Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gissele_rambo.pdf: 235931 bytes, checksum: a4e2ca4dc38eed3295f04e66a374e019 (MD5) Previous issue date: 2008-11-24 / The evaluation of the efficiency of semen cryopreservation is critical to make the use of frozen semen feasible in artificial insemination programs in swine. This study compared the efficiency of two non-penetrating cryoprotectants (dimetilacetamide-DMA or glycerol) on parameters of post-thawing semen quality and in vitro fertility with frozen swine semen. The sperm-rich fractions of 28 ejaculates from four boars were frozen with either DMA or glycerol. The efficiency of semen freezing was evaluated through parameters of post-thawing semen quality and in vitro penetration (IVP) of swine oocytes and embryo production. For samples frozen with DMA, sperm motility (38.1%) and membrane integrity (39.9%) were greater (P < 0.05) than those for glycerol (21.9% and 13.0%, respectively). Both the IVP rate and the number of spermatozoa per oocyte were greater (P < 0.05) for DMA (27.9% and 29.2, respectively) than for glycerol (13.6% and 20.7, respectively). The cleavage rate with DMA and glycerol samples (13.0% and 15.6%, respectively) were similar (P > 0.05). The embryo development rate did not differ (P < 0.05) for DMA (15.8%) and glycerol (22.0%). Therefore, when compared to glycerol, DMA was associated with improved post-thawing semen quality and in vitro fertility. / A avaliação da eficiência da criopreservação do sêmen é uma importante ferramenta para viabilizar o uso de sêmen congelado na inseminação artificial em suínos. Um experimento foi realizado a fim de identificar qual crioprotetor interno (dimetilacetamida-DMA ou glicerol) seria associado com melhores indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento e fertilidade in vitro com sêmen suíno congelado. A fração espermática rica em espermatozóides de 28 ejaculados provenientes de quatro machos foi congelada com DMA ou glicerol. Para estimar o sucesso da criopreservação do sêmen foram utilizados parâmetros de qualidade seminal pós-descongelamento, teste de penetração in vitro (TPIV) de ovócitos suínos e produção in vitro de embriões. Para amostras congeladas com DMA, a motilidade (38,1%) e a integridade da membrana espermática (39,9%) foram superiores (P < 0,05) às observadas com glicerol (21,9% e 13,0%, respectivamente). A taxa de TPIV e o número de espermatozóides por ovócito também foram superiores (P < 0,05) para a DMA (27,9% e 29,2, respectivamente) do que para o glicerol (13,6% e 20,7, respectivamente). A taxa de clivagem alcançada com a DMA (13,0%) foi similar (P > 0,05) à obtida com glicerol (15,6%). A taxa de desenvolvimento embrionário não diferiu (P > 0,05) entre DMA e glicerol (15,8% e 22,0%, respectivamente). Portanto, considerando o conjunto de todos os testes, em comparação com o glicerol, a DMA foi associada com melhores indicadores de qualidade seminal e fertilidade in vitro.

De nombreuses substances chimiques sont utilisées par l’industrie cosmétique pour entrer dans la composition de formules. En dehors de la nécessité d’évaluer leur efficacité, l’industrie cosmétique se doit surtout d’évaluer la sécurité de leurs substances pour l’humain. L'évaluation toxicologique des substances chimiques est réalisée dans le but de révéler un effet toxique potentiel de la substance testée. Parmi les effets potentiels que l’on souhaite détecter, la toxicité du développement (tératogénicité), c’est-à-dire la capacité d’une substance à provoquer l’apparition d’anomalies lors du développement embryonnaire, est fondamentale. En accord avec les législations internationales qui interdisent à l’industrie cosmétique d’avoir recours à des tests sur animaux de laboratoire pour l’évaluation de leurs substances, l’évaluation toxicologique de ces substances se base sur les résultats de tests in silico, in vitro et de tests faits sur des modèles alternatifs aux animaux de laboratoire. Pour le moment cependant, peu de méthodes alternatives existent et ont été validées pour la toxicologie du développement. Le développement de nouvelles méthodes alternatives est donc requis. D'autre part, en plus de l’évaluation de la sécurité des substances chez l’humain, l’évaluation de la toxicité pour l’environnement est nécessaire. L’usage de la plupart des produits cosmétiques et d’hygiène corporelle conduit, après lavage et rinçage, à un rejet à l’égout et donc dans les cours d’eau. Il en résulte que les environnements aquatiques (eaux de surface et milieux marins côtiers) sont parfois exposés aux substances chimiques incluses dans les formules cosmétiques. Ainsi, l’évaluation toxicologique environnementale des cosmétiques et de leurs ingrédients nécessite de connaître leur toxicité sur des organismes représentatifs de chaînes alimentaires aquatiques. Dans ce contexte, le modèle embryon de poisson présente un double avantage pour l’industrie cosmétique. Ce modèle, jugé par les législations internationales comme étant éthiquement acceptable pour les évaluations toxicologiques réalisées par l’industrie cosmétique, est représentatif des organismes aquatiques. Il est donc pertinent pour évaluer la toxicité environnementale des substances chimiques. D'autre part, ce modèle apparaît prometteur pour évaluer l’effet tératogène de substances chimiques chez l’humain. Pour ces raisons, un test d’analyse de la tératogénicité des substances chimiques est actuellement développé. Ce test se base sur l’analyse d’embryons de medaka (Oryzias Latipes) à 9 jours post fertilisation, après exposition des embryons par balnéation à des substances à concentrations déterminées. L’analyse de paramètres fonctionnels et morphologiques conduit au calcul d’un indice tératogène, qui permet de tirer une conclusion quant à l’effet tératogène de la substance testée. Cet indice est calculé à partir des mesures du taux de mortalité et du taux de malformations chez les embryons. L’objectif de ce projet est d’automatiser le test d’analyse de la tératogénicité, par classification automatique des embryons faite à partir d’image et de vidéo. La première méthode développée concerne la détection des battements cardiaques à partir de séquences vidéos, dans le but de calculer le taux de mortalité. Nous nous sommes ensuite concentrés sur deux types de malformations courantes qui sont les malformations axiales, et l'absence de vessie natatoire, en utilisant une méthode d'apprentissage automatique. Cette analyse doit être complétée par l'analyse d'autres malformations et conduire à un calcul du taux de malformations et de l’indice tératogène pour la substance testée / Numerous chemicals are used as ingredients by the cosmetics industry and are included in cosmetics formula. Aside from the assessment of their efficacy, the cosmetics industry especially needs to assess the safety of their chemicals for human. Toxicological screening of chemicals is performed with the aim of revealing the potential toxic effect of the tested chemical. Among the potential effects we want to detect, the developmental toxicity of the chemical (teratogenicity), meaning its capability of provoking abnormalities during the embryonic development, is crucial. With respect to the international regulations that forbid the use of animal testing for the safety assessment of cosmetics, the toxicological assessment of chemicals must base on an ensemble of in silico assays, in vitro assays and alternative models based assays. For now, a few alternative methods have been validated in the field of developmental toxicology. The development of new alternative methods is thus required. In addition to the safety assessment, the environmental toxicity assessment is also required. The use of most of cosmetics and personal care products leads to their rejection in waterways after washing and rince. This results in the exposition of some aquatic environments (surface waters and coastal marine environments) to chemicals included in cosmetics and personal care products. Thus, the environmental assessment of cosmetics and of their ingredients requires the knowledge of their toxicity on organisms that are representative of aquatic food chains. In this context, the fish embryo model, which is ethically acceptable according to international regulations, presents a dual advantage for the cosmetics industry. Firstly, as a model representative of aquatic organisms, it is accurate for the environmental assessment of chemicals. Secondly, this model is promising for the assessment of the teratogenic effect of chemicals on human. For this reason, a teratogenicity assessment test is developed. This test is based on the analysis of medaka fish embryos (Oryzias Latipes) at 9 days post fertilization, after balneation in a predetermined concentration of the chemical under study. The analysis of functional and morphological parameters allows to calculate a teratogenicity index, that depends on both rates of dead and malformed embryos. This index allows to to draw a conclusion concerning the teratogenic effect of the chemical.The objective of this project is to automate the teratogenicity test, by automated image and video classification. A first method is developed that aims to automatically detect embryo heart beats from acquired video sequences. This method will allow to calculate the proportion of dead embryos. We then focus on the detection of two common malformations: axial malformations and absence of a swim bladder, based on a machine learning classification. This analysis must be completed by the detection of other malformations so that we can measure the rate of malformed embryos and thus, calculate the teratogenicity index of the tested chemical

La présence de taureaux sub-fertiles sur le marché de l’Insémination Animale (IA) influence négativement l’efficacité des élevages. L’évaluation de la fertilité des taureaux, basée sur l’analyse combinée de marqueurs génétiques, morphologiques, cinétiques et métaboliques de la semence, n’est pas suffisante pour identifier les taureaux sub-fertiles avant leur entrée en production. Cela suggère l’implication d’autres facteurs, notamment d’origines épigénétiques. Parmi les marques épigénétiques, la méthylation de l’ADN tient une place essentielle : son remaniement est en effet indispensable aux processus fondamentaux que sont la différenciation des cellules germinales, la spermatogénèse et le développement embryonnaire précoce. Alors que chez l’Homme, de nombreuses études ont montré que des altérations des profils de méthylation spermatiques sont associées à la sub-fertilité, très peu de données existent chez le bovin. L’objectif de ce travail de thèse est la caractérisation du méthylome de la semence bovine et l’identification de nouveaux marqueurs fiables de la fertilité mâle à un stade précoce. Cette étude s’inscrit dans un large projet intitulé SeQuaMol (pour « Qualité Moléculaire de la Semence »), mis en place au sein d’un laboratoire commun entre l’INRA et la fédération ALLICE. La caractérisation du méthylome spermatique bovin a été réalisée en utilisant une approche multi-échelle (globale, pangénomique et séquence-spécifique). Les analyses ont permis de révéler l’hypométhylation très marquée du spermatozoïde bovin. L’hypométhylation affecte des gènes importants pour la différenciation de la lignée germinale, les fonctions spermatiques, ainsi que des séquences satellites. L’identification de biomarqueurs de la fertilité a été réalisée en utilisant une approche pangénomique (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS). L’analyse a été effectuée sur une cohorte de 94 taureaux, dont les individus de races Holstein et Montbéliard ont été catégorisés en fonction de l’adéquation entre un indicateur génétique de la fertilité et leur fertilité réelle. Le dispositif inclus également des taureaux de 4 autres races pour obtenir une estimation de la variabilité épigénétique liée à la race. Cette analyse a nécessité l’optimisation et l’automatisation du protocole pour la préparation des banques RRBS à haut-débit, ainsi que la mise au point de l’ensemble de la procédure de traitement bio-informatique et statistique des données. Plusieurs milliers de biomarqueurs de la fertilité ont été identifiés et permettent de prédire de façon robuste le statut de fertilité. De plus, une démarche d’intégration des données de génotype et d’épigénotype a été amorcée, soulignant les interactions potentielles en ces strates d’informations. Enfin, nous avons mis en évidence l’influence de l’âge à la production de semence sur le méthylome. L’ensemble de ces données souligne que les modifications du méthylome spermatique peuvent affecter des gènes impliqués dans les processus précoces et plus tardifs du développement, ainsi que quelques voies du fonctionnement du spermatozoïde. L’ensemble des biomarqueurs identifiés serviront de base à la poursuite du projet SeQuaMol, dont l’aboutissement sera le développement d’outils technologiques et statistiques pouvant être utilisés en routine pour améliorer la prédiction de la fertilité mâle. / The presence of subfertile bulls in the market of Animal Insemination negatively influences the efficacy of breeding farms. The evaluation of bull fertility, based on the combined analysis of genetic, morphological, kinetic and metabolic markers of the semen, is not sufficient to identify subfertile bulls before entering semen production. It suggests the implication of other factors, especially epigenetic ones. Within the epigenetic markers, DNA methylation holds a crucial position: indeed, its reprogramming is indispensable to the fundamental processes that are germinal cell differentiation, spermatogenesis and the embryonic development. Whereas several studies have showed that the alteration of spermatic methylation profiles are associated with subfertility in humans, only a little data exists concerning bovines. The aim of this thesis is the characterization of the methylome of bovine semen and the identification of new reliable markers of male fertility at an early stage. This study is part of a larger project called SeQuaMol (Molecular Quality of Semen) which rely on a common laboratory between INRA and the ALLICE federation. The characterization of the bovine sperm methylome was achieved by using a multiscale approach (global, pangenomic and sequencespecific). The analyses made it possible to observe the hypomethylation of the bovine semen. Hypomethylation affects genes that are crucial for the differentiation of the germline, spermatic functions, and also on satellite sequences.The identification fertility biomarkers was carried out by using a pangenomic approach (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS). The analysis has been performed on a cohort of 94 bulls, including subjects of the Holstein race and Montbeliard race, categorized according to the adequacy between a genetic indicator of fertility and their actual fertility. The process also includes bulls from 4 other breeds in order to obtain an estimate of the genetic variability linked to the breed. This analysis has required the optimization and the automation of the protocol for the high throughput preparation of RRBS libraries, as well as the development of the whole bioinformatic pipeline and data statistics. Several thousands of biomarkers of fertility have been identified, which allow to predict in a robust way the fertility status. Furthermore, a process of integration of genotype and epigenotype data has been started, which underlines the potential interaction between these levels of information. Finally, we have highlighted the influence of the age of semen production on the methylome. Altogether, theses data suggest that modifications of the semen methylome can affect genes that are involved in the process of early and late embryo development, and parts of the functioning of the sperm cell. The biomarkers identified will form a basis for the pursuit of the SeQuaMol project, of which the completion will be the development of technological and statistical tools that may be used routinely to improve male’s fertility prediction.

Die Tetrapyrrol-Biosynthese der Pflanzen ist ein hoch konservierter Prozess, indem sich die Häm- und Chlorophyllsynthese gemeinsame Syntheseschritte von der 5-Aminolävulinsäure (ALA)- bis hin zur Protoporphyrin IX (Proto)-Bildung teilen. Zur Hämsynthese sind in Arabidopsis thaliana zwei Isoformen der Ferrochelatase (FC) vorhanden, welche die Insertion von Eisenionen in Proto katalysieren. In dieser Arbeit wurden fc1 und fc2 Mutanten analysiert und für Komplementationsversuche mit nativen und modifizierten FC1/FC2-Sequenzen genutzt. Die in der fc1-2 Mutante gestörte Embryonalentwicklung infolge des FC1 Mangels konnte durch Expression eines pFC1::FC1 Genkonstruktes komplementiert werden. Die Expression von FC2 unter dem FC1 Promoter (pFC1::FC2) konnte die fc1-2 Mutante unter Standard-Wachstumsbedingungen vollständig komplementieren, jedoch nicht unter Salzstress. Zusätzlich zu den Komplementationsversuchen der fc1 Mutanten wurde auch eine fc2 Null-Mutante zur Expression der beiden genomischen FC Sequenzen herangezogen, um die spezifischen Funktionen der FC2-Varianten zu untersuchen. Während die pFC1FC2 (fc2/fc2) Pflanzen unter Dauerlicht eine vollständige Komplementation zeigten, konnte unter Kurztagbedingungen nur eine partielle Komplementation beobachtet werden. Versuche geben erste wichtige Hinweise, dass auch FC2 an der Regulation der ALA-Synthese infolge ihrer Interaktion mit PORB beteiligt ist. Dies deutet darauf hin, dass der Häm- und der Chlorophyllzweig eine gemeinsame Regulation der ALA-Synthese teilen, um das Gleichgewicht der TBS zu wahren. Neben der Funktion der FC2 in der Regulation der TBS konnte die vorliegende Arbeit ebenfalls die Rolle der FC2 in der Assemblierung der PSII-LHCII Superkomplexe offenlegen. Basierend auf den Ergebnissen, dieser Studie können Modelle für die funktionale Verteilung der beiden FC-Isoformen in unterschiedlichen Geweben und Entwicklungsstadien, sowie die Funktionen in verschiedenen biologischen Prozessen postuliert werden. / In plants, heme and chlorophyll synthesis share the common synthetic steps from 5- aminolevulinic acid (ALA) formation to Protoporphyrin IX (Proto) production in the conserved Tetrapyrrole biosynthesis (TBS) pathway. Arabidopsis thaliana utilizes two ferrochelatses (FC) to catalyse the insertion of ferrous iron into Proto to yield heme. In this study, the fc1 and fc2 defective mutants have been re-analysed and used for complementation tests with expression of a native or modified FC1/FC2 sequence. The pFC1FC1 (fc1/fc1) complementation plants confirmed that the defective embryo maturation in homozygous fc1-2 seeds is attributed to a lack of FC1. Expression of FC2 under the FC1 promoter contributed to a full complementation of fc1-2 under standard growth conditions, but not under salt stress. A fc2 null mutant has been used to express the two FC genomic sequences to substantiate the specific functions of FC2. Expression of FC2 under its own promoter was able to rescue fc2-2 mutants under both SD and CL conditions. However, pFC2FC1 (fc2/fc2) plants showed a partial complementation under SD condition. Via multiple interaction assays and mutant analyses, this thesis uncovered a mechanism of FC2 action on ALA synthesis regulation via interaction of FC2 and PORB. The results indicate that both branches of heme and chlorophyll synthesis share a common regulation to balance the TBS pathway. Apart from a role of FC2 involved in the regulation of TBS pathway, the presented study also revealed FC2 function in the assembly of the PSII-LHCII supercomplexes. Based on all the results obtained in this study, the functional distribution models of the two FC in different tissues and development stages, as well as diverse biological processes, have been proposed. In addition, to which extent that FC1/FC2 could compensate the function of the other isoform has been discussed.

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Infertility affects 15% of reproductive-aged couples. The milieu surrounding the growing embryo is of outmost importance, and should be optimised during in vitro fertilisation (IVF). Many biological processes, such as angiogenesis, coagulation, and immune processes need to be well regulated for a pregnancy to occur and progress normally. Histidine-rich glycoprotein (HRG) is a plasma protein that regulates components of these systems by building complexes with various ligands. A single nucleotide polymorphism (SNP) in HRG, denoted HRG C633T, seem to be of importance for IVF treatment outcomes. The aim of this thesis was to further investigate the proposed human fertility effects of the HRG C633T SNP. According to the findings of this thesis, the HRG C633T genotype is associated with primary recurrent miscarriage. Male HRG C633T genotype is associated with semen characteristics in infertile men, and pregnancy rates following IVF. However, the distribution of the HRG C633T SNP does not differ between infertile and fertile couples. We further examined the role of the region surrounding the HRG C633T SNP for regulation of endometrial angiogenesis and human embryo development. The region affects primary endometrial endothelial cell migration, proliferation and tube-formation in vitro but does not appear to affect human embryo development. No effect of the HRG peptide was noted on the secretome of human embryos. However, early embryos secrete proteins into the surrounding culture media and the level of secretion of VEGF-A, IL-6, EMMPRIN and PlGF is greater in embryos of higher developmental stages. In conclusion, the HRG C633T genotype appears to play a role only if infertility is established. The region surrounding HRG C633T SNP is of relevance in vitro for regulation of human endometrial endothelial cell angiogenesis. To predict which embryos to transfer in IVF, we have highlighted a number of proteins of interest for further investigation.

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice. In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA. In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging. Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice. In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA. In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging. Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.