Orientador: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Rubens Monti / Banca: Célia Maria Araújo Galvão / Resumo: Com a crescente demanda por fontes alternativas de combustíveis, a produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos torna-se uma opção interessante. Esse processo permite o aumento da produção de etanol sem a necessidade de crescimento da área plantada dos cultivares utilizados. Para a produção do etanol celulósico é necessário o fracionamento da biomassa de forma a disponibilizar a maior quantidade de carboidratos possível para o processo de fermentação alcoólica, porém essa biomassa precisa de um pré-tratamento para desorganizar a estrutura recalcitrante do material. Neste sentido, o principal objetivo deste projeto foi avaliar os métodos de pré-tratamentos alcalino, utilizando hidróxido de cálcio, e hidrotérmico, utilizando água, nos bagaços de cana-de-açúcar in natura (obtido diretamente da moenda) e explodido (submetido a explosão a vapor). Foram testados os tempos de 7, 30 e 60 minutos em ambos os tratamentos a uma temperatura de 120 °C em autoclave. Foram realizados planejamentos fatoriais completos a fim de analisar a influência do hidróxido de cálcio e do tempo no desempenho da hidrólise, quantificando a liberação de glicose e açúcares redutores totais (ART). Dessa maneira foram realizadas análises da composição química do bagaço pré-tratado a fim de avaliar uma possível correlação entre as modificações na estrutura do material e a eficiência da hidrólise. Os resultados mostraram que os melhores rendimentos foram obtidos com o bagaço in natura pré-tratado com hidróxido de cálcio em todos os tempos testados, a hidrólise enzimática desse material resultou em um rendimento mais alto, de 3,2 a 4,3 vezes, em comparação com a hidrólise no bagaço in natura sem pré-tratamento. Um novo planejamento foi realizado, delineamento composto central superfície resposta, para determinar as... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Due to the growing demand for alternative sources of fuel, ethanol production from lignocellulosic materials became an interesting option. This process allows the increase of ethanol production without the need of growth of the planted area of the cultivars used. For the production of cellulosic ethanol is necessary to fractionate the biomass to provide the largest possible amount of carbohydrates to ethanol fermentation process, but this biomass needs a pretreatment to disrupt the recalcitrant structure of the material. In this sense, the main objective of this project was to evaluate the methods of alkaline pretreatments, using calcium hydroxide, and hydrothermal,using water, in sugar cane bagasses in natura (obtained directly from the mill) and exploded (subjected to steam explosion). We tested different times (7, 30 and 60 minutes) in both treatments at a temperature of 120 °C in autoclave. Complete factorial designs were performed to examine the influence of calcium hydroxide and hydrolysis time performance by quantifying the release of glucose and total reducing sugars (TRS). Thus were analyzed the chemical composition of the pretreated bagasse to evaluate a possible correlation between changes in material structure and efficiency of hydrolysis. The results showed that the best yields were obtained with the in natura bagasse pretreated with calcium hydroxide at all times tested and the enzymatic hydrolysis increased from 3.2 to 4.3 fold compared to untreated in natura bagasse. A new schedule was conducted, a central composite design surface response, to determine the hydrolysis conditions which lead to maximal glucose release. In this step was done the hydrolysis of in natura bagasse subjected to alkaline pretreatment, with the addition of a nonionic surfactant (Tween 80). The best condition found in this optimization... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Segundo as estimativas da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), na safra de março de 2013/14 o Brasil produziu aproximadamente 12,8 milhões de toneladas de arroz, apresentando um acréscimo de 8% em relação à safra de 2012/13. O processamento deste grão resulta em subprodutos como o farelo de arroz, que apresenta vitaminas do complexo B, proteínas, tocoferóis e mais de 40% de carboidratos, justificando sua utilização em processos fermentativos, como a produção de vinagre. O vinagre é composto por 80% (v/v) de água e 20% de uma grande variedade de outros compostos, como ácidos orgânicos, álcoois, sais minerais, polifenóis, aminoácidos, entre outros. Os substratos utilizados na sua produção devem apresentar carboidratos fermentescíveis para que seja possível realizar as etapas de produção: fermentações alcoólica e acética. Tendo em vista estas considerações, os principais objetivos deste trabalho foram investigar o processo de hidrólise do farelo de arroz desengordurado por via enzimática, avaliar a etapa de fermentação alcoólica para otimizar a produção de etanol, e realizar a produção do vinagre por meio de fermentação submersa, bem como a caracterização do produto final. Para a otimização da etapa de sacarificação dos açúcares complexos do farelo de arroz desengordurado (FAD), realizou-se uma estratégia sequencial de planejamento experimental. Inicialmente aplicou-se um planejamento Fracionário 25-1 com as variáveis concentração de (FAD) (razão farelo/água (g.L-1)), concentração e tempo de atuação da -amilase e da amiloglucosidade (AMG), tendo-se como resposta, a concentração de açúcares redutores (AR); após análise do Planejamento Fracionário, foram aplicados dois Delineamentos Compostos Central Rotacional (DCCR) 22, onde avaliou-se os efeitos das concentrações de ambas enzimas. A validação das condições otimizadas para a hidrólise enzimática foi realizada por meio de dois testes em triplicata, nas vizinhanças das condições otimizadas. Na etapa subsequente de fermentação alcoólica, inicialmente desenvolveu-se um teste objetivando avaliar o efeito do tamanho do inoculo e da agitação para posterior aplicação de um DCCR 23, onde foram avaliados os efeitos da concentração de inoculo, pH e temperatura sobre a resposta de rendimento em etanol (%). Após a análise dos resultados do primeiro DCCR, objetivando-se aumentar o rendimento em etanol, realizou-se um segundo teste preliminar, para avaliar os efeitos da adição de protease e da exposição da suspensão de farelo de arroz desengordurado ao tratamento ultrassônico, anteriormente a etapa de hidrólise enzimática, visto que diversos estudos indicam que a produção de etanol pode ser aumentada nestas condições, devido a maior exposição dos grânulos de amido às enzimas amilolíticas do processo de sacarificação, após a ação de proteases. Os resultados obtidos permitiram definir a sequência do estudo, na qual um segundo DCCR foi aplicado para a avaliação dos efeitos da concentração de inoculo e temperatura em faixas ajustadas, visando alcançar a otimização da fermentação alcoólica, realizando-se a adição de protease anteriormente a hidrólise enzimática. Uma vez otimizada a etapa de fermentação alcoólica, foi realizada uma batelada de produção do vinagre (fermentação acética) com os parâmetros otimizados nas etapas anteriores. A caracterização do vinagre foi realizada por meio da determinação dos parâmetros exigidos na legislação vigente (teor alcoólico residual, acidez total e ácido acético, pH, extrato seco total e reduzido, cinzas e açúcares redutores e totais). A otimização da hidrólise enzimática foi alcançada nos ensaios com concentração de 200 g.L-1 de FAD, 30 µL.g-1 de -amilase e 40 µL.g-1 de amiloglucosidade, com os tempos de atuação das mesmas em 2 e 3 horas, respectivamente. No primeiro teste preliminar, realizado na etapa de fermentação alcoólica, observou-se que a agitação influenciou de forma positiva apenas nos ensaios com 2,0 e 5,0% de inoculo, sendo que o maior rendimento de etanol obtido foi de 1,90% com a utilização de 0,5% de inoculo, em condições estacionárias. Com os resultados obtidos no primeiro teste, ajustou-se as faixas das variáveis do primeiro DCCR onde o teor máximo de etanol obtido foi de 2,10%, com a temperatura em 30°C, 2,8% de inoculo e pH 5,0. Por meio da aplicação do segundo teste verificou-se que, nas condições aplicadas, o tratamento ultrassônico não apresentou efeito significativo na resposta de concentração de etanol, entretanto com a utilização da protease, foi possível aumentar para 3,6% o rendimento de etanol, após as 72h de fermentação alcoólica. Visando alcançar a otimização da fermentação alcoólica, realizou-se um novo DCCR, sendo fixada a concentração de 15 µL.g-1 de protease para atuação anteriormente ao processo de hidrólise enzimática dos polissacarídeos e sendo ajustadas as faixas das variáveis significativas no primeiro DCCR (temperatura: 28 a 35 °C; concentração de inoculo: 1 a 7%), onde foi possível alcançar rendimento de 4,10% de etanol. A fermentação acética foi concluída após oito dias da inoculação das bactérias acéticas, por meio do vinagre forte de etanol, sendo que o produto gerado, vinagre a base de farelo de arroz, não atendeu a legislação em vigor, apenas no parâmetro de cinzas, o qual pode ser ajustado com a aplicação de uma etapa de filtração. / According to estimates of the National Supply Company (CONAB), in the period March 2013/14, Brazil produced approximately 12.8 million tons of rice, an increase of 8 % compared to the period of 2012/13. The grain processing results in by-products such as rice bran, which has B vitamins, proteins, tocopherols and over 40% carbohydrates, justifying their use in fermentation processes such as vinegar production. Vinegar is composed of 80% (v/v) water and 20% of a wide variety of other compounds such as organic acids, alcohols, minerals, polyphenols, amino acids, among others. The substrates used in vinegar production must provide fermentable carbohydrates to alcoholic fermentation, which is followed by acetic fermentation. The aims of this study were to investigate the hydrolysis process of defatted rice bran by enzymatic way, assess the stage of alcoholic fermentation to optimize ethanol production, and carry out production of vinegar by submerged fermentation and characterizing the final product. METHODS: Optimization of enzymatic hydrolysis was achieved using a sequential strategy of experimental design. Firstly, a Fractional Factorial Fesign including 25-1 trials plus 3 center points (19 runs) was applied to evaluate the effects of concentration of amylolytic enzymes, action timeand the dilution rate of defatted rice bran (DRB) on response of reducing sugars (RS) released, followed by two CCRDs (Central Composite Rotatable Design); after the analysis of the effects of Fractional Design, the optimum values of enzymes concentration was reached by the two sequential CCRD. Validation of the optimal conditions for the enzymatic hydrolysis was performed in triplicate in two tests, in the vicinity of the optimized conditions. In the step of alcoholic fermentation, initially was developed a test to evaluate the effect of inoculum size and agitation for application of a CCRD 23 that evaluated the effects of inoculum concentration, pH and temperature on the response of ethanol yield (%). After the analysis the first CCRD, aiming to increase the ethanol yield, the second test was performed to evaluate the effects of protease addition and exposure of the suspension of defatted rice bran to ultrasonic bath treatment, prior to enzymatic hydrolysis with amylases, since several studies indicate that the ethanol production can be increased under these conditions, because of increased exposure of the starch granules to amylolytic enzymes in the saccharification, after the action of proteases. The results allowed to determine the sequence of the study in the second CCRD was used to evaluate the effect of inoculum concentration and temperature, with adjusted tracks to achieve the optimization of fermentation, performing the addition of protease hydrolysis previously enzyme. Once the alcoholic fermentation step was optimized, a batch of vinegar production (acetic fermentation). The characterization of vinegar was performed by determination the parameters required by Brazilian legislation (residual alcohol content, total acidity and acetic acid, pH, total and reduced dry extract, ash and total and reducing sugars). The optimization of enzymatic hydrolysis was achieved with concentration of 200 g•L-1 FAD, 30 g•L-1 α- amylase and 40 g•L-1 amyloglucosidase, with action times of 2 and 3 hours, respectively. In the first preliminary test performed on the alcoholic fermentation step, it was observed that shaking positively influenced only in the tests with 2.0 and 5.0% of inoculums, and the higher yield of ethanol obtained was 1.90 % with the use of 0.5% inoculums, under stationary conditions. with the results obtained in the first test, the tracks of the variables were defined for the first CCRD, where the maximum ethanol content was obtained 2.10%, with the temperature at 30 °C, 2.8% of inoculums and pH 5.0. By applying the second test it was found that under the conditions applied, the ultrasonic treatment had no significant effect on the response of ethanol concentration; however, with the use of protease the yield was increased to 3.6% ethanol, after 72 hours of alcoholic fermentation. A new CCRD was performed, in order to achieve the optimization of the alcoholic fermentation; in this step, the concentration of protease was fixed at 15 μLg-1, before the enzymatic hydrolysis of polysaccharides with the amylases and the ranges studied for the significant variables in the first CCRD was adjusted (temperature: 28 - 35 °C; inoculum concentration: 1 - 7%), being achieved yield of 4.00% ethanol. The acetic fermentation was completed after eight days of inoculation of acetic bacteria (strong ethanol vinegar), and the vinegar produced answered current Brazilian legislation in all parameters, except for ash, which can be adjusted by applying a filtration step. These results may generate technological innovation for the industrial sector, as the results obtained in this work demonstrate the possibility of performing the use of rice bran as raw material for the production of vinegar.

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451400-Texto+Completo-0.pdf: 16861193 bytes, checksum: 8e59e1dc262f6d66b6ff62e7eca281b9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease’s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction’s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) é considerada uma ameaça à saúde global. O aumento na prevalência da doença, a emergência de cepas resistentes e a coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Além disso, há a necessidade de novas drogas contra a micobactéria nos seus diferentes estados fisiológicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metabólicas de nucleotídeos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB. A hidrolase de nucleosídeos catalisa a hidrólise irreversível da ligação N-glicosídica de ribonucleosídeos, dando origem à α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplificação e clonagem do gene iunH, e a expressão e purificação da enzima recombinante hidrolase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cinética no estado estacionário mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cinéticas da ligação da ribose à MtIAGU-NH por espectroscopia fluorimétrica sugerem a existência de duas formas da enzima em equilíbrio, relacionadas à associação ao ligante. As concentrações intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os parâmetros termodinâmicos, estimados. Os parâmetros termodinâmicos de ativação (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação química catalisada pela MtIAGU-NH, além dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titulação isotérmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de múltiplas sequências e experimentos de docagem molecular também são apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este não é essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condições experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases sólidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para diminuir a incidência global da TB.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:25:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451791-Texto+Completo-0.pdf: 11131527 bytes, checksum: 73b1d535d96f83c30dd5fb46e7f2af5d (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5’-monophosphate (IMP) to xanthosine 5’- monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7. 5 and 9. 0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme’s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doenças infectocontagiosas e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos disponíveis há mais de 50 anos, a TB é responsável por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e têm estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Avanços na identificação de novos alvos para drogas contra a TB têm sido possíveis graças ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucidação da função de proteínas envolvidas em rotas bioquímicas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) é uma enzima chave na biossíntese de nucleotídeos de purina, pois participa de uma etapa limitante na síntese de novo de nucleotídeos de guanina, a partir de inosina 5’-monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxidação de IMP a xantosina 5’-monofosfato (XMP), com concomitante conversão de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) à sua forma reduzida, NADH. Essa reação controla os níveis de nucleotídeos de guanina e inibidores da IMPDH têm sido utilizados como agentes imunossupressores, anticâncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima têm sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da região codificante do gene guaB2, a expressão e a purificação da proteína MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular média de 54. 775 Da e a análise através de Espectroscopia de Absorção Atômica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um íon K+ por subunidade. Os experimentos de reação cruzada, utilizando glutaraldeído, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetrâmero em solução. Os estudos de cinética em estado estacionário revelaram que a atividade catalítica da MtIMPDH é dependente de cátions monovalentes, principalmente K+.Os estudos de velocidade inicial e inibição pelos produtos sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo cinético sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente à MtIMPDH, seguido pela ligação do NAD+, e que a transferência do hidreto não é a etapa limitante da reação catalisada pela enzima em estudo. Além disso, a inibição pelo substrato NAD+ indica que a liberação dos produtos é ordenada, onde o NADH é o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotonação de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 é essencial para a atividade catalítica da MtIMPDH e, que aminoácidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK próximos de 7,5 e 9,0 estão envolvidos na ligação ao NAD+. Os dados aqui apresentados são discutidos com base em estudos cinéticos e estruturais disponíveis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Além disso, a identificação de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida por substituição gênica, a fim de avaliar a importância do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene é essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirmação da essencialidade permitirá a validação do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracterização cinética da enzima e da substituição gênica representaram o ponto de partida para o planejamento, seleção e testes de possíveis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos químicos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibição não-competitivo e incompetitivo em relação aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracterização da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibição desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas objetivando o controle da TB.

Made available in DSpace on 2013-12-21T01:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000452946-Texto+Completo-0.pdf: 4295769 bytes, checksum: 7a8634a037c064cad84539c03a441c4a (MD5) Previous issue date: 2013 / Human thymidine phosphorylase (hTP) also known as platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) or gliostatin, has an important role in nucleotide metabolism. hTP is a molecular target for anticancer drug development since it is overexpressed in certain solid tumours, and its catalityc activity has been shown to be essencial to promote angiogenesis. This work describes amplification, cloning, and recombinant expression in E. coli, purification to homogeinity of both precursor and mature protein hTP. Mass spectrometry analysis confirmed the identity of homogeneous hTP and size exclusion chromatography showed that hTP proteins are a dimer in solution. Kinetic studies allowed the determination of apparent and true kinetic constants for forward reaction, and showed that enzymes displayed substrate inhibition for thymidine. Initial velocity and isothermal titration calorimetry (ITC) studies suggested that hTP catalysis follows a rapid-equilibrium random bi-bi kinetic mechanism. Thermodynamics constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates/products binding patterns identification. Additionally, these studies showed differences in the kinetic constants and the thermodynamic parameters between the precursor and the mature protein and these differences were revealed by structural analysis using molecular modeling. The pH-rate profiles suggested that maximal enzyme activity was achieved at low pH values, and functional groups with a pK values of 5. 1 – 5. 2 and 9. 0 – 9. 2 are involved in thymidine binding, and groups with pK value of 6. 1 – 6. 2 and 7. 8 – 8. 6 are involved in phosphate binding. The enzyme characterization provides additional data that may be useful for the rational design of novel inhibitors hTP. Chemical compounds designed and synthesized as potential inhibitors against hTP activity were active in both forms of the enzyme, whereas the compound 5g showed the best inhibitory potential. The compound 5g was characterized as noncompetitive inhibitor towards hTP substrates thymidine and phosphate. The noncompetitive inhibiton mechanism points to the existence of an allosteric binding site at hTP, different from the substrate binding sites. This allosteric site could be considered an important molecular target for the development of potent and selective hTP inhibitors. / A Timidina fosforilase humana (hTP), também conhecida como PD-ECGF e gliostatina, é uma enzima importante no metabolismo de nucleotídeos. A hTP é um alvo molecular para o desenho de inibidores enzimáticos com possível uso na terapia do câncer, visto que essa enzima encontra-se superexpressa em alguns tipos de tumores sólidos e sua atividade catalítica é essencial para promoção da angiogênse. Esta tese descreve a amplificação, clonagem, expressão heteróloga em E. coli, purificação e caracterização bioquímica do precursor e da proteína madura hTP. Análises de espectrometria de massa confirmaram a identidade das proteínas recombinantes e ensaios de cromatografia de exclusão por tamanho revelaram que ambas as enzimas encontram-se como dímeros em solução. Estudos cinéticos permitiram a determinação das constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para a reação direta e mostraram que as enzimas apresentam inibição pelo substrato tidimina. Estudos espectofotométricos de velocidade inicial e estudos de ligação por microcalorimetria de titutalação isotérmica (ITC) sugerem que a catálise enzimática segue um mecanismo cinético bi-bi aleatório de rápido equilíbrio. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos/produtos naturais das enzimas com seus sítios de ligação. Além disto, esses estudos revelaram diferenças nas constantes cinéticas e nos parâmetros termodinâmicos entre o precursor e a proteína madura e tais diferenças foram evidenciadas por meio da análise estrutural de ambas as enzimas.O perfil de pH mostrou que a atividade enzimática máxima foi obtida em valores de pH baixos, e que grupamentos funcionais com valores de pK de 5,1 – 5,2 e 9,0 – 9,2 estão envolvidos na ligação à timidina e grupamentos com valores de pK de 6,1 – 6,2 e 7,8 – 8,6 estão envolvidos na ligação ao fosfato. Os resultados da caracterização da enzima fornecem dados adicionais que podem ser úteis para o desenho racional de novos inibidores da hTP. Os compostos químicos planejados e sintetizados como possíveis inibidores da atividade da hTP foram ativos em ambas as formas da enzima, sendo que o composto 5g apresentou o melhor potencial inibitório. O composto 5g foi caracterizado como um inibidor não competitivo em relação aos substratos naturais timidina e fosfato. O mecanismo de inibição não competitiva sugere a existência de um sitío de ligação alostérico na hTP, diferente dos sítios de ligação aos substratos, podendo ser considerado um alvo molecular importante para a busca de inibidores potentes e seletivos para hTP.

Made available in DSpace on 2014-08-30T02:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460859-Texto+Completo-0.pdf: 2353123 bytes, checksum: dd594f361c31a6e6ca5c19cd19a8c488 (MD5) Previous issue date: 2014 / The Mycobacterium tuberculosis NADH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase (MtInhA) catalyzes hydride transfer to long-chain enoyl thioester substrates. MtInhA is a member of the mycobacterial type II dissociated fatty acid biosynthesis system, and is the bona fide target for isoniazid, the most prescribed drug for tuberculosis treatment. Here, a series of piperazine derivatives was synthesized and screened as MtInhA inhibitors, which resulted in the identification of compounds with IC50 values in the submicromolar range. A structure-activity relationship (SAR) evaluation indicated the importance of the chemical environment surrounding the carbonyl group for inhibition. In addition, the structure of one selected compound was supported by crystallographic studies, and experimental geometrical values were compared with semi-empirical quantum chemical calculations. Furthermore, the mode of inhibition and inhibitory dissociation constants were determined for the nine most active compounds. These findings suggest that these compounds interact with MtInhA at the enoyl thioester (2-trans-dodecenoyl-CoA) substrate binding site. Finally, two 9H-fluoren-9-yl-piperazine-containing compounds exhibited moderate antimycobacterial activity against the M. tuberculosis H37Rv strain. / A enzima 2-trans-enoil-ACP redutase de Mycobacterium tuberculosis (MtInhA) catalisa a etapa enzimática final no ciclo de alongamento da via de biossíntese de ácidos graxos, convertendo 2-trans-enoil-ACP à acil-ACP em um mecanismo dependente de NADH. Essa enzima vem sendo descrita como alvo validado para a descoberta de fármacos. Nesse trabalho uma série de piperazinas foi sintetizada e avaliada quanto ao potencial inibitório da atividade enzimática da MtInhA, resultando em compostos com valores de IC50 na faixa de inibição de nanomolar. Avaliações de relação estrutura-atividade (SAR) indicam a importância do ambiente químico adjacente à carbonila para a inibição. Além disso, a estrutura de um composto foi confirmada por estudos cristalográficos e os valores geométricos experimentais foram comparados com valores obtidos através de cálculos semi-empíricos de obitais moleculares. Experimentos para determinação do modo de inibição e obtenção dos valores das constantes de dissociação foram realizados para os nove compostos mais ativos. Os resultados sugerem que esses compostos interagem com MtInhA no sítio de ligação dos substratos acil-graxos. Finalmente, dois compostos, contendo na sua estrutura 9H-fluoren-9-il-piperazina exibiram moderada atividade antimicrobiana contra a cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Made available in DSpace on 2014-11-15T01:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000462458-Texto+Completo-0.pdf: 2477430 bytes, checksum: d919c3c5fbc07113fb3a1d22bb1b9e59 (MD5) Previous issue date: 2014 / Tuberculosis (TB), a disease mainly caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (MTB), is considered a global public health problem. Infections caused by mycobacteria are generally difficult to treat because of its natural resistance to most antibiotics. This resistance is largely attributed to the formation of the cell wall. The InhA is part of the mycobacterial FAS II system which regulates the elongation of the fatty acid chain, which will compose the cell wall of the bacillus (mycolic acids). As the FAS II system is not present in mammals, this enzyme has been described as an important macromolecular target aiming the development of drugs with selective toxicity. The development of analytical techniques for studying proteins in solution by mass spectrometry combined with cross-linking has permitted access information about the primary, tertiary, and quaternary structure of the proteins. In this work, the technique of cross-linking combined with mass spectrometry was implemented for the characterization of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase (InhA) which catalyzes the final essential enzymatic step in fatty acid elongation in the FAS II pathway, converting 2-trans-enoyl-ACP to acyl-ACP via an NADH-dependent reaction. / A tuberculose (TB), doença causada principalmente pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), é considerada um problema global de saúde pública. As infecções causadas pela micobactéria são, em geral, difíceis de tratar devido principalmente ao surgimento de cepas resistentes á maioria dos fármacos disponíveis e à co-infecção com a síndrome da imunodeficiênciaadquirida (SIDA). Nesse contexto, a caracterização de alvos moleculares para a proposição de novas estruturas químicas candidatas a fármacos anti-TB mostra-se de importância sumária. A enzima enoil-ACP-redutase (InhA) de MTB faz parte do sistema FAS II damicobactéria a qual regula o alongamento da cadeia dos ácidos graxos fornecendo os precursores que irão compor a parede celular do bacilo (ácidos micólicos). Como o sistema FAS II não esta presente em mamíferos esse fato torna essa enzima um importante alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos com toxicidade seletiva. O desenvolvimento de técnicas analíticas para estudar proteínas em solução utilizando a espectrometria de massas combinada com agentes de ligação cruzada vem possibilitandoa caracterização estrutural de proteínas conduzindo a informações sobre suas estruturas primárias, terciárias e quaternárias. No presente trabalho foi implementado a técnica de cross-linking combinada a espectrometria de massas para a caracterização em solução da enzima InhA de MTB.

Orientador: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Maria Cristina Teixeira Duarte / Banca: Meire Cristina Nogeura de Andrade / Resumo: A produção de bioetanol e de açucares a partir do caldo de cana gera como um dos subprodutos, o bagaço. Atualmente, esse último, uma biomassa industrial lignocelulósica, pode ser aproveitado para produção de etanol de segunda geração, desde que previamente submetido a processos hidrolíticos para gerar açúcares fermentescíveis. O objetivo deste trabalho foi estimar a produção de bioetanol a partir desta biomassa agroindustrial. Para tanto, foram utilizados os cogumelos Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii e Pycnoporus sanguineus como potenciais fontes produtoras das enzimas lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase, capazes de hidrolisar o bagaço de cana-de-açúcar. As maiores atividades enzimática observadas para L. edodes, P. ostreatus, P. sanguineus e P. eryngii para lacase foram de 39,23 U-mL ao 25º dia de incubação, 2,5 U-mL e 80 U-mL ao 27º dia de incubação, e 16,45 U-mL ao 15º dia, respectivamente. As enzimas MnP e LiP não apresentaram resultados expressivos. A hidrólise enzimática do bagaço de cana in natura (32,17% de hemicelulose, 52,45% de celulose e 10,62% de lignina) e o bagaço de cana hidrolisado com H2SO4 7,0% (0,20% de hemicelulose, 68,82% de celulose e 25,33% de lignina) foram avaliados para cada conjunto enzimático obtido. Comparado aos demais, as enzimas produzidas pelo P. sanguineus incubado em bagaço in natura apresentaram uma melhor eficiência na conversão dos açúcares, com teor médio de 0,14 g-L de glicose. Embora os baixos teores de glicose determinada nesse trabalho, em relação com a literatura, pode-se afirmar que as enzimas lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase, demonstraram ter potencial hidrolítico, principalmente para as produzidas pelo fungo P. sanguineus / Abstract: The production of ethanol and sugar from sugarcane juice bagasse is generate byproduct. Currently, the bagasse, an industrial lignocellulosic biomass can be used for production of second generation ethanol, since when submitted to hydrolytic processes generate fermentable sugars. The objective of this study was to estimate the production of bioethanol from this agro biomass. Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii and Pycnoporus sanguineus were used as potential sources producing enzymes laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase, capable of hydrolyzing the sugarcane bagasse. The highest activity of enzymes, observed for L. edodes, P. ostreatus, P. sanguineus and P. eryngii were to 39.23 U-mL laccase after 25 days of incubation, 2,5 U-mL and 80 U-mL after 27 days of incubation, and 16,45 U-mL on 15 day, respectively. MnP and LiP showed no significant results. The enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse in natura (32,17% hemicellulose, cellulose 52,45% and 10,62% lignin) and bagasse hydrolyzate with 7,0% H2SO4 (0,20% hemicellulose, 68,82% to 25,33% cellulose and lignin) were evaluated for each enzymatic obtained. Compared to others, the enzymes produced by P. sanguineus incubated in sugarcane bagasse showed better efficiency in getting glucose with an average grade of 0,14 g-L. Although low levels of glucose determined in this work, in relation to the literature, it can be stated that the enzymes laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase, demonstrated good hydrolytic potential, especially for those produced by the fungus P. sanguineus. / Mestre

Banca: Ana Sueli Rodrigues Cavalcante / Banca: Fábio de Abreu Alves / Banca: Luciane Dias de Oliveira / Banca: Luiz Paulo Kowalski / Banca: Márcio Ajudarte Lopes / Resumo: O objetivo desta tese foi reunir os resultados de estudos clínicos, imunohistoquímicos e moleculares que investigaram o perfil demográfico e a etiopatogenia do carcinoma de células escamosas primário (CEC) de boca em pacientes jovens (com idade ≤40 anos). Além disso, a data do tratamento primário foram próximas. Inicialmente, foi realizado um levantamento epidemiológico através dos prontuários dos pacientes atendidos no ambulatório de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do AC Camargo Cancer Center. Foram encontrados 125 pacientes jovens (grupo teste) que foram pareados com 250 pacientes com idade ≥50 anos (grupo controle) que apresentaram tumores em topografia, estadiamento clínico e época de tratamento similares. Em ambos os grupos, a o sexo masculino foi o mais afetado, sendo a língua seguida do soalho bucal os locais acometidos. Tumores em estadios clínicos avançados e bem difernciados foram características mais frequente. Interessantemente, o grupo jovem foi menos exposto ao tabaco (p=0.04). Este grupo apresentou mais recorrências (p=0.02), embora não se tenha observado diferenças nas curvas de sobrevidas global (SG) (p=0.86) e livre de doença (SLD) entre os grupos avaliados. Linfonodos comprometidos, tumores avançados, pobremente diferenciados e a radioterapia como tratamento primário exclusivo diminuíram a SLD. A SG foi melhor nas mulheres, não usuárias de tabaco, lesões localizados em gengiva/palato duro e em estadios clínicos precoce. À partir deste levantamento, foi possível realizar os trabalhos subsequentes. No capítulo 3.2, foi realizado investigação da amplificação do CCND1 e expressão protéica da ciclina D1 em CEC de jovens e resultados encontrados foram comparados ao grupo controle. A superexpressão protéica foi observada em 47.7% vs 32.8% (p=0.03) e amplificação foi encontrada em 46.2% vs 18.6% (p<0.01). No grupo jovem, a superexpressão foi correlacionada com diminuição da SG, embora a... / Abstract: The objective of this thesis was to compile results of clinical, immunohistochemical and molecular studies on the demographics and etiopathogeny of primary oral squamous cell carcinoma (SCC) in young people (aged 40 years or younger). Initially, we carried out an epidemiological survey using medical records from patients treated at the ambulatory care unit of the Head and Neck Surgery Department of AC Camargo Cancer Center. We found 125 young patients (test group), who were then matched to 250 patients aged 50 years or older (control group), having tumors of similar topographies, clinical stages, and dates of treatment. Men were the most affected in both groups, being the tongue and the floor of the mouth the most affected regions. Tumors in advanced clinical stages and well differentiated were the most frequent types. Interestingly, the young group was less exposed to tobacco (p=0.04). Although this group showed higher relapse rates (p=0.02), no differences were found between the groups studied in terms of their Overall Survival (OS) (p=0.86) and Disease-Free Survival (DFS) curves. Involvement of lymph nodes, poorly differentiated tumors, tumors in advanced clinical stages, and radiotherapy as the sole primary treatment all brought down DFS rates. OS was higher in non-smoker women, in gingivae and soft palate lesions, and in early clinical stages. From the findings of this survey, we were able to carry out all subsequent research work. In Chapter 3.2, we carried out investigation on CCND1 amplification and cyclin D1 expression in SCC of young people, and compared the findings against the control group. Protein overexpression was found in 47.7% against 32.8% (p=0.03), and amplification was found in 46.2% against 18.6% (p<0.01). In the young group, overexpression was correlated with OS decrease; however, this difference was not statistically significant (p=0.06). Amplification was not correlated with OS in either of the groups. DFS was lower...

Segundo as estimativas da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), na safra de março de 2013/14 o Brasil produziu aproximadamente 12,8 milhões de toneladas de arroz, apresentando um acréscimo de 8% em relação à safra de 2012/13. O processamento deste grão resulta em subprodutos como o farelo de arroz, que apresenta vitaminas do complexo B, proteínas, tocoferóis e mais de 40% de carboidratos, justificando sua utilização em processos fermentativos, como a produção de vinagre. O vinagre é composto por 80% (v/v) de água e 20% de uma grande variedade de outros compostos, como ácidos orgânicos, álcoois, sais minerais, polifenóis, aminoácidos, entre outros. Os substratos utilizados na sua produção devem apresentar carboidratos fermentescíveis para que seja possível realizar as etapas de produção: fermentações alcoólica e acética. Tendo em vista estas considerações, os principais objetivos deste trabalho foram investigar o processo de hidrólise do farelo de arroz desengordurado por via enzimática, avaliar a etapa de fermentação alcoólica para otimizar a produção de etanol, e realizar a produção do vinagre por meio de fermentação submersa, bem como a caracterização do produto final. Para a otimização da etapa de sacarificação dos açúcares complexos do farelo de arroz desengordurado (FAD), realizou-se uma estratégia sequencial de planejamento experimental. Inicialmente aplicou-se um planejamento Fracionário 25-1 com as variáveis concentração de (FAD) (razão farelo/água (g.L-1)), concentração e tempo de atuação da -amilase e da amiloglucosidade (AMG), tendo-se como resposta, a concentração de açúcares redutores (AR); após análise do Planejamento Fracionário, foram aplicados dois Delineamentos Compostos Central Rotacional (DCCR) 22, onde avaliou-se os efeitos das concentrações de ambas enzimas. A validação das condições otimizadas para a hidrólise enzimática foi realizada por meio de dois testes em triplicata, nas vizinhanças das condições otimizadas. Na etapa subsequente de fermentação alcoólica, inicialmente desenvolveu-se um teste objetivando avaliar o efeito do tamanho do inoculo e da agitação para posterior aplicação de um DCCR 23, onde foram avaliados os efeitos da concentração de inoculo, pH e temperatura sobre a resposta de rendimento em etanol (%). Após a análise dos resultados do primeiro DCCR, objetivando-se aumentar o rendimento em etanol, realizou-se um segundo teste preliminar, para avaliar os efeitos da adição de protease e da exposição da suspensão de farelo de arroz desengordurado ao tratamento ultrassônico, anteriormente a etapa de hidrólise enzimática, visto que diversos estudos indicam que a produção de etanol pode ser aumentada nestas condições, devido a maior exposição dos grânulos de amido às enzimas amilolíticas do processo de sacarificação, após a ação de proteases. Os resultados obtidos permitiram definir a sequência do estudo, na qual um segundo DCCR foi aplicado para a avaliação dos efeitos da concentração de inoculo e temperatura em faixas ajustadas, visando alcançar a otimização da fermentação alcoólica, realizando-se a adição de protease anteriormente a hidrólise enzimática. Uma vez otimizada a etapa de fermentação alcoólica, foi realizada uma batelada de produção do vinagre (fermentação acética) com os parâmetros otimizados nas etapas anteriores. A caracterização do vinagre foi realizada por meio da determinação dos parâmetros exigidos na legislação vigente (teor alcoólico residual, acidez total e ácido acético, pH, extrato seco total e reduzido, cinzas e açúcares redutores e totais). A otimização da hidrólise enzimática foi alcançada nos ensaios com concentração de 200 g.L-1 de FAD, 30 µL.g-1 de -amilase e 40 µL.g-1 de amiloglucosidade, com os tempos de atuação das mesmas em 2 e 3 horas, respectivamente. No primeiro teste preliminar, realizado na etapa de fermentação alcoólica, observou-se que a agitação influenciou de forma positiva apenas nos ensaios com 2,0 e 5,0% de inoculo, sendo que o maior rendimento de etanol obtido foi de 1,90% com a utilização de 0,5% de inoculo, em condições estacionárias. Com os resultados obtidos no primeiro teste, ajustou-se as faixas das variáveis do primeiro DCCR onde o teor máximo de etanol obtido foi de 2,10%, com a temperatura em 30°C, 2,8% de inoculo e pH 5,0. Por meio da aplicação do segundo teste verificou-se que, nas condições aplicadas, o tratamento ultrassônico não apresentou efeito significativo na resposta de concentração de etanol, entretanto com a utilização da protease, foi possível aumentar para 3,6% o rendimento de etanol, após as 72h de fermentação alcoólica. Visando alcançar a otimização da fermentação alcoólica, realizou-se um novo DCCR, sendo fixada a concentração de 15 µL.g-1 de protease para atuação anteriormente ao processo de hidrólise enzimática dos polissacarídeos e sendo ajustadas as faixas das variáveis significativas no primeiro DCCR (temperatura: 28 a 35 °C; concentração de inoculo: 1 a 7%), onde foi possível alcançar rendimento de 4,10% de etanol. A fermentação acética foi concluída após oito dias da inoculação das bactérias acéticas, por meio do vinagre forte de etanol, sendo que o produto gerado, vinagre a base de farelo de arroz, não atendeu a legislação em vigor, apenas no parâmetro de cinzas, o qual pode ser ajustado com a aplicação de uma etapa de filtração. / According to estimates of the National Supply Company (CONAB), in the period March 2013/14, Brazil produced approximately 12.8 million tons of rice, an increase of 8 % compared to the period of 2012/13. The grain processing results in by-products such as rice bran, which has B vitamins, proteins, tocopherols and over 40% carbohydrates, justifying their use in fermentation processes such as vinegar production. Vinegar is composed of 80% (v/v) water and 20% of a wide variety of other compounds such as organic acids, alcohols, minerals, polyphenols, amino acids, among others. The substrates used in vinegar production must provide fermentable carbohydrates to alcoholic fermentation, which is followed by acetic fermentation. The aims of this study were to investigate the hydrolysis process of defatted rice bran by enzymatic way, assess the stage of alcoholic fermentation to optimize ethanol production, and carry out production of vinegar by submerged fermentation and characterizing the final product. METHODS: Optimization of enzymatic hydrolysis was achieved using a sequential strategy of experimental design. Firstly, a Fractional Factorial Fesign including 25-1 trials plus 3 center points (19 runs) was applied to evaluate the effects of concentration of amylolytic enzymes, action timeand the dilution rate of defatted rice bran (DRB) on response of reducing sugars (RS) released, followed by two CCRDs (Central Composite Rotatable Design); after the analysis of the effects of Fractional Design, the optimum values of enzymes concentration was reached by the two sequential CCRD. Validation of the optimal conditions for the enzymatic hydrolysis was performed in triplicate in two tests, in the vicinity of the optimized conditions. In the step of alcoholic fermentation, initially was developed a test to evaluate the effect of inoculum size and agitation for application of a CCRD 23 that evaluated the effects of inoculum concentration, pH and temperature on the response of ethanol yield (%). After the analysis the first CCRD, aiming to increase the ethanol yield, the second test was performed to evaluate the effects of protease addition and exposure of the suspension of defatted rice bran to ultrasonic bath treatment, prior to enzymatic hydrolysis with amylases, since several studies indicate that the ethanol production can be increased under these conditions, because of increased exposure of the starch granules to amylolytic enzymes in the saccharification, after the action of proteases. The results allowed to determine the sequence of the study in the second CCRD was used to evaluate the effect of inoculum concentration and temperature, with adjusted tracks to achieve the optimization of fermentation, performing the addition of protease hydrolysis previously enzyme. Once the alcoholic fermentation step was optimized, a batch of vinegar production (acetic fermentation). The characterization of vinegar was performed by determination the parameters required by Brazilian legislation (residual alcohol content, total acidity and acetic acid, pH, total and reduced dry extract, ash and total and reducing sugars). The optimization of enzymatic hydrolysis was achieved with concentration of 200 g•L-1 FAD, 30 g•L-1 α- amylase and 40 g•L-1 amyloglucosidase, with action times of 2 and 3 hours, respectively. In the first preliminary test performed on the alcoholic fermentation step, it was observed that shaking positively influenced only in the tests with 2.0 and 5.0% of inoculums, and the higher yield of ethanol obtained was 1.90 % with the use of 0.5% inoculums, under stationary conditions. with the results obtained in the first test, the tracks of the variables were defined for the first CCRD, where the maximum ethanol content was obtained 2.10%, with the temperature at 30 °C, 2.8% of inoculums and pH 5.0. By applying the second test it was found that under the conditions applied, the ultrasonic treatment had no significant effect on the response of ethanol concentration; however, with the use of protease the yield was increased to 3.6% ethanol, after 72 hours of alcoholic fermentation. A new CCRD was performed, in order to achieve the optimization of the alcoholic fermentation; in this step, the concentration of protease was fixed at 15 μLg-1, before the enzymatic hydrolysis of polysaccharides with the amylases and the ranges studied for the significant variables in the first CCRD was adjusted (temperature: 28 - 35 °C; inoculum concentration: 1 - 7%), being achieved yield of 4.00% ethanol. The acetic fermentation was completed after eight days of inoculation of acetic bacteria (strong ethanol vinegar), and the vinegar produced answered current Brazilian legislation in all parameters, except for ash, which can be adjusted by applying a filtration step. These results may generate technological innovation for the industrial sector, as the results obtained in this work demonstrate the possibility of performing the use of rice bran as raw material for the production of vinegar.