Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431138-Texto+Completo-0.pdf: 1089028 bytes, checksum: b3d0bb2ab98885aab405ecc4329e3335 (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis (TB) is the major cause of human mortality from a curable infectious disease, attacking mainly in developing countries. Among targets identified in Mycobacterium tuberculosis genome, enzymes of the shikimate pathway deserve special attention, since they are essential to the survival of the microorganism and absent in mammals. The object of our study is shikimate kinase (SK), the fifth enzyme of this pathway. We applied virtual screening methods in order to identify new potential inhibitors for this enzyme. In this work we employed MOLDOCK program in all molecular docking simulations. Accuracy of enzyme-ligand docking was validated on a set of 12 SK-ligand complexes for which crystallographic structures were available, generating root-mean square deviations below 2. 0 Å. Application of this protocol against a commercially available database allowed identification of new molecules with potential to become drugs against TB. Besides, we have identified the binding cavity residues that are essential to intermolecular interactions of this enzyme. / Entre as doenças infecciosas, a tuberculose se destaca, como sendo a principal causa de morte humana, principalmente em países em desenvolvimento. Entre os alvos identificados no genoma de Mycobacterium tuberculosis, as enzimas da via do chiquimato merecem atenção especial, pois são essenciais para a sobrevivência dos microorganismos e ausente em mamíferos. O objeto do nosso estudo é a quinta enzima desta via, a Chiquimato Quinase (SK). Foram aplicados métodos de virtual screening, a fim de identificar novos potenciais inibidores para esta enzima. Neste trabalho nós empregamos o programa MOLDOCK em todas as simulações de docking molecular. A precisão do docking enzima-ligante foi validada em um conjunto de 12 complexos de SK- ligante, para aquelas estruturas cristalográficas que estavam disponíveis, gerando um RMSD abaixo de 2,0 Å. A aplicação deste protocolo em um banco de dados comercialmente disponível permitiu a identificação de novas moléculas com potencial para se tornar drogas contra tuberculose. Além disso, foram identificados os resíduos da cavidade de ligação que são essenciais para as interações intermoleculares desta enzima.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412457-Texto+Completo-0.pdf: 570496 bytes, checksum: cf4c4f06ed8ca9eb35fd95c4cacc5cb0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Human tuberculosis (TB), caused by an infectious agent, Mycobacterium tuberculosis, represents a global threat leading the causes of death in adults, responsible for killing approximately 2 million of people a year throughout the world. It is estimated that one third of the population is latently infected with the bacillus. India, China, Indonesia, South African, and Nigeria are the first five countries in the raking of the greatest absolute numbers of cases and Brazil is in the 15th position. The M. tuberculosis can remain viable in the infected host cell for a long time. This condition is called latent TB, which is the non-contagious form of the disease when the bacteria persists inactive. More efficient and less toxic chemotherapy agents are needed to reduce the duration of current treatments, as well as to improve the possibilities of treatment for MDR-TB and XDR-TB strains. Moreover, two major approaches in combating this disease are a more effective treatment to latent TB, urgent to prevent the disease developing to the active form, and drugs that do not interfere with the anti-retroviral therapy used for AIDS. Enzymes involved in purine salvage pathway are of special interest to this effort. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT; EC 2. 4. 2. 8) is a purine salvage enzyme that catalyzes the Mg+2-dependent reversible transfer of the 5’-phosphoribosyl group from α-D-ribofuranose 1’- pyrophosphate 5’-phosphate (also known as 5’-phosphorybosil-α-1’-pyrophosphate; PRPP) to a purine basis (guanine, hypoxanthine) to form the corresponding ribonucleotides IMP (inosine 5`-monophosphate), and GMP (guanosine 5`- monophosphate) with the release of PPi (inorganic pyrophosphate).In this work, we have reported the cloning, expression in E. coli BL21(DE3) cells, purification for the homogeneity, N-terminal sequencing, mass espectrometry analysis, and determination of apparent steady-state kinetic parameters of HGPRT enzyme. / A tuberculose humana (TB), causada por um único agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis, representa uma ameaça global liderando a morte em adultos, responsável por cerca de dois milhões de óbitos por ano no mundo. Estima-se que aproximadamente um terço da população está latentemente infectada com o bacilo. A Índia, China, Indonésia, África do Sul e Nigéria são os primeiros cinco países do ranking com maiores números absolutos de casos e o Brasil encontra-se na 15ª posição. O M. tuberculosis pode permanecer viável dentro da célula do hospedeiro infectado por longo tempo. Esta condição é chamada de TB latente, que é a forma não contagiosa da doença, onde a bactéria permanece inativa. Agentes quimioterápicos mais eficazes e menos tóxicos são necessários para reduzir a duração do tratamento atual, assim como melhorar as possibilidades de tratamento para as cepas MDR-TB e XDR-TB. Além disso, há necessidade de um tratamento eficaz para a TB latente, impedindo que a doença se desenvolva para a forma ativa e, também, drogas que não interfiram com os anti-retrovirais, utilizados para o tratamento da AIDS. Neste contexto, enzimas envolvidas no salvamento de purinas são de interesse particular. A hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT – EC 2. 4. 2. 8) é uma enzima chave da via de salvamento de purinas que catalisa a transferência reversível, dependente de magnésio, de um grupo fosforibosil do 5- fosfo-α-D-ribosil-pirofosfato (PRPP) para uma base purina (hipoxantina ou guanina) para formar o ribonucleotídeo purina, inosina monofosfato ou guanosina monofosfato, liberando pirofosfato (PPi). Neste trabalho, relatamos a clonagem, a expressão em células E. coli BL21(DE3), a purificação para homogeneidade, o sequenciamento N-terminal, a análise da espectrometria de massas e a determinação dos parâmetros cinéticos aparentes da enzima HGPRT.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432437-Texto+Completo-0.pdf: 10723389 bytes, checksum: d0fa4e1abb05919515c5199dcf4ecc73 (MD5) Previous issue date: 2011 / The inhA gene from Mycobacterium tuberculosis (Mtb), encodes for an enoyl acyl carrier protein reductase, InhA, a key enzyme of the mycobacterial type II fatty acid elongation cycle and has been validated as an effective target for the development of anti-microbial agents. InhA catalyzes the NADH-dependent reduction of trans double bond between positions C2 and C3 of fatty acyl substrates. It is the target of isoniazid, a first line drug in the tuberculosis treatment. Mutations in InhA structural gene are associated with isoniazid resistance in vivo. Even though mutations within the inhA gene are known to facilitate isoniazid resistance, InhA remains a good candidate for drug design because: (i) the vast majority of the mutations found in isoniazid-resistant clinical isolates are associated with the isoniazid activator (KatG catalase-peroxidase); (ii) only one enoyl-ACP reductase is found in Mtb, unlike some of the other enzymes of bacterial FAS-II systems; (iii) the longer substrate chain length specificity of InhA distinguishes it from the enoyl-ACP reductases from other sources. Our goal with this work was to analyze in detail the structural and physicochemical available information about Mtb InhA using bioinformatics tools. As a result, we developed a pharmacophoric model based on the InhA substrate binding cavity that allowed the application of a virtual screening methodology focused in selecting ligands that satisfied these features, allowing so, a best complementarity with the target protein. Besides we tested the hability of four docking algorithms to find similar conformation to a molecule, providing clues that this would be the conformation closest that adopted in vivo. Finally, molecular dynamics simulations were employed to achieve a better comprehension of the interaction between InhA and a known inhibitor. / O gene inhA de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) codifica a enzima enoil redutase, InhA, uma enzima chave no ciclo de alongamento de ácidos graxos tipo II e têm sido validada como um alvo efetivo para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. A InhA catalisa a redução NADH-dependente da ligação dupla trans entre as posições C2 e C3 de substratos de ácidos graxos. Ela é o alvo da isoniazida, uma droga de primeira linha no tratamento da tuberculose. Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas com a resistência à isoniazida in vivo. Mesmo que mutações no gene inhA sejam conhecidas por facilitar a resistência à isoniazida, InhA ainda é uma excelente candidata a alvo para o planeamento de fármacos porque: (i) a grande maioria das mutações encontradas em isolados clínicos de cepas resistentes à isoniazida estão associadas com o ativador da isoniazida (KatG catalase-peroxidase); (ii) apenas uma enoil-ACP redutase é encontrada em M. tuberculosis, ao contrário de outras enzimas dos sistemas FAS-II de bactérias; (iii) a especificidade da InhA por substratos de cadeia mais longa a distingue das enoil-ACP redutases de outros tipos. Nosso objetivo com este trabalho foi de analisar em detalhe as informações estruturais e físico-químicas disponíveis sobre a InhA de Mtb utilizando ferramentas de bioinformática. Como resultado, foi desenvolvido um modelo farmacofórico baseado na estrutura do sítio de ligação ao substrato da InhA, permitindo a aplicação de uma metodologia de triagem virtual focada em selecionar ligantes que satisfizessem essas características, permitindo assim, a melhor complementariedade com a proteína alvo. Além disso testamos a habilidade de quatro algoritmos de docagem molecular em encontrar conformações semelhantes para uma mesma molécula, fornecendo indícios de que esta seja a conformação mais próxima àquela adotada in vivo. Por fim, simulações de dinâmica molecular foram empregadas para melhor compreensão da interação da enzima InhA com um inibidor já conhecido desta enzima.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431172-Texto+Completo-0.pdf: 1194899 bytes, checksum: 952b6d1718311a7687aedbe05f823d2b (MD5) Previous issue date: 2010 / The zebrafish is one of the most important vertebrate models for studying genetics, developmental biology, neurophysiology, and biomedicine, and it is used as a model of human diseases and for the development of new therapeutic drugs, including drugs for Alzheimer's disease treatment. Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease characterized by amyloid plaques deposition, development of neurofibrillary tangles, inflammation and neuronal loss in different parts of the brain that contribute to the cognitive impairment characteristic of the disease. The cholinergic system, the main system involved in this disease, presents acetylcholine (ACh) as a neurotransmitter and is strongly related to processes of learning and memory formation. Besides the cholinergic system, other neurotransmitter systems, such as the purinergic system are involved in Alzheimer’s pathology. The purine-derived nucleosides and nucleotides display a role as extracellular signaling molecules in various tissues via purinergic receptors. ATP has its extracellular levels controlled by a group of enzymes called ectonucleotidases, which includes ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-5'- nucleotidase, which carry out the degradation of purine nucleotides to adenosine, a nucleoside neuromodulator of cellular homeostasis. Polyphenols, compounds derived from plants, can act as modulators of cholinergic and purinergic signaling, present known antioxidant effects and no severe side effects, showing great potential as a treatment for Alzheimer's disease. Therefore, the aim of this study was to evaluate the potential neuroprotective role of polyphenols quercetin and rutin in the prevention of cognitive impairment caused by scopolamine, a cholinergic antagonist widely used for testing new drugs that facilitate cognitive abilities, as well as to analyze their effects on the enzymes responsible for modulation of neurotransmitters levels, such as ATP and acetylcholine. Our results have shown that administration of quercetin or rutin intraperitoneal (50 mg/kg) in zebrafish prevents cognitive deficits caused by exposure to scopolamine (200 μM), as demonstrated by increased latency to cross to the dark side of the inhibitory avoidance apparatus. None of the compounds in which the animals were exposed are able to alter the locomotor activity of the animals. Moreover, it has been observed that treatment with rutin followed by water exposure inhibited acetylcholine hydrolysis whereas the treatment with rutin followed by scopolamine exposure reduced ATP hydrolysis. Regarding the effects of quercetin, it has inhibited the AMP hydrolysis when its administration was followed by water or scopolamine exposure. Therefore, these results have demonstrated that polyphenols may display protective potential on to the cognitive impairment induced by scopolamine. Moreover, our findings have shown that rutin and quercetin per se are able to modulate the levels of acetylcholine, ATP, and adenosine in zebrafish brain. These results are promising regarding the possibility of preventive therapy to be carried throughout lifespan to avoid the occurrence of cognitive decline associated with aging. / O peixe zebra é um dos modelos vertebrados mais importantes para estudos de genética, biologia do desenvolvimento, neurofisiologia e biomedicina, sendo utilizado como um modelo de doenças humanas e para triagem de novas drogas, tais como fármacos para o tratamento da doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que se caracteriza pela deposição de placas amilóides, desenvolvimento de emaranhados de neurofibrilas, inflamação e perda neuronal em diversas partes do cérebro que contribuem para os déficits cognitivos característicos da doença. O sistema colinérgico, o principal sistema envolvido nesta doença, apresenta a acetilcolina (ACh) como neurotransmissor e está fortemente relacionado à processos de aprendizado e formação da memória. Além do sistema colinérgico, outros sistemas, como o sistema purinérgico, estão envolvidos na patologia da doença de Alzheimer. Os nucleosídeos e nucleotídeos derivados de purinas exercem um papel de moléculas sinalizadoras extracelulares em vários tecidos, através dos receptores purinérgicos. O ATP tem seus níveis extracelulares controlados por enzimas da família das ectonucleotidases, entre elas as ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e a ecto-5´-nucleotidase, que realizam a degradação de nucleotídeos púricos até adenosina, um nucleosídeo neuromodulador da homeostase celular. Os polifenóis, os quais são compostos derivados de plantas, podem atuar como moduladores da sinalização purinérgica e colinérgica, além de apresentarem efeitos antioxidantes, com ausência de efeitos colaterais severos, apresentando um grande potencial como tratamento para a doença de Alzheimer. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial neuroprotetor dos polifenóis quercetina e rutina na prevenção dos déficits cognitivos causados pela escopolamina, um antagonista colinérgico muito utilizado para testes de novos fármacos facilitadores da capacidade cognitiva, bem como seus efeitos sobre as enzimas responsáveis pela modulação dos níveis dos neurotransmissores ATP e acetilcolina. Os resultados obtidos demonstram que a administração intraperitonial de quercetina ou rutina (50 mg/kg) em peixe zebra previniu o déficit cognitivo causado pela exposição à escopolamina (200 μM), como demonstrado pelo aumento da latência para cruzar para o lado escuro do aparato da tarefa de esquiva inibitória. A exposição a estes compostos não promoveu alterações na locomoção dos animais. Além disso, foi observado que o tratamento com rutina seguido de exposição à água inibiu a hidrólise de acetilcolina enquanto que o tratamento com rutina seguido pela exposição à escopolamina diminuiu a hidrólise de ATP. Com relação aos efeitos da quercetina, esta inibiu a hidrólise de AMP quando sua administração foi seguida pela exposição à água ou escopolamina. Portanto, estes resultados demonstram que os polifenóis podem apresentar potencial protetor com relação ao prejuízo cognitivo induzido pela escopolamina. Além disso, nossos resultados demonstram que rutina e quercetina per se são capazes de modular os níveis de acetilcolina, ATP e adenosina em encéfalo de peixe zebra. Estes resultados são promissores em relação à possibilidade de terapia preventiva a ser realizada ao longo da vida, visando a não ocorrência de declínio cognitivo associado ao envelhecimento.

Orientadora : Prof. Dr. Jörg Wolfgang Metzger / Coorientadores: Profª. Drª. Arislete Dantas de Aquino e Prof. Dr. José Domingos Fontana / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Mestrado Profissional em Meio Ambiente Urbano e Industrial, em parceria com o Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial e a Universität Stuttgart. Defesa: Curitiba, 28/08/2017 / Inclui referências : f. 114-134 / Resumo: O bisfenol A (BFA) é um monômero empregado na fabricação de resinas epóxi e plásticos policarbonatados, e também como insumo para outros fins industriais. Este composto é classificado como um interferente endócrino capaz de causar perturbações no sistema endócrino, imunológico e nervoso dos seres vivos, além de causar sérios distúrbios ambientais. Os tratamentos físico-químicos para remoção deste tipo de poluente são dispendiosos. Assim, tratamentos com o emprego de enzimas fúngicas como as lacases podem ser uma alternativa promissora para este fim. Este trabalho teve como objetivo otimizar a produção da enzima lacase por meio do cultivo do fungo Trametes sp. com a adição de extratos de lignina bruta e indutores químicos, e sua aplicação na biorremediação de BFA em meio aquoso. O estudo da produção da lacase teve início com a aplicação de seis extratos de lignina bruta de bracatinga, peroba, pinus, bagaço de cana-de-açúcar, casca de soja e casca de trigo, em concentração de 1 g L-1 nos experimentos. Os extratos de peroba e bagaço de cana-de-açúcar apresentaram maior potencial indutor frente aos demais, de modo que foram empregados na otimização da produção de lacase por meio de um delineamento de experimentos fatorial fracionáro5-2, juntamente com os potenciais indutores químicos: dioxano, siringol e sulfato de cobre, estes na concentração de 1 mmol L-1. A biorremediação do BFA foi realizada pela aplicação de 500 U L-1 de lacase bruta em meio tamponado em pH 5 contendo 100 mg L-1 do contaminante que foi quantificado por cromatografia líquida (HPLC-DAD). A técnica analítica de espectrofotometria UV-Vis derivativa foi avaliada para a determinação do BFA em solução multicomponente. A faixa de pH ótimo para a lacase foi observada entre os valores de 4 a 6, na qual a atividade enzimática se manteve estável por um período de 72h. O melhor efeito indutor obtido na otimização da produção de lacase ocorreu pela interação dos cinco indutores atingindo uma atividade de 45.185 + 321 U L-1 em 24 dias de cultivo. Também ocorreu um forte efeito indutor com os extratos de bagaço de cana-de-açúcar e de peroba juntamente com o CuSO4, e com o extrato de peroba, dioxano e CuSO4 que obtiveram resultados de 35.926 + 642 U L-1 e 35.556 + 1.111 U L-1, respectivamente. A biorremediação do BFA pela lacase bruta se mostrou eficiente, sendo que na primeira hora de reação foi reduzida cerca de 50% da concentração inicial, e após 10 h de reação já não foi mais possível detectar a presença do contaminante em solução aquosa. A avaliação da técnica de espectrofotometria UV-Vis derivativa foi positiva para a análise do BFA em solução contendo lacase bruta de Trametes sp., quando comparada com a técnica de HPLC-DAD. Palavras-chave: Dioxano. Espectrofotometria UV Vis derivativa. Interferentes endócrinos. Lignina. Siringol. / Abstract: The bisphenol A (BPA) is a monomer widely used in the manufacture of epoxy resins and polycarbonate plastics, and also as an input for other industrial purposes. This compound is classified as an endocrine interferent capable of causing disturbances in the endocrine, immune and nervous system of living beings, besides causing serious environmental disturbances. The physical-chemical treatments for this type of pollutant are quite expensive, so treatments using fungal enzymes, such as laccases, can be a very promising alternative. The objective of this study was to optimize the laccase enzyme production through the cultivation of Trametes sp. fungus, with the addition of crude lignin extracts and chemical inducers, and its application in bioremediation of BPA in water base. The laccase production study began by applying six gross lignin extracts of bracatinga wood, peroba wood, pinus wood, sugarcane bagasse, soybean hull and wheat husk, in a concentration of 1 g L-1 in the experiments. The extracts of peroba wood and sugarcane bagasse presented higher inductive potential compared to the others, so that they were used in the lacase optimization production through a fractional 5-2 factorial experimental design, along with the potential chemical inducers: dioxane, syringol and copper sulphate 1 mmol L-1 concentration. The BPA bioremediation was performed by applying 500 U L-1 crude laccase in buffered medium at pH 5 containing 100 mg L-1 of the contaminant which was quantified by liquid chromatography (HPLC-DAD). The analytical technique of derivative ultraviolet spectrophotometry was evaluated for BPA determination in multicomponent solution. The optimum pH range for the laccase was observed between the values of 4 to 6, in which the enzymatic activity remained stable for a period of 72h. The best inducing effect on laccase production occurred through the interaction of the five inducers reaching an activity of 45.185 + 321 U L-1 in 24 days of cultivation, also a strong inducing effect occurred between the extracts of sugarcane bagasse and peroba together with the CuSO4, and between the peroba extract, dioxane and CuSO4 that obtained results of 35.926 + 642 U L-1 and 35.556 + 1.111 U L-1, respectively. The BPA bioremediation by the crude laccase was efficient, and in the first hour of reaction, about 50% of the initial concentration was reduced, and after 10 hours of reaction it was no longer possible to detect the presence of the contaminant in the aqueous solution. The evaluation of the derivative ultraviolet spectrophotometry technique was satisfactory for the analysis of the BPA in solution containing Trametes sp. crude laccase, when compared with the HPLC-DAD technique. Key-words: Dioxane. Derivative ultraviolet spectrophotometry. Endocrine disruptors. Lignin. Syringol.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-25Bitstream added on 2014-06-13T21:01:17Z : No. of bitstreams: 1 bahia_vrlo_dr_jabo.pdf: 5914838 bytes, checksum: a4109e25129929b7572704f28e3ae1ad (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A importância da fase de girino para a ranicultura reside no fato de que após a metamorfose existirão animais em condições compatíveis com os índices zootécnicos. Entretanto, a compreensão dos processos morfológicos e fisiológicos pelos quais os girinos passam durante o seu desenvolvimento e metamorfose ainda é limitada. Neste contexto, este estudo tem como objetivo descrever as mudanças morfológicas do sistema digestório e o perfil das enzimas digestivas dos girinos da rã touro (Rana catesbeiana), durante seu desenvolvimento e metamorfose. Os girinos utilizados foram cedidos pelo Setor de Ranicultura do CAUNESP. As análises biométricas, anatômicas e histológicas foram realizadas no Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal e no Laboratório de Microscopia Eletrônica e as análises das enzimas digestivas realizadas no Departamento de Tecnologia da FCAV-UNESP. Para a biometria, anatomia e histologia, os girinos foram separados em estágios de desenvolvimento, anestesiados em água com gelo a 4ºC e tiveram seu comprimento total, parcial e peso registrados. Posteriormente, o tubo digestivo foi dissecado e avaliou-se o comprimento, a largura e o peso do intestino, fígado e pâncreas. Para a microscopia de luz, o tubo digestivo foi fragmentado em intestino anterior, intestino médio e posterior, fígado e pâncreas, que foram fixados em Bouin e processados de acordo com a metodologia do Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal. Para microscopia eletrônica de varredura, a região oral foi dissecada, fixada em solução de Karnovsky e pós-fixada em tetróxido de ósmio, e as amostras processadas de acordo com o Laboratório de Microscopia Eletrônica. Para a análise das enzimas digestivas, os girinos foram separados em estágios de desenvolvimento e permaneceram em jejum por 24 horas... / The importance of the tadpole phase to the raniculture is due to the fact that from this phase animals that are in agreement with zootechnical indexes must be obtained, after metamorphosis. However, few studies aim to understand the physiological and morphological processes that tadpoles undergo during their development and metamorphosis. In such context, the present study describes the morphological changes and the enzymatic profile of the bullfrog tadpole's (Rana catesbeiana) digestive system, during development and metamorphosis. The animals used in the tests were made available by the CAUNESP's Frog Farming Sector. Biometrical, anatomical and histological analyses were performed at the Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal and Laboratório de Microscopia Eletrônica. The analysis of the digestive enzymes were performed at the Laboratório de Tecnologia of FCAV-UNESP. For biometry, anatomy and histology, tadpoles were separated according developmental stages and anesthetized in water with ice at 4ºC. Their total and partial lengths, as well as their weight were recorded. Afterwards, the digestive tubes were removed and the length, width and weight of the intestine, liver and pancreas were registered. For light microscopy, the digestive tube was fragmented into stomach, esophagus, medium and posterior intestines, liver and pancreas. Fragments were fixated in Boiun's solution according to the methodology of the Histology Laboratory of the Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal. For scanning electronic microscopy, oral region was dissected and fixated in Karnovsky's solution. A second fixation was performed in osmium tetroxide. All samples were processed according to the Laboratorio de Microscopia Eletrônica. For the analysis of digestive enzymes, tadpoles were separated according their developmental stages and unfed for 24 hours... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-23Bitstream added on 2014-06-13T20:04:37Z : No. of bitstreams: 1 cucolo_gr_dr_rcla.pdf: 912012 bytes, checksum: bb2f52ae986d8910d4d4ba1e27a6db3e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Ciclodextrina-glicosil-transferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é uma enzima capaz de formar ciclodextrinas (CDs), tendo o amido como substrato. A enzima é de grande interesse industrial, principalmente nas indústrias alimentícias, cosméticas, químicas e farmacêuticas. CDs são moléculas cíclicas formadas por monômeros de glicoses, unidos por ligações α-1,4. Os tipos mais comuns de ciclodextrinas, α-, β- e γ- CD, consistem de 6, 7 e 8 monômeros de glicose, respectivamente. A molecula de CD possui uma estrutura única com a cavidade interna hidrofóbica e a região externa hidrofílica, sendo possível a formação de complexos de inclusão com uma variedade de compostos, que pode melhorar ou proteger as propriedades físicoquímicas da molécula encapsulada. Este estudo foi dividio em três capitulos, o primeiro foi uma revisão bibliografica, e os outros dois são trabalhos de pesquisa. No primeiro trabalho estudou-se a produção de CDs pela CGTase do Bacillus clausii subgrupo E16, tanto em relação ao efeito da concentração do amido na produção das CDs, como em relação a utilização de fontes alternativas de amido (amido solúvel de batata PA, de milho, de trigo e de mandioca) como substrato. Observouse que a enzima produziu preferencialmente β-CD nos diferentes tipos de substrato utilizados. O mais alto grau de conversão de CDs foi obtido com o uso de amido de mandioca, tendo convertido 95,30% (p/p) em β-CD, seguido de 86,60% (p/p) do amido solúvel. A concentração de 1% de amido de mandioca apresentou o melhor rendimento na produção de CDs. No segundo trabalho de desquisa, o objetivo foi a produção de CDs pela CGTase do Bacillus clausii E16 em fontes alternativas de substrato (farelo de trigo, farelo de mandioca; farinhas de milho, trigo e mandioca). Observou-se que a enzima produziu β-CD nos diferentes tipos de substratos utilizados. O grau de conversão de CDs... / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is an enzyme capable of converting starch into cyclodextrins (CDs) molecule. CDs are becoming increasingly popular in pharmaceutical, chemical, cosmetics and food industries. CDs are cyclic oligosaccharides compounded of glucose units jointed by α-1,4 linkages. The most common types of cyclodextrins, α-, β- and γ- CD, consist of 6, 7 and 8 glucose units, respectively. A CD molecule has a unique torus-shaped structure with a hydrophobic internal cavity and a hydrophilic external surface. As a result, CDs can form inclusion complexes with many hydrophobic guest molecules and thereby change their physical and chemical properties. This study was divided in three chapters, the first is about one bibliographic review, and the other are about two research approaches. The aim of the first work was to verify the effect of different starch botanical sources and the concentration of starch in the production of cyclodextrins by CGTase enzyme from Bacillus clausiii E16. It was noticed that the enzyme mainly produced β-CD with the different types of starch (soluble potato starch, corn starch, wheat starch and cassava starch) used substrate. The higher degree of conversion of CDs was obtained with the use cassava starch, of which 95,30% (w/w) was converted in β-CD, followed by 86,60% (w/w) of soluble starch. The concentration 1% of cassava starch showed the best efficiency in the production of CDs. In the second research work, the aim was studied the application of a CGTase from Bacillus clausiii E16 in alternative substrate sources (cassava bran, wheat bran; corn meal, wheat flour e cassava flour) for production of cyclodextrins. It was noticed that the enzyme produced β-CD with the different types of used substrate. The degree of conversion of CDs obtained with the use cassava bran was 40,48% (w/w) in β-CD and preliminary studies... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-08Bitstream added on 2014-06-13T20:04:39Z : No. of bitstreams: 1 terrasan_crf_dr_rcla.pdf: 2923287 bytes, checksum: 6f131c106722e1d7349212e5619e3b4f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Xilanases e β-xilosidases são as principais enzimas responsáveis pela degradação da xilana, o segundo principal constituinte da parede celular vegetal. Tanto a produção destas enzimas por micro-organismos, quanto a caracterização bioquímica das mesmas têm sido amplamente estudadas devido às suas inúmeras aplicações biotecnológicas. Neste trabalho, as principais xilanase e β-xilosidase produzidas por uma linhagem de Penicillium janczewskii em meio de cultura líquido foram purificadas por métodos clássicos de purificação de proteínas, sendo, posteriormente, caracterizadas bioquimicamente. A xilanase apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 65 °C e a β-xilosidase em pH 5,0 e a 75 °C. Ambas as enzimas apresentaram características interessantes principalmente com relação à atividade ótima de ambas as enzimas em elevadas temperaturas, a prolongada estabilidade da β-xilosidase a 60 °C, e a estabilidade da xilanase em pH mais alcalinos, considerando-se algumas de suas possíveis aplicações. Visando uma futura aplicação, a produção destas enzimas foi avaliada em cultivos sólidos utilizando-se como substrato o bagaço de malte, resíduo da indústria cervejeira. As melhores condições para produção enzimática foram: utilização da umidade inicial do substrato de 50% fornecida com solução de sais de Vogel, tempo de cultivo de sete dias a 25 °C para produção de xilanases e a 20 °C para produção de b-xilosidases. O material fermentado apresentou aumento no teor protéico, na quantidade de alguns aminoácidos essenciais e ausência de micotoxinas. Ainda com um enfoque ambiental o filtrado de cultura de P. janczewskii, produzido em condições anteriormente selecionadas, foi aplicado no biobranqueamento de uma polpa kraft de eucalipto pré-branqueada com oxigênio, sendo realizados ensaios para seleção da concentração de xilanases e do tempo de reação / Xylanases and β-xylosidases are the main enzymes responsible for the degradation of xylan, the second main constituent of plant cell walls. The production of these enzymes by microorganisms, and their biochemical characterization has been extensively studied due to their wide range of biotechnological applications. In this work, the main xylanase and β-xylosidase produced in liquid cultures by a Penicillium janczewskii strain were purified by classical methods of protein purification, and further biochemically characterized. The xylanase showed optimal activity at pH 6.0 and 65 °C and β-xylosidases at pH 5.0 and 75 °C. Considering some possibilities of applications, the enzymes presented interesting characteristics especially in relation to the optimal activity at high temperatures, the prolonged stability of the β-xylosidase at 60 °C, and the stability of the xylanase in alkaline pH. Aiming at a future application, the production of these enzymes was investigated in solid state fermentation using brewer’s spent grain, a residue of the brewing industry, as substrate. The optimized conditions were: 50% initial substrate moisture supplied by Vogel’s salt solution, culturing for 7 days at 25 °C for xylanase production and at 20 °C for b-xylosidase production. The fermented substrate showed increase in protein content, in the amount of some essential amino acids, and absence of mycotoxins. Maintaining the environmental focus, the P. janczewskii crude filtrate, produced under previously selected conditions, was applied in the biobleaching of eucalyptus kraft pulp pre-bleached with oxygen. Trials were conducted for the selection of xylanase concentration and reaction time

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-23Bitstream added on 2014-06-13T19:03:41Z : No. of bitstreams: 1 carneiro_aaj_dr_rcla_parcial.pdf: 344876 bytes, checksum: f4257e3a50f28d8e5fbbfc16ac265fb6 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-04T11:39:25Z: carneiro_aaj_dr_rcla_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-02-04T11:40:11Z : No. of bitstreams: 1 000687526.pdf: 2190725 bytes, checksum: 76a291fbe3368473b4a2340b9a8996c5 (MD5) / As glucanas fúngicas têm sido muito estudadas por apresentarem respostas biológicas benéficas à saúde. O Agaricus blazei, conhecido popularmente como cogumelo do sol, é um basidiomiceto que apresenta propriedades funcionais devido às β-glucanas. Os fungos Trichoderma harzinaum e Trichoderma reesei foram capazes de se desenvolverem em Agaricus blazei em pó como única fonte de carbono produzindo β-1,3-glucanases, analisadas por superfície de resposta. As enzimas hidrolisaram β-glucanas de A. blazei e produziu glucose e diferentes glucooligossacarídeos. As enzimas brutas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram menos de 15 % de glucana e em torno de 40 % de laminarina (β-1,3 glucana comercial), após 60 minutos, respectivamente. Utilizando a β-1,3-glucanase bruta de T. harzianum foram detectados gentiobiose e laminaritriose nos hidrolisados enzimáticos de β- glucana e laminarina, enquanto a laminaritetraose, celotetraose e celotriose foram identifificados e quantificados apenas nos hidrolisados de β-glucana de A. blazei. A ação da β- 1,3-glucanase bruta de T. reesei sobre a laminarina e glucana de A. blazei resultou em glicose e gentiobiose. O que sugere uma possível diferença na ação catalítica das duas enzimas. As enzimas parcialmente purificadas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram 47 e 85 % de laminarina, respectivamente. A β-1,3-glucanase purificada de T. harzianum não degradou a glucana de A. blazei, e a enzima purificada de T. reesei degradou 2,6 % de glucana, após 60 minutos, no entanto, gentiobiose e laminaritriose foram detectados no hidrolisado de laminarina. Utilizando a enzima parcialmente purificada de T. reesei gentiobiose foi detectado no hidrolisado de glucana e de laminarina, e celotriose e laminaritriose foram detectados apenas no hidrolisado de laminarina. A fim de conhecer melhor... / Fungal glucans have been studied extensively because of their biological responses, which have been shown to possess health benefits. Agaricus blazei, commonly known as mushroom of the sun, is a basidiomycete that has functional properties because of its β-glucans. The fungi Trichoderma harzinaum and Trichoderma reesei were able to develop in a powdered form of A. blazei, which served as the only carbon source. The result was the production of β- 1,3-glucanases, which were analyzed using response surface methodology. The enzymes hydrolyzed the β-glucans of A. blazei, and produced glucose and different glucooligosaccharides. The crude enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed less than 15% of glucan and approximately 40% of laminarin after 60 minutes, respectively. Using crude β-1,3-glucanase from T. harzianum, gentiobiose and laminaritriose were detected in enzymatic hydrolysates of β-glucan and laminarin, while laminaritetraose, cellotriose and celotetraose were identified and quantified only in the hydrolysates of the β-glucan of A. blazei. The action of the crude β-1,3-glucanase of T. reesei on the laminarin and glucan of A. blazei resulted in glucose and gentiobiose. These results suggest a possible difference in the catalytic action of the two enzymes. The partially purified enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed 47% and 85% of laminarin, respectively. The purified β-1,3-glucanase from T. harzianum did not degrade the glucan of A. blazei, and the purified enzyme from T. reesei degraded 2.6% of the glucan after 60 minutes; however, gentiobiose and laminaritriose were detected in the hydrolyzates of laminarin. Using partially purified enzymes from T. reesei, gentiobiose was detected in the hydrolyzates of both glucan and laminarin, and laminaritriose and cellotriose and were detected... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Fábio Erminio Mingatto / Resumo: Fipronil é um inseticida de amplo-espectro de ação, utilizado para o controle de pragas nas lavouras e de ectoparasitas na medicina veterinária. O objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos tóxicos do fipronil sobre a fertilidade de ratos machos por meio da avaliação da produção de espermatozoides e de danos oxidativos causados no homogenato de testículos, além de avaliar a ação protetora da vitamina E. Ratos Wistar machos pesando aproximadamente 200 g foram divididos em três grupos (n = 6): controle: DMSO (60%) mais salina (40%) por via intraperitoneal (i.p.); fipronil 5: fipronil dissolvido em DMSO (60%) mais salina (40%) (5 mg/kg de peso corporal i.p.); fipronil 5 + vitamina E: fipronil dissolvido em DMSO (60%) mais salina (40%) (5 mg/kg de peso corporal i.p.) e vitamina E (100 mg/kg de peso vivo via oral).Durante 14 dias os animais foram pesados e cada grupo recebeu seu respectivo tratamento conforme citado, sendo que no 15º dia os animais foram eutanasiados e os testículos e epidídimos foram isolados para realização das seguintes análises: concentração de espermatozoides nos epidídimos, atividade das enzimas glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT), determinação das concentrações de glutationa reduzida (GSH), grupos tióis de proteínas e malondialdeído (MDA) no homogenato dos testículos. Os dados foram analisados por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. O fipronil reduziu significantemente a produção de espermatozoides (P < 0,01) e a vitamina E apresentou efeito prote... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre