La superficie articular es un indicador pronóstico del éxito del implante osteocondral criopreservado y podría constituirse en parámetro para el control de la calidad del proceso de almacenamiento de este tipo de tejidos. Objetivos: fotografiar la superficie articular de injertos osteocondrales frescos, crear un sistema de clasificación de los principales aspectos morfológicos de la superficie condral de los injertos y determinar los cambios que en ellos produce la congelación a - 40 ºC y la criopreservación a -196 ºC según la escala diseñada. Metodología: se empleó un microscopio electrónico de barrido ambiental para fotografiar la superficie condral sin técnicas de fijación. Se clasificaron los principales aspectos morfológicos y se validó la escala según variabilidad inter e intra-observador. Las imágenes de los injertos congelados y criopreservados se obtuvieron siguiendo la misma metodología. Conclusiones: el microscopio de barrido ambiental es una herramienta útil para fotografiar la superficie de injertos osteocondrales frescos, congelados y criopreservados. La superficie articular de los injertos frescos no es totalmente lisa, hallándose diversos aspectos clasificables en un sistema cualitativo para la detección de cambios en situaciones experimentales o patológicas. La superficie del injerto congelado presenta aumento de colinas y protuberancias al compararlos con los injertos frescos y criopreservados, así como un mayor número de lagunas condrocíticas vacías. La superficie del injerto criopreservado muestra aumento de colinas y protuberancias al compararlos con los injertos frescos. Los condrocitos del tejido criopreservado difieren del fresco algunas oportunidades, mostrando imágenes de posible lesión en su membrana asi como lagunas vacías.

A través d'aquest treball s'ha realitzat un estudi morfològic de la superfície osteocondral d'empelts osteocartilaginosos procedents del còndil intern de la raça de conill New Zealand. S'han dissenyat tres grups a estudi, un grup control, corresponent als empelts en estat fresc i dos grups a estudi que corresponen als empelts criopreservats mitjançant el medi RPMI sense L-glutamina i els empelts criopreservats mitjançant el medi Krebs-Henseleit modificat.L'objectiu d'aquest treball ha estat obtenir imatges de la superfície osteocondral dels empelts osteocondrals amb un microscopi electrònic de rastreig ambiental i avaluar i comparar els principals aspectes morfològics de la superfície articular d'empelts osteocondrals frescos amb empelts osteocondrals que han estat emmagatzemats amb els dos mètodes diferents de criopreservació, mitjançant un sistema de classificació validat, a partir de les imatges obtingudes amb un microscopi electrònic de rastreig ambiental. la conclusió de l'estudi ha estat que el medi Krebs-Henseleit modificat mostra imatges més pròximes a les obtingudes dels empelts en estat fresc que el seu homòleg en medi RPMI sense L-glutamina. / In this work a morphological study of the osteochondral surface of osteochondral grafts coming from the internal condile of the New Zealand rabbit race has been carried out. Three study groups have been designed, the control group that corresponds to the fresh state grafts, a second one cryopreserved with RPMI without L-glutamine method, and the third one cryopreserved with modified Krebs-Henseleit method. Surface's images of each group have been obtained by means of an environmental scanning electronic microscope and after that they have been classified using a validated scale. Later on we have proceeded to the evaluation and comparison of these images with a statiscally method. In this study we have concluded that the cryopreservation modified Krebs-Henseleit method shows images of environmental scanning electronic microscope more similar to the fresh state than those obtained with RPMI without L-glutamine method. / RESUMEN:A través de este trabajo se ha realizado un estudio morfológico de la superficie osteocondral de injertos osteocartilaginosos procedentes del cóndilo interno de conejo raza New Zealand. Se han diseñado tres grupos de estudio, un grupo control, que corresponde a los injertos en estado fresco y dos grupos a estudio que corresponden a los injertos criopreservados mediante medio RPMI sin L-glutamina y los injertos criopreservados mediante Krebs-Henseleit modificado.Se han obtenido imágenes de superficie de cada grupo mediante un microscopio electrónico de rastreo ambiental y se han clasificado utilizando un método validado por nuestro grupo de investigación, para proceder posteriormente a la evaluación y comparación de dichas imágenes. Se ha concluido en este estudio que el medio de criopreservación Krebs-Henseleit modificado muestra imágenes de microscopia electrónica de rastreo ambiental más próximas al estado fresco que su homólogo mediante RPMI sin L-glutamina.

El trasplante renal es la mejor opción disponible para el tratamiento de la enfermedad renal crónica avanzada, tanto en términos de supervivencia como de calidad de vida de los pacientes. La escasez de órganos disponibles para el procedimiento es la mayor limitación de este tipo de terapéutica y por tanto prolongar la vida útil de los injertos renales es la principal prioridad en el contexto del trasplante renal. Después del primer año de funcionamiento del trasplante, la disfunción crónica del injerto (DCI) constituye la principal causa de daño y perdida injerto renal. Esta tesis es un análisis de la correlación del estudio del proteoma urinario mediante espectrometría de masas con la severidad y subtipo histológico de la disfunción crónica del injerto. Los sujetos fueron agrupados según el resultado de la biopsia del injerto y el análisis proteómico mediante espectrometría de masas se realizó en una muestra obtenida antes de realizar la biopsia por indicación clínica. Se realizaron dos tipos de estrategias mediante espectrometría de masas: un primer abordaje, utilizando MALDI- TOF, previa extracción del muestra mediante cromatografía de fase reversa mostró diferencias en el perfil proteómico urinario entre sujetos sanos, pacientes trasplantados con buena función del injerto renal y pacientes con disfunción crónica del injerto. Un segundo estudio mediante LC-MS-MS cuantificó estas diferencias y además aportó información acerca de la secuencia de los péptidos diferenciales. Péptidos específicos derivados de uromodulina y bradiquinina son candidatos a biomarcadores de buen funcionamiento del injerto renal, ya que su presencia en la orina puede ser utilizada para discriminar entre pacientes trasplantados con disfunción del injerto renal y pacientes trasplantados con buena función del injerto. Los niveles elevados del ión 642.5 y niveles bajos del ión 638.0 derivado de uromodulina son característicos de la orina proveniente de pacientes con disfunción crónica del injerto y permiten detectar sus subtipos histológicos. Los iones de m/z 645.59 y m/z 642.61 estaban aumentados de forma significativa en pacientes con rechazo crónico activo mediado por anticuerpos respecto a pacientes con fibrosis intersticial y atrofia tubular aislada (4.4-2.7 fold change) y pacientes trasplantados con función estable del injerto (5.3-14.6 fold change) permitiendo cuantificar las diferencias entre estos dos subtipos de disfunción crónica del injerto ya demostradas en los análisis cualitativo con MALDI-TOF. Este trabajo es la primera prueba de concepto de la utilidad de la proteomica urinaria para detectar biomarcadores y el futuro diseño de una herramienta diagnóstica no invasiva en la disfunción crónica del injerto y en dos de sus subtipos histológicos: Fibrosis intersticial y atrofia tubular sin evidencias de otras lesiones y el Rechazo crónico activo mediado por anticuerpos. / Despite optimal immunosuppressive therapy, more than 50% of kidney transplants fail because of chronic allograft dysfunction. A noninvasive means to diagnose chronic allograft dysfunction may allow earlier interventions that could improve graft half-life. In this proof-of-concept study, we used mass spectrometry to analyze differences in the urinary polypeptide patterns of patients with chronic allograft dysfunction ( with pure interstitial fibrosis and tubular atrophy and with chronic active antibody-mediated rejection) and control subjects (stable recipients and healthy control subjects). Unsupervised hierarchical clustering showed good segregation of samples in groups corresponding mainly to the four biomedical conditions. Moreover, the composition of the proteome of the pure interstitial fibrosis and tubular atrophy group differed from that of the chronic active antibodymediated rejection group, and an independent validation set confirmed these results. Specific peptides derived from uromodulin and kininogen were found to be significantly more abundant in control than in CAD patients and correctly identified the two groups. These peptides are therefore potential biomarkers that might be used for the diagnosis of CAD. In addition, ions at m/z 645.59 and m/z 642.61 were able to differentiate between patients with different forms of CAD with specificities and sensitivities of 90% in a training set and, significantly, of 70% in an independent validation set of samples. Interestingly low expression of uromodulin at m/z 638.03 coupled with high expression of m/z 642.61 diagnosed CAD in virtually all cases. Multiple reaction monitoring experiments further validated the results, illustrating the power of our label-free quantitative LC-MS approach for obtaining quantitative profiles of urinary polypeptides in a rapid, comprehensive, and precise fashion and for biomarker discovery. In summary, this study establishes a pattern for two histologic lesions associated with distinct graft outcomes and constitutes a first step to designing a specific, noninvasive diagnostic tool for chronic allograft dysfunction.

INTRODUCCIÓN: Los cementos y vidrios basados en fosfatos de calcio son biomateriales que poseen propiedades biológicas de interés para emplearlos como potenciales sustitutivos óseos. En esta tesis doctoral se compara dos formulaciones de cementos óseos y dos de vidrios bioactivos con el autoinjerto óseo esponjoso fresco.MATERIAL Y MÉTODO: Se realizó un estudio experimental prospectivo, comparativo y controlado, interviniendo quirúrgicamente 60 conejos albinos de la raza Nueva Zelanda, a los que se practicó defectos cavitarios de 6 mm. de diámetro en la metáfisis distal del fémur derecho. Los animales fueron divididos en cinco grupos de 12 individuos que recibieron como implantes, cemento de fosfato &#945; tricálcico (CH), cemento de fosfato monocálcico (CR), vidrio de fosfato del sistema P2O5-CaO-Na2O (G0), vidrio de fosfato del sistema P2O5-CaO-Na2O-TiO2 (G5) y autoinjerto óseo (Grupo Control). Los resultados se obtuvieron por medio de estudios radiológico, histológico e histomorfométrico a las 4 y 12 semanas.RESULTADOS: Los estudios radiológico e histológico mostraron una correcta osteointegración y sustitución de los implantes por hueso neoformado en todos los animales. El estudio histomorfométrico reveló que la neoformación ósea conseguida a las 4 semanas es mayor, con diferencias estadísticamente significativas, en los grupos control, CH y CR. La regeneración ósea obtenida con los cuatro biomateriales a las 12 semanas es equivalente a la lograda con el autoinjerto óseo. La reabsorción de los cuatro materiales a las 12 semanas no presentó diferencias significativas (P < 0.05).CONCLUSIÓN: Los cementos y vidrios basados en fosfatos de calcio son materiales osteoconductivos, biocompatibles y biodegradables que se comportan como sustitutivos óseos en los defectos cavitarios en el animal de experimentación.PALABRAS CLAVES: Fosfatos cálcicos, cementos óseos, vidrios bioactivos, injertos óseos, sustitutivos óseos. / COMPARATIVE STUDY OF THE UTILITY OF CALCIUM PHOSPHATE BASED CEMENTS AND GLASSES AS A BONE SUBSTITUTES IN EXPERIMENTAL CAVITARY DEFECTSINTRODUCTION: Calcium phosphate based cements and glasses are biomaterials that possess interesting biological properties that can be potentially employed as a bone substitutes. Two formulations of bone cements and two bioactive glasses were compared with the fresh cancellous bone autograft in this PhD Thesis.MATERIAL AND METHOD: A prospective, comparative and controlled experimental study was performed. A bone cavitary defect of 6 mm. of diameter was practice in the right distal femoral methaphyses of 60 New Zealand white rabbits. The animals were divided in five groups of 12 rabbits that received as implants &#945; tricalcium phosphate cement (CH), monocalcium phosphate cement (CR), phosphate glass of P2O5-CaO-Na2O system (G0), phosphate glass of P2O5-CaO-Na2O-TiO2 system (G5) and autologous bone (Control group). The results were evaluated with a radiological, histological and histomorphometric studies at 4 and 12 weeks. RESULTS: The radiological and histological studies demonstrated a correct osseointegration and substitution of the implants by new bone in all the animals. The histomorphometric study showed that the bone neoformation obtained at 4 weeks was greater, with statistically significant differences in control, CH and CR groups. The bone regeneration obtained with the four biomaterials at 12 weeks is equivalent to the bone neoformation generated for the autologous bone graft. There were no significant differences in the resorption of the four materials at 12 weeks (P < 0.05).CONCLUSION: Calcium phosphate based cements and glasses are osteoconductive, biocompatible and biodegradable materials that behave as a bone substitutes in the cavitary defects in the experimentation animal.KEYWORDS: Calcium phosphates, bone cements, bioactive glasses, bone grafts, bone substitutes.

Un Banc d'Ossos és la organització encarregada de la selecció de donants, obtención, processament, emmagatzemament i distribució d'al.loempelts d'aparell locomotor per a la seva posterior utilització mèdica. El principi bàsic és obtenir teixit segur i eficaç per als pacients. Un al.loempelt és aquell empelt realitzat entre individus de la mateixa espècie. però amb genotip diferent. La difusió dels al.loempelts ossis es va iniciar amb Inclan (1942), qui publicà la primera gran sèrie utilitzant ossos conservats per a un període de fins dos mesos. A França, Andrè Sicard estableix al 1946 una "reserva d'empelts" a l'Hospital de Beaujon. El centre més important d'utilització dels al.loempelts, però, ha estat als Estats Units de l'Amèrica del Nord. Mankin inicia l'any 1971, a l'Hospital General de Massachussets, una llarga sèrie de resseccions tumorals amb substitució per empelts massius obtinguts de cadàvers i congelats a -80º. També als Estats Units, Malinin (1976), a la Universitat de Miami, inicia una llarga sèrie de més de 900 al.loempelts massius, obtinguts de cadàvers i conservats en nitrògen líquid, a -150°. A fi d'unificar criteris i crear unes normes, el Consell Musculoesquelètic de la Societat Americana de Bancs de Teixits (AATB) publica la primera guia el 1979 per als bancs de teixits musculoesquelètics. Als Estats Units hi ha actualment 220.000 receptors anuals d'al.loempelts ossis o de parts toves, que provénen de 5000 donants/any. A Europa, de manera semblant a l'AATB dels Estats Units apareixen la Societat Europea de Bancs de Teixits (EATB) l'any 1991 i la Societat Europea de Transplantament Musculo-esquelètic (EAMST) l'any 1992. L'any 1951 es crea el primer banc d'ossos d'Espanya a l'Hospital Provincial de Madrid (Sanchis Olmos, 1953). Poc després, l'any 1953, es constitueix per Ordre Ministerial el Banco Nacional de Huesos (González Sánchez 1956). Els primers Bancs d'ossos que segueixen la metodologia establerta per l' AATB i els grans bancs americans sorgeixen en la dècada dels vuitanta. L'any 1992 L'Organización Nacional de Trasplantes (ONT) publica unes recananacions per unificar els criteris de funcionament dels bancs d'ossos a Espanya. Per a la realització d’aquesta tesi doctoral s'han valorat els 53 donants multiorganics generats per l'Hospital Clínic de Barcelona i per altres centres coordinats amb aquest, des del desembre de 1987 fins al desembre de 1992, dels quals s'ha practicat l'extracció de teixit esquelètic. El nombre total d'ossos obtinguts ha estat 270, i el d' al.loempelts 475. Els paràmetres estudiats han estat els següents: edat i sexe del donant, causa de mort, hospital d’extracció, equips extractors d'altres òrgans i teixits previs, nombre de membres de l'equip extractor de teixit esquelètic, tipus d’os, cultiu de l’os a l'extracció, fragmentació, tipus de fragment, cultiu del fragment, temps d'emmagatzemament, centre d'implantació, diagnòstic del receptor, cultiu del al.loempelt i del llit receptor, i resultat clínic i radiològic de l' empelt. L’objectiu general d’aquesta tesi és optimitzar el funcionament, el rendiment i els resultats d'un Banc d’Ossos que anomenem "Regional", és a dir, que obté els al.loempelts esquelètics de donants multiorgànics i tissulars, en contraposició als Bancs d’Ossos quirúrgics, que es nodreixen bàsicament de caps de fèmur. Per obtenir aquest objectiu general hem establert els següents objectius particulars: (1) Avaluació dels factors que poden ser significatius en el resultat dels cultius realitzats en els ossos després de la seva obtenció: I’hospital d'extracció, les extraccions prèvies d'òrgans I eixits, el nombre d'equips extractors previs, el nombre de membres de l'equip extractor de teixit esquelètic, la causa de mort, l'edat i el sexe del donant, i el tipus d'os obtingut. (2) Valoració de les possibles causes de contaminació dels al.loempelts obtinguts després de la fragmentació dels ossos, analitzant l’os d'origen i el tipus de fragment. (3) Anàlisi de la distribució geogràfica dels centres en els quals s'implanten els empelts generats pel Banc d'Ossos de l'Hospital Clínic, i el nivell d'utilització dels diversos tipus de fragments. (4) Examen dels diferents paràmetres que poden determinar el comportament dels al.loempelts: edat i sexe del donant, tipus d'os d'origen, tipus de fragment, temps d'emmagatzemament, cultiu de l'al.loempelt, cultiu del llit receptor, i tipus d'intervenció. Les conclusions són: (1) Els factors que s'han mostrat determinants en la contaminació dels ossos obtinguts de donants multiorgànics són: l'hospital d’extracció (menys mltius positius en els ossos obtinguts a l'hospital on està ubicat el Banc amb relació als explantats en un altre centre), i el nombre de membres de l'equip extractor d’aparell locomotor (més contaminació quan hi ha 4 o més membres). (2) Les extraccions prèvies dels diferents òrgans i teixits, el nombre d'equips extractors previs a l'obtenció del teixit esquelètic, la causa de mort, l'edat i el sexe del donant, i el tipus d’os, no han presentat diferències significatives en la contaminació dels ossos obtinguts de donants multiorgànics. (3) Justifiquem la fragmentació dels ossos obtinguts, realitzada en condicions adequades, pel baix percentatge de contaminació dels segments, amb relació al benefici que aporta, ja que permet que més receptors puguin gaudir dels avantatges dels al.loempelts. (4) L'evolució cronclògica ha estat un factor determinant en la diferent distribució geogràfica de la utilització dels al.loempelts generats pel Banc d'Ossos de l'Hospital Clínic, i s'ha convertit en la pròpia d'un Banc regional. (5) El tipus d'al.loempelt més sol.licitat i utilitzat és el fragment esponjós. (6) El temps d' emnagatzernament, amb un mètode de conservació i d'embalatge idonis, no és un factor determinant en la contaminació dels al.loempelts, i quant més prolongat és, menors són les complicacions dels implants. (7) El millor resultat de les osteotomies metafisàries d‘addició per un costat i l'augment de les complicacions en les fractures obertes i les artrodesis lumbars per l’altra, indiquen que la qualitat del llit receptor i les condiciones biomecàniques són altres determinants en el comportament dels al.loempelts. (8) L'edat i el sexe del donant (amb una adequada selecció), el tipus d'os i de fragment (amb una correcta indicació), els cultius de l'al.loempelt i del receptor, i la resta d’indicacions analitzades no són determinants en l'aparició de complicacions del comportament dels al.loempelts. / The general term for the activities of donor screening, retrieval, processing, storage and distribution of bone allografts is “Bone Banking". The Hospital Clínic of Barcelona Bone Bank was instituted in 1987. From December 1987 to December 1992 a total of 475 bone allografts were obtained of 270 bones; they belonged to 53 donors, all of them multi-organic or tissular donors. The grafts were obtained under strictly aseptic conditions and bacteriological cultures were performed of each bone. The grafts were packed in two sterile plastic bags and then stored by freezing in electrical freezers (-40°C / -80°C). The parameters studied have been: age and sex of the donor, cause of death, hospital of extraction, number of persons of the bone procurement team, previous organ procurements from the same donor, type of bone, culture of the bone, fragmentation, type of fragment, culture of the fragment, time of storage, hospital of implantation, diagnostic of the recipient, culture of the allograft, culture of the recipient bed, and clinical and radiographic results of the allograft. The aim of this thesis is to optimize the results of a Regional Bone Bank. The conclusions are: (1) Number of contaminated bones has been significantly higher in extractions outside of the main hospital, and in the procurements with more than 4 team members. (2) The age and sex of the donor, the cause of death, the number of previous organ procurements from the same donor and the type of bone weren't determinative factors contributing to bacterial contamination of the bones. (3) We justify fragmentation of the obtained bones. (4) The chronological evolution has been a determinative factor of the different distribution of the allogratts of the Hospital Clínic Bone Bank. (5) Cancellous allograft is the type of fragment more implant. (6) Lang time of storage is a determinative factor to decrease de number of complications of the allografts. (7) Addition osteotomies have shown the best results of the bone allografts, and exposed fractures and lumbar arthrodeses the worst. (8) Age and sex of the donor, type of fragment, cultures of the allograft and the recipient bed aren’t determinative factors in the clinical and radiographic results of the bone allografts.

El trasplante hepático es la solución para personas que sufren enfermedades hepática terminales o insuficiencia hepática aguda. La principal limitación para la aplicación del trasplante es la falta de órganos respecto a la demanda. El trasplante hepático con injerto de tamaño reducido se desarrolló para aumentar el número de órganos disponibles y así disminuir la lista de espera. Además del síndrome de isquemia/reperfusión (I/R) asociado al proceso de trasplante, es necesario un proceso de regeneración para la viabilidad del injerto. El síndrome de I/R también tiene efectos sistémicos nocivos en el pulmón. El precondicionamiento isquémico (PC) es una estrategia quirúrgica útil frente a la lesión por I/R en modelos de I/R normotérmica y trasplante hepático con 8 y 16 horas de isquemia, con buenos resultados en la clínica, en resección de tumores, pero se desconoce su efecto en el modelo de trasplante hepático con injerto de tamaño reducido en la rata. En la presente tesis se ha demostrado que el PC es una estrategia útil frente a la lesión por I/R y que favorece la regeneración asociada al modelo de trasplante hepático de tamaño reducido en la rata, modulando factores de crecimiento, como el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) y el factor de crecimiento transformante-beta (TGF-beta), modulando la producción de radicales libres (RLO) (por parte de las células de kupffer) y todo esto cursa a través de la disminución de la IL-alfa y con una implicación del óxido nítrico (NO). Sin embargo, el PC no ejerce su papel protector mediante cambios en el sistema productor de RLO xantina/xantina oxidasa, cambios en los niveles de las citoquinas TNF-alfa y IL-6, ni mediante la preservación del metabolismo energético. Por otra vía independiente del NO, el PC estimula la expresión de la Heat shock protein (HSP) 70 y HO-1, estimulando la regeneración en el caso de la HSP70 y disminuyendo la lesión y estimulando la regeneración en el caso de la HO-1. Por otro lado, el PC fue capaz de conferir protección a nivel pulmonar, así la disminución de la IL-1alfa se tradujo en una disminución en los niveles de TNF-alfa plasmáticos y un aumento del receptor soluble de TNF-alfa de tipo 2 (sTNFR2), que es capaz de inactivar el TNF-alfa libre en la circulación sanguínea, evitando los efectos nocivos del TNF-alfa a nivel pulmonar. / Reduced-size liver transplantation (RSLT) was developed to arise the number of available liver grafts In addition to ischemia/reperfusion (I/R) injury associated to liver transplantation, the reduced grafts have to overcome a necessary regeneration process. I/R injury has deleterious systemic effects, leading to pulmonary complications. Ischemic preconditioning (IP) is able to protect liver against I/R injury and lung damage in conventional rat liver transplantation. Recently, has been published its clinical application in tumour resections. In the present thesis work, it has been demonstrated the IP is able to reduce I/R injury and stimulate regeneration associated to RSLT. IP modulated growth factors, as hepatocyte growth factor and transforming growth factor-beta and the stress oxidative production, and it was related to the reduction of IL-1alpha levels . Nitric oxide (NO) was implicated in the benefits of IP. However, PC has not any effect on xanthine/xanthine oxidase system, neither on IL-6 and TNF-alpha levels and energetic metabolism. By another pathway independent of NO, IP induced heat shock protein 70 (HSP70) and haem-oxygenase-1 (HO-1). HO-1 protected against I/R injury and liver regeneration, whereas the benefits resulting from HSP70 were mainly related to hepatocyte proliferation. On the other hand, IP was able to confer lung protection. In this line, reduction of IL.-1alpha levels was associated with lower TNF-alpha and higher soluble receptor TNF-alpha type 2 (sTNFR2) plasma levels.