atuais como um dos mais eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. As cadeias polissacarídicas destes glicosaminoglicanos são clivadas por liases, denominadas heparinases, através de um mecanismo de eliminação. As heparinases, identificadas inicialmente na bactéria do solo Flavobacterium heparinum (sinonímia: Pedobacter heparinus), diferem em tamanho, carga e grau de especificidade pela sequência dissacarídica do substrato. Possuem importantes aplicações na terapêutica, diagnóstico e também na produção de heparinas de baixo peso molecular (HBPM). Dentre as heparinases já descritas para F. heparinum a enzima do tipo II é a menos específica, sendo capaz de clivar ligações glicosídicas do tipo 1-4 entre a glicosamina e ácido urônico (idurônico ou glicurônico), presentes na heparina e no heparan sulfato. Entretanto, o processo de reconhecimento enzima-substrato neste sistema é ainda pouco conhecido. Particularmente com relação à dependência por metais, esta enzima tem sua atividade inibida pela presença do íon cálcio que, em contrapartida, é importante para a atividade das heparinases dos tipos I e III. A heparinase II é uma glicoproteína e apresenta um sítio de ligação ao íon zinco, o qual exerce uma importante função de manutenção da integridade da estrutura protéica. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo a caracterização estrutural e conformacional da enzima heparinase II e, a partir destas informações, subsidiar o entendimento do reconhecimento e especificidade da interação enzima-substrato, fundamentando um planejamento racional de novos ligantes. Empregando-se a Dinâmica Molecular (MD), quatro sistemas envolvendo a enzima foram estudados, considerando-se a presença ou ausência de íons Ca+² e Zn+² e da estrutura de glicosilação. Os dados obtidos indicam que a presença do íon Zn+² pode estar envolvida no controle da flexibilidade da estrutura protéica em regiões específicas da heparinase II. Em contrapartida, a presença do íon Ca+² promove um acréscimo significativo na flexibilidade em regiões equivalentes àquelas do Zn+², relacionada à influência do íon no sítio catalítico da enzima. Adicionalmente, a presença da O-glicosilação parece ser capaz de promover uma estabilização adicional da estrutura secundária da proteína, sugerindo um papel na estabilidade conformacional da mesma. Globalmente, os resultados indicam que simulações de MD podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação de glicoproteínas como a heparinase II, permitindo a caracterização de diversas propriedades, como a quantificação de suas interações com cofatores metálicos e o papel de seu sítio de glicosilação. Cria-se, portanto, uma sólida base para o estudo das demais heparinases, de suas respectivas especificidades e, por fim, para o planejamento racional de novos candidatos a agentes moduladores dos processos hemostáticos. / The hemostasis comprises important physiologic events following the rupture of vascular integrity. During these processes, heparin and heparan sulfate glycosaminoglycans (HSGAG) presents important physiological functions. In particular heparin, isolated in the beginning of the XX century, remains until today as one of the most efficient antithrombotic therapeutic agents. The polysaccharide chains of these HSGAGs are cleaved by lyases, named heparinases, through an elimination mechanism. The heparinases, first identified in the soil bacterium Flavobacterium heparinum (also named Pedobacter heparinus), differ in size, charge and substrate specificity. They have important applications, such as therapeutic, diagnostic and production of low molecular weight heparins (LMWH). Within the heparinases from F. heparinum, the type II enzyme has the broadest substrate specificity, being capable of cleavage upon the (1-4) glycosidic linkages between glucosamine and uronic acid (either glucuronic or iduronic) residues contained by heparin and heparan sulfate. However, the enzyme-substrate recognition process is poorly structurally described. Mainly in relation of the metals dependence, this enzyme has its activity inhibited by the presence of the calcium ion which, in opposite, is important for heparinanses I and III activities. The heparinase II is a glycoprotein and shows a zinc ion binding site, which plays an important role in the protein structure maintenance. Thus, the current work aims to characterize the structure and conformation of heparinase II enzyme and, based on this information, support the understanding of the recognition and specificity of the enzyme-substrate interaction, and further the rational design of new ligands of the enzyme. Using molecular dynamics (MD) calculations, four systems were studied, considering the presence or absence of Ca+² and Zn+² ions and the glycosylation structure. The obtained data indicates that the presence of a Zn+² ion may be involved in the control of the protein flexibility at some specific regions of the heparinase II. In opposite, the Ca+² presence promotes a significant increase of the flexibility on the same regions, related to the influence of this ion in the enzyme active site. Additionally, the O-glycosylation seems to be capable to promote an additional stabilization of the protein secondary structure, what may indicate its role as an element that contributes to the conformational stability of the protein. Altogether the results show that MD simulations can be used to correctly represent the glycoprotein conformations, such as heparinase II, allowing characterizing its properties, as well as quantifying its interactions with metallic cofators and the role of the glycosylation site. Thus, is generated a solid basis to the study of the other heparinases, their respective specificities, and finally to the design of new candidates to hemostatic process modulating agents.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-08-08T15:39:48Z No. of bitstreams: 1 Maria Carolina de Albuquerque Wanderley.pdf: 2883739 bytes, checksum: 94e90bdc40c402108ba400821ee8a88d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-08T15:39:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Carolina de Albuquerque Wanderley.pdf: 2883739 bytes, checksum: 94e90bdc40c402108ba400821ee8a88d (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Collagen specific enzymes are capable of degrading triple helix of the native or denatured collagen. The search for new microbial collagenases has greatly increased over the years. A new strain of Penicillium sp. (UCP 1286) isolated from soil of Caatinga, an exclusively Brazilian biome, was selected for the production of collagenase. The culture medium used had only gelatin as a source of carbon and nitrogen. The collagenolytic activity achieved was about 2.7 times higher than the values reported in the literature, both for volumetric activity (379.79 U/mL) and specific activity (1460.77 U/mg) in a time interval of 126 hours of production. With factorial design application, enzyme production increased 65% compared to the preliminary results, equivalent to 632.70 U/mL of collagenolytic activity. The characterization of the enzyme showed that the optimum pH and temperature were, respectively, 9.0 and 37 °C. Due to the total inhibition by phenylmethylsulfonyl fluoride, the enzyme seems to be classified in the family of serinocollagenases. With regard to specificity, collagenase produced by Penicillium sp. UCP 1286 showed higher activity when used as a substrate azocoll, showing no activity when tested against the azocasein. Comparing the enzyme degradation capacity produced by Penicillium SP. With commercial enzyme produced by Clostridium histolyticum, the first presented more specific to type V collagen and gelatin. The major band observed in electrophoresis corresponded to the molecular weight of 37 kDa, and zimogram confirmed collagenolytic activity. The purification technique via aqueous two-phase system (ATPS) was effective for collagenase produced by Penicillium sp. UCP 1286. The run with better values of yield and partition coefficient were at runs on center point, using PEG 3350 g/mol at 15.0% (w/w) concentration, and phosphate at pH 7.0 and concentration 12.5% (w/w). Results indicate that the enzyme is a promising biotechnological product. / Colagenases são enzimas específicas capazes de degradar a tripla hélice do colágeno nativo ou desnaturado. A busca por novas colagenases microbianas têm aumentado bastante ao longo dos anos. Uma nova cepa de Penicillium sp. (UCP 1286) isolada do solo da Caatinga, um bioma exclusivamente brasileiro, foi selecionada para produção de colagenase. O meio de cultura utilizado foi constituído apenas de gelatina como fonte de carbono e nitrogênio. A atividade colagenolítica obtida foi cerca de 2,7 vezes maior que os valores descritos na literatura, tanto para a atividade volumétrica (379,79 U/mL) quanto específica (1.460,77 U/mg), no intervalo de tempo de 126 h de produção. A partir da aplicação de planejamento fatorial, produção da enzima aumentou 65% em comparação aos resultados preliminares obtidos, sendo equivalente a 632,70 U/mL de atividade colagenolítica. A caracterização da enzima mostrou que o pH ótimo foi 9,0 e a temperatura ótima, 37 °C. Considerando a inibição total pelo fenilmetilsulfonil fluoreto, a enzima parece estar classificada na família das serinocolagenases. Com relação à especificidade, a colagenase produzida por Penicillium sp. UCP 1286 apresentou maior atividade quando utilizado o azocoll como substrato, não apresentando atividade relevante quando testada frente à azocaseína. Comparando a capacidade de degradação da enzima produzida por Penicillium sp. com a enzima comercial de Clostridium histolyticum, observou-se que apresentou maior especificidade para o colágeno tipo V e gelatina, e a principal banda observada através de eletroforese correspondeu ao peso molecular de 37 kDa e o zimograma confirmou atividade colagenolítica. A purificação por Sistema Duas Fases Aquosas (SDFA) foi eficiente para a colagenase produzida por Penicillium sp. UCP 1286. Sendo os maiores valores de rendimento e coeficiente de partição obtidos no planejamento fatorial [PEG 3350 g/mol a 15% (m/m) de concentração, e fosfato com pH 7 e concentração 12,5% (m/m)]. Os resultados sugerem que a enzima produzida apresenta-se como um produto biotecnológico promissor com aplicabilidade na área da saúde.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5100_1.pdf: 1414667 bytes, checksum: adaa042e8a901926ad1151535e3a2641 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Uma sulfatase (EC 3.1.6.1.), heparina específica, foi identificada no fígado do molusco Aplysia cervina, largamente encontrado na costa nordestina do Brasil. Esta enzima foi purificada por precipitações sucessivas com sulfato de amônio e acetona e por cromatografia de afinidade em Heparina-Sepharose CL-6B. Algumas das propriedades físico-químicas e cinéticas desta preparação purificada 89,7 vezes (rendimento de 5,37%) foram investigadas usando o p-nitrofenil sulfato (pNFS) como substrato. Seus valores ótimos de pH e temperatura foram 5,0 e 45oC, respectivamente. Ela reteve mais de 90% de sua atividade quando incubada por 15 minutos a 45ºC enquanto que perdeu 60% a 55ºC. Seu Km foi igual a 3,71 ± 0,41 mM. Sua atividade foi estimulada por MgCl2, CaCl2 e FeCl2 e inibida por Na2S2O3, Na2SO4, KCl, C6H5Na3O7 (citrato de sódio), HgCl2, Na2HPO4 e NaH2PO4. Heparina de baixa massa molecular competiu com o pNFS pelo centro ativo da enzima mais do que a de massa molecular elevada. Esta enzima foi covalentemente imobilizada ao Dacron e a uma rede semi-interpenetrada de polisiloxano e álcool polivinílico (POS/PVA), ambos magnetizados, resultando em derivados com atividade específica e retenção de 3,17 unidades/mg proteína, 1,85 unidades/mg proteína, 36,5% e 21,23%, respectivamente. Estas preparações foram removidas facilmente da mistura de reação por um campo magnético e foram reutilizadas diversas vezes sem perda de suas atividades. Elas foram mais termoresistentes do que a enzima solúvel e apresentaram o mesmo pH ótimo, temperatura ótima e Km aparente. O derivado sintetizado com o Dacron ferromagnético apresentou uma vida útil mais elevada do que aquele em POS/PVA. O MgCl2, CaCl2 e EDTA ativaram ambos os derivados de sulfatase insolúveis em água enquanto que Na2HPO4 e NaH2PO4 e a heparina inibiram. A ação pelos outros íons variou de acordo com o suporte

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5224_1.pdf: 78152 bytes, checksum: 35e604885e46a0bb1e9890920f4ef797 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A enzima que degrada (IDE) é uma proteína intracelular que degrada insulina e outros peptídeos e hormônios. A degradação da insulina é um processo importante tanto para o controle das respostas celulares ao hormônio como para a interação da insulina com seus tecidos-alvo. Muitas funções celulares estão relacionadas com a IDE em adição à degradação, incluindo funções regulatórias e de ligação. A IDE é regulada em situações de proliferação celular e apoptose, mostrando um aumento ou diminuição em sua quantidade e atividade respectivamente nessas condições. Foi demonstrado que a atividade do proteassoma é requerida para que as células cancerígenas sobrevivam e que o consumo de vegetais e frutas está associado à diminuição do risco de câncer. As catecinas (polifenóis solúveis em água) presentes em muitos alimentos, incluindo chá verde, guaraná, frutas e vegetais, apresentam efeitos inibitórios sobre a atividade do proteassoma e induzem apoptose em células tumorais. O presente trabalho avaliou o efeito do extrato aquoso do chá verde e do guaraná (GTE e GE) e das catecinas puras encontradas nesses extratos, a epigalocatecina-3-galato (EGCG), a (-) epicatecina e a (+) catecina, sobre a atividade da IDE "in vitro". Frações citosólicas de homogenizados de próstatas de rato foram incubadas com 125I-insulina na presença de GTE: 87.5 a 70 μg/ML, GE: 175 a 1400 μg /ML e EGCG: 50 a 300 μg /ML.Os resultados mostraram que o GTE e o GE são capazes de inibir a atividade da IDE e que esse efeito foi mimetizado somente pela EGCG. A presença de um grupo galato na epigalocatecina-3- galato parece ser importante para seu efeito inibitório na degradação da insulina, sugerindo uma relação estrutura-atividade nesse efeito inibitório. O efeito inibitório do extrato de guaraná pode ser devido à presença dos taninos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4875_1.pdf: 358311 bytes, checksum: cfada42988282675ba62ef4d948688d0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Uma enzima do tipo tripsina foi parcialmente purificada do intestino e cecos pilóricos do saramunete (Pseudupeneus maculatus). Para isto foi utilizado um método simples de quatro etapas (tratamento térmico, precipitação por sulfato de amônio, diálise e cromatografia em gel de filtração Sephadex G-75). As enzimas do intestino e cecos pilóricos tiveram os coeficientes de purificação de 96 vezes e 57.7 vezes purificadas, respectivamente, de acordo com esses procedimentos, e os rendimentos foram de 68.1% e 26.1%, respectivamente. As proteínas coletadas da cromatografia em gel de filtração Sephadex G-75 apresentaram uma única banda em SDS-PAGE, com um peso molecular de 24.5 kDa e foram hábeis para hidrolisar caseína. Ambas as enzimas apresentaram um pH ótimo idêntico de 9.0 e temperatura ótima de 55oC. Perderam metade de sua atividade quando incubadas nesta temperatura por 30 min. O Km para as enzimas do intestino e dos cecos pilóricos foram 3.23 ± 0.04 mM (n =7) e 1.86 ± 0.26 mM (n = 8), respectivamente. Esta diferença estatisticamente significativa no Km foi a única discrepância entre as enzimas em estudo. Finalmente, essas atividades enzimáticas foram inibidas pelos seguintes íons em ordem decrescente: Al3+>Zn2+>Hg2+=Cu2+> Cd2+. Os efeitos do Ca2+, Mg2+ , Mn2+, Ba2+, K+1, Li+1 e Co2+ foram estatisticamente significantes entre as enzimas do intestino e cecos pilóricos

Dissertação(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2009. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-08-23T22:33:15Z No. of bitstreams: 1 dissertao valcenir j. m. furlan.pdf: 906418 bytes, checksum: 98d6cbdee394d89fec01db81274e7779 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-09-03T18:53:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertao valcenir j. m. furlan.pdf: 906418 bytes, checksum: 98d6cbdee394d89fec01db81274e7779 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-03T18:53:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertao valcenir j. m. furlan.pdf: 906418 bytes, checksum: 98d6cbdee394d89fec01db81274e7779 (MD5) Previous issue date: 2009 / As atuais políticas ambientais buscam redução no consumo energético e no despejo de resíduos ao meio ambiente, através do desenvolvimento de alternativas ligadas a fontes renováveis. O aproveitamento de resíduos agroindustriais como a palha e a casca de arroz para geração de energia, apresentam elevado potencial, visto que são constituídos principalmente de carboidratos polimerizados, os quais podem ser utilizados como matéria-prima para a produção de bioetanol, já que na forma macromolecular não são assimiláveis nos processos fermentativos. O presente trabalho teve como objetivo estudar a produção de bioetanol utilizando palha e casca de arroz através de hidrólise ácida e enzimática seguida de fermentação. Na sacarificação ácida das matérias-primas foram avaliados o efeito da temperatura de reação (72 a 128ºC) e concentração de substrato (0,2 a 5,8%, p/v) na conversão de açúcares indiretamente para diretamente fermentescíveis utilizando como agente catalisador H2SO4 (72%, p/p), empregando um planejamento composto central ortogonal, sendo os maiores valores de açúcares redutores (AR) registrados no primeiro minuto de reação. Quando houve aumento da temperatura, verificou-se um efeito significativo (p=0,05) e negativo sobre a concentração de AR, tanto para a palha como para a casca de arroz. O máximo rendimento em AR (55,12%) foi obtido através da sacarificação da palha de arroz na concentração 3% (p/v) a 72°C. Na hidrólise enzimática estudou-se o efeito da temperatura, concentração de enzima e substrato na conversão de açúcares, após pré-tratamento para deslignificação da palha e casca de arroz. Os hidrolisados foram obtidos utilizando as enzimas comerciais celulase NS 50013 e -glucosidase NS 50010 (10:1), com agitação 150 min-1, pH 4,8 durante 48 h. Através da análise estatística observou-se que a concentração de enzima foi a variável que apresentou maior influência na formação de AR para ambas as matérias-primas. A máxima sacarificação alcançada foi através da hidrólise enzimática (79,90% de AR) da palha de arroz após 48 h de reação a 41,6°C. A fermentação do hidrolisado enzimático contendo 130 g/L de açúcares foi realizada em condições anaeróbias produzindo 23,3 g/L de etanol correspondendo a 0,41 g/g de conversão. Estes resultados indicam a potencialidade da palha de arroz para a utilização em processos biotecnológicos como para produção de bioetanol. / Current environmental politics look for energy consumption reduction and residues discard in environment, through development of renewable alternatives sources. The use of agroindustrial wastes as hulls and straw rice for energy generation show high potential because they are constituted mainly of polymerized carbohydrates, which can be used as raw material for the bioethanol production, since previously hydrolysates, because in the macromolecular form aren’t assimilable in fermentation processes. The present work had as objective to study the ethanol production from hulls and straw rice through acid and enzymatic hydrolysis followed by fermentation. In the acid saccharification of the raw materials were evaluated the effect of reaction temperature (72 and 128ºC) and substrate concentration (0.2 to 5.8%, w/v) on conversion of sugars indirectly for directly fermentable with catalytic agent H2SO4 (72%, w/w) using central composite rotatable design and the largest AR values recorded in the first minute reaction. When the temperature increased, a significant (p=0.05) and negative effect was verified on AR concentration, so much hulls as straw rice. The maximum AR (55.12%) was obtained from the saccharification straw rice on the concentration 3% (w/v) at 72°C. In the enzymatic saccharification was studied the effect of temperature, enzyme concentration and substrate concentration on conversion sugars, after pretreatment for delignification of hulls and straw rice. The hydrolysates were obtained using commercial enzymes Cellulase NS 50013 and b-glucosidase NS 50010 (10:1), with stirring 150 min-1, pH 4.8 for 48 h. Through the statistical analysis was observed that enzyme concentration was the variable that showed larger influence in the AR production in both raw materials. The maximum saccharification achieved was by straw rice through enzymatic hydrolysis (79.90% AR) of straw rice after 48 h reaction at 41.6°C. The fermentation of enzymatic hydrolysates containing 130 g/L sugars was accomplished in anaerobic conditions producing 23.3 ethanol g/L corresponding conversion of 0.41 g/g. These results indicate the potentiality of straw rice for use in processes biotechnological as bioethanol production.

A identificação de compostos bioativos que atuem em proteínas é imprescindível no conceito atual da Química Medicinal. Quase todos os processos biossintéticos dos organismos vivos são regulados por enzimas. Dentro deste contexto a enzima glicossomal Gliceraldeído-3-Fosfato desidrogenase (GAPDH) do Tripanosoma cruzi (agente etiológico causador da Doença de Chagas) tem-se mostrado um alvo promissor para o planejamento de inibidores contra o parasito. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é uma ferramenta robusta na identificação e otimização de compostos bioativos. Através da ITC podem-se determinar parâmetros cinéticos da atividade enzimática (kcat, KM e Ki) e parâmetros termodinâmicos de interação (DH, DG e DS) entre o alvo biomacromolecular e o composto bioativo. Neste trabalho desenvolveu-se um protocolo de ensaio cinético para a enzima GAPDH através da ITC, visando à identificação de novos compostos tripanossomicidas. A atividade da enzima foi avaliada na presença de diferentes concentrações (0 a 10 % v/v) de dois solventes orgânicos padrões (dimetilsulfóxido e metanol). Esses solventes são utilizados em bioensaios e também para aumentar a solubilidade de substâncias em água. A concentração de 5 % v/v de ambos solventes orgânicos foi determinada como aquela em que a GAPDH manteve-se estável. Houve um aumento significativo da atividade enzimática em relação aos experimentos sem uso de co-solventes. Através do ensaio padronizado foram testados os seguintes compostos frente à GAPDH: ácido 4-butilfenil-amino-metileno-fosfônico, mangiferina, quercetina-3-O- B-L-arabinopiranosídeo, caempferol-3-O-alfa-D-(6-O-p-coumaroyl) glucosídeo e marcianina. As constantes de inibição (Ki) dessas substâncias apresentam-se no intervalo de 20,1 (±1,70) a 27,3 (±2,47) mM. Uma nova classe de pequenas moléculas de origem em produtos naturais e denominada xantonas foi identificada com potencial atividade tripanossomicida. / The identification of new bioactive chemical samples that act on proteins is essential in modern Medicinal Chemistry. Enzymes regulate almost all-biosinthetic processes in the life of an organism. The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas´ disease. Its glycosomal Glyceldehide-3-Phosphate Dehydrogenase enzyme (GAPDH) is regarded as a promising target for the structure-based discovery and development of new antiparasitic drugs. The Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful tool in the discovery and optimization of new bioactive substances. The use of ultrasensitive calorimetry for the life sciences via isothermal titration calorimetry provides a new paradigm in the drug discovery area. It greatly improves the chances of producing a probe molecule that binds to the target enzyme. Kinetics (kcat, KM and Ki) and thermodynamics parameters (DH, DG and DS) can be determined by measuring the interactions between the target enzyme and bioactive chemical substances. In this work, a protocol for a kinetic enzyme assay was developed to study the activity of T. cruzi GAPDH using ITC. The enzyme activity in the presence of different standard co-solvent concentrations (0-10 % v/v), used in bioassays, was evaluated. The concentration of 5 % v/v for both co-solvents was chosen for standardized condition. This was elected so due to a great increase in the enzyme activity when compared to the experiments with no co-solvent added. Using the standardized enzyme assay protocol the following chemical substances were tested against the T. cruzi GAPDH: 4-butylfenyl-amine-methylenephosphonic acid, quercetin-3-O-B-L-arabinopyranoside, mangiferin, kaempferol-3-O- alfa-D-(6-O-p-coumaroyl) glucoside and martianine. The inhibition constants (Ki) were measured for these substances and their values are in the range of 20,1 (±1,7 ) and 27,3 (±2,5) mM. A natural product molecular class named xantone was identified as a new potential trypanocide agent.

As enzimas são incorporadas aos alimentos das aves, com o propósito de melhorar o desempenho destas e, com isso, a rentabilidade do setor avícola. O uso de fitase em rações avícolas é uma prática aceita mundialmente em diversas realidades deste setor produtivo, sendo uma das enzimas mais estudadas na nutrição animal. Ela degrada as moléculas de ácido fítico e fitato. A hidrólise do fitato não é responsável somente pela liberação de fósforo, mas também de minerais e proteínas, que podem estar associadas aos íons fosfato. O uso desta enzima permite diminuir a quantidade de certas substâncias adicionadas às rações, o que pode reduzir custos de produção e melhorar resultados zootécnicos. Pesquisas sobre o uso de fitase foram desenvolvidas com frangos de corte e poedeiras. Entretanto, não se encontram dados na literatura a respeito do uso de fitase na dieta de codornas. Objetivou-se avaliar os efeitos do fornecimento de rações com níveis diferentes de fósforo e fitase, sobre o desempenho das codornas e a qualidade dos ovos, durante 84 dias, com 320 aves de 35 semanas de idade. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, com 4 níveis de fósforo disponível (0,106; 0,210; 0,315; 0,385%) e 2 níveis de fitase (0 e 600FTU), totalizando 8 tratamentos com 5 repetições. Os resultados mostraram que os níveis de fósforo e o uso da fitase não influenciaram no consumo de ração, na conversão alimentar por dúzia de ovos e no peso dos componentes dos ovos (albúmen, gema e casca). Já para a produção de ovos e produção de ovos comercializáveis por dia por ave, houve interação fósforo x fitase, demonstrando uma tendência ao efeito linear, sendo que o melhor desempenho foi com o nível de 0,385% fósforo disponível sem adição de fitase. Para o peso e a massa dos ovos a interação também apresentou efeito, porém de desvio da quadrática, e os melhores resultados foram observados com o nível de 0,210% fósforo disponível sem adição de fitase. Para gravidade específica o melhor resultado foi observado com a adição de fitase e 0,106% fósforo disponível, mostrando um efeito de desvio da quadrática para a interação fósforo x fitase. Resultados significativos para a porcentagem de casca, um efeito linear para a interação fósforo x fitase com a maior porcentagem observada com o nível de 0,385% fósforo disponível sem adição de fitase e para a porcentagem de gema um efeito de desvio da quadrática para os níveis de fósforo, com a maior porcentagem observada com o nível de 0,315% fósforo disponível. Pode-se concluir que a suplementação de 600FTU é eficaz na qualidade da casca dos ovos, em dietas com 0,106% de fósforo disponível. Os níveis de fósforo disponível podem ser reduzidos para 0,106% sem alterar o consumo de ração, a conversão alimentar, o peso dos componentes dos ovos e a porcentagem de albúmen. Para a massa e o peso dos ovos o nível ideal de fósforo disponível na dieta é 0,210% e para a porcentagem de gema e de casca o nível ideal é de 0,385% de fósforo disponível. / The enzymes are incorporated into foods from poultry, in order to improve their performance and thereby the profitability of the poultry sector. The use of phytase in poultry rations is an accepted practice worldwide in diverse realities of this sector, being one of the most studied enzymes in animal nutrition. It degrades the molecules of phytic acid and phytate. Hydrolysis of phytate is responsible not only for the release of phosphorus, but also minerals and proteins that may be associated with the phosphate ions. The use of this enzyme can reduce the amount of certain substances added to the rations, which can reduce production costs and improve outcomes husbandry. Research on the use of phytase were developed with broilers and layers. However, there are no published data regarding the use of phytase in the diet of quails. The objective was to evaluate the effects of feeding with different levels of phosphorus and phytase on performance and quality of quail eggs for 84 days, with 320 birds of 35 weeks of age. We used a completely randomized design with four levels of available phosphorus (0.106, 0.210, 0.315, 0.385%) and two phytase levels (0 and 600FTU), totalizing eight treatments with five replications. The results showed that phosphorus levels and the use of phytase did not influence the feed intake, feed conversion per dozen eggs and weight of egg components (albumen, yolk and shell). As for egg production and commercial egg production per day per bird, phosphorus x phytase interaction was observed, demonstrating a tendency to linearly, with the best performance was with the level of 0.385% available phosphorus with no added phytase. For the weight and egg mass also showed the interaction effect, but the deviation from quadratic, and the best results were observed at the level of 0.210% available phosphorus with no added phytase. Specific gravity for the best result was observed with the addition of phytase and available phosphorus 0.106%, showing an effect of the quadratic deviation for phosphorus x phytase interaction. Significant results for the percentage of shell, a linear effect for phosphorus x phytase interaction with the highest percentage observed at the level of 0.385% available phosphorus with no added phytase and the yolk percentage deviation from a quadratic effect on the levels of phosphorus, with the highest percentage observed at the level of 0.315% available phosphorus. It can be concluded that supplementation of 600FTU is effective as the egg shell in diets with 0,106% available phosphorus. The available phosphorus levels can be reduced to 0.106% without changing feed intake, feed conversion, weight of egg components and the percentage of albumen. For mass and weight of eggs to an optimal level of available phosphorus in the diet is 0.210% and the percentage of yolk and shell is the ideal level of 0.385% available phosphorus.