Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-14T15:47:55Z No. of bitstreams: 1 Gilvany Rodrigues de Andrade.pdf: 924850 bytes, checksum: ef0dafff6a459323ab75707a3d72942e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T15:47:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gilvany Rodrigues de Andrade.pdf: 924850 bytes, checksum: ef0dafff6a459323ab75707a3d72942e (MD5) Previous issue date: 2011-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The occurrence of supersprouting in sugar cane, known as "green masses", was evaluated for the effect of BAP, correlating with the response of antioxidative system of plants and green masses. The plant material was derived from micropropagation in temporary immersion bioreactors (BIT) with BAP. Plants and green bodies were transferred to culture in static system in a liquid medium with or without BAP. Micropropagated plants in BIT without BAP remained without cytokinin, in static fluid system. Plants that remained with BAP (PcBAP) had increased tillering, but there was an inverse relationship to the size of the tiller. The presence of BAP inhibited the rooting of shoots and masses. In treatments with BAP in static system continued with the formation of green mass, proving that the culture system did not affect the occurrence of the anomaly, which was conditioned by prolonged exposure to BAP. The highest activity of POD was observed in roots and shoots of plants were in cultivation without BAP and had higher root formation, confirming the role of POD in the metabolism of indole acetic acid (IAA). The activity of catalase and ascorbate peroxidase were somewhat complementary, highlighting the need of joint antioxidant enzyme system. The activity of polyphenol oxidase in roots was higher in plants without BAP. In the green masses PPO activity was inversely proportional to total phenols. The phenolic content increased in shoots of plants grown with BAP and BAP in the masses without green (and PsBAP MsBAP), which coincides with rooting. There was no difference in total glutathione, but the plants that were not subject to the presence of BAP exhibited the highest ratio reduced glutathione / glutathione disulfide (GSH / GSSG). / A ocorrência de superbrotação em cana-de-açúcar, conhecida como ―massas verdes‖, foi avaliada quanto ao efeito do BAP, correlacionando com a resposta do sistema antioxidativo das plantas e massas verdes. O material vegetal foi proveniente da micropropagação em biorreatores de imersão temporária (BIT) com BAP. As plantas e massas verdes foram transferidas para cultivo em sistema estático em meio líquido com ou sem BAP. Plantas micropropagadas em BIT sem BAP permaneceram sem a citocinina, em sistema estático líquido. As plantas que permaneceram com BAP (PcBAP) apresentaram maior perfilhamento, mas observou-se uma relação inversamente proporcional ao tamanho dos perfilhos. A presença de BAP inibiu o enraizamento dos brotos e das massas. Nos tratamentos em sistema estático com BAP continuou havendo formação de massa verde, comprovando que o sistema de cultivo não interferiu na ocorrência da anomalia, que foi condicionada pela prolongada exposição ao BAP. A maior atividade da POD foi observada em raízes e parte aérea de plantas que estavam em cultivo sem BAP e apresentavam maior formação de raiz, confirmando o papel da POD no metabolismo do ácido indolacético (AIA). A atividade da catalase e da peroxidase do ascorbato foram de certa forma complementares, evidenciando a necessidade conjunta do sistema enzimático antioxidativo. A atividade de polifenoloxidase nas raízes foi maior nas plantas sem BAP. Nas massas verdes a atividade da PPO foi inversamente proporcional ao teor de fenóis totais. O teor de fenóis aumentou na parte aérea das plantas cultivadas com BAP e nas massas verdes sem BAP (PsBAP e MsBAP), coincidindo com o enraizamento. Não houve diferença quanto à glutationa total, mas as plantas que não foram submetidas à presença de BAP exibiram a mais alta relação glutationa reduzida/glutationa dissulfeto (GSH/GSSG).

A maceração do milho é uma das etapas mais importantes para seu processamento através da moagem por via úmida. Consiste em uma série de processos que envolvem fermentação e hidrólise química de forma a permitir a separação adequada de seus componentes. Trata-se de uma etapa demorada que requer alto investimento em tanques e utilidades. No presente trabalho buscou-se avaliar o uso de enzimas para auxiliar na redução do tempo de maceração de milho dentado, em escala laboratorial, produzido na região do triângulo mineiro. Para tal, os grãos foram submetidos a diferentes tratamentos com as enzimas xilanase e protease. A ação enzimática foi comparada a padrões de maceração convencionais. Os resultados obtidos mostraram que o uso de enzima permite diminuir o tempo de maceração em torno de 18 horas assim como reduzir a quantidade de SO2 adicionada ao processo de maceração. / Corn steeping is one of the most important stage in the corn wet milling process. It consists of several processes involving fermentation and chemical hidrolysis to enable separation of different fractions of the grain. This process is time and capital investment intense. In the present work it was studied the use of enzymes to reduce the steeping time for dent corn, produced in the southeast of Brazil, in laboratory scale. The evaluated enzymes were xilanase and protease. The enzyme performance was compared with the regular steeping process. The final result has shown that the use of enzymes enabled to reduce steeping time in 18 hours as weel as the amount of added SO2 in the steeping process.

A baixa disponibilidade do ácido fítico para os animais não ruminantes tem incrementado as pesquisas quanto ao uso da enzima fitase. Pesquisas têm sido realizadas com a adição de fitase em rações para frangos de corte e têm demonstrado resultados favoráveis sobre o aproveitamento do fósforo e a digestibilidade de nutrientes como aminoácidos e proteína. Para se avaliar os efeitos do fornecimento de rações contendo níveis reduzidos de proteína bruta e fósforo disponível com adição da enzima fitase sobre o desempenho, excretas e parâmetros ósseos em frangos de corte no período de 1 a 21 dias de idade foram utilizados 504 pintos de corte, machos, de linhagem comercial de frangos de corte, de 1 dia de idade, distribuídos em 12 tratamentos com seis repetições cada. O delineamento foi em blocos casualizados e os tratamentos foram organizados de acordo com um esquema fatorial 2x2x3: dois níveis de fósforo disponível, dois níveis de fitase e três níveis de proteína bruta. Houve um aumento do peso das aves que receberam dietas contendo a enzima fitase embora não tenha afetado a conversão alimentar. O consumo não foi afetado pelos níveis de proteína bruta quando ocorreu a suplementação com fitase. A porcentagem de fósforo nas excretas diminuiu com o nível intermediário de proteína bruta (20,5%) com a adição de fitase (1,15 vs. 1,03%). A proteína bruta excretada foi reduzida com a suplementação de fitase (33,36 vs. 31,83%). A enzima fitase atua de forma significativa na dieta à base de milho e farelo de soja com baixos níveis de proteína bruta e fósforo disponível para frangos de corte. / The low phytic acid availability to nonruminant animals has increased the researches about the phytase enzyme use. Researches have been realized with phytase addition in broiler diets and they demonstrated favorable results on phosphorus utilization and nutrients digestibility as amino acids and protein. To evaluate the effects of feeding low levels of crude protein and available phosphorus diets supplemented with phytase on performance, feces and bone parameters on broiler chickens over a 21 days period, it was used 504 (five hundred four) 1 day old male chicks, of a commercial broiler line, distributed in 12 treatments, with 6 replicates per treatment. The experimental design was casually blocked and treatments were organized in a 2x2x3 factorial arrangement: two phosphorus levels, two phytase inclusion levels and three protein levels. Body weight gain (BWG) was observed in birds fed diets with phytase supplementation although it hasn\'t affected the feed conversion ratio (FCR). Feed intake (FI) wasn\'t affected by the low protein levels with added phytase. Phosphorus percentage in excretion decreased with the intermediary protein level (20.5%) when phytase was added (1.15 vs 1.03%). Crude protein excreted was lower with phytase supplementation (33.36 vs 31.83%). Phytase enzyme acts in a significant way on broilers fed a corn-soybean diet with low levels of crude protein and available phosphorus.

Las metalocarboxipeptidasas son enzimas que escinden residuos C-terminales de otras proteínas o péptidos. Dentro de esta familia de proteínas encontramos, por un lado, las procarboxipeptidasas pancreáticas y, por otro, las carboxipeptidasas reguladoras.Las procarboxipeptidasas pancreáticas son un sistema muy estudiado, del cual se cuenta con numerosos datos, tanto a nivel estructural como a nivel funcional. En esta tesis se han estudiado los mecanismos de activación e inhibición de una proteína perteneciente a este grupo, la procarboxipeptidasa B porcina. Para ello, se han obtenido mutantes de esta proteína mediante el método de expresión heteróloga de la levadura Pichia pastoris, que nos han ayudado a acabar de definir su proceso de activación, relacionándolo con algunas de sus características estructurales.En las carboxipeptidasas reguladoras se habían realizado algunos estudios funcionales, pero hasta el momento del inicio de esta tesis, eran completamente desconocidas a nivel estructural. En este trabajo se ha conseguido expresar, purificar y concentrar el dominio 2 de la carboxipeptidasa D (CPD) de pato a niveles adecuados para su cristalización y se ha resuelto su estructura cristalina. Consideramos que ésta es un prototipo para las carboxipeptidasas reguladoras, ya que es la primera estructura que se ha obtenido de esta subfamilia, y la única hasta el momento.Por último, nos hemos basado en la estructura cristalina del dominio 2 de CPD de pato para confeccionar modelos teóricos de otras reguladoras (dominios 1 y 3 de CPD de pato y CPE humana) Además, se ha resuelto la estructura del mismo dominio acomplejado con un inhibidor.La obtención de la primera estructura cristalina de una carboxipeptidasa reguladora abre las puertas para el estudio de la relación estructura/función en esta subfamilia. / Metallocarboxypeptidases are enzymes that split C-terminal residues of proteins or peptides. Whithin this protein family, we can find, on one hand, pancreatic procarboxypeptidases and, on the other hand, regulatory carboxypeptidases.Pancreatic carboxypeptidases are a very well studied system, from which we have numerous data, at the structural and at the functional level. In this thesis, activation and inhibition mechanisms of a protein from this family, porcine procarboxypeptidase B, have been studied. For this purpose, mutants of this protein have been obtained by the heterologous expression method of the yeast Pichia pastoris. This mutants helped us to define its activation process, relating it with some of its structural features.In the regulatory carboxypeptidases, some functional studies had been done. However, until the beginning of this thesis, this proteins were completely unknown at the structural level. In this work, domain 2 of duck carboxypeptidase D (CPD) has been expressed, purified and concentrated at suitable levels for its crystallization and its crystal structure was determined. We consider that this structure is a prototype for the regulatory carboxypeptidases because it is the first known structure of this subfamily and, for the moment, the unique.Based on the crystal structure of domain 2 of duck CPD, we have done theoretical models of other regulatory carboxypeptidases (domains 1 and 3 of duck CPD and human CPE) In addition, the crystal structure of the same domain complexed with an inhibitor was determined.The determination of the first crystal structure of a regulatory carboxypeptidase opens a way for the study of the relationship structure/function in this subfamily.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004 / A angiotensina II (AngII), produto final da cascata bioquímica do sistema renina angiotensina (SRA), é formada sob a ação da enzima conversora de angiotensina (ECA). No coração, a Ang II pode atuar na gênese da hipertrofia cardíaca (HC) tanto em situações fisiológicas quanto patológicas. Além disso, o SRA parece estar associado às adaptações cardiovasculares e metabólicas ao treinamento físico (TF). No presente estudo, camundongos geneticamente modificados contendo 1 a 4 cópias do gene a ECA foram submetidos ao TF com natação (2 sessões de 1,5h, 5 dias/semana durante 4 semanas) ou mantidos sedentários (S), com a finalidade de avaliar in vivo o efeito do genótipo da ECA para a magnitude de desenvolvimento da HC. O TF melhorou a capacidade de realização, de exercício físico, reduziu a freqüência cardíaca de repouso elevou a atividade da citrato sintase (CS) (T1: 12.8 e 41.8 por cento, T2: 12.3 e 34.4 por cento, T3: 14. e 51.8 por cento, T4: 14.3 e 26.2 por cento), enquanto a concentração de lactato sangüíneo e pressão arterial sistólica permaneceram inalteradas. O aumento da razão número de capilares/fibras foi observado apenas nos treinados com 3 e 4 cópias (21 por cento e 28 por cento, respectivamente). O peso de ventrículo esquerdo e diâmetro de miócitos aumentaram significativamente em todos os treinados comparados com os respectivos grupos sedentários (TI: 12.6 e 17.9 por cento, T2: 15.2 e 13.8 por cento, T3: 16.9 e 20 por cento , T4: 17 e 19 por cento). Entretanto, a HC foi semelhante entre os grupos e somente a resposta metabólica muscular foi genótipo dependente, onde a maior atividade da CS foi associada à menor dosagem de ECA muscular (mECA). A atividade da renina plasmática (ARP) foi maior no grupo sedentário com 1 cópia comparado com os grupos S3 e S4 (4.89±0.5 versus 2.43±0.6 e 2.12±01.1 ng.ml-1. AngI, respectivamente) enquanto a ECA cardíaca (CECA) foi maior no grupo S3 comparado com S 1 e S2 (5946±590.8 versus 2951.5±328.3 e 3504.1±258.9 uF.min-1.ml-1, respectivamente). Já a mECA, foi maior nos grupos sedentários com 3 e 4 cópias comparados com o grupo S1 (11.42±2.8 e 10.85±2, respectivamente versus 4.61±2.9 uF.min-1.ml-1). Após o TF, ARP e mECA permaneceram inalteradas. CECA e angiotensina II foram semelhantes nos grupos treinados. Desta forma, observamos que os animais treinados apresentaram adaptações aeróbias ao TF com natação, especialmente HC em igual magnitude. Contrário aos modelos patológicos de HC, nossos resultados indicaram que o genótipo da ECA não influenciou a magnitude de HC fisiológica em camundongos treinados com natação. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Glucansucrases são enzimas que atuam em reações de síntese de polissacarídeos e oligossacarídeos. Para que esses biocatalisadores sejam aplicados em escala industrial, é desejável ótimas estabilidades térmica e operacional, o que pode ser alcançado com a imobilização de enzimas. Como alternativa aos suportes sólidos amplamente estudados, está a quitosana, polímero que não apresenta toxicidade e possui alta biocompatibilidade e alta afinidade com proteínas. Outra possibilidade promissora na imobilização de enzimas, é a síntese dos agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs), os quais apresentam alta atividade catalítica e alta estabilidade. Contudo, uma peculiaridade das glucansucrases quando produzidas em meio contendo sacarose é a camada de polímero que as envolve, e que bloqueia o acesso aos grupos reativos na superfície da proteína. No caso da expressão heteróloga das glucansucrases em Escherichia coli essa dificuldade pode ser contornada. Além disso, o uso da mutagênese sítio-dirigida pode proporcionar modificações de aminoácidos na superfície da enzima, tais como os resíduos Lys, Cys, His, com o intuito de que melhorias na imobilização sejam alcançadas. Sendo assim, na primeira etapa desse trabalho, uma extensa discussão é apresentada em relação às metodologias de imobilização de dextransucrase encontradas na literatura. A seguir, estudos referentes à imobilização da dextransucrase de Leuconostoc mesenteroides B-512 F em esferas de quitosana ativadas com glutaraldeído foram realizados. Esse imobilizado apresentou alta atividade catalítica (197 U/g) quando utilizada a carga de proteína de 400 mg/g de suporte. Além disso, observou-se que a imobilização covalente e os açúcares maltose e glicose promoveram proteção à enzima em temperaturas de 40 ºC e 50 ºC. Na etapa seguinte, a produção e a caracterização de CLEAs de dextransucrase de L. mesenteroides B-512 F foram investigados. Demonstrou-se que o tratamento com a dextranase foi essencial para a imobilização da glucansucrase e que o isopropanol foi o melhor agente precipitante. Os CLEAs apresentaram pH e temperatura ótimos de 3,0 e 60 ºC, respectivamente, enquanto que a dextransucrase imobilizada nas esferas de quitosana funcionalizada com glutaraldeído apresentaram os valores de 4,5 e 20 ºC. Ambas formas imobilizadas apresentaram boa estabilidade operacional na síntese de oligossacarídeos uma vez que após 10 ciclos, 40 % de atividade residual foi observada. Por fim, estão apresentados estudos sobre a modelagem das estruturas tridimensionais e a mutagênese sítio-dirigida das glucansucrases DSR-S vardel Δ4N and ASR C-APY del. Os modelos preditos demonstraram boa qualidade e a mutagênese sítio-dirigida não promoveu perdas significativas na atividade enzimática dos mutantes. Somente o mutante DSR_S326C mostrouse inativo. Os resultados obtidos sugerem que a imobilização da dextransucrase foi satisfatória e que cada técnica possibilita diferentes características ao imobilizado. Além disso, os imobilizados foram adequados para síntese de dextrana e oligossacarídeos. / Glucansucrases are enzymes that catalyze the synthesis of polysaccharides and oligosaccharides. In order to assure continuous processing and reuse of the biocatalyst in industrial applications, enzyme immobilization techniques are required to promote good thermal and operational stabilities. Among the several solid supports for enzyme immobilization, chitosan shows interesting properties because it is non-toxic, it is biocompatible, and it has high protein affinity. Other possibility is the production of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs), which presents high catalytic activity and good stability. However, glucansucrases have a particularity when produced in sucrose medium, since a polymer layer surrounds the protein, blocking the access to reactive groups on the enzyme surface. To overcome this problem, it is possible to make the heterologous production of glucansucrases in Escherichia coli. Likewise, the site-directed mutagenesis may promote changes in the amino acids located on the surface to improve immobilization parameters. Therefore, this work aimed to discuss the several techniques applied for dextransucrase immobilization, and to design new immobilized biocatalysts. In a first step, it is presented a review about the distinct immobilization methodologies for dextransucrase. In a second study, an investigation about dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides B-512 F immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan particles was carried out. The novel immobilized biocatalyst showed 197 U/g (400 mg/g dried support) of catalytic activity. The covalent immobilization promoted protection against enzyme damages at 40 ºC and 50 ºC, whereas maltose and glucose acted as stabilizers. Furthermore, it was studied the production and characterization of CLEAs dextransucrase from L. mesenteroides B-512 F. It was demonstrated that dextranase treatment was crucial for immobilization. Isopropanol was chosen as the best precipitant agent. CLEAs presented optimal pH and temperature of 3.0 and 60 ºC, respectively, whereas it was found values of 4.5 e 20 ºC for dextransucrase immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan particles. Both immobilized biocatalysts showed good operational stability in the oligosaccharides synthesis, exhibiting 40 % of residual activity after 10 cycles. Finally, the study concerning the homology modeling and site-directed mutagenesis of glucansucrases DSR-S vardel Δ4N and ASR C-APY del is presented. The predicted models showed good quality and it has been demonstrated that the site-directed mutagenesis did not promote significant losses in the variant enzyme activities. Only one mutant (DSR_S326C) had shown no dextransucrase activity. The results obtained in this work suggest that the immobilization of dextransucrase was satisfactory, also showing that each technique promotes different characteristics to the immobilized biocatalyst. Besides, these immobilized enzymes were feasible for the synthesis of dextran and oligosaccharides.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. / Made available in DSpace on 2012-10-18T00:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T18:03:06Z : No. of bitstreams: 1 170966.pdf: 2860510 bytes, checksum: f684509f14267a0919dd3c1ac1dbf1eb (MD5) / Investigação dos efeitos da quercetina (30 mg/Kg v.o.) no extravasamento plasmático induzido pela substância P (10 nmol/Kg i.v.) em diversos tecidos do sistema nervoso central (cerebelo, bulbo olfatório e córtex) e dura-máter de ratos além dos efeitos da inibição da endopeptidase neutra pelo fosforamidon (2,5 µg/Kg i.v.) e da enzima conversora da angiotensina pelo captopril (10 nmol/Kg i.v.) nos mesmos tecidos. A substância P aumentou o extravasamento plasmático de modo dose relacionada na dura-máter, não alterando os outros tecidos. A inibição farmacológica seletiva da endopeptidase neutra e da enzima conversora da angiotensina com fosforamidon e captopril respectivamente aumentaram o extravasamento plasmático induzido pela substância P na dura-máter de ratos. O pré-tratamento isolado com quercetina (30mg/Kg, v.o) aumentou o extravasamento plasmático em relação ao controle em todos os tecidos quando administrada isoladamente e potencializou o extravasamento plasmático induzido pela substância P na dura-máter, tecido onde há inervação peptidérgica o que coincide com a modulação da endopeptidase neutra e da enzima conversora da angiotensina.

A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

Este trabalho testa a hipótese de que a inibição da enzima conversora da angiotensina (ECA), mesmo em doses baixas que não causam alteração de pressão, é capaz de influenciar nos processos de hipertrofia cardíaca, estresse oxidativo e controle autonômico em animais espontaneamente hipertensos (SHR). Os animais foram tratados com um inibidor da enzima conversora da angiotensina (iECA) e foram quantificados a hipertrofia e o estresse oxidativo cardíacos. Também foi avaliado o controle autonômico através da análise espectral de séries temporais de pressão arterial sistólica e freqüência cardíaca. Além disso, foram investigadas as características não-lineares das series de freqüência cardíaca envolvidas na hipertensão arterial sistemica e o efeito do tratamento sobre estes parâmetros através de um teste de irreversibilidade desenvolvido para detectar dinâmicas não-lineares independentemente da escala temporal de ação. Neste contexto, o primeiro estudo (artigo 1) objetivou o desenvolvimento do novo método para análise de irreversibilidade estatística (IE) capaz de detectar inclusive a presença de dinâmicas não-lineares mais lentas das observadas pelos métodos tradicionais. A nova técnica, denominada irreversibilidade bidimensional múltipla (IBM), foi validada e mostrouse útil quando aplicada a séries fisiológicas exibindo um padrão de não-linearidade aumentado em situações de predominância simpática. No segundo momento (artigo 2) o novo método foi aplicado a séries temporais de freqüência cardíaca em situações em que a ativação simpática foi provocada. Após demonstrar a associação entre a irreversibilidade e a modulação simpática em situação fisiológica, usando um protocolo de estimulação simpática gradual, o método também foi aplicado a uma situação patológica, caracterizada pela hipertensão espontânea em ratos. Nesta situação, houve um aumento da IE e o mecanismo não-linear envolvido na referida patologia possui ação mais lenta, sendo possível de ser detectado apenas com o uso de técnicas de alta dimensionalidade, como a irreversibilidade bidimensional múltipla. Além disso, foi verificado o efeito do tratamento com iECA, que reduziu a modulação simpática e restaurou o padrão de irreversibilidade a percentuais semelhantes aos do grupo controle. O terceiro estudo (artigo 3) teve como objetivo avaliar o efeito da inibição da ECA sobre a hipertrofia cardíaca, estresse oxidativo e controle autonômico em doses não anti-hipertensivas. Os resultados demonstraram uma redução da hipertrofia cardíaca, do estresse oxidativo cardíaco, mesmo sem alterar a pressão arterial. Apesar de não alterar a modulação simpática vascular ou atuar na sensibilidade baroreflexa, o tratamento em baixa dose melhorou o balanço autonômico, em favor da modulação vagal. Tais resultados podem indicar uma ação central que busca restabelecer o equilíbrio cardiovascular, precedente à alteração de pressão. Assim sendo, o presente estudo poderá contribuir no desenvolvimento de novas estratégias que, num futuro próximo, permitirão não só avaliar os efeitos do tratamento, mas principalmente, prevenir o estabelecimento de novos quadros hipertensivos e de insuficiência cardíaca. / This work presents the hypothesis that inhibition of the angiotensin converting enzyme (ACE), even in low doses that do not cause decrease of pressure, is able to alter the cardiac hypertrophy, the oxidative stress and the autonomic control in spontaneously hypertensive rats (SHR). To evaluate cardiac oxidative stress and its hypertrophy, animals were treated with an angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEi). Also the autonomic control was analyzed by the spectral analysis of systolic arterial pressure and heart rate series. Besides, non-linear characteristics present in hypertension and the ACEi treatment effect were also evaluated by an irreversibility test developed to detect non-linear dynamics independently of their temporal scale. The first study (article 1) aimed at developing a new method for analysis of statistical irreversibility (SI) which was able to detect the presence of non linear dynamic including those that were slower than the ones observed by traditional methods. The new technique, called multiple bi-dimensional irreversibility (MBI), was validated and showed to be useful when applied to physiological series, presenting an increased non linear pattern increased in situations with sympathetic predominance. This new method was also applied to time series of heart rate in situations of sympathetic activation (article 2). After the demonstration of an association between irreversibility and sympathetic modulation in a physiological condition, the method was applied to a pathological situation, in SHR. SHR data showed that there was an increase of SI. Furthermore, the non-linear mechanism wrapped in this pathology has slower action, which can be detected only with the use of multidimensional techniques, as MBI. Besides, the ACEi treatment resulted in a reduction of the sympathetic modulation and restored the irreversibility pattern to those similar to control. Finally, the third study (article 3) evaluates the effect of ACEi on the cardiac hypertrophy, oxidative stress and autonomic control in no anti-hypertensive doses. The results demonstrated a cardiac hypertrophy and cardiac oxidative stress reduction, with no alteration of blood pressure. In spite of producing no alteration in the sympathetic vascular modulation or no action in the baroreflex sensibility, the low dose of ACEi treatment improved the autonomic balance, in favour of vagal modulation. Such results can indicate a central action to re-establishing the cardiovascular balance, preceding to the pressure alterations. Thus, the present study may help to the new strategies development to treat and, mainly, to prevent the establishment of hypertension and of heart failure.

A hemostasia envolve diversos eventos fisiológicos desencadeados após a ruptura da integridade vascular. Durante estes processos, os glicosaminoglicanos, incluindo a heparina e o heparan sulfato, desempenham funções fisiológicas fundamentais. Particularmente a heparina, isolada no início do século XX, permanece até os dias atuais como um dos mais eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. As cadeias polissacarídicas destes glicosaminoglicanos são clivadas por liases, denominadas heparinases, através de um mecanismo de eliminação. As heparinases, identificadas inicialmente na bactéria do solo Flavobacterium heparinum (sinonímia: Pedobacter heparinus), diferem em tamanho, carga e grau de especificidade pela sequência dissacarídica do substrato. Possuem importantes aplicações na terapêutica, diagnóstico e também na produção de heparinas de baixo peso molecular (HBPM). Dentre as heparinases já descritas para F. heparinum a enzima do tipo II é a menos específica, sendo capaz de clivar ligações glicosídicas do tipo 1-4 entre a glicosamina e ácido urônico (idurônico ou glicurônico), presentes na heparina e no heparan sulfato. Entretanto, o processo de reconhecimento enzima-substrato neste sistema é ainda pouco conhecido. Particularmente com relação à dependência por metais, esta enzima tem sua atividade inibida pela presença do íon cálcio que, em contrapartida, é importante para a atividade das heparinases dos tipos I e III. A heparinase II é uma glicoproteína e apresenta um sítio de ligação ao íon zinco, o qual exerce uma importante função de manutenção da integridade da estrutura protéica. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo a caracterização estrutural e conformacional da enzima heparinase II e, a partir destas informações, subsidiar o entendimento do reconhecimento e especificidade da interação enzima-substrato, fundamentando um planejamento racional de novos ligantes. Empregando-se a Dinâmica Molecular (MD), quatro sistemas envolvendo a enzima foram estudados, considerando-se a presença ou ausência de íons Ca+² e Zn+² e da estrutura de glicosilação. Os dados obtidos indicam que a presença do íon Zn+² pode estar envolvida no controle da flexibilidade da estrutura protéica em regiões específicas da heparinase II. Em contrapartida, a presença do íon Ca+² promove um acréscimo significativo na flexibilidade em regiões equivalentes àquelas do Zn+², relacionada à influência do íon no sítio catalítico da enzima. Adicionalmente, a presença da O-glicosilação parece ser capaz de promover uma estabilização adicional da estrutura secundária da proteína, sugerindo um papel na estabilidade conformacional da mesma. Globalmente, os resultados indicam que simulações de MD podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação de glicoproteínas como a heparinase II, permitindo a caracterização de diversas propriedades, como a quantificação de suas interações com cofatores metálicos e o papel de seu sítio de glicosilação. Cria-se, portanto, uma sólida base para o estudo das demais heparinases, de suas respectivas especificidades e, por fim, para o planejamento racional de novos candidatos a agentes moduladores dos processos hemostáticos. / The hemostasis comprises important physiologic events following the rupture of vascular integrity. During these processes, heparin and heparan sulfate glycosaminoglycans (HSGAG) presents important physiological functions. In particular heparin, isolated in the beginning of the XX century, remains until today as one of the most efficient antithrombotic therapeutic agents. The polysaccharide chains of these HSGAGs are cleaved by lyases, named heparinases, through an elimination mechanism. The heparinases, first identified in the soil bacterium Flavobacterium heparinum (also named Pedobacter heparinus), differ in size, charge and substrate specificity. They have important applications, such as therapeutic, diagnostic and production of low molecular weight heparins (LMWH). Within the heparinases from F. heparinum, the type II enzyme has the broadest substrate specificity, being capable of cleavage upon the (1-4) glycosidic linkages between glucosamine and uronic acid (either glucuronic or iduronic) residues contained by heparin and heparan sulfate. However, the enzyme-substrate recognition process is poorly structurally described. Mainly in relation of the metals dependence, this enzyme has its activity inhibited by the presence of the calcium ion which, in opposite, is important for heparinanses I and III activities. The heparinase II is a glycoprotein and shows a zinc ion binding site, which plays an important role in the protein structure maintenance. Thus, the current work aims to characterize the structure and conformation of heparinase II enzyme and, based on this information, support the understanding of the recognition and specificity of the enzyme-substrate interaction, and further the rational design of new ligands of the enzyme. Using molecular dynamics (MD) calculations, four systems were studied, considering the presence or absence of Ca+² and Zn+² ions and the glycosylation structure. The obtained data indicates that the presence of a Zn+² ion may be involved in the control of the protein flexibility at some specific regions of the heparinase II. In opposite, the Ca+² presence promotes a significant increase of the flexibility on the same regions, related to the influence of this ion in the enzyme active site. Additionally, the O-glycosylation seems to be capable to promote an additional stabilization of the protein secondary structure, what may indicate its role as an element that contributes to the conformational stability of the protein. Altogether the results show that MD simulations can be used to correctly represent the glycoprotein conformations, such as heparinase II, allowing characterizing its properties, as well as quantifying its interactions with metallic cofators and the role of the glycosylation site. Thus, is generated a solid basis to the study of the other heparinases, their respective specificities, and finally to the design of new candidates to hemostatic process modulating agents.