aumento do número de casos de tuberculose e o surgimento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (MTB) resistentes a múltiplas drogas, entre elas a isoniazida (INH) representa um sério problema de saúde pública. A enzima InhA, ou 2-trans-Enoil-ACP (CoA) redutase de MTB, catalisa a redução NADHdependente de ácidos graxos α,β-insaturados, precursores dos ácidos micólicos (importantes componentes do envelope celular do MTB). Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas à resistência in vivo à INH devido a uma menor afinidade pela molécula de NADH, sugerindo que o mecanismo de resistência deva estar relacionado com interações específicas entre a enzima e o cofator. Para verificar os eventos moleculares associados à afinidade da enzima pelo ligante e identificar os aspectos moleculares relacionados com a resistência, foram realizados estudos de simulação por dinâmica molecular (DM) dos sistemas InhA-NADH (espécie selvagem wt e mutantes) completamente solvatados.Todos os sistemas enzimáticos apresentaram grande flexibilidade durante as trajetórias por DM. Apesar da flexibilidade, no complexo wt InhA-NADH, a molécula de NADH permanece firmemente ligada ao sítio da enzima numa conformação estendida. Nos complexos mutantes I21V e I16T, onde as mutações ocorrem na alça rica em glicina, as interações entre enzima e cofator são menos efetivas, permitindo que a porção pirofosfato do NADH experimente importantes mudanças conformacionais e se afaste de sua região de ligação, indicando, provavelmente, um estágio inicial da dissociação do ligante. No mutante I47T, a substituição da Ile por Thr causa uma contração no sítio de ligação do NADH, que é refletida no rearranjo conformacional do NADH e na expulsão de moléculas de água importantes para a associação do cofator O mutante S94A apresentacomportamento muito semelhante à enzima selvagem, como esperado a partir dos experimentos cristalográficos. As afinidades das enzimas pelo NADH foram avaliadas por experimentos de docking molecular, onde as estruturas instantâneas geradas durante as trajetórias da DM foram utilizadas como forma de considerar explicitamente a flexibilidade da macromolécula. Os resultados do docking molecular mostraram que todos os mutantes apresentam menor afinidade pelo NADH, exceto o mutante S94A, cuja energia livre de ligação do NADH foi estatisticamente igual à observada para a enzima selvagem. Os resultados apresentados neste trabalho devem contribuir para o entendimento do mecanismo molecular específico de resistência à INH, que é crucial para o desenvolvimento de novos fármacos para o controle da tuberculose. / The increasing prevalence of tuberculosis in many areas of the world, coupled with the rise in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MTB) strains presents a major threat to global health. InhA, the enoyl-ACP reductase from MTB, catalyzes the NADH-dependent reduction of long chain trans-2-enoyl-ACP fatty acids, an intermediate in mycolic acids biosynthesis. Mutations in the structural gene for InhA are associated with isoniazid resistance in vivo due to a reduced affinity for NADH, suggesting that the mechanism of drug resistance may be related to specific interactions between enzyme and cofactor within the NADH binding site. In order to compare the molecular events underlying this ligand affinity in the wild type and S94A, I21V, I16T and I47T clinical mutant enzymes, and to identify the molecular aspects related to resistance, molecular dynamics (MD) simulations of fully solvated NADH-InhA (wt and mutants) systems were performed.All InhA-NADH systems showed a large flexibility during the MD trajectories. Although very flexible, in the wt InhA-NADH complex, the NADH molecule keeps its extended conformation firmly bounded to the enzyme’s binding site. In the I21V and I16T mutant complexes, where mutated residues were located in the glycine rich loop, interactions between enzyme and cofactor became more labile, and the NADH pyrophosphate moiety undergoes to considerable conformational changes, becoming more hydrated and moving apart from its binding site, probably indicating the initial phase of ligand expulsion. In the I47T mutant, the substitution of an Ile residue for Thr causes a binding site contraction with conformational changes of the NADH molecule and expulsion of water molecules important for cofactor binding to the enzyme. The S94A mutant showed to be very similar to the wt enzyme, in agreement to crystallographic experiments observations. The enzyme-ligand affinities were evaluated by molecular docking experiments which were performed in the trajectory ensembles of MD snapshots asa way to explicit consider the macromolecular flexibility. All mutant enzymes had lower affinities for the NADH molecule, except the S94A mutant, whose free energy of NADH binding was statistically similar to that of the wild type enzyme. This results presented here should contribute to our understanding of specific molecular mechanisms of drug resistance, which is crucial for designing more potent antimycobacterial agents for controlling tuberculosis.

Submitted by João Arthur Martins (joao.arthur@ufpe.br) on 2015-04-10T14:27:54Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Michelly Delegado Paes Barreto.pdf: 1162383 bytes, checksum: 12b97d33f04c9b2e628465f4c3ac5944 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T14:27:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Michelly Delegado Paes Barreto.pdf: 1162383 bytes, checksum: 12b97d33f04c9b2e628465f4c3ac5944 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Estudos epidemiológicos evidenciam que indivíduos desnutridos no período crítico do desenvolvimento apresentam maior risco para o aparecimento de doenças cardiovasculares quando adultos. Além disso, vem se mostrando que o treinamento físico moderado pode atuar como um agente terapêutico em inúmeras doenças cardíacas. Dessa forma, o intuito do presente estudo foi avaliar o metabolismo cardíaco usando animais de experimentação que sofreram desnutrição no período critico do desenvolvimento e posteriormente foram treinados cronicamente em intensidade moderada. Para tal, foi avaliada a cinética das seguintes enzimas: fosfofrutoquinase (PFK), β-hidroxiacil-CoA desidrogenase (β-HAD), citrato sintase (CS), glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e ácido graxo sintase (FAS). Ratas gestantes da linhagem Wistar foram divididas em dois grupos: controle (C), dieta com caseína a 17%, e desnutrido (D), dieta com caseína a 8%. A dieta foi mantida durante a lactação. Após o desmame, apenas os ratos machos permaneceram no experimento, e todos eles passaram a alimentar-se de Labina (dieta do laboratório). Aos 60 dias de vida, os animais foram subdivididos de acordo com a prática ou não de treinamento físico de intensidade moderada: controle (C), desnutrido (D), treinado (T) e desnutrido treinado (DT). Foi seguido o protocolo experimental em esteira motorizada (8 semanas, 5 dias/semana e 60min/dia a 70%VO2máx). Para atingir o valor de VO2máx desejado, a velocidade, a inclinação da esteira e o tempo de exercício foram manipulados. Em torno dos 120 dias de vida, os animais foram sacrificados por decapitação, e em seguida, o coração foi retirado. Foram utilizados, em cada grupo, de 4 a 7 animais para as análises bioquímicas. A atividade cinética de cada enzima foi expressa em U/mg proteina. Para dados não paramétricos, foi utilizado o teste Kruskal-Wallis com pós-teste Dunns; para os dados paramétricos, foi realizado teste Anova One-Way seguido do teste Bonferroni. O nível de significância foi mantido em 5% para todas as análises. Nossos resultados mostraram que em PFK (C=2.25 ± 0.39; D=10.13 ± 2.52; T=29.87 ± 5.07; DT=4.42 ± 0.98), o grupo D tem maior atividade em relação ao grupo C, o grupo T também mostra maior atividade quando comparado ao grupo C, e o grupo DT tem menor atividade enzimática em relação ao grupo T. Em ß-HAD (C=3.08 ± 0.79; D=4.86 ± 0.47; T=3.48 ± 0.57; DT=5.05 ± 1.34), não houve diferença entre os grupos. Em CS (C=3.96 ± 0.78; D=1.85 ± 0.36; T=1.47 ± 0.42; DT=2.51 ± 0.17), o grupo D apresenta menor atividade enzimática em ralação ao grupo C, o grupo T também tem atividade reduzida comparado ao grupo C. Em FAS (C=15.46 ± 1.40; D=35.91 ± 7.11; T=52.39 ± 9.30; DT=31.61 ± 5.85), o grupo D teve maior atividade em relação ao grupo C, e o grupo T teve também aumento da atividade quando comparado ao grupo C. Em G6PDH (C= 4.93 ± 0.40; D=4.38 ± 0.68, T=4.41 ± 0.26; DT=5.18 ± 0.70) não houve diferença entre os grupos. As alterações nas atividades enzimáticas de ratos apenas desnutridos foram as mesmas de ratos apenas treinados. O treinamento físico moderado em ratos desnutridos pode induzir modificações no metabolismo cardíaco quanto às atividades de PFK e CS.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6497_1.pdf: 683530 bytes, checksum: 067ab5a9b397b0646649f9ddbb1291b4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / O queijo de coalho é tradicionalmente produzido a mais de 150 anos em vários Estados da Região Nordeste do Brasil. Os objetivos deste trabalho foram conhecer as leveduras presentes no queijo de coalho, verificar a osmotolerância e a produção de enzimas lipolíticas e proteolíticas. A população de leveduras isoladas variou de 4x102 a 8x104 CFU/g. Issatchenkia orientalis foi à espécie isolada com maior frequência dos queijos fabricados com leite cru, seguido das espécies de Yarrowia lipolytica e Geotrichum candidum, isolados de queijos produzidos com leite pasteurizado. Amostras de Kluveromyces marxianus, Candida tropicalis, Candida intermedia e Kodamaea ohmeri também foram isolados. As análises dos componentes do queijo demonstraram similaridade entre os teores de proteínas, lipídios e sódio das amostras avaliadas. Das 43 espécies testadas, 95,3% apresentaram crescimento de fraco a forte, na concentração de 1,5 mol/L, após 72 horas. Na concentração de 3,5 mol/L, 43,53% das amostras demonstraram crescimento de moderado a fraco. Amostras de I. orientalis, Y. lipolytica e G. candidum apresentaram-se osmotolerantes nos ensaios. Das amostras avaliadas quanto a produção de enzimas lipolíticas, 62,8% das leveduras foram capazes de produzir lipases e se desenvolverem no meio de crescimento, enquanto que 27,9% produziram proteases nos experimentos. Os resultados para as análises de quantificação das enzimas lipolíticas, a amostra 1 de Y. lipolytica apresentou-se como melhor produtora de enzimas lipolíticas e proteolítica, produzindo 0.81 e 0.55 unidade de atividade por mL, respectivamente

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2830_1.pdf: 12426045 bytes, checksum: 373eadff9d5b0a2bba2fac0933300fe7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O alumínio é um elemento ubiquitário e sem papel biológico definido, aplicado em tratamento de água devido sua ação floculante. Seu acúmulo em ambientes aquáticos, mesmo em condições alcalinas, acarreta ação tóxica para a biota aquática, sobretudo quando a exposição se dá num período prolongado, causando doenças em especies de peixes podendo levar a morte. Organismosteste como a tilapia tem grande potencial em ferramentas no biomonitoramento de áreas impactadas. Objetivamos, avaliar enzimas hidrolases da tilápia-do-Nilo por indução a exposição de concentrações desse metal. Neste contexto, foram utilizadas sete enzimas de tilápias-do-Nilo O. niloticus, a saber: AChE cerebral, AChE muscular, BChE muscular, pepsina, tripsina, quimotripsina e amilase intestinal; como biomarcadores, através da indução a exposição ao alumínio em ensaios in vivo (análises dos grupos induzidos a exposição) e in vitro (indução por incubação a partir de amostras do grupo controle do ensaio in vivo). Os peixes foram cultivados e expostos a diferentes concentrações de alumínio, delineando três grupos experimentais: Tratamento Grupo Controle (TGC, sem exposição ao Al2(SO4)3); Tratamento Grupo 1 ppm de Al2(SO4)3 (TG1); Tratamento Grupo 3 ppm de Al2(SO4)3 (TG3). O cultivo foi realizado durante um período ininterrupto de 14 dias, com alimentação ad libitum, fotoperíodo 12:12, troca dinâmica da água (80%) e monitoramento diário dos parâmetros físico-químicos da qualidade de água. Em seguida, coletadas amostras de fígado e brânquias e imersas em CH2O (10%) para posterior análise, enquanto cérebro, músculo e intestino foram macerados e homogeneizados, obtendo o extrato bruto (E.B.) para as análises enzimáticas. Não houve alterações morfológicas nas avaliações das brânquias e do fígado da tilápia. As três enzimas colinesterásicas apresentaram aumento de atividade nos grupos expostos ao alumínio (TG1 e TG3), tanto nos ensaios in vivo quanto nos in vitro. A AChE cerebral teve atividade máxima de 126.93 ± 13.20% e 160.13 ± 10.92%, in vivo e in vitro, respectivamente, nos tratamentos expostos a concentração de 3 ppm (TG3), em relação ao tratamento grupo controle (TGC, 100%). Nas mesmas condições, também aumentou a da AChE muscular, com 163.81 ± 0.30% e 138.77 ± 4.07%. Entre as colinesterases, a BChE apresentou resultado mais expressivo no tratamento in vitro, 168.28 ± 5.49% e 196.17 ± 4.08%, para os grupos TG1 e TG3. Das quatro enzimas digestivas analisadas, a pepsina in vivo apresentou menor atividade, 65.01 ± 1.04% (TG1) e 61.06 ± 1.90% (TG3), embora todas as demais, tripsina, quimotripsina e amilase intestinal tenham demonstrado redução de sua atividade em ambos os ensaios, in vivo e in vitro. Nas análises experimentais in vivo a atividade da quimotripsina e da amilase intestinal demonstraram redução significativa entre os tratamentos, sobretudo em relação ao TG3, 73.0 ± 1.8% e de 60.20 ± 3.95%, respectivamente. A atividade in vitro da tripsina foi menor do que a in vivo, inclusive entre os tratamentos TG1 e TG3. Os resultados demonstram a relevância da aplicação de biomarcadores enzimáticos de O. niloticus. O aumento da atividade colinesterásica e a redução na atividade de principais enzimas do metabolismo digestivos, forneceram resultados que indicam a presença do alumínio. Sugerimos o procedimento como ferramenta útil e alternativa no monitoramento de áreas impactadas pelo metal

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-13T16:48:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lidiane (versão final).pdf: 2079756 bytes, checksum: 59bb3bdcf001b436d125cd653b130aea (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T16:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lidiane (versão final).pdf: 2079756 bytes, checksum: 59bb3bdcf001b436d125cd653b130aea (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / CAPES / A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é um dos peixes mais importantes para a aquicultura brasileira, apresentando-se como o mais cultivado no país. Suas vísceras têm sido estudadas para obtenção de biomoléculas, especialmente as proteases digestivas que apresentam alta eficiência catalítica e estabilidade em diferentes condições. Dentre as proteases digestivas da tilápia do Nilo, destaca-se a tripsina, que apresenta características favoráveis a sua aplicação na área biotecnológica e industrial. Com o propósito de ampliar o conhecimento acerca desta enzima, o presente trabalho objetivou purificar e caracterizar bioquimicamente uma tripsina-símile do intestino de O. niloticus. A purificação da enzima foi realizada seguindo quatro etapas: aquecimento a 45 °C, fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de exclusão molecular e afinidade. A pureza da tripsina foi verificada através da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e o peso molecular de 23,9 kDa foi confirmado a partir da espectrometria de massa (MALDI-TOF). A atividade da enzima foi testada na presença de inibidores específicos para proteases, com forte inibição de sua atividade por TLCK e PMSF. Ademais, a tripsina da tilápia apresentou atividade em ampla faixa de pH (7,0 a 12,0) e manteve-se ativa a altas temperaturas, conservando sua atividade até 60 °C. O íon cálcio e o polietilenoglicol (PEG), em diferentes concentrações, apresentaram efeito ativador da enzima. A tripsina manteve atividade residual acima de 70 % na presença de surfactantes (Tween 20, Triton x-100, Triton X-450 e saponina), exceto na presença de SDS, que foi responsável por uma redução acima de 50% na atividade da enzima. A tripsina-símile da tilápia apresentou eficiência na hidrólise de substratos com asparaginina (N) e treonina (T) na posição P1’ e isoleucina (I), leucina (L) e ácido aspártico (D) na posição P2. Considerando os resultados, foi possível verificar o potencial da tripsina da tilápia do Nilo para aplicações industriais e biotecnológicas, que necessitem da presença de agentes surfactantes, íons e ampla faixa de pH e temperaturas. / Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is the most farmed fish in Brazil. Its viscera had been studied to obtain biomolecules, mainly digestive proteases which present high catalytic efficiency and stability at different conditions. Among Nile tilapia digestive proteases, with emphasis to a trypsin, which shows favorable characteristics for its biotechnological and industrial application. In order to increase the knowledge about this enzyme, the present work aimed to purify and characterize biochemically a trypsin-like from O. niloticus intestine. The enzyme purification was carried out following four-step: heating at 45 °C, ammonium sulphate fractionation and size exclusion and affinity chromatography. Trypsin purity was checked by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the molecular weight of 23.9 kDa was confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF). The enzyme activity was tested on the presence of specific protease inhibitors, with stronger inhibition by TLCK and PMSF. Furthermore, tilapia’s trypsin showed activity in a wide pH range (7.0 to 12.0) and high temperatures, keeping its activity until 60 °C. Calcium ion and polyethylene glycol (PEG), at different concentrations presented activator effect on the enzyme. The trypsin kept over 70 % of its activity in surfactants (Tween 20, Triton x-100, Triton X-450 and saponin). SDS was an exception, since it diminished the enzyme activity below 50 %. Moreover, trypsin-like from tilapia showed efficiency by hydrolyzing substrates presenting asparaginine (N) and treonine (T) residues at P1’ position and isoleucine (I), leucine (L) and aspartic acid (D) at P2 position. Considering these results, it was possible to determine the potential of Nile tilapia trypsin to industrial and biotechnological applications that require surfactants agents and ion presence, wide pH range and high temperature.

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2009. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-08-23T22:23:17Z No. of bitstreams: 1 dissertao_ana paula rosa da silva.pdf: 605920 bytes, checksum: e5c8aacf84203b41f2ba0dfba76d5ab2 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T23:06:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertao_ana paula rosa da silva.pdf: 605920 bytes, checksum: e5c8aacf84203b41f2ba0dfba76d5ab2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T23:06:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertao_ana paula rosa da silva.pdf: 605920 bytes, checksum: e5c8aacf84203b41f2ba0dfba76d5ab2 (MD5) Previous issue date: 2009 / A enzima b-galactosidase pode ser encontrada na natureza, distribuída entre vegetais, em órgãos de animais e também ser produzida por grande quantidade de microrganismos, tais como fungos filamentosos, bactérias e leveduras. A importância industrial da b-galactosidase está na sua aplicação na indústria de laticínios. Esta enzima hidrolisa a lactose, carboidrato característico do leite em seus monossacarídeos glicose e galactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lácteos, ideais para consumidores intolerantes à lactose. A b- galactosidase é muito produzida por leveduras do gênero Kluyveromyces, sendo uma enzima intracelular. A purificação da b-galactosidase constitui uma etapa complexa do processo, pois para produtos intracelulares é necessário efetuar o rompimento celular, causando aumento da viscosidade ampliando a diversidade de contaminantes, necessitando de muitas etapas de purificação para remover a enzima desejada, o que aumenta o custo do processo e reduz o seu rendimento. O sistema aquoso bifásico(SAB) é uma alternativa para o primeiro passo de purificação, por remover vários contaminantes em um processo simples e econômico. Os processos de separação por membrana (PSM), como a ultrafiltração, são uma alternativa entre os processos de separação existentes para recuperar, concentrar e até purificar macromoléculas. Estes processos oferecem vantagens como a possibilidade de separação dos produtos e operação em temperaturas brandas, o que os torna adequados para separação de compostos termolábeis como as enzimas. A partir disto este trabalho teve por objetivo estudar a purificação da enzima b-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 utilizando a técnica de sistema aquoso bifásico (SAB) e ultrafiltração, determinando as condições de purificação, considerando a pureza e o rendimento da enzima. Na purificação por SAB o sistema era formado por polietilenoglicol (PEG) e tampão fosfato de potássio, sendo avaliadas as variáveis pH (6,0; 7,0; 8,0) e massa molar de PEG (300, 1500, 4000, 6000, 8000 e 10000). A melhor das condições obtida foi com fator de purificação da b-galactosidase de 10,1 vezes e recuperação de 175,2% na fase de fundo do SAB utilizando PEG 8000 no pH 8,0. Testes de ultrafiltração foram realizados a fim de selecionar a massa molar de corte (10, 50 e 60 KDa) de uma membrana comercial mais adequada ao processo, na qual permitisse a passagem da menor quantidade de enzima para o permeado, o que foi quantificado por medidas de atividade enzimática e do teor de proteína na alimentação e no permeado após cada teste. Para o fracionamento com membranas foi utilizado o sistema pH 6,0 e a temperatura entre 5-10 ºC em pressão manométrica de 147,1 KPa em uma célula de ultrafiltração tipo “dead-end” com agitação magnética. A membrana de massa molar de corte de 50 KDa foi a que apresentou melhores resultados, permitindo uma recuperação de 66,3% e fator de concentração de 7,6 vezes. Foi avaliada a variação de pH (6,0; 7,0; 8,0) e adição de NaCl à solução de alimentação contendo a enzima utilizando a membrana de 50 KDa selecionada anteriormente. Através dos resultados obtidos, foi verificado que mudanças no pH e na força iônica da solução enzimática não levaram a melhoria na separação. / The enzyme b-galactosidase can be found in the nature, distributed among vegetables, in organs of animals and they are also produced by a great amount of microorganisms, such as filamentous fungi, bacteria and yeasts. The industrial importance of the - galactosidase is in its application in the dairy industry. This enzyme hydrolyzes the lactose, the characteristic carbohydrate of the milk, in their monossacarides glucose and galactose, improving the solubility and digestibility of the milk and milk-based products, what is ideal for consumers intolerant to lactose. The b-galactosidase is highly produced by the yeast genus Kluyveromyces, being an intracellular enzyme. The purification of the b-galactosidase constitutes a complex stage of the process, because for intracellular products it is necessary to break the cells, causing an increase in the viscosity and in the diversity of contaminants. This increase the need for many purification steps for removing the desired enzyme, what increases the cost of the process and reduces its yield. The aqueous two-phase system (ATPS) is an alternative for the first step of purification, since it can remove many contaminants in a simple and economical process. The membrane process (MP), such as ultrafiltration, is an alternative to the existing processes of separation to recover, concentrate and even purify macromolecules. These processes offer advantages as the separation of the products and operation at mild temperatures, which makes this process suitable for heat sensitive compounds, as enzymes. This work aimed to study the purification of the enzyme b-galactosidase produced by Kluyveromyces marxianus CCT 7082 using aqueous two-phase systems (ATPS) and ultrafiltration, determining the purification condictions and considering the purity and the yield of the enzyme. In the purification using ATPS, the system consisted in polyethyleneglycol (PEG) and potassium phosphate buffer. The pH (6.0; 7.0; 8.0) and molecular weight of PEG (300, 1500, 4000, 6000, 8000 and 10000) were evaluated. The best factor of purification of b- galactosidase was 10.1-fold and recovery of 175.2% in the top phase of ATPS using PEG 8000 at pH 8.0. Ultrafiltration tests were carried out to more select the most suitable molecular weight cut off (10, 50 and 60 KDa) of commercial membranes, which allowed the permeation of the least amount of enzyme to the permeate. The enzymatic activity and the protein content in the feed and permeate were measured in each test. The permeation runs were carried out at pH 6.0 and at 5-10 ºC, in a feed manometric pressure of 147.1 KPa, using a dead-end stirred ultrafiltration cell. The membrane wit MWCO of 50 KDa was the one that presented the best results. yielding a 66.3% recovery and a concentration factor of 7.6. The variation in pH from 6.0 to 8.0 and the addition of NaCl to the feed solution cotaining the enzyme were assessed. The results showed that the changes in pH and ionic strength did not influence separation performance, showing the efficiency of the ultrafiltration process in the recovery and concentration of the enzyme.

Dissertação(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2008. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-09-17T14:46:33Z No. of bitstreams: 1 dissertaovnia.pdf: 754889 bytes, checksum: d24dfb5596ca30a0d5f0dacfb90ce785 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-09-18T21:25:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertaovnia.pdf: 754889 bytes, checksum: d24dfb5596ca30a0d5f0dacfb90ce785 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-18T21:25:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertaovnia.pdf: 754889 bytes, checksum: d24dfb5596ca30a0d5f0dacfb90ce785 (MD5) Previous issue date: 2008 / O trabalho tem como objetivo determinar propriedades funcionais de tecidos vegetal e microbiano visando fornecer subsídios para uma dieta saudável. O tecido vegetal escolhido para este estudo foi a cebola cultivada na região sul do Rio Grande do Sul e a microalga chlorella, que será avaliada como padrão de funcionalidade. As amostras de cebolas foram fornecidas e separadas em classes comerciais, conforme o Regulamento Técnico de Qualidade de Cebola, aprovado em 1995 pelo Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária, pelos técnicos da EMATER - Rio Grande. A composição centesimal, pH e acidez (AOAC, 2000) e os compostos fenólicos da cebola que foram extraídos em três sistemas solventes sob condições padronizadas (etanólico, aquoso, acetato de etila) e quantificados colorimétricamente com reagente de Folin-Ciocalteau. Na microalga chlorella os fenóis foram extraídos em sistema solvente metanólico. O teor de lipídios foi determinado pelo método de Bligh & Dyer para ambas as matrizes, os açúcares redutores foram determinados conforme método do 3,5-DNS (MILLER) para as amostras de cebola e na microalga chlorella foi estimado por diferença. Nas cebolas foi estimada a atividade específica de catalase, peroxidase e polifenoloxidase. A estimativa do potencial funcional dos compostos fenólicos foi indicada pela capacidade de seqüestrar o radical livre (DPPH), inibição da ação de enzimas oxirredutases e inibição de produção de peróxidos e compostos oxidados em sistemas lipídicos. Nos extratos de cebola a média dos teores de fenóis em solvente metanol, água e acetato de etila foram respectivamente 2,3; 3 e 0,08 mg/g de cebola. Os valores para umidade variaram entre 88,3 e 88,6%, lipídios entre 0,16 e 0,19%, proteínas entre 0,86 e 1,04%, cinzas entre 0,73 e 0,76%, fibras entre 0,6 e 0,7%, açúcares redutores entre 3,73 e 5,2%, o pH entre 5,08 e 5,23, a acidez entre 0,29 e 0,38%. A microalga chlorella apresentou 56,9% de proteína, 4,1% de umidade, 6,3% de cinzas, 22,3% de açúcares redutores, 2,8% de fibra-bruta, 7,6% de lipídios, 0,2% de acidez e pH 5,7. A atividade específica da catalase nas diferentes classes de cebola variou entre 0,014 e 0,025 mg H2O2/min/mg proteínas, sendo os maiores valores encontrados nas classes 2 e 3. A polifenoloxidase não foi detectada nas diferentes classes enquanto que a atividade específica da peroxidase variou entre 0,003 e 0,031 abs/min/mg proteínas. Todos os extratos apresentaram atividade seqüestradora do radical livre DPPH, porém o extrato de cebola extraído com acetato de etila foi o que apresentou maior inibição específica (53%) em relação aos demais. As velocidades máximas da reação de escurecimento enzimático diminuíram em presença dos extratos de cebola e chlorella, o que caracteriza o efeito de inibição da oxidação do guaiacol catalisado pela peroxidase. O extrato mais promissor para evitar a oxidação ocasionada pela catálise metálica em sistema lipídico foi o extrato de cebola extraído com acetato de etila com uma inibição percentual de 53% acompanhado pela menor formação de peróxido (até três vezes menor) e de malonaldeído (1,5 vezes menor) ao longo do tempo do experimento. / The work has as objective to determine functional properties in vegetal and microbian tissues aiming at to supply subsidies a healthful diet. The tissue vegetal chosen for this study was the onion cultivated in the southern region of the Rio Grande do Sul and the microalgae chlorella, that it will be evaluated as functionality standard. The samples of onions had been supplied and separate in commercial classrooms, as the Regulation Technician of Quality of Onion, approved in 1995 for the Ministry of Agriculture, the Supplying and the Agrarian Reformation, for the technician of the EMATER – Rio Grande. The centesimal composition, pH and acidity (AOAC, 2000) and the phenolic composites of the onion that had been extracted in three solvent systems under conditions standardized (ethanolic, watery, acetate of etila) and quantified colorimetrically with reagent of Folin-Ciocalteau. In the microalgae chlorella the phenols had been extracted in methanolic solvent system. The content of lipids was determined by the method of Bligh & Dyer for both the matrices, the reducing sugars had been determined in agreement method of 3,5-DNS (MILLER) for the samples of onion and in the microalgae chlorella was esteem by difference. In the onions the specific activity of catalase was esteem, peroxidase and poliphenoloxidase. The estimate of the functional potential of phenolic composites was indicated by the capacity to scavenging the radical (DPPH), inhibition of the enzyme action oxirredutases and inhibition of production of peroxides and composites oxidated in lipídicos systems free. In onion extracts the average of phenol texts in solvent methanol, water and acetate of etila had been respectively 2,3; 3 and 0,08 mg/g of onion. The values for humidity had varied between 88,3 and 88,6%, reducing lipids between 0,16 and 0,19%, proteins between 0,86 and 1,04%, leached ashes between 0,73 and 0,76%, staple fibers between 0,6 and 0,7%, sugars between 3,73 and 5,2%, pH between 5,08 and 5,23, the acidity between 0,29 and 0,38%. The microalgae chlorella presented 56.9% of protein, 4.1% of humidity, 6.3% of leached ashes, 22.3% of reducing sugars, 2.8% of fiber-rude, 7.6% of lipids, 0.2% of acidity and pH 5,7. The specific activity of catalase in the different classrooms of onion varied between 0,014 and 0,025 mg H2O2/min/mg proteins, being the biggest values found in classrooms 2 and 3. Poliphenoloxidase w as not detected in the different classrooms while that the specific activity of peroxidase varied between 0,003 and 0,031 abs/min/mg proteins. All the extracts had presented scavenging activity of free radical DPPH, however the extract of onion extracted with acetate of etila was what it presented greater specific inhibition (53%) in relation to excessively. The maximum speeds of the reaction of enzymatic blackout had diminished in presence of extracts of onion and chlorella, what it characterizes the effect of inhibition of the oxidation of guaiacol catalyzed by peroxidase. The extract most promising to prevent the oxidation caused for the metallic catalysis in lipídico system was the extract of onion extracted with ethyl acetate with a percentile inhibition of 53% followed by the lesser peroxide formation (up to three times lesser) and of malonaldeído (1,5 lesser times) to the long one of the time of the experiment.

Made available in DSpace on 2018-08-02T00:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_5189_dissertacao copia pdf 16-06-11.pdf: 1399769 bytes, checksum: 0958cfc2a47f37e3c2fa855d50d600f9 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / RESUMO Esse estudo objetivou investigar, em regime de casa de vegetação, o desempenho fisiológico de duas cultivares (FB300 e FB200) do maracujazeiro Passiflora edulis Sims., submetidas à deficiência hídrica e posterior recuperação. Os parâmetros analizados foram: potêncial hídrico (ψw), fluorescência transiente (teste JIP) e modulada da clorofila a, teor de clorofila, atividade da catalase , peroxidase e determinação da peroxidação lípidica pelo conteúdo de MDA (malondialdeído). Sessenta dias após a germinação, o déficit hídrico foi iniciado pela supressão total da água por 11 dias e seguido por 6 dias de reidratação. As duas cultivares apresentaram um comportamento semelhante de redução do ψw com o avanço da supressão hídrica e recuperação com a reidratação. Entretanto, a cultivar FB200 mostrou-se mais susceptível ao déficit hídrico comprovado por uma maior queda de seus valores em todos os parâmetros analisados e por um maior aumento dos níveis de peroxidação lipídica. FB300 apresentou uma maior plasticidade fisiológica para tolerar a imposição da supressão hídrica, confirmada pelo menor declínio dos valores na maioria dos parâmetros analisados e pelo menor tempo necessário para sua recuperação ao nível do controle.

Made available in DSpace on 2018-08-02T00:16:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6215_Dissertação20131210-131132.pdf: 1920529 bytes, checksum: cfaa316fb682a15baad0c8462f6f814c (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / RESUMO A toxidez do alumínio (Al) é um fator limitante do crescimento e desenvolvimento da maioria das culturas agrícolas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do Al sobre aspectos fisiológicos do maracujazeiro cv. Maguary (FB 100) e cv. Yellow Master (FB 200) em plantas jovens, em casa de vegetação (Capítulo 1), e adultas, em campo (Capítulo 2). Foram analisados aspectos das trocas gasosas, fluorescência da clorofila a, índice de clorofila e atividade específica da SOD, catalase e peroxidase do ascorbato, no maracujazeiro, nas duas situações distintas. As determinações em casa de vegetação foram realizadas em plantas cultivadas por 45 dias em vasos plásticos contendo areia lavada e irrigadas com solução nutritiva diferenciada, com 0 mM Al (pH 6); 0; 0,2 e 2,0 mM de Al (pH 4) durante 10 dias. As medidas em campo foram realizadas em três lavouras, no município de Jaguaré ES, de um ano de idade contendo 0 (pH 6); 0,33 (pH 5,6) e 2,6 mM de Al (pH 4,7). Nas plantas jovens, houve apenas tendências ao declínio na assimilação líquida de CO2 que não se concretizaram em eventos significativos. Também não foram observadas grandes mudanças na atividade das enzimas antioxidantes. Apesar disso, as cultivares FB 100 e FB 200 de maracujazeiro apresentam respostas diferenciadas à exposição ao Al em solução nutritiva. Contudo, o padrão apresentado pelas bandas L e K ao longo dos dias de tratamento indicam que a presença do Al em solução é um fator estressante apenas até os cinco dias de tratamento na cultivar FB 100 e apenas aos 10 dias na cultivar FB 200. Nas plantas expostas ao Al em condições naturais também não foram observadas grandes alterações nas trocas gasosas. Porém a atividade da SOD e da peroxidase do ascorbato foram maiores apenas nas plantas expostas à maior concentração de Al. Nas plantas expostas à menor concentração, houve a presença das bandas K e L negativas, indicando que as plantas se encontravam em situação de estresse. Os resultados indicam que o Al não é capaz de causar grandes prejuízos ao aparato fotossintético do maracujazeiro.

O Penicillium echinulatwn linhagem 9A02Sl é um fungo filamentoso que apresenta um sistema celulolítico com potencial para aplicaqão em processos de degradação de materiais lignocelulósicos para produção de etanol. O crescente interesse nesse combustível e a abundância de materiais lignocelulósicos que podem ser usados como matéria-prima fez aumentar o interesse no estudo de celulases. Neste estudo, a linhagem 9A02Sl de Penicillium echinulatum foi cultivada em cultivos submersos em frascos mantidos sob agitação recíproca, com variações quanto às fontes de carbono. Além de crescimento, foram avaliadas as produções de celulases, ~-glicosidases e xilanases e a expressão das enzimas através ale zimogramas em géis de poliacrilamida para detemlinação da massa molecular. Observou-se que o crescimento micelial provocou a redução do pH do meio de cultivo, e que não está relacionado a produção de enzimas. A celulose apresentou-se como indutora para todas as enzimas analisadas. A carboximetilcelulose mostrou-se uma eficiente fonte de carbono para a produção de atividade sobre papel filtro, endoglicanases e xilanases, apesar do baixo crescimento micelial. Celobiose, glicerol e glicose estimularam a produção de ~glicosidases. Uma banda de atividade endoglicanêlsica de 74 kDa foi detectada nos zimogramas de todos os caldos enzimáticas obtidos na presença d1e diferentes fontes de carbono, sugerindo esta seja uma enzima constitutiva. A expressão da ~-glicosidase oconeu ao fmal do cultivo (5° e 6° dias), sendo que em todos os cultivos avaliados houve a expressão de uma banda de 220 kDa, indicando tratar-se de uma enzima constitutiva. A expressão de outras bandas com diferentes massas moleculares sugerem que diferentes genes, fotmats multiméricas ou modificações pós-traducionais estão envolvidos no perfil destas enzimas em Peni'cillium echinulatum. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq / The st:rain of Penicillium echinulatum 9A02Sl is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential application in processes of degradation of lignocellulosic materiais for ethanol production. The growing interest in fhel and the abundance of lignocellulosic materiais that can be used as raw material has inc:reased the interest in cellulases. In this study, the strain P echinulatum 9A02Sl was grown in submerged cultivation in agitated flasks in presence of different carbon sources. In addition to growth, it was evaluated the production of cellula.ses, Pglucosidases and xylanases, and enzyme expres:sion in activity polyacrylamide gels in order to detemlinate the molecular ma.ss. The mycelial growth decreased pH o f the medium and this fact was not related to enzyme production. The cellulose was an inducer for all the enzymes ana.lyzed. The carboximetilcellulose was found to be an effi[cient carbon source for production o f filter paper a.ctivity, endogluca.nases and xylanases, despite the low mycelial growth. Cellobiose, glycerol and glucose stimulated the production of P-glucosidases. An endoglucanase band of 74 kDa was detected in zymograms o f all enzyme broths obtained in the presence o f different carbon sources, suggesting it is a constitutive enzyme. The expression of P-glucosidase occuned at the end of cultivation (5 and 6 days), and in all medium that was evaluated was observed a 250 kDa band, indica.ting that this is a. constitutive enzyme. The expression of other bands with different molecular mass suggest that different genes, multimeric fonns or post-translational modifications are involved in the expression ofthese enzymes in P echinulatum.