Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-28T14:59:15Z No. of bitstreams: 1 2013_DianaPaolaGomezMendoza.pdf: 3302680 bytes, checksum: 30eebfba95186093786be13ff26f3486 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-28T15:12:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DianaPaolaGomezMendoza.pdf: 3302680 bytes, checksum: 30eebfba95186093786be13ff26f3486 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-28T15:12:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DianaPaolaGomezMendoza.pdf: 3302680 bytes, checksum: 30eebfba95186093786be13ff26f3486 (MD5) / Trichoderma harzianum é um fungo filamentoso capaz de secretar enzimas hidrolíticas ao meio extracelular as quais agem despolimerizando componentes da biomassa vegetal como celulose e hemicelulose. O conjunto de proteínas secretadas por uma célula é denominado de secretoma, uma subpopulação do proteoma total. Amostras correspondentes ao secretoma de T. harzianum foram obtidas por fermentação submersa (SmF) em meio sintético suplementado com 1 %(m/v) de glicose, celulose, xilana ou bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram posteriormente submetidos à análise proteômica seguindo duas abordagens distintas, eletroforese bidimensional (2-DE) seguida de espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF para a identificação de polimorfismos proteicos provenientes do gel, e LC-MS/MS para identificação do total de proteínas presentes em cada amostra. Os secretomas de T. harzianum foram igualmente tratados com a enzima PNGase F a fim de detectar presença de proteínas glicosiladas e mudanças no perfil bidimensional das amostras. O crescimento nas diferentes fontes de carbono resultou na identificação de diversos grupos de proteínas extracelulares que incluíram glicosil hidrolases como celulases, xilanases, pectinases e quitinases, bem como proteínas associadas à parede celular fúngica como hidrofobinas e proteínas elicitoras e um alto número de proteínas putativas, cuja expressão diferencial parece estar regulada pela natureza e complexidade da fonte de carbono utilizada na cultura. Adicionalmente este trabalho apresenta evidência sobre a ocorrência de complexos multienzimáticos no secretoma do fungo após o crescimento por SmF em bagaço de cana, graças à utilização de técnicas eletroforéticas, enzimológicas e espectrométricas como BN-PAGE, zimografia e LC-MS/MS, respectivamente. Os resultados indicam que proteínas secretadas por T. harzianum naturalmente envolvidas na desconstrução de substratos (hemi) celulolíticos e quitinolíticos formam parte de elementos oligoméricos constituídos por subunidades de diferente especificidade catalítica que aparentemente são requeridas para uma conversão eficiente e específica dos polímeros da biomassa. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Trichoderma harzianum is a filamentous fungus able to secret hydrolytic enzymes to the extracellular medium which act degrading the biopolymeric components of plant biomass such as cellulose and hemicellulose in fermentable sugars. This set of secreted proteins corresponds to the secretome, a subset of the proteome. The samples related to the T. harzianum secretome were obtained by submerged fermentation (SmF) in synthetic medium supplemented with1% (w/v) glucose, cellulose, xylan or sugarcane bagasse as a carbon source. The secretomes were explored by two different proteomic approaches, gel-based proteomics using two-dimensional electrophoresis (2-DE) followed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry for the identification of the protein polymorphisms from the gel, and gel-free proteomics using LC-MS/MS for identification of the total of protein present in each sample. The T. harzianum secretomes were also treated with the enzyme PNGase F in order to detect the presence of glycosylated proteins and changes in the dimensional profile of the samples. Growth on different carbon sources resulted in the identification of several groups of extracellular proteins such as glycoside hydrolases including cellulases, xylanases, pectinases, chitinases, as well as cell-wall associated hydrophobins and elicting proteins, and putative proteins whose differential expression appears to be regulated by the nature and complexity of the carbon sources used in the culture. In addition the occurrence of multienzymatic complexes in the secretome after SmF growth in sugarcane bagasse containing medium was demonstrated by means of electrophoretic, spectrometric and enzymologic techniques, such as BN-PAGE, zimography, and LC-MS/MS, respectively. The results indicate that enzymes and proteins secreted by T. harzianum naturally involved in the deconstruction of (hemi) cellulolytic and chitinolytic substrates are part of oligomeric elements composed of subunits with different catalytic specificities apparently required for specific and efficient conversion of biomass polymers.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-11T20:16:38Z No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-04T18:33:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-04T18:33:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) Previous issue date: 2009 / O fungo filamentoso Trichoderma harzianum conhecido produtor de enzimas extracelulares como xilanases e celulases foi crescido em três fontes de carbono quimicamente definidas, glicose, celulose e xilana e uma fonte complexa, bagaço de cana, a fim de determinar-se as variações que cada uma geraria na atividade enzimática e na composição do secretoma do fungo. A produção enzimática de T. harzianum sobre bagaço de cana foi inicialmente avaliada durante 15 dias, evidenciando pouca variação em termos de concentração, produção de proteínas e perfis eletroforéticos ao longo do tempo. Após crescimento por 9 dias, detectou-se atividade xilanolítica (0,00610 UI/mL) e celulolítica (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) no meio suplementado com glicose, indicando uma possível produção constitutiva das enzimas. A mais alta atividade xilanolítica(0,09514UI/mL) e celulolítica (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) foram observadas quando T. harzianum foi cultivado em meio com bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram submetidos a eletroforese bidimensional (2-DE) em faixa de pH 3-10 que mostrou perfil pouco complexo na amostra do meio com glicose e uma maior concentração de spots protéicos na região ácida dos demais géis. Foram então realizadas eletroforeses 2-DE na faixa de pH 4-7, a fim de obter melhor resolução de spots correspondentes a possíveis isoformas protéicas. Os géis bidimensionais na faixa de 4-7 foram submetidos a análise de imagens para determinar o número total de spots em cada gel assim como os spots exclusivos e os pareados entre as diferentes condições. Tentativas de identificação de spots por peptide mass fingerprinting e MS/MS mostraram baixa porcentagem de sucesso, provavelmente devido ao baixo número de sequências de T. harzianum em banco de dados e a existência de modificações pós-traducionais como glicosilações nas enzimas secretadas. Nacetil-glucosaminidase e α-L-Arabinofuranosidase, foram identificadas no secretoma obtido em meio contendo bagaço de cana. Espera-se que a conclusão dos mapas secretômicos possa contribuir na compreensão dos mecanismos de expressão e secreção de enzimas de T. harzianum e aplicações destas em processos biotecnológicos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The filamentous fungus Trichoderma harzianum recognized producer of extracellular enzymes such as xylanase and cellulases was grown in three chemically defined carbon sources, glucose, cellulose and xylan, and a complex source, sugarcane bagasse, in order to determine the variations in enzyme activity and secretome composition of fungus. The enzyme production of T. harzianum on sugarcane bagasse, was initially evaluated for 15 days, showing little variation in terms of concentration, protein production and electrophoretic profiles over time. After 9 days of growth, xylanolytic (0,00610 UI/mL) and cellulolytic (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) activities were detected in the medium supplemented with glucose, indicating a possible constitutive production of enzymes. The major cellulolytic (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) and xylanolytic (0,09514UI/mL) activities were observed when the T. harzianum was grown in medium with sugarcane bagasse. The secretoms were subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) in pH range 3-10 showed low complex profile in the sample of medium with glucose and a greater concentration of proteic spots in the acidic region of other gels. Electrophoresis were then performed 2-DE in the range of pH 4-7, to obtain greater resolution of spots corresponding to possible protein isoforms. The two-dimensional gels in the range of 4-7 were subjected to computational analysis of images that showed the total number of spots in each gel as well as exclusive and matched spots between the different conditions. Attempts to identify spots by peptide mass fingerprinting and MS / MS showed low percentage of success, probably due to the low number of sequences of T. harzianum in the database and the existence of posttranslational modifications as glycosylation in the secreted enzymes. N-acetyl-glucosaminidase and α-L- arabinofuranosidase, were identified in sugarcane bagasse secretome. It is expected that the conclusion of secretomic maps can contribute to a better understanding of the expression and secretion mechanisms of T. harzianum enzymes and their applications in biotechnological processes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T17:42:29Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) Previous issue date: 2009-08 / Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Rafael Barcelos Santos (rafabarcelosdf@hotmail.com) on 2011-06-30T18:54:38Z No. of bitstreams: 1 2007_YaradeFatimaHamu.pdf: 563964 bytes, checksum: b20377fdfcc682383a00ae04d5c460e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-07-03T19:23:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_YaradeFatimaHamu.pdf: 563964 bytes, checksum: b20377fdfcc682383a00ae04d5c460e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-03T19:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_YaradeFatimaHamu.pdf: 563964 bytes, checksum: b20377fdfcc682383a00ae04d5c460e7 (MD5) / O fungo Dicyma pulvinata (Deuteromycotina: Hyphomycete), apresenta grande potencial de uso em biocontrole de doenças de plantas, e tem sido encontrado em lesões induzidas pelo fungo Microcyclus ulei (Ascomycete), em folhas de seringueira (Hevea spp.). Esta doença, mal-das-folhas da seringueira, constitui fator limitante para a produção de látex e para a expansão da cultura no Brasil e em outros países da América Latina. O controle biológico do M. ulei, pelo fungo D. pulvinata, vem sendo apontado como promissor, pois o antagonista coloniza estromas do fitopatógeno, impedindo sua esporulação e, conseqüentemente, reduzindo o desfolhamento das plantas e a taxa de inóculo para reinfecções. É atualmente aceito que enzimas hidrolíticas, principalmente quitinases, b- glucanases e proteases produzidas por fungos com capacidade antagônica hidrolisam componentes da parede celular de fungos fitopatogênicos causando assim, sua destruição. Acredita-se, portanto, que agentes de biocontrole com maior capacidade de produção de enzimas micolíticas apresentem maior capacidade de controle. Assim, variantes de D. pulvinata – isolados CEN 93 (CG 774) e CEN 62 (CG 683) que apresentam potenciais de controle diferenciados foram avaliados quanto à produção de hidrolases; adicionalmente foi procedida a caracterização bioquímica de uma proteinase e a purificação parcial desta enzima, para cada isolado. Para o isolado CEN 62, houve uma melhor atividade proteinolítica com 192 h e para o isolado CEN 93, com 240 h de crescimento em meio de cultura. Após a detecção de atividade proteinolítica, estas foram investigadas quanto aos efeitos do pH e temperatura. O pH ideal foi igual a 8,0 e a temperatura ideal entre 25° e 50°C para os dois isolados de D. pulvinata. As amostras com atividade proteinolítica foram concentradas e submetidas a cromatografias de troca iônica. Os isolados CEN 62 e CEN 93 apresentaram cinco picos de proteínas e as frações com atividades proteolíticas foram reunidas, concentradas e recromatografadas em outras colunas de troca iônica e, então, seu perfil eletroforético estabelecido. Verificou-se que todas as amostras resultantes dos processos cromatográficos apresentaram mais de uma espécie protéica, demonstrando que as proteases foram purificadas apenas parcialmente. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The fungus Dicyma pulvinata(Deuteromycotina: Hyphomycete) shows strong biocontrol potential for plant diseases, and has been found in lesions caused in plants by Microcyclus ulei (Ascomycete), the agent of the South American Leaf Blight (SALB). This disease of the rubber tree (Hevea spp.), is a limiting factor for latex production and for expansion culture in Brazil and other countries of Latin America. The biological control of M.ulei by D. pulvinata, is currently considered as promising, because it colonizes strums of phytopathogen, preventing their sporulation and, consequently, reducing defoliation and inoculum rate reinfection. It is well accepted that hydrolytic enzymes, mainly chitinase, b- glucan and protease produced by fungi with antagonic capability hydrolyse the cell wall components of phytopathogenic fungi. It is therefore, believed that control agents with higher capacity of micolytic enzymes production show also higher capacity of biological control. So, variants of D. pulvinata – isolates CEN 93 (CG 774) and CEN 62 (CG 683) showing distinct capacity of M. ulei control were evaluated for their capacity to produce hydrolases. In addition, proteases produced by these two isolates were partially purified and characterized. The enzyme levels present in the culture filtrates indicated that the isolate CEN 62 had higher capacity of proteolytic enzymes production. The optima pH and temperature for each protease were about 8.0, and 25°C - 50°C, respectively. Ion exchange chromatographies of proteolytic enzyme samples from both isolates resulted in the separation of several protein peaks. Poliacrylamide gel electrophoresis indicated that all the protein fractions having proteolytic activity were partially purified only.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-12-09T12:09:31Z No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Os venenos de serpentes são muito pesquisados pela diversidade de moléculas e suas atividades. Dentre as principais classes de moléculas presentes nesses venenos podem ser destacas PLA2s e neurotoxinas, por possuírem moléculas com ações ocultas, presentes em diferentes sítios das mesmas moléculas. As serpentes da família Elapidae são excelentes representantes desta diversidade, por apresentarem os dois tipos de moléculas. As serpentes brasileiras da família Elapidae estão restritas ao gênero Micrurus, chamadas corais-verdadeiras, pela coloração característica. Micrurus frontalis representa bem esse gênero devido à diversidade de moléculas contidas em seus venenos e alta imunogenicidade, que a levou a ser a principal espécie utilizada na fabricação de soro antielapídico. Este estudo objetivou o isolamento de PLA2s presentes no veneno de Micrurus frontalis, e caracterização de atividades de peptídeos encriptados em suas estruturas primárias. Foram purificadas aproximadamente 30 frações doveneno de M. frontalis por meio de RP-HPLC em coluna semipreparativa, onde as de concentração de fase móvel ACN de eluição maior que 35% em geral apresentavam ao menos uma molecula de massa correspondente à de PLA2s. A fração Mf18 foi escolhida pela pureza e abundancia do componente de massa 13.447,37 Da. Sua estrutura primária foi determinada por Degradação de EDMAN e seqüenciamento de novo após redução, alquilação e digestão com enzima Glu-C. Após comparação com banco de dados de PLA2s presentes em venenos de Elapídeos, a proteína Mf18 foi enquadrada por homologia, na categoria de PLA2s de Classe I, pela presença da alça elapídica característica, número de pontes dissulfeto e comprimento da sequência. Pela conservação da região correspondente à alça ligante ao íon calcio de todas as outras enzimas da Classe I, e pela identidade de seu N-terminal com peptídeos opióides, principalmente encefalina, foram sintetizados 3 peptídeos chamados Elapidorfina-Y, Elapidorfina-W e Elapidorfina-F. Os peptídeos encontrados encriptados na sequência da PLA2 de M. frontalis foram liberados através de síntese em sílica. Após síntese em fase sólida por Fmoc e purificados, as atividades antinociceptivas foram avaliadas pelo ensaio de tailflick e ensaio de formalina. O peptídeo Elapidorfina-Y apresentou significativa atividade antinociceptiva quando comparada ao controle, que se mostrou dependente da dose, do tempo após aplicação e da relação dose X tempo após aplicação. Essa atividade em doses nanoMolares foi comparável aquela obtida com morfina. Nos ensaios de formalina, todos os peptídeos apresentaram atividade antinociceptiva, sendo notadamente maior do que o controle na fase inflamatória para o peptídeo Elapidorfina-W. Muitas proteínas são fontes de peptídeos menores, utilizando para isso diversas formas de serem obtidas, sendo a principal as clivagens de suas sequências mais longas em sítios específicos, dando origem a peptídeos com diversas atividades biológicas, em alvos distintos. Um exemplo dessa possibilidade é o peptídeo Crotalphine que possui atividade antinociceptiva, e a mesma sequência da porção N-terminal da Crotoxina, proteína isolada do mesmoveneno (Crotalus durissus). Os resultados obtidos concordam com o descrito para a própria encefalina, que também é resultado da liberação endógena de um peptídeo por meio de modificações postraducionais da proteína precursora Proencefalina. O presente trabalho mostrou a identificação e caracterização parcial de PLA2 doveneno de Micrurus frontalis e apresentou a atividade antinociceptiva no SNC e periférica de peptídeos liberados de sua sequência por meio de síntese em fase sólida. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Many researches focus on snake venoms due to the diversity of the molecules they possess and their activities. Among the main classes of molecules in these venoms, the PLA2s and neurotoxins are emphasized for pursuing different effects encrypted in each site. The elapidae snakes are excellent representatives of such diversity, because their venoms contain the two kinds of molecules. The brazillian elapidae are restricted to the Micrurus genus also known as the coral-snakes for their characteristic color. Micrurus frontalis well represents this genus for the diversity of molecules and high immunogenicity of its venom that led to its use in the manufacturing of the elapidae antivenom. The objective of this study was to identify, characterize and evaluate the PLA2s present in M. frontalis venom and isolate encrypted peptides with sequences similar to that of bioactive peptides. The initial chromatography step led to the fractionation of the crude M. frontalis venom in approximately 30 fractions by RP-HPLC with C18 semi preparative column. Each fraction that eluted at an ACN mobile phase concentration of 35% and more had at least one molecule with molecular mass corresponding to that of a PLA2. Fraction Mf18 was chosen for its purity and abundance of a component with a mass of 13.447,37 Da, which was then reduced, alkylated had its N-terminal sequenced by EDMAN degradation. The main fraction resulting of refractioning with analytical C18 was digested using a GLU-C V8 enzyme. Each generated enzymatic cleavage fragment was purified and had their primary structure determined by de novo sequencing. After comparisons with online elapidae snake PLA2s databanks, Mf18 protein was placed in the Class I snake PLA2s category due to its similarity, the presence of the elapid loop, the number of disulfide bridges and the sequence length. The high conservation of the region corresponding to the Calcium binding loop among all the Class I snake PLA2s and the identity of this region’s N-terminal to enkephalin’s, led us to use it as a model for the synthesis of three peptides named Elapidorphin-Y, Elapidorphin-W e Elapidorphin-F which only differ in their N-terminal by Y,W and F. Tertiary structure alignment of PLA2s from elapid snakes venoms and mammal pancreas also revealed similarity in the three dimensional structure of this region. After the synthesis, they were purified and had their sequence confirmed my mass spectrometry fragmentation and sequencing. Since the primary and tertiary structures resembles that of the antinociceptive peptide enkephalin, antinociceptive activity was evaluated through the tailflick and the formalin assay. The Elapidorphin-Y peptide presented significant antinociceptive activity when compared to control, dependent on the dose, time after infusion and the relation dose X time. This activity in nanoMolar scale was comparable to that of morphine. In the formalin assays, all the peptides presented antinociceptive activity, and was statistically higher than control in the inflammatory phase for the peptide Elapidorphin-W. The encrypted peptides discovered in a M. frontalis PLA2 sequence were released by solid phase synthesis. Many proteins are sources of smaller peptides, using many different mechanisms to be obtained, among which the main is the cleavage of their sequence at specific sites by endoproteinases originating peptides with diverse activities in various localities. The peptide Crotalphine possesses antinociceptive activity, and in a interesting way presents the same sequence as the Nterminal portion of Crotoxin, a longer PLA2 isolated from the venom of Crotalus durissus, raising the possibility of multiple cleavages after the endogenous synthesis. The obtained results agrees with the described for enkephalin itself, which is also the result of the cleavage from its precursor protein Proenkephalin by different enzymes. In conclusion, the present work showed for the first time the partial sequence of a PLA2 from the venom of M. frontalis and the peripheral and central nervous system antinociceptive activity of peptides released from its sequence by solid phase synthesis.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Neste trabalho, nanopartÃculas magnÃticas de ferro (Fe3O4) (NPM) foram avalia- das como suporte para a imobilizaÃÃo de lipase de Candida antarctica do tipo B (CALB). O biocatalisador (CALB-NPM) foi analisado na catÃlise dos Ãsteres: oleato de etila (biodiesel), butirato de metila e etila. NanopartÃculas magnÃticas sÃo particularmente interessantes para imobilizaÃÃo enzimÃtica devido as suas propriedades magnÃticas favorecerem a fÃcil separaÃÃo da mistura reacional atravÃs do uso de magnetismo. A enzima CALB à uma enzima capaz de atuar em diversas reaÃÃes, como, hidrÃlises e transesterificaÃÃes. Contudo, um dos problemas do uso de enzimas como catalisadores homogÃneos à a sua recuperaÃÃo. Assim, à necessÃrio o uso de suportes que retenham a enzima, mantendo suas caracterÃsticas catalÃticas. As na- nopartÃculas foram produzidas pelo mÃtodo de co-precipitaÃÃo. Determinou-se o tamanho das nanopartÃculas (11 nm) atravÃs da tÃcnica de difraÃÃo de raios-X (DRX) com posterior refi- namento das fases obtidas pelo mÃtodo Rietveld. Espectros de infravermelho foram obtidos para anÃlise de presenÃa de hidroxilas usando pastilhas de KBr das ferritas magnÃticas. O espectro foi medido na regiÃo entre 400 e 4000 cm−1. ModificaÃÃes foram realizadas na su- perfÃcie das mesmas com γ-aminopropiltrietoxissilano (APTS) e glutaraldeÃdo. No processo de imobilizaÃÃo, a influÃncia da velocidade de agitaÃÃo (20-250 rpm), carga enzimÃtica (45-200 UpNPB.g−1), tempo de contato enzima-suporte (0,5-5 h), concentraÃÃo de glutaraldeÃdo (2,5 e 25 % (m/v)), aditivo dodecil sulfato de sÃdio (SDS 0,23 %) e reutilizaÃÃo do biocatalisador fo- ram avaliadas. A imobilizaÃÃo foi realizada na presenÃa de 100 mM de tampÃo bicarbonato de sÃdio, pH 10, a 25 ÂC. ApÃs a imobilizaÃÃo, a enzima imobilizada exibiu melhor estabilidade tÃrmica e operacional do que na forma solÃvel. As condiÃÃes Ãtimas de imobilizaÃÃo foram: velocidade de agitaÃÃo de 45 rpm, carga enzimÃtica (80 UpNPB.g−1), tempo de imobilizaÃÃo de 1 h, soluÃÃo de glutaraldeÃdo (25 % (m/v)), possibilitando um rendimento de imobilizaÃÃo de 41,8 % e atividade enzimÃtica do derivado de 29,1 UpNPB/g. AlÃm disso, o biocatalisador manteve aproximadamente, 53% de atividade catalÃtica inicial apÃs cinco ciclos consecutivos de reaÃÃo hidrolÃtica. ApÃs a imobilizaÃÃo, a estabilidade tÃrmica dos derivados foi realizada a partir da reaÃÃo de hidrÃlise com 0,01 g de CALB-NPM. atividade catalÃtica da enzima livre e imobilizada foi analisada a 60 ÂC. A produÃÃo de esteres foi realizada com o biocatalisador na melhor condiÃÃo catalÃtica. AlÃm das nanopartÃculas foram analisadas a bioconversÃo de esteres por resinas acrÃlicas comerciais (CALB imobilizada). A conversÃo de oleato de etila foi de aproximadamente 90% para os biocatalisadores testados. Os ciclos de reaÃÃo consecutivos (14) mostram a manutenÃÃo da produÃÃo de biodiesel. A mÃxima conversÃo de buitrato de etila (96,8%) e metila (93,9%) foram obtidos apÃs 8 h de reaÃÃo a 25 ÂC com CALB imobilizada em nanopartÃculas magnÃticas. Os ciclos de reaÃÃo consecutivos (12) mostram a manutenÃÃo da produÃÃo dos Ãsteres (aproximadamente 76% para as nanopartÃculas e 79% para a resina acrÃlica). / In this work, magnetic nanoparticles of iron (Fe3O4) (NPM) were evaluated as a support for the immobilization of lipase Candida antarctica B (CALB). The biocatalyst (CALB- NPM) was analyzed in the catalysis of esters: ethyl oleate (biodiesel), methyl and ethyl buty- rate. Magnetic nanoparticles are particularly interesting for enzyme immobilization due to their magnetic properties favoring the easy separation from the reaction mixture by use of magne- tism. The CALB enzyme is an enzyme capable of acting in various reactions, such as hydrolysis and transesterifications. However, one problem of using enzymes as homogeneous catalysts is their recovery. Thus, it is necessary to use brackets that retain the enzyme while maintaining its catalytic characteristics. Nanoparticles were produced by co-precipitation method. We de- termined the size of the nanoparticles (11 nm) using the technique of X-ray diffraction (XRD) with subsequent refining of the phases obtained by the Rietveld method. Infrared spectra were obtained for analysis of the presence of hydroxyls using KBr pellets of magnetic ferrites. The spectrum was measured in the region between 400 and 4000 cm −1. Modifications were car- ried out on the nanoparticlesâ surfaces with γ-aminopropyltriethoxysilane (APTS) and glutaral- dehyde. The influence of stirring speed (20-250 rpm), enzyme load (45-200 UpNPB/gsupport), immobilization time (0.5-5 h), glutaraldehyde solution (2.5 and 25%), additive (SDS 0.23%) and reuse of the biocatalyst (six hydrolytic cycles reactions) were evaluated. The immobiliza- tion was performed in the presence of 100mMsodium bicarbonate buffer, pH 10, at 25 ÂC. After immobilization, CALB exhibited improved thermal and operational stabilities. The best result (Immobilization yield: 53% and immobilized enzyme activity: 29.1 UpNPB/gsupport) was obtained at 45 rpm, using 200 UpNPB/gsupport and 1h of immobilization. Furthermore, immo- bilized Calb maintained approximately 41.8 % of initial activity after five cycles of hydrolysis. The ethyl oleate production was analyzed with the best condition and compared to commercial acrylic resins (CALB immobilized). The ethyl oleate conversion was approximately 90 % for the two biocatalyst at 48 h. The consecutive reaction cycles (14) show the maintenance in the production of biodiesel. Maximum conversion of methyl butyrate (93.9 %) and ethyl butyrate (96.8 %) were achieved after 8 h of reaction at 25 ÂC for CALB immobilized onto magnetic nanoparticles. The consecutive reaction cycles (12) show the maintenance in the production of esters (approximately 76 % for nanoparticles and 79 % for acrylic resin).

Vários estudos têm sugerido que seres vivos podem ser suscetíveis aos campos eletromagnéticos (CEMs). Os supostos efeitos dos Campos Eletromagnéticos de Ultra Alta Freqüência (CEMUAFs) em sistemas biológicos são pouco conhecidos. Os relatos de um possível efeito biológico dependente da alteração de estados de oxidação entre pares de radicais sugerem um mecanismo de transdução orgânica para os campos. Outros trabalhos obtiveram alterações na sinalização celular e defesas antioxidantes após a exposição CEMUAFs e, tais alterações, poderiam ser um agente causador de doenças como, por exemplo, a leucemia infantil, esta já correlacionada com a exposição aos CEMs. Desta forma o objetivo deste estudo foi investigar se o CEMUAF (834 MHz) poderia interferir com o balanço oxidativo de planárias e ratos, assim como, estudar a participação de enzimas responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos, enzimas estas reconhecidas por serem influenciadas pela ação de radicais livres. As planárias foram expostas por 1, 3 e 6 dias (8 h/dia). Após a exposição foi feito um homogenato de todo o corpo de cada animal. Foi encontrado um aumento na atividade da superóxido desmutase (SOD) e um decréscimo na atividade da catalase (CAT) e na defesa antioxidante não-enzimática (TRAP) após 6 dias de exposição. Adicionalmente, houve um aumento na freqüência de micronúcleos (MN) após 3 e 6 dias de exposição. Não houve alteração nos parâmetros de dano oxidativo a lipídios (TBARS) e proteínas (Carbonil) em nenhum dos tempos de exposição. Estes resultados sugerem um aumento nos níveis de radicais livres e de danos aos ácidos nucléicos. Estudos posteriores deverão determinar se estes efeitos apresentam ou não associações do tipo causa e efeito. Foram utilizados três modelos com ratos. No primeiro modelo, animais com idades de 30, 80 e 210 dias foram expostos por 6 dias (7:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças nos parâmetros de TRAP, TBARS e Carbonil em nenhuma das idades expostas ao CEMUAF. Estes resultados sugerem que os tempos de exposição utilizados não foram suficientes para causar alguma mudança perceptível nos parâmetros de estresse oxidativo. No segundo modelo, utilizou-se o sangue e fígado dos neonatos expostos ao CEMUAF ainda no útero de suas mães durante todo o seu desenvolvimento embrionário (8:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças em nenhum parâmetro oxidativo. Foi encontrado um aumento na freqüência de MN nas hemácias, sugerindo um efeito genotóxico da irradiação do celular afetando o tecido hematopoiético dos fetos. No terceiro modelo, utilizou-se o sangue de ratos adultos (180 dias) expostos por 12 dias (8:30 h/dia). Os níveis da hidrólise de ATP e ADP estavam aumentados no grupo irradiado. Nenhum efeito foi observado nas atividades da SOD e da CAT, sugerindo nenhuma participação de radicais livres nestes resultados. Ainda são necessários muitíssimos estudos para determinar quais os mecanismos transdutores dos CEMUAFs em sistemas biológicos e de que forma esta interação ocorre, porém estes resultados sugerem: (a) um papel para os radicais livres sobre, pelo menos, alguns dos efeitos atribuídos aos CEMUAFs e (b) que os organismos em fase de formação podem ser mais sensíveis aos campos. Por fim, sugerimos que sistemas biológicos podem sofrer a ação da irradiação com uma quantidade de energia muito menor do que a esperada para promover algum efeito no metabolismo. / Several studies have suggested that living being could be susceptible to the electromagnetic fields (EMFs). The supposed effects of ultra high frequency electromagnetic fields (UHF-EMFs) in biological systems are not very well-known. The reports of a possible effect biological dependent of the alteration of oxidation states among radical pairs suggest a mechanism of organic transduction for the EMFs. Other works have obtained alterations in the cellular signaling and antioxidant defenses after the UHF-EMFs exposure and, such alterations could be a diseases causative agent as, e.g., the infantile leukemia, this already correlated to EMF exposure. This way we have investigated if the non thermal UHF-EMF (834 MHz) could interfere with the planarians and rats oxidative balance, as well as, to study the participation of responsible enzymes for the nucleotides hydrolysis. Nucleotide hydrolysis is known be influenced by the free radicals action. Planarians were exposed for 1, 3 and 6 days (8 h/day). After the exposure was made a whole body homogenate of each animal. It was found an increase in the superoxide dimutase (SOD) activity, a decrease in the catalase (CAT) activity and a decrease in the non-enzymatic antioxidant defense (TRAP) after 6-day exposure. It was also found an increase in the micronúcleos frequency (MN) after 3 and 6 days of exposure. It was not found changes in the parameters of lipid and protein oxidative damage (TBARS and Carbonyl, respectively) in none of the exposure times. These results suggest an increase in the levels of free radicals and of nucleic acids damages. Future studies would determine if these effects show or not cause and effect associations. Three models were used with rats. In the first model, animals with ages of 30, 80 and 210 days were exposed for 6 days (7:30 h/day). It was not found changes in the TRAP, TBARS and Carbonil parameters in none of the UHF-EMF exposed ages. Three models were used with rats. In the first model, animals with ages of 30, 80 and 210 days were exposed for 6 days (7:30 h/day). It was not found changes in the TRAP, TBARS and Carbonil parameters in none of the UHF-EMF exposed ages. These results suggest the exposure times used were not enough to cause some perceptible changes in the oxidative stress parameters. In the second model, it were used the blood and liver of offspring exposed to UHF-EMF (8:30 h/day) still inside of mothers' uterus during all its embryonic development. It was not found changes in any oxidative parameters. It was found an increase in the erythrocytes MN frequency suggesting a cellular irradiation genotoxic effect in the fetus hematopoietic tissue. In the third model, the blood of adult rats (180 days) was used after 12 days UHF-EMF exposure (8:30 h/day). The levels of the ATP and ADP hydrolysis were increased in the UHF-EMF group and no effect was observed in the activities of SOD and of CAT, suggesting no free radicals participation in these results. It is still necessary a lot of studies to determine which the UHF-EMF transductions mechanisms in biological systems and that forms this interaction happens, but these results suggest: (a) a role for the free radicals in, at least, some of the effects attributed to UHFEMFs and (b) that the organisms in formation phase may be more sensitive to these fields. Finally, we suggested that biological systems may suffer the irradiation action with an amount of energy lesser than the energy believed to promote some effect in the metabolism.

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.