El objetivo de esta investigación fue seleccionar las condiciones que permitan la producción de enzimas pectinasas, a partir de cáscaras de naranja, empleando Actinomyces naeslundii. En la primera fase, se determinaron las condiciones de pH , temperatura, agitación y aireación, para un buen crecimiento del microorganismo. En la segunda, se empleó el diseño experimental Plackett-Burman, mediante la evaluación de ocho nutrientes, con dos niveles de variación. Los nutrientes fueron: cáscara de naranja, sulfato de amonio, úrea, sulfato ferroso, cloruro de calcio, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y carbonato de sodio, utilizándose matraces Erlenmeyer con 150 mL de medio experimental pH 7.00 a 37 ºC y 300 rpm por 5 días. En la tercera fase, fue realizada la optimización del medio de cultivo experimental, siguiendo el diseño de Box-Benhken, en el que hubo evaluación de las concentraciones de cáscara de naranja, sulfato de amonio y sulfato ferroso en tres niveles. Con los resultados obtenidos, se realizó el análisis de regresión múltiple. Los cálculos y gráficos estadísticos fueron ejecutados con el software Statistical 2.1. obteniéndose la máxima producción de enzimas, con las siguientes concentraciones: cáscara de naranja 16.7 g / L, sulfato de amonio 5 g /L y sulfato ferroso 0.013 g / L, obteniéndose 0.65 U.I. / mL de actividad enzimática, en tres días de biotransformación. / The objective of this research was to choice the conditions that they permit to optimize the pectinasas enzymes production using orange skins and Actinomyces naeslundii; on first phase was used qualitative techniques for to determinate the conditions of pH, cultivation temperature, agitation and aeration for a good growth microorganism. On the second phase was used the Plackett- Burman design through the investigation of eight nutrients with two variation levels; The eight nutrients was: oranges skin, ammonium sulfate, urea, ferrous sulfate, calcium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate y sodium carbonate. It was used Erlenmeyer flask with 150 mL of experimental medium pH 7, to 37 ºC, agitation to 300 rpm for 5 days. Third phase of optimization was developed through Box- Benhken design, oranges skin, ammonium sulfate and ferrous sulfate concentration were evaluated on three level. It was realized a multiple regression analyses with the three variables found previously . calculus and graphics were developed with Statistical 2.1 software. Optimum Parameters were: oranges skin 16.7 g / L, ammonium sulfate 5 g / L and ferrous sulfate 0.013 g / L. it was obtained 0.65 UI / mL of enzymatic activity in three days of biotransformation.

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar aspectos biológicos básicos do fungo celulolítico Humicola sp. Assim, através da auxanografia, determinou-se que biotina e tiamina eram necessárias ao meio mínimo, para o desenvolvimento de culturas transferidas por inoculação de ponto; contudo, raramente ocorreu germinação nesse meio, quando suspensões de esporos foram semeadas. Devido ao crescimento não individualizado em meio completo, cinco redutores de crescimento foram ensaiados, optando-se pela utilização de citrato de sódio 0,700%, o qual possibilitou redução de 70,1% no diâmetro da colônia, sem prejuízo da sobrevivência. Para indução de mutação foram utilizados: ácido nitroso, etil metano sulfonato, luz ultra-violeta e radiação gama, sendo estabelecidas as curvas de sobrevivência de esporos desse fungo, quando submetidos a esses mutagênicos. Foram então isolados três mutantes auxotróficos e 27 mutantes morfológicos, que posteriormente foram caracterizados. Observações citológicas de núcleos em 250 esporos da linhagem selvagem indicaram que a classe mais freqüente, constituía de 12 núcleos por esporo, evidenciando o estado multinuclear dos conídios desse·fungo. Isso pode permitir a ocorrência de heterocariose, e ser responsável, pelo menos em parte, pela variabilidade observada. As curvas de distribuição do numero de núcleos por esporo dos mutantes morfológicos, apresentaram máximos para as classes 6, 12, 18 e 24 núcleos, sendo que a linhagem mor10 apresentou pico em 3, podendo ser esse o numero básico de núcleos em esporos dessa espécie. Estudo do comportamento cromossomal durante a divisão nuclear demonstrou que a mitose é similar a de outros fungos filamentosos. O número de cromossomos, observados no final da metáfase, não pode ser determinado, com segurança, mas sugeriu-se estar entre 6 e 8. Em culturas de Humicola sp foi freqüentemente observada anastomose de hifas, possibilitando a ocorrência de heterocariose e/ou heteroplasmose e, indicando que o ciclo parassexual pode ocorrer nessa espécie. A interação entre vários pares de mutantes morfológicos produziu conídios pigmentados semelhantes aos da linhagem selvagem, indicando a ocorrência de algum tipo de sintrofismo ou complementação morfológica. A linhagem selvagem e alguns mutantes morfológicos apresentaram variabilidade quanto à morfologia e produção de celulases. Assim, após várias tentativas de estabilização da linhagem selvagem e de alguns mutantes morfológicos, foram determinadas as atividades exoglucanase, endoglucanase, β-glicosidase, amilase e protease neutra dos mesmos. A atividade β-glicosidase do mutante mor13 foi superior à do selvagem e mor21 destacou-se como melhor produtor de amilase, apesar do selvagem ter demonstrado boa produção das referidas enzimas. Coeficiente de correlação altamente significativo foi verificado entre as atividades exoglucanase-endoglucanase, sugerindo que as mesmas devem ser correguladas nesse microorganismo. Correlações significativas foram verificadas, também entre exoglucanase - protease, endoglucanase - protease e β-glicosidase - protease. / This research was carried out aiming to study some biological aspects of Humicola sp., a cellulolytic fungus. Through the auxanographical assay, it was determined that biotin and thiamine are essential for the growth of this fungus. It rarely occured germination in minimal medium, when spore suspensions were plated. Since the colonies were not grown in complete medium independently, five growth reducers were tested. Sodium citrate at the concentration of 0.700% reduced in 70.1% of the colony size, however did not affect the fungus survival. Nitrous acid, sulfonethylmethane, ultra-violet light and gamma ray were used to induce mutation. The survival ratio of this fungus was observed. From these treatments, three auxotrophic and 27 morphological mutants were isolated and characterized. From the cytological observation, multinuclear conditions were observed in the spore ce11s and myce1ium both wild and mutant strains. It might be possible the occurrence of heterokaryosis and probably it is·responsible for part of the variability. Observations of the nuclei in 250 spores of wild strains showed that the most frequent class included 12 nuclei per spore. Classes with 6, 12, 18 and 24 nuclei per spore were observed in morphological mutants. Three nuclei as the most frequent class was observed in the mutant strain mor10. It suggested that the basic number of nuclei in this fungus is three. The chromosomal behaviour showed a typical mitosis similar to other filamentous fungi. The chromosome number observed at the end of metaphase could not properly determined, however it might be between 6 and 8. In general, Humicola sp. showed anastomosis and it allows the occurrence of heterokaryosis and/or heteroplasmosis. It suggests that the parasexual cycle can occur in this fungus. The association of two morphological mutants produced pigmented spores suggesting some kind of synthrophism or morphological complementation. The wild strain and some morphological mutants showed wide variability concerning to morphology and cellulase production. Five enzyme systems: exoglucanase, endoglucanase, Βglucosidase, amylase and neutral protease activities were analysed in wild and selected mutants. Besides the suitable production of Βglucosidase and amylase by the wild strain, the mutant mor13 was better producer of Βglucosidase and mor21 for amylase. Highly significant level of correlation was observed between exoglucanase and endoglucanase activities showing co-regulation of these enzymes in this fungus. Significant level of correlations were obtained to exog1ucanase-protease, endoglucanase-protease and Βg1ucosidase-protease production, as well.

Na doença periodontal associada à placa dentobacteriana, produtos bacterianos difundem-se através dos tecidos periodontais, induzindo mecanismos de defesa não específicos e específicos, com síntese de vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo o óxido nítrico (NO). A enzima responsável pela produção de NO, a NO sintase (NOS), foi identificada em vários tipos celulares e possui ação direta sobre o metabolismo ósseo, bem como sobre fenômenos destrutivos teciduais e imunopatológicos. Com o objetivo de analisar a presença de NO na doença periodontal, realizamos um estudo quantitativo geral e proporcional com análise estatística de células iNOS positivas em amostras de tecidos gengivais clinicamente saudáveis, gengivites associadas à placa dentobacteriana e periodontites crônicas localizadas, através da técnica imuno -histoquímica. Significante aumento do número de células iNOS positivas por mm2 foi observado em amostras de gengivites e periodontites, comparadas ao grupo controle. Em todos os grupos, a maioria das células iNOS positivas eram mononucleares apresentado fraca a moderada imunorreatividade. Por outro lado, as células polimorfonucleares iNOS positivas demonstraram intensa imunomarcação, independente do estágio da doença, e apenas a porcentagem de células polimorfonucleares iNOS positivas apresentaram significante aumento comparada àquela do grupo controle. Nossos resultados indicam que, nos tecidos periodontais, o NO aumenta na presença de doença inflamatória. Neste contexto, o NO pode estar associado com a regulação da destruição tecidual e reabsorção óssea ou ainda com fenômenos imunopatológicos. Nossos resultados indicam também uma via adicional de ativação nas células inflamatórias na doença periodontal, em especial os polimorfonucleares neutrófilos, que expressam iNOS significativamente, provavelmente representando uma importante origem de óxido nítrico nesta doença. / In periodontal disease, bacterial products of the subgingival plaque diffuse through the periodontal tissue, inducing non-specific and specific defense mechanisms, with the consequent synthesis of various pro-inflammatory mediators, including nitric oxide (NO). The enzyme responsible for NO production, the NO synthase (NOS), has been identified in several cell types and the NO has a direct action on osseous metabolism and may also take on the tissue destruction and in immunopathological phenomena. In order to further characterize the presence of NO in human periodontal disease, we undertook a general and proportional quantitative study with statystical analysis of iNOS positive cells in sam ples of clinically healthy gingival tissues, plaque-induced gingivitis and localizated chronic periodontitis using immunohistochemistry. A significant increase in the number of iNOS+ cells per mm2 was found in the samples of the gingivitis and periodontitis compared to those of the control. In all groups almost all of the iNOS+ cells were mononuclear demonstrating weak to moderate immunoreactivity. Conversely, polymorphonuclear cells showed intense immunoreactivity for iNOS independent of the disease stage, and only the percentage of iNOS+ polymorphonuclear cells in the inflammatory infiltrate demonstrated a significant increase when compared with the control. Taken together, our results indicate that NO augments in the presence of periodontal disease, which may be associated with the regulation of tissue destruction, bone resorption and immunopathological phenomena. In addition, our findings also suggest that the inflammatory cells present an additional activation pathway on inflammatory cells in the periodo ntal disease, specially of the polymorphonuclear cells, that it express significant iNOS and probably represent an important source of nitric oxide in human periodontal disease.

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar aspectos biológicos básicos do fungo celulolítico Humicola sp. Assim, através da auxanografia, determinou-se que biotina e tiamina eram necessárias ao meio mínimo, para o desenvolvimento de culturas transferidas por inoculação de ponto; contudo, raramente ocorreu germinação nesse meio, quando suspensões de esporos foram semeadas. Devido ao crescimento não individualizado em meio completo, cinco redutores de crescimento foram ensaiados, optando-se pela utilização de citrato de sódio 0,700%, o qual possibilitou redução de 70,1% no diâmetro da colônia, sem prejuízo da sobrevivência. Para indução de mutação foram utilizados: ácido nitroso, etil metano sulfonato, luz ultra-violeta e radiação gama, sendo estabelecidas as curvas de sobrevivência de esporos desse fungo, quando submetidos a esses mutagênicos. Foram então isolados três mutantes auxotróficos e 27 mutantes morfológicos, que posteriormente foram caracterizados. Observações citológicas de núcleos em 250 esporos da linhagem selvagem indicaram que a classe mais freqüente, constituía de 12 núcleos por esporo, evidenciando o estado multinuclear dos conídios desse·fungo. Isso pode permitir a ocorrência de heterocariose, e ser responsável, pelo menos em parte, pela variabilidade observada. As curvas de distribuição do numero de núcleos por esporo dos mutantes morfológicos, apresentaram máximos para as classes 6, 12, 18 e 24 núcleos, sendo que a linhagem mor10 apresentou pico em 3, podendo ser esse o numero básico de núcleos em esporos dessa espécie. Estudo do comportamento cromossomal durante a divisão nuclear demonstrou que a mitose é similar a de outros fungos filamentosos. O número de cromossomos, observados no final da metáfase, não pode ser determinado, com segurança, mas sugeriu-se estar entre 6 e 8. Em culturas de Humicola sp foi freqüentemente observada anastomose de hifas, possibilitando a ocorrência de heterocariose e/ou heteroplasmose e, indicando que o ciclo parassexual pode ocorrer nessa espécie. A interação entre vários pares de mutantes morfológicos produziu conídios pigmentados semelhantes aos da linhagem selvagem, indicando a ocorrência de algum tipo de sintrofismo ou complementação morfológica. A linhagem selvagem e alguns mutantes morfológicos apresentaram variabilidade quanto à morfologia e produção de celulases. Assim, após várias tentativas de estabilização da linhagem selvagem e de alguns mutantes morfológicos, foram determinadas as atividades exoglucanase, endoglucanase, β-glicosidase, amilase e protease neutra dos mesmos. A atividade β-glicosidase do mutante mor13 foi superior à do selvagem e mor21 destacou-se como melhor produtor de amilase, apesar do selvagem ter demonstrado boa produção das referidas enzimas. Coeficiente de correlação altamente significativo foi verificado entre as atividades exoglucanase-endoglucanase, sugerindo que as mesmas devem ser correguladas nesse microorganismo. Correlações significativas foram verificadas, também entre exoglucanase - protease, endoglucanase - protease e β-glicosidase - protease. / This research was carried out aiming to study some biological aspects of Humicola sp., a cellulolytic fungus. Through the auxanographical assay, it was determined that biotin and thiamine are essential for the growth of this fungus. It rarely occured germination in minimal medium, when spore suspensions were plated. Since the colonies were not grown in complete medium independently, five growth reducers were tested. Sodium citrate at the concentration of 0.700% reduced in 70.1% of the colony size, however did not affect the fungus survival. Nitrous acid, sulfonethylmethane, ultra-violet light and gamma ray were used to induce mutation. The survival ratio of this fungus was observed. From these treatments, three auxotrophic and 27 morphological mutants were isolated and characterized. From the cytological observation, multinuclear conditions were observed in the spore ce11s and myce1ium both wild and mutant strains. It might be possible the occurrence of heterokaryosis and probably it is·responsible for part of the variability. Observations of the nuclei in 250 spores of wild strains showed that the most frequent class included 12 nuclei per spore. Classes with 6, 12, 18 and 24 nuclei per spore were observed in morphological mutants. Three nuclei as the most frequent class was observed in the mutant strain mor10. It suggested that the basic number of nuclei in this fungus is three. The chromosomal behaviour showed a typical mitosis similar to other filamentous fungi. The chromosome number observed at the end of metaphase could not properly determined, however it might be between 6 and 8. In general, Humicola sp. showed anastomosis and it allows the occurrence of heterokaryosis and/or heteroplasmosis. It suggests that the parasexual cycle can occur in this fungus. The association of two morphological mutants produced pigmented spores suggesting some kind of synthrophism or morphological complementation. The wild strain and some morphological mutants showed wide variability concerning to morphology and cellulase production. Five enzyme systems: exoglucanase, endoglucanase, Βglucosidase, amylase and neutral protease activities were analysed in wild and selected mutants. Besides the suitable production of Βglucosidase and amylase by the wild strain, the mutant mor13 was better producer of Βglucosidase and mor21 for amylase. Highly significant level of correlation was observed between exoglucanase and endoglucanase activities showing co-regulation of these enzymes in this fungus. Significant level of correlations were obtained to exog1ucanase-protease, endoglucanase-protease and Βg1ucosidase-protease production, as well.

Orientador: Lorena Benathar Ballod Tavares. / Orientador: Edson Alves de Lima. / Dissertação (Mestrado em Engenharia Ambiental) - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Centro de Ciências Tecnológicas.

Na indústria coureira há uma grande preocupação com o meio ambiente, já que a maioria das etapas para o processamento do couro são realizadas através de processos químicos. Estes processos devem ser controlados para um baixo impacto ambiental e menor custo de tratamento de resíduos. Este trabalho visa desenvolver um extrato enzimático completamente biodegradável, constituído por lipases de microrganismos, para diminuir o uso de tensoativos nos curtumes. Para tal foi necessário o uso de microrganismos que produzem lipases de maneira eficiente para substratos específicos com a variação no espectro de temperatura e pH utilizados nos processos de processamento do couro. Portanto, foi realizado o isolamento de diversos microrganismos em um curtume e estes foram submetidos à análise da produção de lipases induzida por gordura animal. A partir destes isolados foram selecionados e identificados os melhores produtores de lipases: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris e Proteus sp. Dentre estes microrganismos, o mais promissor, foi a levedura P. pastoris. A produção de lipases é afetada por diferentes fatores ambientais, assim foram testados, em escala piloto, a influência do tempo de cultivo, pH, temperatura de cultivo e agitação. Além disso, também foram testados o uso de goma arábica e três diferentes surfactantes no cultivo para o possível aumento da produção da enzima. As melhores condições de crescimento para uma maior produção de lipase por P. pastoris foram otimizadas em 72 h, 28ºC, pH 8,0 e 200 rpm. A adição de Triton X-100 ao final do cultivo também aumentou a atividade de lipase. A partir destes resultados a levedura foi submetida ao cultivo em reator de 10 L e determinados o melhor tempo de cultivo, o consumo de glicose e a densidade óptica a 600 nm. O melhor tempo de cultivo manteve-se em 72 h. Ao final deste cultivo, o extrato bruto foi utilizado para determinar a estabilidade da enzima à formulação empregada nos processos de curtimento, já que as condições destes processos podem afetar a atividade de algumas enzimas. A enzima não se mostrou estável aos químicos utilizados no processamento de couros. Por isto, para testar a eficácia da enzima em relação aos produtos encontrados no mercado algumas etapas foram reformuladas para que a enzima pudesse manter a sua atividade original. Os resultados destes experimentos mostraram-se satisfatórios, provando que a produção e utilização desta enzima no mercado é promissora. / The tanning industry has a great concern with the environment, since the majority of stages for leather processing is carried out using chemicals. These processes must be controlled for a low ambient impact and lesser cost of residues treatment. This work aims to develop a completely biodegrading enzymatic extract consisting of microbial lipases, to diminish the use of surfactants in the tanneries. For this product production is necessary the use of efficient microorganisms producing lipases for specific substrates with the variation in the specter of temperature and pH used in the tannery. Therefore, the screening of diverse microorganisms in a tannery was carried out and these had been submitted to the analysis of the induced lipases production with animal fat. It had been selected and identified the best lipases producers: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris and Proteus sp. Among these microorganisms, the most promising was P. pastoris. The lipase production is affected by different ambiental factors, thus it was tested, in scale pilot, the influence of the growth time, pH, growth temperature and agitation. Moreover, also the use of arabic gum and three different surfactants in the culture for the possible increase of the enzyme production was tested. The best growth conditions for the best lipase production of P. pastoris are 72 h, 28ºC, pH 8.0 and 200 rpm. The addition of Triton X-100 in the cultivation end also increases the lipase activity. Through these results the yeast was grown in 10 L culture reactor. During this cultivation the best growth time, the glucose consumption and the optical density at 600 nm were determined. The best growth time remained in 72 h. This culture crude extract was used to determine the enzyme stability to the formulation used in the tanning processes, since the conditions of these processes may affect enzyme activity. The enzyme was not stable in the presence of these chemicals. To compare the enzyme effectiveness with the chemicals and commercial enzymes, some processing stages were improved, so that the enzyme could keep its original activity. These results were satisfactory, suggesting that this enzyme production and its commercial use are promising.

Resumo: Nas bactérias Gram-positivas Streptomyces davawensis e Streptomyces coelicolor a transcrição dos genes responsáveis pela biossíntese de riboflavina (RF; vitamin B2) ribBMAH é iniciada a partir do promoter da riboflavina (Prib). Nas duas espécies um ribB FMN riboswitch está presente imediatamente à montante em relação a Prib, regulando a expressão gênica ao nível traducional. S. davawensis produz o atibiótico roseoflavina (RoF), um análogo de riboflavina, o qual é convertido a roseoflavina 5'-mononucleotídeo (RoFMN) no citoplasma das células alvo. S. davawensis é resistente a RoF, enquanto que S. coelicolor é sensível a RoF. Através de experimentos de transcrição/tradução in vitro foi demonstrado que o ribB FMN riboswitch de S. coelicolor é desligado na presença de RoFMN. Em contraste, o ribB FMN riboswitch de S. davawensis mostrou-se mais ativo na presença de RoFMN. Compatível com esse resultado, a atividade enzimática correspondente ao produto do primeiro gene (ribB) do cluster ribBMAH foi fortemente reduzida em S. coelicolor, mas não em S. davawensis, quando ambas foram cultivadas em meio acrescido de RoF. Através de mutagênese sítio-dirigida foi identificado um único nucleotideo (A61) na estrutura do ribB FMN riboswitch de S. davawensis como sendo responsável pela resposta diferencial a RoFMN. A introdução do ribB FMN riboswitch de S. davawensis em S. coelicolor gerou uma linhagem resistente a RoF. O presente trabalho apresenta evidências de que o ribB FMN riboswitch de S. coelicolor é controlado termodinamicamente, enquanto que o ribB FMN riboswitch de S. davawensis é controlado cineticamente. Os últimos resultados muito provavelmente explicam as diferentes respostas com relação a RoFMN observada para os dois ribB FMN riboswitches quase idênticos. Em resumo, os... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the Gram-positive soil bacterium Streptomyces davawensis and in the closely related Streptomyces coelicolor transcription of the riboflavin (RF; vitamin B2) biosynthetic genes ribBMAH originates from the riboflavin promoter (Prib). In both species a ribB (ribo)flavin mononucleotide (FMN) binding riboswitch is present immediately downstream of Prib regulating gene expression at the translational level. S. davawensis produces the antibiotic roseoflavin (RoF), a RF analog, which is converted to roseoflavin mononucleotide (RoFMN) within the cytoplasm of target cells. S. davawensis is RoF resistant, whereas S. coelicolor is RoF sensitive. In vitro transcription/translation experiments revealed that the S. coelicolor ribB FMN riboswitch was turned off in the presence of RoFMN. In contrast, the S. davawensis ribB FMN riboswitch was found to be more active in the presence of RoFMN. In line with this finding was that the activity of the product of the first gene (ribB) of the ribBMAH cluster was strongly reduced in S. coelicolor, but not in S. davawensis, when cells were grown in the presence of RoF. Sequence alignments and site directed mutagenesis experiments identified a single nucleotide (A61) within the S. davawensis ribB FMN riboswitch which is responsible for its specific response to RoFMN. Introduction of the S. davawensis ribB FMN riboswitch to S. coelicolor produced a RoF resistant S. coelicolor strain. The present work gives evidence that the ribB FMN riboswitch of S. coelicolor is thermodynamically controlled whereas the S. davawensis ribB FMN riboswitch is kinetically controlled. The latter finding most likely explains the different response of the two almost identical ribB FMN riboswitches with respect to RoFMN. Altogether, the present results show that a highly specialized FMN riboswitch confers RoF resistance to... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Eleonora Cano Carmona / Coorientador: Matthias Mack / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Maria Celia Bertolini / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-15Bitstream added on 2014-06-13T18:41:24Z : No. of bitstreams: 1 aragon_cc_dr_araiq_parcial.pdf: 352399 bytes, checksum: 4041cfc92fd5c40daad9f3969d15d31d (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-23T17:35:46Z: aragon_cc_dr_araiq_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-02-23T17:36:21Z : No. of bitstreams: 1 000718951.pdf: 1019999 bytes, checksum: b74f94cf1bb93fd6c428e6e6426f5372 (MD5) / As xilanases são glicosidases que catalisam a hidrólise das ligações 1,4-β-xilosídicas da xilana e que possuem potencial biotecnológico em vários processos industriais, como na clarificação de sucos e vinhos, na fabricação de pães, na filtração da cerveja e no tratamento das polpas celulósicas. Recentemente, recebem atenção pela produção dos xilooligossacarídeos como ingredientes prebióticos. Embora possuam diversas vantagens sobre os métodos químicos, as enzimas são, geralmente, limitadas para uso industrial. A imobilização em suportes sólidos melhora a estabilidade dos biocatalisadores e o controle operacional, promovendo a recuperação do produto sem a contaminação pela enzima. Assim, os objetivos deste trabalho foram: produzir e caracterizar a xilanase de Aspergillus niger; imobilizar covalentemente, em suportes sólidos, a xilanase de A. niger e quatro outras, provenientes de diferentes fontes (Aspergillus versicolor, Trichoderma longibrachiatum, Thermomyces lanuginosus e Streptomyces halstedii); caracterizar os derivados obtidos; analisar o produto de hidrólise da xilana pelos derivados. A xilanase de A. niger mostrou ótima estabilidade até 55°C, com meia-vida de 15 minutos a 60°C, e sua produção foi induzida por pequenas concentrações de xilose. O fungo secretou pelo menos duas isoformas com atividade xilanolítica. A xilanase I foi purificada em uma única etapa, por adsorção em suporte ativado com quelatos, assim como a enzima de S. halstedii, contendo cauda de histidina. A xilanase de T. longibrachiatum (comercial) foi parcialmente purificada com suportes iônicos, e as de T. lanuginosus (comercial) e A. versicolor já apresentavam alto grau de pureza. As enzimas foram imobilizadas em agarose ativada com diferentes grupos reativos, com fatores de estabilização entre 12 (T. lanuginosus) e 600... / Xylanases are glycosidases that catalyze the hydrolytic cleavage of β-1,4-linked polymers of D-xylose and they have biotechnological potential in various industrial processes such as in the clarification of juices and wines, in the manufacturing of breads, in beer filtration and in the treatment of cellulose pulps. Recently, attention is given to the production of xylo-oligosaccharides as prebiotic ingredients. While enzymes have several advantages over chemical methods, they are generally limited for industrial use. Immobilization on solid supports improves the stability of the biocatalyst and the operational control, and promotes the easy recovery of the product without contamination by the enzyme. The objectives of this study were: to produce and characterize xylanases from Aspergillus niger; to immobilize the xylanase of Aspergillus niger and four others from different sources (Aspergillus versicolor, Trichoderma longibrachiatum, Thermomyces lanuginosus and Streptomyces halstedii) covalently on solid supports; to characterize the derivatives obtained; to analyze the products profile of xylan hydrolysis by the derivatives. The xylanase of A. niger showed excellent stability up to 55°C, with a half-life of 15 minutes at 60°C, and its production was induced by low concentrations of xylose. The fungus produced at least two isoforms with xylanolytic activity. Xylanase I was purified in one step by adsorption on support activated with chelates, as well as the histidine-tagged enzyme of S. halstedii. The xylanase of T. longibrachiatum (commercial) was partially purified with ionic supports, and those from T. lanuginosus (commercial) and A. versicolor already showed high degree of purity. The xylanases were then immobilized on agarose activated with different reactive groups, and presented stabilization factors between 12 (T. lanuginosus)... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:01:21Z : No. of bitstreams: 1 tavano_ol_dr_araiq.pdf: 761592 bytes, checksum: 1c98a6250ff1a76b1380af40256bd7b4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho estudou-se a possibilidade de imobilização de uma amilase produzida por cepa de Neurospora crassa (mutante exo-1), e produção de derivados ativos e estabilizados. Foram testados diferentes suportes sólidos, incluindo-se diferentes suportes de agarose e suportes epóxidos preparados com Eupergit e Sepabeads. Além da agarose 10BCL foi utilizada a agarose 4BCL para que se verificasse possíveis dificuldades difusionais do substrato desta enzima, o amido. O acompanhamento das cinéticas de imobilização com a maltose como alternativa ao amido, também colaborou em evidenciar a dificuldade de difusão do amido através de ambos os suportes glioxil-agarose. O derivado obtido com agarose 10BCL, assim como aquele produzido com uso de suporte Eupergit foram os derivados mais estáveis, capazes de manter 100% de suas atividades após 12 horas de incubação à temperatura de 60°C, quando na forma solúvel a enzima conservou apenas 12% de sua atividade inicial. Quando incubados a 70°C destacou-se o derivado de glioxil-agarose (10BCL) como mais estável, mantendo cerca de 30% de sua atividade inicial após 4 horas de incubação. Quando testada a utilização de uma agarose comercial alternativa, sem percentual de crosslink conhecido, de menor custo, sua aplicação mostrou-se promissora e os derivados produzidos além de ativos se apresentam estáveis frente à temperatura. Em conjunto, as informações contidas no presente estudo indicam que a amilase de Neurospora crassa apresenta-se promissora em comparação às amilases de mercado aqui estudadas, tanto em sua utilização na forma solúvel quanto no que se relaciona a produção de derivados estáveis. / In this work were studied the immobilization of amylase from Neurospora crassa (Mutant Exo-1). This amylase showed easily production, purification and high capacity of immobilization on agarose and epoxy supports. It was used crosslinked agarose with two polymer concentration: 4 and 10%. The 4BCL agarose presents bigger porous diameter than 10 BCL agarose, so, in this case, possible diffusion problems of the starch across the supports could be reduced. Also, in this study, we have tested two epoxy supports for this amylase immobilization, using Eupergit and Sephabeads supports. The activies of the obtained derivatives were measured using two substrates - maltose and starch. Both glyoxyl agarose support prepared with 4BCl and 10BCL agarose present diffusion problems when the starch was used as substrate to measure the immobilization course. The 10BCL glyoxyl derivative presented the highest thermal stability when comparing the others derivatives. Among the epoxy derivatives the Eupergit one were better than the derivatives obtained using Sepabeads as support. In a confrontation between the two best derivatives, that is, the glyoxyl 10 BCL and Eupergit derivatives, both of them were stable at 60º incubation, maintaining 100% of activities for 12 hours, while the soluble amylase preserved about 12% of initial activity. These two amylase derivatives only showed differences at 70ºC incubation, when the glyoxyl 10BCL amylase derivative was more thermally stable, preserving about 30% of the initial activity after 4 hours.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-25Bitstream added on 2014-06-13T18:41:25Z : No. of bitstreams: 1 cano_vsp_dr_araiq.pdf: 7066563 bytes, checksum: 8a9c3624091ccc481f0a5993a6d2b85a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em um rastreamento por duplo-híbrido, dois parceiros físicos de eIF5A foram identificados: Dys1 e Lia1 (Ligante de eIF5A). Lia1 foi identificada mais tarde como desoxihipusina hidroxilase. As interações físicas evidenciadas por duplo-híbrido foram confirmadas por copurificação. Mapeamento do sítios de ligação de eIF5A revelou que ambos os domínios N- e C-terminal podem ligar-se a Dys1, enquanto que o domínio Cterminal é suficiente para a ligação com Lia1. Pela primeira vez foi demonstrado in vivo que a estrutura secundária em -hélice, presente na extremidade N-terminal da proteína Dys1, pode modular a atividade da enzima através do impedimento estérico da entrada do substrato eIF5A no sítio ativo. Experimentos de inativação gênica mostraram que, em contraste com eIF5A e Dys1, Lia1 não é essencial para a viabilidade celular. Superexpressão do gene LIA1 não suprime o fenótipo temperatura-sensível de mutantes condicionais de eIF5A. Além disso, os alelos de TIF51A não são sinteticamente letais com a deleção de LIA1. Assim como previamente demonstrado para a enzima humana DOHH, o ferro também é essencial para a atividade hidroxilásica de Lia1. O sítio ativo de Lia1 é compreendido pelos resíduos de aminoácidos H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 e E271. A proteína recombinante é uma mistura de formas ligada e não ligada ao metal, as quais foram separadas por gel nativo ou gel filtração, sugerindo um raio hidrodinâmico maior para a apoenzima. A forma mais alongada adotada por Lia1 na ausência do metal foi confirmada por ensaios de “quenching” da fluorescência do triptofano por acrilamida e SAXS. Além da alteração conformacional e inativação da enzima, a perda do metal levou à maior instabilidade de Lia1 na desnaturação térmica ou química. Os resultados obtidos em conjunto mostram que, além de manter a estabilidade da proteína... / In a two-hybrid screen, two eIF5A binding partners were identified: Dys1 and Lia1 (Ligand of eIF5A). Lia1 was further identified as deoxyhypusine hydroxylase. The two-hybrid interactions were confirmed by GST pulldown. Mapping binding sites for these proteins revealed that both eIF5A domains can bind to Dys1, whereas the C-terminal domain is sufficient to bind Lia1. We demonstrate for the first time in vivo that the N-terminal α-helix of Dys1 can modulate enzyme activity by impairing eIF5A interaction. Gene disruption studies showed that, in contrast to the essential nature of eIF5A and Dys1, Lia1 is not essential for cell viability. Overexpression of LIA1 gene does not suppress temperature-sensitivity of eIF5A mutants. Moreover, these TIF51A alleles are not synthetically lethal with a knockout strain of LIA1. Recently, It was shown that LIA1 encodes the enzyme responsible for the final step of hypusine formation, the metalloenzyme deoxyhypusine hydroxylase. As the hydroxylation step in hypusine synthesis is not required for eIF5A activity, lack of genetic interactions between these two genes is expected. As previously demonstrated for the human enzyme DOHH, iron is also essential for Lia1 hydroxylase activity. Lia1 active site is formed by aminoa cid residues H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 and E271. The recombinat protein is a mixture of iron-bound and iron-free forms, which were separated by native gel or gel filtration, suggesting a bigger hydrodynamic radius for the apoenzyme. The elongated shape adopted by Lia1 in the absence of the metal was confirmed by acrylamide quenching of tryptophan intrinsic fluorescence and SAXS. In addition to the conformational change and enzyme inactivation, loss of iron led to higher instability of Lia1 during thermal or chemical unfolding. Taken together, the results show that, besides the ability of iron to keep the stability of the protein...(Complete abstract click electronic access below)