Orientador: Roberto da Silva / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Banca: Inês Conceição Roberto / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Eleni Gomes / Resumo: As glucanas fúngicas têm sido muito estudadas por apresentarem respostas biológicas benéficas à saúde. O Agaricus blazei, conhecido popularmente como cogumelo do sol, é um basidiomiceto que apresenta propriedades funcionais devido às β-glucanas. Os fungos Trichoderma harzinaum e Trichoderma reesei foram capazes de se desenvolverem em Agaricus blazei em pó como única fonte de carbono produzindo β-1,3-glucanases, analisadas por superfície de resposta. As enzimas hidrolisaram β-glucanas de A. blazei e produziu glucose e diferentes glucooligossacarídeos. As enzimas brutas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram menos de 15 % de glucana e em torno de 40 % de laminarina (β-1,3 glucana comercial), após 60 minutos, respectivamente. Utilizando a β-1,3-glucanase bruta de T. harzianum foram detectados gentiobiose e laminaritriose nos hidrolisados enzimáticos de β- glucana e laminarina, enquanto a laminaritetraose, celotetraose e celotriose foram identifificados e quantificados apenas nos hidrolisados de β-glucana de A. blazei. A ação da β- 1,3-glucanase bruta de T. reesei sobre a laminarina e glucana de A. blazei resultou em glicose e gentiobiose. O que sugere uma possível diferença na ação catalítica das duas enzimas. As enzimas parcialmente purificadas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram 47 e 85 % de laminarina, respectivamente. A β-1,3-glucanase purificada de T. harzianum não degradou a glucana de A. blazei, e a enzima purificada de T. reesei degradou 2,6 % de glucana, após 60 minutos, no entanto, gentiobiose e laminaritriose foram detectados no hidrolisado de laminarina. Utilizando a enzima parcialmente purificada de T. reesei gentiobiose foi detectado no hidrolisado de glucana e de laminarina, e celotriose e laminaritriose foram detectados apenas no hidrolisado de laminarina. A fim de conhecer melhor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fungal glucans have been studied extensively because of their biological responses, which have been shown to possess health benefits. Agaricus blazei, commonly known as "mushroom of the sun," is a basidiomycete that has functional properties because of its β-glucans. The fungi Trichoderma harzinaum and Trichoderma reesei were able to develop in a powdered form of A. blazei, which served as the only carbon source. The result was the production of β- 1,3-glucanases, which were analyzed using response surface methodology. The enzymes hydrolyzed the β-glucans of A. blazei, and produced glucose and different glucooligosaccharides. The crude enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed less than 15% of glucan and approximately 40% of laminarin after 60 minutes, respectively. Using crude β-1,3-glucanase from T. harzianum, gentiobiose and laminaritriose were detected in enzymatic hydrolysates of β-glucan and laminarin, while laminaritetraose, cellotriose and celotetraose were identified and quantified only in the hydrolysates of the β-glucan of A. blazei. The action of the crude β-1,3-glucanase of T. reesei on the laminarin and glucan of A. blazei resulted in glucose and gentiobiose. These results suggest a possible difference in the catalytic action of the two enzymes. The partially purified enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed 47% and 85% of laminarin, respectively. The purified β-1,3-glucanase from T. harzianum did not degrade the glucan of A. blazei, and the purified enzyme from T. reesei degraded 2.6% of the glucan after 60 minutes; however, gentiobiose and laminaritriose were detected in the hydrolyzates of laminarin. Using partially purified enzymes from T. reesei, gentiobiose was detected in the hydrolyzates of both glucan and laminarin, and laminaritriose and cellotriose and were detected... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Teresa Cristina Goulart de Oliveira Sequeira / Resumo: O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de caracterizar os produtos de excreção/secreção (PE/S) de larvas de Dermatobia hominis, especialmente, no que se refere à atividade proteolítica desses produtos. Os PE/S foram obtidos de larvas de primeiro estágio (L1) cultivadas em laboratório e de larvas de segundo (L2) e terceiro (L3) estágios colhidas de bovinos parasitados. O perfil das proteínas foi obtido pela eletroforese dos PE/S em gel de poliacrilamida contendo sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE) e a atividade proteolítica foi investigada utilizando gelatina, azocaseína e N-a-benzoil-arginina-nitroanilida (BAPNA) como substratos. Para caracterização das proteases foram realizados ensaios utilizando estes mesmos substratos, nos quais as amostras foram tratadas com os inibidores: PMSF, TPCK, TLCK, DCI, E-64, EDTA, Elastatinal, Leupeptina, Fenantrolina e Antipaína. Nos PE/S de L1 foram detectadas exclusivamente proteases com peso molecular aparente acima de 168 kDa, cuja inibição revelou pertencerem aos grupos das metalo-proteases e serina-proteases. Os zimogramas dos PE/S de L2 e L3 em géis copolimerizados com gelatina revelaram uma ampla faixa de atividade proteolítica, na qual estavam presentes proteases de alto, médio e baixo pesos moleculares aparentes. Nos ensaios realizados com inibidores de proteases, utilizando os três substratos, as proteases presentes em L2 e L3 foram identificadas como pertencentes ao grupo das serina-proteases, sendo em L3, predominantemente, do tipo tripsina. As alterações nos padrões de proteólise e nas características bioquímicas das proteases presentes nos três estágios larvais discuti- se à atividade das larvas em cada fase do seu desenvolvimento. / Abstract: In the present investigation the biochemical characteristics of the Dermatobia hominis larvae secretory/excretory products (PE/S) were analyzed mainly regard to their proteolytic activities. The PE/S of first-instar larvae were collected from larvae reared in the laboratory and of the second and third instars from larvae removed from infested cattle.The PE/S were tested in a sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to identify their proteic profiles and the proteases activity were investigated using gelatine, azocasein, and N-a-benzoil-arginine-nitroanilide (BAPNA) as substrates. The proteases characterizations were performed by treating PE/S samples by the following proteases inhibitors: PMSF, TPCK, DCI, E-64, EDTA, Elastatinal, Leupeptine, Phenatroline, and Antipain. SDS-PAGE-Gelatin profiles of L1 PE/S revealed only proteases with molecular weight above 168 KDa whereas profiles from L2 and L3 PE/S revealed a high range of proteolytic activity, including high, medium and low molecular weight proteases. The assays performed with the protease inhibitors, and gelatin and azocasein as substrates, revealed that metalloprotease is the major class of proteases present in the PE/S of L1 besides the low content of serine-proteases. The major class of proteases present in the PE/S of L2 and L3 was characterized as serine-proteases, being in L3 predominantly of trypsin type. The changes in the proteolytic patterns and biochemical characteristics of the proteases found in all three instar larvae of D. hominis were with the larval activity in each phase of their development. / Mestre

Orientador: Lara Durães Sette / Coorientador: Rafaella Bonugli Santos / Banca: Luiz Henrique Souza Guimarães / Banca: Eleonora Cano Carmona / Resumo: As lacases são enzimas que catalisam uma reação que oxida moléculas aromáticas fenólicas. Com grande potencial biotecnológico, as lacases podem ser empregadas em diversos setores industriais. Suas principais aplicações são referentes a indústria de polpa e papel, têxtil, alimentícia, bem como na química sintética e biorremediação. Em estudos prévios, o fungo basidiomiceto Peniophora sp. CBMAI 1063, isolado da esponja marinha Amphimedon viridis, apresentou 1.350 U/L de atividade para lacases em meio submerso salino otimizado. Tendo em vista a importância dos fungos e dessas enzimas para a biotecnologia, o objetivo do trabalho foi estudar a produção de lacases pelo basidiomiceto de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063 em biorreatores de bancada. Foram conduzidos 11 cultivos em biorreatores de agitação mecânica (STR) e um em biorreator pneumático (air-lift), definindo parâmetros como o tempo em que o inóculo do biorreator deve ser incubado, frequência de agitação, kLa e valor do pH inicial. A atividade máxima para lacases obtida em biorreator de agitação mecânica foi de 2.700 U/L em 120h de cultivo, em 150 rpm de agitação (1,0 vvm: kLa de 17,2 h-1) e pH 4,5 inicial. Nessas condições e com o inóculo cultivado também por 120h, a taxa máxima de formação do produto foi de 60 U/L.h e produtividade máxima de 25,5 U/L.h. O fungo quando cultivado em biorreator air-lift sob 1,0 vvm de aeração apresentou atividade de 4.014 U/L em 96 horas de cultivo, com taxa máxima de formação do produto de 55 U/L.h e produtividade máxima de 40 U/L.h. Análises da macro-morfologia fúngica ao término do bioprocesso indicaram que o biorreator STR causou mais danos ao micélio fúngico do que o cultivo em biorreator air-lift. Experimentos adicionais em frascos agitados demonstraram que o fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 apresentou melhores atividades para lacases e maiores índices de biomassa seca na presença de 65%... / Abstract: Laccases are enzymes that catalyzes a reaction that oxidizes phenolic compounds. With a great biotechnological potential, laccases can be applied in many industrial areas. Most of the applications are related to pulp and paper, textile, food and beverage industries, as well as in synthetic chemistry and bioremediation. In earlier studies, the basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063, isolated from marine sponge Amphimedon viridis, exhibited 1.350 U/L of laccases' activity under submerged culture in optimized saline medium. Taking into consideration the importance of the fungi and these enzymes for biotechnology, the purpose of this work was to study the laccases' production by the marine-derived basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063 in bench bioreactors. It was performed 11 experiments in stirred tank reactor (STR) and one in pneumatic bioreactor (air-lift), establishing parameters such as inoculum incubation time, frequency of agitation, kLa, and initial pH value. The maximum laccases activity obtained in stirred tank reactor was 2.700 U/L in 120 hours of cultivation under 150 rpm of agitation (1,0 vvm: kLa de 17.2 h-1) and initial pH value of 4.5. In those conditions, with the inoculum cultivated for 120 hours, the maximum product formation rate was 60 U/L.h and the maximum productivity was 25.5 U/L.h. The fungus when cultivated in air-lift bioreactor under 1.0 vvm of aeration showed the activity of 4.014 U/L in 96 hours of growth. The maximum product formation rate obtained in that experiment was 55 U/L.h and the maximum productivity was 40 U/L.h. Analysis of the macro-morphology at the end of the processes indicated that STR bioreactor caused more damage to the fungus' mycelium than the air-lift bioreactor. Additional experiments in agitated flasks showed that the fungi Peniophora sp. CBMAI 1063 had higher laccases' activity and higher yields of dry biomass in the presence of 65% (v/v) of artificial seawater (ASW) and 2mM of ... / Mestre

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Janete Apparecida Desidério / Banca: Mariana Carina Frigieri Salaro / Resumo: A metagenômica é uma ferramenta poderosa na descoberta de novos genes microbianos com potencial biotecnológico, pois não são necessárias as técnicas tradicionais de cultivo. Para suprir as necessidades de enzimas no mercado esta técnica tem sido muito utilizada para a descoberta de novos genes codificadores de lipases e esterases microbianas muito utilizadas em processos biotecnológicos como produção de detergentes, biodiesel e biorremediação. Em trabalhos anteriores, foram prospectadas sequências codificadoras para enzimas lipolíticas em uma biblioteca metagenômica de DNA com 4224 clones, de um consórcio microbiano obtido de solo contaminado com hidrocarbonetos de petróleo, localizado na cidade de Ribeirão Preto - São Paulo - Brasil, obtendo-se 30 clones com possível atividade lipolítica em Tributirina. No presente trabalho, um dos clones foi selecionado após ensaio em placa de Petri com Tributirina para a construção de uma sub-biblioteca, com 480 subclones. O sequenciamento foi realizado em aparelho ABI Prism 3100 e o "contig" obtido analisado no ORF Finder do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Maryland, USA). Foi possível identificar um gene de 1032 pb, 344 aminoácidos , denominado ORF2, que codifica uma enzima lipolítica com identidade de 94 % com uma hidrolase de Pseudomonas denitrificans (YP_007656829.1). As sequências que representam as oito famílias de enzimas lipolíticas propostas por Arpying e Jaeger (1999) foram extraídas do banco de dados do NCBI e comparadas com a sequência da ORF2, possibilitando afirmar que esta enzima é um novo membro da família V de enzimas lipolíticas bacteriana. O gene codificador da ORF2 foi clonado em vetor de expressão pET28a e superexpressado em Escherichia coli BL21(D3). A fração solúvel da proteína foi analisada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), em condição desnaturante. A atividade lipolítica das bandas da proteína ... / Abstract: The metagenomics is a powerful tool in the discovery of new microbial genes with biotechnological potential, they are not necessary traditional cultivation techniques. With increasing demand for enzymes in the market this technique has been widely used for the discovery of new genes encoding microbial lipases and esterases widely used in biotechnological processes such as the production of detergents, biodiesel and bioremediation. In previous work, coding sequences for lipolytic enzymes were prospected in 4224 clones from a metagenomic DNA library from a microbial consortium obtained from soil contaminated with petroleum hydrocarbons, located in the city of Ribeirão Preto - São Paulo - Brazil, obtaining 30 clones with possible lipase activity on tributyrin. In this study, one clone was selected after testing in a Petri dish with Tributyrin to build a sub-library, with 480 subclones. Sequencing was performed on ABI PRISM 3100 instrument and analyzed "contig"s obtained in the ORF finder from the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Maryland, USA). It was possible to identify a gene of 1032 bp, 344 amino acids, termed ORF2, encoding a lipolytic enzyme with 94% identity with a hydrolase from Pseudomonas denitrificans (YP_007656829.1). The sequences representing eight families of lipolytic enzymes and Arpying proposed by Jaeger (1999) were extracted from the NCBI database and compared with the sequence of ORF2, allowing affirm that this enzyme is a new member of the family V bacterial lipolytic enzymes . The encoder ORF2 gene was cloned into pET28a expression vector and overexpressed in Escherichia coli BL21 (D3). The soluble protein fraction was analyzed by polyacrylamide (SDS-PAGE) gel in denaturing condition. The lipolytic activity of the recombinant protein bands on the SDS-PAGE gel was confirmed by a zymogram indicating its functionality in a specific substrate. Three-dimensional modeling was also ... / Mestre

Orientador: Rodrigo Fernando Costa Marques / Banca: Ariela Veloso de Paula / Banca: Maria Gabriela Nogueira Campos / Resumo: As enzimas são catalisadores de alto custo, sendo necessário a imobilização para que haja a recuperação e a reutilização tornando o processo viável econo micamente. Além disso, a utilização de enzima s imobilizada s permite simplificar o modelo de reatores e o contr ole da reação. Assim, a imobilização é geralmente u m requisito para a utilização de enzima s com o biocatalisador es industriais . A escolha do suport e para imobilização depende das propriedades da enzima a ser imobilizada. Suportes sólidos podem interagir com a enzima por diferentes vias: por adsorção, ligação covalente ou encapsulamento. Um importante fator para imobilizar a enzima é que o suporte dev e ser inerte e biocompatível ao ambiente, ou seja, não deve interferir na estrutura nativa da proteína e nem comprometer sua atividade biológica. D entre as principais enzimas, a s lipases hidrolisam triglicerídeos (T A G) em glicerol e ácidos graxos e por est e motivo estão na classe das hidrolases. Uma proposta de imobilização destas enzimas consiste na utilização de nanoestruturas magnéticas como biocatalisadores d a reação de transesterificação para a produção de biodiesel, devido à facilidade e a rápida sepa ração das enzi mas imobilizadas, a partir da mistura reacional, usando um campo magnético externo . As vantagens das enzimas imob ilizadas em relação às enzimas livres surgem da sua maior estabilidade e facilidade de separação, o que acarreta economia signifi cativa no custo global do processo, desde que o procedimento de imobilização não seja muito caro, haja boa recuperação da atividade enzimática e que a estabilidade operacional da enzima imobilizada seja suficientemente longa. O uso de enzimas imobilizadas permite a retenção do biocatalisador no reator; elevada concentração de catalisador no reator permitindo intensificar o processo; controle do microambiente da... / Abstract: Enzymes are expensive catalysts, immobilizat ion is necessary for recovery and reuse making the process economically viable. Fu rthermore, use of immob ilized enzymes can simplify model r eactor and control reaction. Thus, immobilization is generally a requirement for use of the enzyme as an industrial b iocatalyst. The choice of support for biocatalys ts immobilization depends on properties of enzyme to be immobilized. Solid supports can int eract with enzyme in different ways: by adsorption, covalent bonding or encapsulation. An important factor to immobilize the enzyme is that support must be inert and b iocompatible to environment; it should not interfere in native structure of protein and n ot compromising their biological activity. The main enzymes, lipases hydrolyze triglycerides (T A G) to glyc erol and fatty acids and for this reason; they are in the class of hy drolases. These enzymes are carbo xylesterases that catalyze hydrolysis in glyceri des synthesis. A proposal for immobil ization of these enzymes is u se of magnetic nanostructures in biocatalysts transesterification reaction for producing biodiesel due to e ase and rapid separation of immobilized enzyme, from a mixture reaction using an ex ternal magnetic field. The benefits of immobilized enzymes compared to free enzymes arise from their greater stability and ease of separation, which leads to significant savings in the overall cost of the process, provided that immobilization procedure is not very expensive, there is good recov ery of enzyme activity, and operational stability of immobilized enzyme is sufficiently long. The use of immobilized enzymes allow retention of biocatalyst in reactor; high concentration of catalyst in reactor to int ens ify the process; control of microenvironment of enzyme; ea se of recovery and reuse of ca talyst, which reduces the costs of enzymes; possibility of be ing used in continuous systems... / Mestre

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Luiz Juliano / Banca: Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandão de Oliveira / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Paula Rahal Liberatore / Resumo: As peptidases ou proteases hidrolisam ligações peptídicas. Apesar de todas terem essa característica funcional comum, elas diferem acentuadamente no seu grau de especificidade. O conhecimento da especificidade das cisteíno-peptidase, nos fornece valiosas informações que podem levar a uma melhor compreensão da relação estrutura-função, do papel fisiológico destas enzimas, ou para o desenho de inibidores seletivos. Pela caracterização realizada, a Fastuosaina, uma cisteíno peptidase extraída de frutos verdes de gravatá (Bromelia fastuosa) possui um pH ótimo próximo do neutro, semelhante à Bromelina do talo e do fruto, por enquanto para a Papaína, que possui um pH ótimo de 6,3. Em relação à estabilidade térmica, a Fastuosaina mostrou ser mais resistente à desnaturação, seguida pela Papaína, a Bromelina do fruto e por último a Bromelina do talo. / Abstract: Peptidases, also known as proteases, hydrolyse peptide bonds with different specificities. Knowing their preferences for cleavage sites, gives valuable informations that can lead to a better understanding of the structure-function relationships, their physiological role, or for design of selective inhibitors. We performed a characterization of Fastuosain, a cystein-peptidase isolated from unripe fruits of "gravatá" (Bromelia fastuosa), which showed an optimum pH near 7.0, as found also for stem and fruit bromelains. Papain showed a lower value, at pH 6.3. Concerning its thermal stability, Fastuosain showed higher resistance to denaturation, followed by Papain, Fruit and Stem Bromelain. / Doutor

Orientador: Rafael Henrique Nóbrega / Banca: Elisabeth Criscuolo Urbinati / Banca: George Shigueki Yasui / Resumo: O gene vasa codifica uma proteína que pertence a uma família de proteínas denominada DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box, constituída de RNA helicases ATP-dependente. Extremamente conservada entre os organismos, sua função está associada com o metabolismo do RNA. Na maioria das espécies investigadas, a expressão do vasa restringe-se a linhagem germinativa. Estudos realizados utilizando metodologias distintas (knockdown, knockout, mutação) para conhecer o papel do vasa, demonstraram que o vasa tem fundamental importância no desenvolvimento da linhagem germinativa dos invertebrados e vertebrados. Em nosso estudo, caracterizamos o cDNA do vasa de forma inédita em uma espécie nativa, R. quelen (Heptapteridae, Siluriformes). Análises comparativas da proteína foram realizadas, mostrando que a proteína é altamente conservada ao longo da evolução. Além disso, a expressão do Rqvasa (Rhamdia quelen vasa) por RT-PCR (transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase) e qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real) em diferentes tecidos mostra que o mesmo é expresso somente nas gônadas. Os sítios de expressão do Rqvasa localizam-se exclusivamente nas células da linhagem germinativa. Análises por RT-PCR e por qRT-PCR durante o desenvolvimento embrionário de R. quelen demonstram que o Rqvasa é herdado maternalmente e sua expressão diminui gradativamente ao longo do desenvolvimento embrionário e larval. Através da hibridização in situ nos embriões e larvas, foi possível visualizar o processo migratório das células germinativas primordiais (CGPs). Desta forma, este trabalho caracteriza de forma inédita, o cDNA do Rqvasa, descrevendo sua expressão durante o desenvolvimento assim como o processo migratório das CGPs. Os resultados obtidos neste estudo servirão de base para utilizar o gene vasa em diferentes abordagens biotecnológicas, como por exemplo, esterilidade, transgenia (vasa::egfp, como exemplo), transplante... / Abstract: The vasa gene encodes a protein that belongs to protein family called DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) Box, which is constituted of ATP-dependent RNA helicases. This protein is extremely conserved among the organisms, and its role is associated with RNA metabolism. In the majority of the investigated species, vasa expression is restricted to the germline cells. Different methods (such as knockdown, knockout and mutation) to address vasa's role have demonstrated that vasa is crucial for germ cell development. In this study, we have characterized the full cDNA of vasa from a native species, R. quelen (Heptapteridae Siluriformes). Comparative analysis using the protein sequence has demonstrated that Vasa is highly conserved along the evolution. Moreover, we have evaluated through RT-PCR and qRT-PCR Rqvasa expression in different tissues, showing that vasa transcripts are exclusively expressed in the R. quelen gonads, specifically in the germinal cells RT-PCR and qRT-PCR analysis during embryonic and larval development have shown that Rqvasa is maternally inherited and its expression decreased during development. in situ hybridization techniques performed in whole embryos and larvae allowed to study the primordial germ cells (PGCs) migratory process towards the gonadal ridge. This work has characterized for the first time the full length cDNA of vasa, describing its expression patterns during R. quelen embryonic development as well as the PGCs migratory process in this species. Our results will contribute for the basic reproductive biology of this native species, and will support studies using vasa in different biotechnological studies, such as sterility, transgenesis (vasa::egfp, for example) germ cell transplantation and others / Mestre

Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Ariela Veloso de Paula / Banca: Eleonora Cano Carmona / Resumo: Atualmente, a biotecnologia é acompanhada dos estudos sobre o funcionamento, estrutura e utilização, principalmente na indústria, das enzimas obtidas a partir de microorganismos, o que têm despertado grandes interesses em pesquisadores da área. De modo especial, os fungos filamentosos vêm se destacando como grandes produtores de enzimas, principalmente o gênero Aspergillus, pertencente aos ascomicetos. Dentre as enzimas de interesse biotecnológico encontramos a tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20),, também conhecida como tanase, a qual pode ser produzida por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. Desta forma, foi objetivo deste trabalho o estudo da produção de tanases pelo fungo filamentoso Aspergillus carbonarius padronizando-se as melhores condições físico-químicas para o crescimento do micro-organismo, visando a obtenção de tanases em níveis elevados assim purificando e caracterizando-as bioquimicamente. Os maiores níveis enzimáticos em FSS foram obtidos utilizando folhas de chá verde trituradas como fonte de carbono umedecidas com água de torneira (1:1 m/v) a 30°C por 3 dias.A tanase foi purificada 11,3 vezes com recuperação de 98%, após dois passos cromatográficos, DEAE-Celulose e Sepharose CL-6B. A enzima possui massa molar de 134,89 kDa com 50% de carboidratos. A temperatura ótima de atividade foi de 60°C e o pH ótimo foi 5,0. A tanase se mostrou bastante estável entre as temperaturas de 40°C a 65°C e em pH ácido. A atividade enzimática foi aumentada em 32% na presença de Ag+, e foi inibida por Mg+ , Fe2+, Zn2+, Al3+ e Cu2+ . Os parâmetros cinéticos foram analisados, sendo que a enzima apresentou maior afinidade pelo substrato metil galato (Km de 1,42mM) se comparado acido tânico (Km de 2,2mM). Portanto conclui-se que a tanase produzida por Aspergillus carbonarius possui um bom potencial biotecnológico e é promissora para o emprego industrial. / Abstract: Nowadays, biotechnology is accompanied by functional, structural and application studies, mainly in industry, of microbial enzymes, which have aroused great interest in researchers around the world. Specially filamentous fungi have been highlighted as the major enzymes producers, mostly Aspergillus genera, an ascomycete. Among the enzymes of biotechnological interest we can found the tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20), also known as tannase that can be produced by filamentous fungi, yeasts and bacterias. Acoording to the this objective of this work was to study the production of tannase by Aspergillus carbonarius standardizing the best physico-chemical conditions for the microorganism growth, in order to obtain high levels of tannase, purifying and characterizing them biochemically. The higher enzymes levels in SSF were obtained when it was used green tea leaves as carbon source moistured with tap water (1: 1 w / v) at 30° C for 3 days. Tannase was purified 11,3 fold with 98% of recover after two chromatographic steps: DEAE-celulose and Sepharose CL-6B. The enzyme has a molecular weight of 134,89 kDa with 50% of carbohydrates. The optimal temperature of activity was 60ºC and the optimal pH was 5.0. Tannase showed quite stability to temperatures between 40ºC and 65ºC and under acid pH. The enzyme activity was strongly inhibited by Mg+, Fe2+, Zn2+, Al3+ e Cu2+. The kinetic parameters were analyzed and the enzyme showed higher affinity to the substrate methyl gallate (Km 1.42mM) in it compared to tannic acid (Km 2.2mM). Therefore it is concluded that the tannase produced by Aspergillus carbonarius has great biotechnological potential and it is promising for industrial use. / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Morais Polizeli / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Rodrigo Simões Ribeiro Leite / Resumo: Ciclodextrina-glicosil-transferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é uma enzima capaz de formar ciclodextrinas (CDs), tendo o amido como substrato. A enzima é de grande interesse industrial, principalmente nas indústrias alimentícias, cosméticas, químicas e farmacêuticas. CDs são moléculas cíclicas formadas por monômeros de glicoses, unidos por ligações α-1,4. Os tipos mais comuns de ciclodextrinas, α-, β- e γ- CD, consistem de 6, 7 e 8 monômeros de glicose, respectivamente. A molecula de CD possui uma estrutura única com a cavidade interna hidrofóbica e a região externa hidrofílica, sendo possível a formação de complexos de inclusão com uma variedade de compostos, que pode melhorar ou proteger as propriedades físicoquímicas da molécula encapsulada. Este estudo foi dividio em três capitulos, o primeiro foi uma revisão bibliografica, e os outros dois são trabalhos de pesquisa. No primeiro trabalho estudou-se a produção de CDs pela CGTase do Bacillus clausii subgrupo E16, tanto em relação ao efeito da concentração do amido na produção das CDs, como em relação a utilização de fontes alternativas de amido (amido solúvel de batata PA, de milho, de trigo e de mandioca) como substrato. Observouse que a enzima produziu preferencialmente β-CD nos diferentes tipos de substrato utilizados. O mais alto grau de conversão de CDs foi obtido com o uso de amido de mandioca, tendo convertido 95,30% (p/p) em β-CD, seguido de 86,60% (p/p) do amido solúvel. A concentração de 1% de amido de mandioca apresentou o melhor rendimento na produção de CDs. No segundo trabalho de desquisa, o objetivo foi a produção de CDs pela CGTase do Bacillus clausii E16 em fontes alternativas de substrato (farelo de trigo, farelo de mandioca; farinhas de milho, trigo e mandioca). Observou-se que a enzima produziu β-CD nos diferentes tipos de substratos utilizados. O grau de conversão de CDs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is an enzyme capable of converting starch into cyclodextrins (CDs) molecule. CDs are becoming increasingly popular in pharmaceutical, chemical, cosmetics and food industries. CDs are cyclic oligosaccharides compounded of glucose units jointed by α-1,4 linkages. The most common types of cyclodextrins, α-, β- and γ- CD, consist of 6, 7 and 8 glucose units, respectively. A CD molecule has a unique torus-shaped structure with a hydrophobic internal cavity and a hydrophilic external surface. As a result, CDs can form inclusion complexes with many hydrophobic guest molecules and thereby change their physical and chemical properties. This study was divided in three chapters, the first is about one bibliographic review, and the other are about two research approaches. The aim of the first work was to verify the effect of different starch botanical sources and the concentration of starch in the production of cyclodextrins by CGTase enzyme from Bacillus clausiii E16. It was noticed that the enzyme mainly produced β-CD with the different types of starch (soluble potato starch, corn starch, wheat starch and cassava starch) used substrate. The higher degree of conversion of CDs was obtained with the use cassava starch, of which 95,30% (w/w) was converted in β-CD, followed by 86,60% (w/w) of soluble starch. The concentration 1% of cassava starch showed the best efficiency in the production of CDs. In the second research work, the aim was studied the application of a CGTase from Bacillus clausiii E16 in alternative substrate sources (cassava bran, wheat bran; corn meal, wheat flour e cassava flour) for production of cyclodextrins. It was noticed that the enzyme produced β-CD with the different types of used substrate. The degree of conversion of CDs obtained with the use cassava bran was 40,48% (w/w) in β-CD and preliminary studies... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Márcia Rossini Justino Mutton / Banca: Eduardo da Silva Martins / Banca: João Martins Pizauro Júnior / Resumo: A utilização de fermentação em estado sólido a partir de subprodutos agroindustriais possibilita a obtenção de várias biomoléculas de interesse industrial. As amilases são enzimas com grande aplicação nas indústrias têxtil, farmacêuticas, alimentícias e sucroalcooleira, representando aproximadamente 25% do mercado mundial. Neste trabalho foram isoladas três linhagens fúngicas (Rhizopus oryzae, Malbranchea pulchella e Chrysosporium zonatum), que apresentaram potencial amilolítico, quando cultivadas em três resíduos agroindustriais (quirera de arroz e de milho e farelo de trigo). Para a cepa que apresentou maior atividade enzimática, avaliou-se melhor substrato, tempo de cultivo, teores de umidade, fontes suplementares de nitrogênio, pH e temperatura de incubação, objetivando otimizar as condições de cultivo. Observou-se que a maior atividade enzimática foi obtida com a cepa de R. oryzae em 24 horas de fermentação, em meio de cultura contendo farelo de trigo como substrato, em temperatura de 35°C, utilizando solução de sais composta de NH4NO3 a 0,1% e MgSO4.7H2O a 0,1% como fonte de nitrogênio. Alterações de pH entre 4,0 e 6,0 não afetaram significativamente a síntese da enzima. A condições ótimas de atuação foram temperatura de 75°C e pH de 4,5. As enzima manteve-se estável a 75°C na ausência de substrato por 25 minutos / Abstract: The use of fermentation in a solid state from agroindustrial byproducts permits the obtaining of several biomolecules of interest the industry, like the enzymes. The amylases are enzymes with great application on the textile, pharmaceutical and food industries, representing around 25% of the worldwide market. In this work three ungal strains (Rhizopus oryzae, Malbranchea pulchella and Chrysosporium zonatum) were isolated. They presented amylolytic potential when cultivated in three agroindustrial by products (brewers rice, corn grits and wheat bran). To the strain that presented the greatest enzyme activity, it was evaluated the best substrate, cultivation time, moisture content, additional sources of nitrogen, pH and incubation temperature, aiming the optimization of cultivation conditions. I was observed that the greatest enzyme's activity was obtained with 24 hours of fermentation, in R. orizae in a culture medium that contained wheat bran as the substrate, at 35°C, using salt solution made with NH4NO3 0.1%, MgSO4.7h2O 0.1% and (NH4)2SO4 0.1% as nitrogen source. pH alterations between 4.0 and 6.0 didn't change significantly the enzyme's activity. The optimum conditions of performance of the enzyme were temperature of 75°C and pH 4.5. The enzyme kept stable in the lack of substrate for 25 minutes in 75°C / Mestre