Xylella fastidiosa é uma bactéria patogênica encontrada em várias plantas. Esta bactéria secreta proteases extracelulares detectadas em gel de eletroforese, sendo a gelatina usada como substrato co-polimerizado. Três principais bandas protéicas foram detectadas com massa molar (MM) de 122, 84 e 65 kDa produzidas pelo isolado de citros (X0) e duas bandas de aproximadamente 84 e 65 kDa de isolado de videira (9713). Estas bactérias produziram zonas de hidrólise em meio sólido contendo gelatina, caseína e hemoglobina. Os resultados usando a gelatina como substrato foram os melhores para a atividade das proteases. A atividade enzimática das proteases de X. fastidiosa de citros e videira foi completamente inibida por PMSF e parcialmente inibida por EDTA, podendo ser visualizado em gel de eletroforese nativo. A temperatura ótima de atividade protéica foi de 30oC e o pH ótimo de 7,0. Além das proteases secretadas por este fitopatógeno, quitinase e β-1,3-glucanase foram também detectadas no sobrenadante das culturas. Os resultados sugeriram que estas proteases produzidas pela X. fastidiosa de citros e videira pertencem ao grupo das serina e metalo proteases. / Xylella fastidiosa is a pathogenic bacterium found in several plants. These bacteria secrete extracellular proteases into the culture broth as visualized in sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide activity gels containing gelatin as a co-polymerized substrate. Three major protein bands were produced by strain X0 (citrus) with molar masses (MM) of 122, 84 and 65 kDa. Grape strain 9713 produced two bands of approximately 84 and 64 kDa. These organisms produced zones of hydrolysis in agar plates amended with gelatin, casein and hemoglobin. Gelatin was the best substrate for these proteases. SDS-PAGE activity gel indicated that the protease activities of X. fastidiosa from citrus and grape were completely inhibited by PMSF and partially inhibited by EDTA. The optimal temperature for protease activity was 30oC with an optimal pH of 7.0. Among the proteolytic enzymes secreted by the phytopathogen, chitinase and β-1,3-glucanase activities were also detected in cultures of X. fastidiosa (citrus). From these results, it is suggested that these proteases produced by strains of X. fastidiosa from citrus and grape, belong to the serine- and metallo-protease group.

A maceração do milho é uma das etapas mais importantes para seu processamento através da moagem por via úmida. Consiste em uma série de processos que envolvem fermentação e hidrólise química de forma a permitir a separação adequada de seus componentes. Trata-se de uma etapa demorada que requer alto investimento em tanques e utilidades. No presente trabalho buscou-se avaliar o uso de enzimas para auxiliar na redução do tempo de maceração de milho dentado, em escala laboratorial, produzido na região do triângulo mineiro. Para tal, os grãos foram submetidos a diferentes tratamentos com as enzimas xilanase e protease. A ação enzimática foi comparada a padrões de maceração convencionais. Os resultados obtidos mostraram que o uso de enzima permite diminuir o tempo de maceração em torno de 18 horas assim como reduzir a quantidade de SO2 adicionada ao processo de maceração. / Corn steeping is one of the most important stage in the corn wet milling process. It consists of several processes involving fermentation and chemical hidrolysis to enable separation of different fractions of the grain. This process is time and capital investment intense. In the present work it was studied the use of enzymes to reduce the steeping time for dent corn, produced in the southeast of Brazil, in laboratory scale. The evaluated enzymes were xilanase and protease. The enzyme performance was compared with the regular steeping process. The final result has shown that the use of enzymes enabled to reduce steeping time in 18 hours as weel as the amount of added SO2 in the steeping process.

A identificação de compostos bioativos que atuem em proteínas é imprescindível no conceito atual da Química Medicinal. Quase todos os processos biossintéticos dos organismos vivos são regulados por enzimas. Dentro deste contexto a enzima glicossomal Gliceraldeído-3-Fosfato desidrogenase (GAPDH) do Tripanosoma cruzi (agente etiológico causador da Doença de Chagas) tem-se mostrado um alvo promissor para o planejamento de inibidores contra o parasito. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é uma ferramenta robusta na identificação e otimização de compostos bioativos. Através da ITC podem-se determinar parâmetros cinéticos da atividade enzimática (kcat, KM e Ki) e parâmetros termodinâmicos de interação (DH, DG e DS) entre o alvo biomacromolecular e o composto bioativo. Neste trabalho desenvolveu-se um protocolo de ensaio cinético para a enzima GAPDH através da ITC, visando à identificação de novos compostos tripanossomicidas. A atividade da enzima foi avaliada na presença de diferentes concentrações (0 a 10 % v/v) de dois solventes orgânicos padrões (dimetilsulfóxido e metanol). Esses solventes são utilizados em bioensaios e também para aumentar a solubilidade de substâncias em água. A concentração de 5 % v/v de ambos solventes orgânicos foi determinada como aquela em que a GAPDH manteve-se estável. Houve um aumento significativo da atividade enzimática em relação aos experimentos sem uso de co-solventes. Através do ensaio padronizado foram testados os seguintes compostos frente à GAPDH: ácido 4-butilfenil-amino-metileno-fosfônico, mangiferina, quercetina-3-O- B-L-arabinopiranosídeo, caempferol-3-O-alfa-D-(6-O-p-coumaroyl) glucosídeo e marcianina. As constantes de inibição (Ki) dessas substâncias apresentam-se no intervalo de 20,1 (±1,70) a 27,3 (±2,47) mM. Uma nova classe de pequenas moléculas de origem em produtos naturais e denominada xantonas foi identificada com potencial atividade tripanossomicida. / The identification of new bioactive chemical samples that act on proteins is essential in modern Medicinal Chemistry. Enzymes regulate almost all-biosinthetic processes in the life of an organism. The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas´ disease. Its glycosomal Glyceldehide-3-Phosphate Dehydrogenase enzyme (GAPDH) is regarded as a promising target for the structure-based discovery and development of new antiparasitic drugs. The Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful tool in the discovery and optimization of new bioactive substances. The use of ultrasensitive calorimetry for the life sciences via isothermal titration calorimetry provides a new paradigm in the drug discovery area. It greatly improves the chances of producing a probe molecule that binds to the target enzyme. Kinetics (kcat, KM and Ki) and thermodynamics parameters (DH, DG and DS) can be determined by measuring the interactions between the target enzyme and bioactive chemical substances. In this work, a protocol for a kinetic enzyme assay was developed to study the activity of T. cruzi GAPDH using ITC. The enzyme activity in the presence of different standard co-solvent concentrations (0-10 % v/v), used in bioassays, was evaluated. The concentration of 5 % v/v for both co-solvents was chosen for standardized condition. This was elected so due to a great increase in the enzyme activity when compared to the experiments with no co-solvent added. Using the standardized enzyme assay protocol the following chemical substances were tested against the T. cruzi GAPDH: 4-butylfenyl-amine-methylenephosphonic acid, quercetin-3-O-B-L-arabinopyranoside, mangiferin, kaempferol-3-O- alfa-D-(6-O-p-coumaroyl) glucoside and martianine. The inhibition constants (Ki) were measured for these substances and their values are in the range of 20,1 (±1,7 ) and 27,3 (±2,5) mM. A natural product molecular class named xantone was identified as a new potential trypanocide agent.

A beta-glicosidase digestiva (Mr 50.000) de Spodoptera frugiperda (Sfgli50) possui em seu sítio ativo resíduos de aminoácido que interagem de forma não-covalente com o substrato. Essas interações não-covalentes garantem a especificidade da enzima em relação a seus substratos. Esse trabalho visa estudar o papel desses aminoácidos e suas interações com o substrato na especificidade da Sfgli50. Para isso, um modelo de previsão de especificidade baseado nas energias de interação entre diferentes resíduos de aminoácidos das posições 451 e 39 da Sfgli50 e as hidroxilas 4 e 6 do glicone do substrato foi elaborado e testado através da produção e caracterização de três duplos-mutantes (S451N39, S451E39 e A451E39) da Sfgli50. O modelo mostrou-se apropriado qualitativamente para previsão do comportamento da especificidade frente a glucosídeos e galactosídeos, mas totalmente inadequado para previsões de preferência frente a fucosídeos e galactosídeos. Estas conclusões indicaram que pressupostos iniciais do modelo, como independência das interações com o substrato e conservação estrutural do sítio ativo nos mutantes, estavam errados. Analisou-se também a contribuição de outros dois resíduos do subsítio do glicone para a especificidade da Sfgli50: H142 e N186, cujas energias de interação ainda não haviam sido determinadas. Experimentos de mutação sítio-dirigida foram realizados para introduzir resíduos de Alanina nas posições 142 e 186. Os mutantes H142A e N186A foram expressos em bactéria e em seguida parcialmente purificados. O mutante N186A apresentou baixa atividade catalítica, o que limitou sua caracterização. Por outro lado, a determinação de parâmetros cinéticos (Vmáx e Vmáx/Km) mostrou que, em contraste com a Sfgli50 selvagem, o mutante H142A é menos específico, principalmente no que diz respeito a fucosídeos. / The Mr 50,000 Spodoptera frugiperda beta-glycosidase (Sfgli50) has active site amino acid residues that interact non-covalently with the substrate. These non-covalent interactions determine the enzyme’s specificity towards its substrates. This work aims to study the role of these amino acids and its interactions with the substrate in the specificity of Sfgli50. A specificity prediction model was created for such purpose. This model is based on interaction energies between different amino acid residues in positions 451 and 39 of the enzyme and hydroxyls 4 and 6 of the substrate\'s glycone. The production and characterization of three double-mutants (S451N39, S451E39 and A451E39) were used to test the model, which proved to be qualitatively appropriate to predict the Sfgli50 specificity when comparing glucosides to galactosides. However, the model failed to predict the differences in specificity between fucosides and galactosides. These results indicate that the model\'s assumptions of independent interactions with the substrate and structural conservation of the active site in the mutants were wrong. Sfgli50 glycone residues H142 and N186, whose interaction energies had not been previously determined, were also investigated. Site-directed mutagenesis replaced the former residues in positions 142 and 186 for Alanine. The mutant proteins H142A and N186A were synthesized in bacteria and partially purified. Mutant N186A presented low catalytic activity, hindering its characterization. In contrast, mutant H142A is less specific than the wild-type Sfgli50. Kinetic parameters indicated that it is specially less specific to fucosides.

O presente trabalho teve como objetivo a purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase pela tecnologia de extração líquido-líquido em Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Estes sistemas são constituídos por soluções de tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, o que possibilita seletividade na partição da enzima de acordo com sua hidrofobicidade e proporciona um ambiente ameno às biomoléculas. Foram estudados alguns dos fatores que influenciam a partição da G6PD, como: tipo e concentração de diferentes agentes tensoativos não-iônicos (C10E4 e Triton X-114), temperatura e adição de ligantes de afinidade (cibacron blue e procion red) e o efeito da adição dos sais sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e sulfato de sódio (Na2SO4). Estudou-se ainda a síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Em todos os ensaios a enzima foi recuperada preferencialmente na fase diluída, pobre em micelas, tanto em sistema Triton X-114/tampão como para C10E4/tampão, no qual existe maior volume disponível, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1. A utilização dos ligantes de afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos proporcionou um pequeno aumento nos valores de KG6PD da enzima, porém com valores inferiores a 1. Os sistemas Triton X-114/Sal não influenciaram a partição da enzima para a fase micelar, apesar da existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases destes sistemas. O efeito desempenhado pelo volume de exclusão foi dominante em todos os sistemas estudados e, portanto, a enzima foi predominantemente excluída para a fase aquosa, pobre em micelas. A tecnologia por SMDFA para a purificação do homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae demonstrou ser eficiente em recuperar a biomolécula alvo na fase aquosa, pobre em micelas, permitindo separar da presença de biomoléculas ou mesmo de contaminantes com caráter hidrofóbico. Dessa forma, o SMDFA pode ser empregado como uma possível etapa de purificação num processo biotecnológico. / In this work, the use of two-phase micellar system was studied aiming at the purification of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Usually, these systems are constituted of micellar surfactants solutions and offer both hydrophobic and hydrophilic environments, providing selectivity to the enzyme partitioning according to its hydrophobicity. Some of the factors influencing the G6PD partition in micellar systems were studied, such as: type and concentration of nonionic surfactant agents (C10E4 and Triton X-114), temperature, addition of affinity ligands (Cibacron Blue and Procion Red) and the addition of the salts ammonium sulfate ((NH4)2SO4) and sodium sulfate (Na2SO4). The synthesis of the affinity surfactant TX-114-Blue was also studied. In all the assays the experiments, G6PD partitioned preferentialy to dilute, micelle-poor phase, in which there is a higher volume available for the enzyme to be, resulting in KG6PD values lower than 1. The use of affinity ligands in G6PD partitioning in both C10E4 and Triton X-114 systems provided some increase in the KG6PD, however with values still lower than 1. Employing a methodology previously described in the literature with some alterations, it was not possible to obtain the affinity surfactant TX-114-Blue. The systems Triton X-114/salt have not shown a significant influence on the enzyme partition to the micelle-rich phase, in spite of the existence of an electrostatic potential difference between the phases of the systems. The excluded-volume effect was dominant in all the systems studied and, therefore, the enzyme predominantly excluded to the dilute, micelle-poor phase. The use of Triton X-114 two-phase aqueous micellar systems to the purification of the Saccharomyces cerevisiae cell homogenate was found to be efficient in the recovery of G6PD in the dilute, micelle-poor phase, partially separating this target molecule from other proteins and contaminants of hydrophobic character. Therefore, aqueous two-phase micellar systems can be considered useful as a possible purification stage in a biotechnology process.

Glucansucrases são enzimas que atuam em reações de síntese de polissacarídeos e oligossacarídeos. Para que esses biocatalisadores sejam aplicados em escala industrial, é desejável ótimas estabilidades térmica e operacional, o que pode ser alcançado com a imobilização de enzimas. Como alternativa aos suportes sólidos amplamente estudados, está a quitosana, polímero que não apresenta toxicidade e possui alta biocompatibilidade e alta afinidade com proteínas. Outra possibilidade promissora na imobilização de enzimas, é a síntese dos agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs), os quais apresentam alta atividade catalítica e alta estabilidade. Contudo, uma peculiaridade das glucansucrases quando produzidas em meio contendo sacarose é a camada de polímero que as envolve, e que bloqueia o acesso aos grupos reativos na superfície da proteína. No caso da expressão heteróloga das glucansucrases em Escherichia coli essa dificuldade pode ser contornada. Além disso, o uso da mutagênese sítio-dirigida pode proporcionar modificações de aminoácidos na superfície da enzima, tais como os resíduos Lys, Cys, His, com o intuito de que melhorias na imobilização sejam alcançadas. Sendo assim, na primeira etapa desse trabalho, uma extensa discussão é apresentada em relação às metodologias de imobilização de dextransucrase encontradas na literatura. A seguir, estudos referentes à imobilização da dextransucrase de Leuconostoc mesenteroides B-512 F em esferas de quitosana ativadas com glutaraldeído foram realizados. Esse imobilizado apresentou alta atividade catalítica (197 U/g) quando utilizada a carga de proteína de 400 mg/g de suporte. Além disso, observou-se que a imobilização covalente e os açúcares maltose e glicose promoveram proteção à enzima em temperaturas de 40 ºC e 50 ºC. Na etapa seguinte, a produção e a caracterização de CLEAs de dextransucrase de L. mesenteroides B-512 F foram investigados. Demonstrou-se que o tratamento com a dextranase foi essencial para a imobilização da glucansucrase e que o isopropanol foi o melhor agente precipitante. Os CLEAs apresentaram pH e temperatura ótimos de 3,0 e 60 ºC, respectivamente, enquanto que a dextransucrase imobilizada nas esferas de quitosana funcionalizada com glutaraldeído apresentaram os valores de 4,5 e 20 ºC. Ambas formas imobilizadas apresentaram boa estabilidade operacional na síntese de oligossacarídeos uma vez que após 10 ciclos, 40 % de atividade residual foi observada. Por fim, estão apresentados estudos sobre a modelagem das estruturas tridimensionais e a mutagênese sítio-dirigida das glucansucrases DSR-S vardel Δ4N and ASR C-APY del. Os modelos preditos demonstraram boa qualidade e a mutagênese sítio-dirigida não promoveu perdas significativas na atividade enzimática dos mutantes. Somente o mutante DSR_S326C mostrouse inativo. Os resultados obtidos sugerem que a imobilização da dextransucrase foi satisfatória e que cada técnica possibilita diferentes características ao imobilizado. Além disso, os imobilizados foram adequados para síntese de dextrana e oligossacarídeos. / Glucansucrases are enzymes that catalyze the synthesis of polysaccharides and oligosaccharides. In order to assure continuous processing and reuse of the biocatalyst in industrial applications, enzyme immobilization techniques are required to promote good thermal and operational stabilities. Among the several solid supports for enzyme immobilization, chitosan shows interesting properties because it is non-toxic, it is biocompatible, and it has high protein affinity. Other possibility is the production of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs), which presents high catalytic activity and good stability. However, glucansucrases have a particularity when produced in sucrose medium, since a polymer layer surrounds the protein, blocking the access to reactive groups on the enzyme surface. To overcome this problem, it is possible to make the heterologous production of glucansucrases in Escherichia coli. Likewise, the site-directed mutagenesis may promote changes in the amino acids located on the surface to improve immobilization parameters. Therefore, this work aimed to discuss the several techniques applied for dextransucrase immobilization, and to design new immobilized biocatalysts. In a first step, it is presented a review about the distinct immobilization methodologies for dextransucrase. In a second study, an investigation about dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides B-512 F immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan particles was carried out. The novel immobilized biocatalyst showed 197 U/g (400 mg/g dried support) of catalytic activity. The covalent immobilization promoted protection against enzyme damages at 40 ºC and 50 ºC, whereas maltose and glucose acted as stabilizers. Furthermore, it was studied the production and characterization of CLEAs dextransucrase from L. mesenteroides B-512 F. It was demonstrated that dextranase treatment was crucial for immobilization. Isopropanol was chosen as the best precipitant agent. CLEAs presented optimal pH and temperature of 3.0 and 60 ºC, respectively, whereas it was found values of 4.5 e 20 ºC for dextransucrase immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan particles. Both immobilized biocatalysts showed good operational stability in the oligosaccharides synthesis, exhibiting 40 % of residual activity after 10 cycles. Finally, the study concerning the homology modeling and site-directed mutagenesis of glucansucrases DSR-S vardel Δ4N and ASR C-APY del is presented. The predicted models showed good quality and it has been demonstrated that the site-directed mutagenesis did not promote significant losses in the variant enzyme activities. Only one mutant (DSR_S326C) had shown no dextransucrase activity. The results obtained in this work suggest that the immobilization of dextransucrase was satisfactory, also showing that each technique promotes different characteristics to the immobilized biocatalyst. Besides, these immobilized enzymes were feasible for the synthesis of dextran and oligosaccharides.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2016-08-17T14:55:11Z No. of bitstreams: 1 DANIELLA FABIOLA DOS SANTOS.pdf: 702349 bytes, checksum: b479d0d411d5a404d1e3f2dba2f21c37 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-17T14:55:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIELLA FABIOLA DOS SANTOS.pdf: 702349 bytes, checksum: b479d0d411d5a404d1e3f2dba2f21c37 (MD5) Previous issue date: 2007-08-01 / Klebsiella pneumoniae is an important ethiological agent of infections in the nosocomial environment and due to indiscriminate use of broad spectrum antimicrobials, especially of third generation cephalosporins; a selective pressure is produced, what favors the growth of strains producing extended spectrum β-lactamases (ESBLS). These enzymes hydrolyse broad spectrum cephalosporins and monobactams, but are inhibited by β-lactamases inhibitors. ESBLs have been identified in other pathogens but are more often found in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. The fails in the detection of ESBL increase the mortality and morbity rates, favors the occurance of multirresistant drug outbreaks and increase the costs to control these microorganisms. The purpose of this study was to evaluate the prevalence, susceptibility to antimicrobial agents and genomic variability of ESBL Klebsiella pneumoniae in the hospital with the highest prevalence of ESBL producing isolates in Goiânia. A total of 61 strains of Klebsiella pneumoniae (89,9%) and 7 of Klebsiella oxytoca (10,1%) were isolated from January 2005 to May 2006 from hospitalized patients in three hospitals in Goiânia. All the isolates were identified and the susceptibility to antimicrobials tested by the authomatized semiquantitative method (MicroScan WalkAway® - Dade Behring, USA). The double-disk diffusion was used to detect the ESBL producing strains; a disk containing amoxicillin/clavulanate was placed as the inhibitor of β-lactamase 20mm from the oxymino-β-lactam. Enhancement of the zone inhibition of the oxymino β-lactam caused by the clavulanate disk was considered as evidence of ESBL production. The chomossomal DNA analysis was performed by Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The prevalence of ESBL producing Klebsiella pneumoniae was high (25%, 28.5% and 66.7% respectively) and the antimicrobial resistance rates were higher among ESBL producing isolates. Only the imipenem showed excellent activity in vitro. The chomossomal DNA analysis showed a great variability among 5 strains (multiclonal) and similarity among 6 strains (clonal) producing ESBL. / Klebsiella pneumoniae é importante agente etiológico de infecções no meio ambiente hospitalar e o uso indiscriminado de antimicrobianos de amplo espectro, principalmente cefalosporinas de terceira geração, produz pressão seletiva que favorece a proliferação de isolados produtores de β-lactamases de espectro ampliado (ESBLS). Estas enzimas hidrolisam cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos, mas são sensíveis aos inibidores de β- lactamases. As ESBLs já foram identificadas em outros patógenos, mas são encontradas principalmente em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli. As falhas na detecção de ESBL aumentam as taxas de morbidade, de mortalidade, favorece a ocorrência de surtos por organismos multirresistentes aos antibióticos e aumentam os custos hospitalares. Os objetivos do estudo foram avaliar a prevalência, o perfil de sensibilidade e a variedade genética de amostras de Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBL no hospital com prevalência elevada de infecções causadas por este microrganismo em Goiânia. Foram avaliadas 61 amostras de Klebsiella pneumoniae (89,9%) e 7 de Klebsiella oxytoca (10,1%) isoladas de janeiro de 2005 a maio de 2006 de pacientes hospitalizados em três hospitais de Goiânia. Todos os isolados foram identificados e testados quanto à suscetibilidade aos antimicrobianos por meio do método automatizado semi-quantitativo (MicroScan WalkAway® - Dade Behring, USA). O teste de difusão dupla em disco foi utilizado para detectar as amostras produtoras de ESBL. Um disco contendo amoxicilina/clavulanato foi usado como inibidor de β-lactamase e posto a 20 mm do oximino-β-lactâmico. O aumento da zona de inibição do oximino-β-lactâmico causado pelo clavulanato evidenciou a produção ESBL. A tipagem das amostras produtoras de ESBL do Hospital C foi realizada pelo método Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). A prevalência de amostras de Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBL foi elevada (25%, 28,5% e 66,7% respectivamente) e as taxas de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos foram maiores entre isolados produtores de ESBL. Somente o imipenem teve atividade ótima in vitro. A análise do DNA cromossomal das cepas mostrou uma variedade genética em 5 amostras (natureza multiclonal) e similaridade entre 6 (natureza clonal) produtoras de ESBL.

O presente trabalho teve como objetivo a purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase pela tecnologia de extração líquido-líquido em Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Estes sistemas são constituídos por soluções de tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, o que possibilita seletividade na partição da enzima de acordo com sua hidrofobicidade e proporciona um ambiente ameno às biomoléculas. Foram estudados alguns dos fatores que influenciam a partição da G6PD, como: tipo e concentração de diferentes agentes tensoativos não-iônicos (C10E4 e Triton X-114), temperatura e adição de ligantes de afinidade (cibacron blue e procion red) e o efeito da adição dos sais sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e sulfato de sódio (Na2SO4). Estudou-se ainda a síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Em todos os ensaios a enzima foi recuperada preferencialmente na fase diluída, pobre em micelas, tanto em sistema Triton X-114/tampão como para C10E4/tampão, no qual existe maior volume disponível, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1. A utilização dos ligantes de afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos proporcionou um pequeno aumento nos valores de KG6PD da enzima, porém com valores inferiores a 1. Os sistemas Triton X-114/Sal não influenciaram a partição da enzima para a fase micelar, apesar da existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases destes sistemas. O efeito desempenhado pelo volume de exclusão foi dominante em todos os sistemas estudados e, portanto, a enzima foi predominantemente excluída para a fase aquosa, pobre em micelas. A tecnologia por SMDFA para a purificação do homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae demonstrou ser eficiente em recuperar a biomolécula alvo na fase aquosa, pobre em micelas, permitindo separar da presença de biomoléculas ou mesmo de contaminantes com caráter hidrofóbico. Dessa forma, o SMDFA pode ser empregado como uma possível etapa de purificação num processo biotecnológico. / In this work, the use of two-phase micellar system was studied aiming at the purification of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Usually, these systems are constituted of micellar surfactants solutions and offer both hydrophobic and hydrophilic environments, providing selectivity to the enzyme partitioning according to its hydrophobicity. Some of the factors influencing the G6PD partition in micellar systems were studied, such as: type and concentration of nonionic surfactant agents (C10E4 and Triton X-114), temperature, addition of affinity ligands (Cibacron Blue and Procion Red) and the addition of the salts ammonium sulfate ((NH4)2SO4) and sodium sulfate (Na2SO4). The synthesis of the affinity surfactant TX-114-Blue was also studied. In all the assays the experiments, G6PD partitioned preferentialy to dilute, micelle-poor phase, in which there is a higher volume available for the enzyme to be, resulting in KG6PD values lower than 1. The use of affinity ligands in G6PD partitioning in both C10E4 and Triton X-114 systems provided some increase in the KG6PD, however with values still lower than 1. Employing a methodology previously described in the literature with some alterations, it was not possible to obtain the affinity surfactant TX-114-Blue. The systems Triton X-114/salt have not shown a significant influence on the enzyme partition to the micelle-rich phase, in spite of the existence of an electrostatic potential difference between the phases of the systems. The excluded-volume effect was dominant in all the systems studied and, therefore, the enzyme predominantly excluded to the dilute, micelle-poor phase. The use of Triton X-114 two-phase aqueous micellar systems to the purification of the Saccharomyces cerevisiae cell homogenate was found to be efficient in the recovery of G6PD in the dilute, micelle-poor phase, partially separating this target molecule from other proteins and contaminants of hydrophobic character. Therefore, aqueous two-phase micellar systems can be considered useful as a possible purification stage in a biotechnology process.

Orientador: Luciana Francisco Fleuri / Resumo: O Eucalyptus é um importante gênero florestal plantado mundialmente para fins comerciais. O Brasil é líder global em produtividade de Eucalyptus, devido às condições climáticas favoráveis e a eficientes programas de melhoramento baseados em plantações clonais, porém alguns clones de Eucalyptus possuem dificuldades de propagação, principalmente relacionadas ao enraizamento. A inoculação fúngica e bacteriana pode auxiliar o enraizamento e desenvolvimento vegetal pela produção de metabólitos tais como ácido indol-3-acético (AIA) e fitases. O objetivo deste trabalho foi produzir AIA e fitases por fermentação em estado sólido (FES) utilizando Aspergillus spp., Trichoderma spp. e Bacillus spp. e a inoculação das cepas de maior produtividade em mudas de Eucalyptus grandis x E. urophylla (clone IPB2) visando otimizar o desenvolvimento vegetal. A FES ocorreu utilizando bagaço de mandioca, farelos de soja e trigo e grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS) de sorgo e milho como substratos. Nos filtrados da FES foram determinados a concentração de AIA e a atividade de fitase. As características físicas e químicas dos substratos [macroporosidade (%), microporosidade (%), retenção de água (mL/cm3), condutividade elétrica (mS/cm3), pH, proteína bruta (%), lipídeos (%), hemicelulose (%), celulose (%) e lignina (%)] foram determinadas e correlacionadas à produtividade das biomoléculas, a fim de esclarecer a influência na alteração do metabolismo microbiano para maior ou menor produtivida... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Eucalyptus is an important forest genus planted worldwide for commercial purposes. Brazil is the global leader in Eucalyptus productivity due to favorable climatic conditions and efficient breeding programs based on clonal plantations, but some Eucalyptus clones have difficulties of propagation, mainly related to rooting. Fungal and bacterial inoculation can positively influence rooting and plant development by producing metabolites such as indole-3-acetic acid (IAA) and phytases. This work aimed to produce IAA and phytases under solid state fermentation (SSF) using Aspergillus spp., Trichoderma spp. and Bacillus spp. and inoculate the best producers in cuttings of Eucalyptus grandis x E. urophylla (clone IPB2), aiming to optimize plant development. The SSF technique was performed using cassava bagasse, soybean and wheat bran and distillers dried grains with solubles (DDGS) of sorghum and maize as substrates. The concentration of IAA and phytase activity were determined in SSF filtrates. The physical and chemical characteristics of the substrates [macroporosity (%), microporosity (%), water retention (mL/cm3 ), electrical conductivity (mS/cm3 ), pH, brute protein (%), lipids (%), hemicellulose %), cellulose (%) and lignin (%)] were determined and correlated to the biomolecules productivity in order to clarify their influence on the alteration of microbial metabolism for higher or lower productivity of IAA and phytases. The microorganisms with higher productivity of IAA and ph... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As enzimas são incorporadas aos alimentos das aves, com o propósito de melhorar o desempenho destas e, com isso, a rentabilidade do setor avícola. O uso de fitase em rações avícolas é uma prática aceita mundialmente em diversas realidades deste setor produtivo, sendo uma das enzimas mais estudadas na nutrição animal. Ela degrada as moléculas de ácido fítico e fitato. A hidrólise do fitato não é responsável somente pela liberação de fósforo, mas também de minerais e proteínas, que podem estar associadas aos íons fosfato. O uso desta enzima permite diminuir a quantidade de certas substâncias adicionadas às rações, o que pode reduzir custos de produção e melhorar resultados zootécnicos. Pesquisas sobre o uso de fitase foram desenvolvidas com frangos de corte e poedeiras. Entretanto, não se encontram dados na literatura a respeito do uso de fitase na dieta de codornas. Objetivou-se avaliar os efeitos do fornecimento de rações com níveis diferentes de fósforo e fitase, sobre o desempenho das codornas e a qualidade dos ovos, durante 84 dias, com 320 aves de 35 semanas de idade. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, com 4 níveis de fósforo disponível (0,106; 0,210; 0,315; 0,385%) e 2 níveis de fitase (0 e 600FTU), totalizando 8 tratamentos com 5 repetições. Os resultados mostraram que os níveis de fósforo e o uso da fitase não influenciaram no consumo de ração, na conversão alimentar por dúzia de ovos e no peso dos componentes dos ovos (albúmen, gema e casca). Já para a produção de ovos e produção de ovos comercializáveis por dia por ave, houve interação fósforo x fitase, demonstrando uma tendência ao efeito linear, sendo que o melhor desempenho foi com o nível de 0,385% fósforo disponível sem adição de fitase. Para o peso e a massa dos ovos a interação também apresentou efeito, porém de desvio da quadrática, e os melhores resultados foram observados com o nível de 0,210% fósforo disponível sem adição de fitase. Para gravidade específica o melhor resultado foi observado com a adição de fitase e 0,106% fósforo disponível, mostrando um efeito de desvio da quadrática para a interação fósforo x fitase. Resultados significativos para a porcentagem de casca, um efeito linear para a interação fósforo x fitase com a maior porcentagem observada com o nível de 0,385% fósforo disponível sem adição de fitase e para a porcentagem de gema um efeito de desvio da quadrática para os níveis de fósforo, com a maior porcentagem observada com o nível de 0,315% fósforo disponível. Pode-se concluir que a suplementação de 600FTU é eficaz na qualidade da casca dos ovos, em dietas com 0,106% de fósforo disponível. Os níveis de fósforo disponível podem ser reduzidos para 0,106% sem alterar o consumo de ração, a conversão alimentar, o peso dos componentes dos ovos e a porcentagem de albúmen. Para a massa e o peso dos ovos o nível ideal de fósforo disponível na dieta é 0,210% e para a porcentagem de gema e de casca o nível ideal é de 0,385% de fósforo disponível. / The enzymes are incorporated into foods from poultry, in order to improve their performance and thereby the profitability of the poultry sector. The use of phytase in poultry rations is an accepted practice worldwide in diverse realities of this sector, being one of the most studied enzymes in animal nutrition. It degrades the molecules of phytic acid and phytate. Hydrolysis of phytate is responsible not only for the release of phosphorus, but also minerals and proteins that may be associated with the phosphate ions. The use of this enzyme can reduce the amount of certain substances added to the rations, which can reduce production costs and improve outcomes husbandry. Research on the use of phytase were developed with broilers and layers. However, there are no published data regarding the use of phytase in the diet of quails. The objective was to evaluate the effects of feeding with different levels of phosphorus and phytase on performance and quality of quail eggs for 84 days, with 320 birds of 35 weeks of age. We used a completely randomized design with four levels of available phosphorus (0.106, 0.210, 0.315, 0.385%) and two phytase levels (0 and 600FTU), totalizing eight treatments with five replications. The results showed that phosphorus levels and the use of phytase did not influence the feed intake, feed conversion per dozen eggs and weight of egg components (albumen, yolk and shell). As for egg production and commercial egg production per day per bird, phosphorus x phytase interaction was observed, demonstrating a tendency to linearly, with the best performance was with the level of 0.385% available phosphorus with no added phytase. For the weight and egg mass also showed the interaction effect, but the deviation from quadratic, and the best results were observed at the level of 0.210% available phosphorus with no added phytase. Specific gravity for the best result was observed with the addition of phytase and available phosphorus 0.106%, showing an effect of the quadratic deviation for phosphorus x phytase interaction. Significant results for the percentage of shell, a linear effect for phosphorus x phytase interaction with the highest percentage observed at the level of 0.385% available phosphorus with no added phytase and the yolk percentage deviation from a quadratic effect on the levels of phosphorus, with the highest percentage observed at the level of 0.315% available phosphorus. It can be concluded that supplementation of 600FTU is effective as the egg shell in diets with 0,106% available phosphorus. The available phosphorus levels can be reduced to 0.106% without changing feed intake, feed conversion, weight of egg components and the percentage of albumen. For mass and weight of eggs to an optimal level of available phosphorus in the diet is 0.210% and the percentage of yolk and shell is the ideal level of 0.385% available phosphorus.