La utilización de inmunosupresores en el transplante requiere tratamientos indefinidos. Los parámetros farmacocinéticos, a pesar que son muy útiles sobretodo en la prevención de la toxicidad, no son suficientes ni para evidenciar toda la variabilidad interindividual existente, ni para conocer ¿Qué nivel de inmunosupresión necesita un paciente concreto? ni ¿Qué nivel de inmunosupresión se obtiene con los fármacos que se administran? En los últimos años se han iniciado toda una serie de estudios centrados en el conocimiento del impacto biológico que realizan estos fármacos en el sistema inmunitario del receptor, es lo que se conoce como Farmacodinamia. Farmacocinética y Farmacodinamia son dos disciplinas que se complementan: una nos define el destino del fármaco mientras que la otra nos define el efecto de las dosis administradas. En los últimos años se han propuesto diversos métodos con el fin de evaluar más eficazmente la acción de los inmunosupresores: 1/ Evaluar la actividad del enzima diana del inmunosupresor en cuestión; 2/ Evaluar algún mediador implicado en el mecanismo de acción; 3/ Evaluar marcadores colaterales inducidos por los inmunosupresores. El objetivo de la tesis ha sido dar soporte experimental a la hipótesis de que la medida de la actividad de la enzima diana de determinados inmunosupresores es una herramienta útil para evidenciar déficit en la inmunosupresión. Hemos desarrollado toda una serie de métodos farmacodinámicos en función del fármaco evaluado: Micofenolato Mofetil (MMF) (Actividad enzimática IMPDH, Respuesta CEM); Ciclosporina (CsA) y Tacrolimus (TRL) (Actividad fosfatasa calcineurina, producción de IL-2 e IFN-) y se ha realizado un exhaustivo seguimiento tanto farmacocinético como farmacodinámico en poblaciones de transplantados renales en etapa de mantenimiento como en un población infectada por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV).Los resultados se centran en 3 artículos publicados: Clinical Chemistry, 2000; 46:9;1376; Clinical Chemistry, 2003; 49:11;1891 y Clinical Pharmacokinetics 2003, in press y unos datos sometidos a publicación. Para la monitorización farmacodinámica del tratamiento con MMF el parámetro de Respuesta de CEM, diseñado por nuestro grupo, se ha mostrado más eficaz que la evaluación de su diana específica, la enzima IMPDH, dada la elevada variabilidad que presento este parámetro. La evaluación de la actividad calcineurina es válida para el seguimiento del tratamiento inmunosupresor con monoterapias basadas en la administración de CsA o TRL, pero cuando estos fármacos anticalcineurínicos se administran concomitantemente con MMF el parámetro que mejor refleja la acción conjunta de estos fármacos es la evaluación de la producción de IL-2. Cuando se evaluó la eficacia de dosis bajas de MMF en pacientes infectados por el HIV, sólo el parámetro de Respuesta de CEM se mostró capaz de diferenciar aquellos pacientes que rebotaban en la carga viral tras la supresión del tratamiento antiretroviral respecto los que no la rebotaron. La Farmacodinamia junto con la Farmacocinética son imprescindibles para el avance en el conocimiento del tratamiento inmunosupresor. Haciendo uso de ambas disciplinas se podría optimizar la introducción de nuevos fármacos, nuevas asociaciones y nuevas pautas de dosificación. / In transplantation, current standard immunosuppressive therapy protocols are generally highly effective in preventing acute rejection. However, long-term immunosuppressive treatment has substantial adverse effects and its efficacy in preventing chronic rejection is poor. The measurement of several markers had been proposed to assess the impact of immunosuppressants on the immune system of individual patients. Various approaches have been proposed for the pharmacodynamic monitoring of immunosuppressants: 1/ The evaluation of the activity of the specific target enzyme, such as calcineurin activity (CNa) for Cyclosporine A (CsA) and Tacrolimus (TRL), inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) for MMF; 2/ The evaluation of an intermediate step in the action mechanism: for instance, the measurement of IL-2 and IFN- production in vitro whole blood for CsA and TRL, and DNA duplication for MMF; and 3/ The measurement of collateral markers modified by the presence of the immunosuppressant. The hypothesis of this Thesis was: the measurement of the residual activity of the target enzyme, as pharmacodynamic parameter, could be a good marker of the impact of the immunosuppressive therapy achieve above the immune system.The aims of this Thesis were: 1/ to establish pharmacodynamic parameters with the objective to identify the biological impact of low doses of CsA, TRL or MMF; 2/ To find pharmacodynamic parameters which reflect the action of all the drugs implies in the therapy. The populations evaluated were: stable renal transplanted patients and patients infected with the HIV virus treated with low doses of MMF. The mainly results obtained, were published: Clinical Chemistry, 2000;46:9;1376; Clinical Chemistry, 2003; 49:11;1891 and in Clinical Pharmacokinetics 2003, in press.Briefly; the results showed that the measurement of CNa might be a good predictory parameter of the biological efficacy of the monotherapy with CsA or TRL, whereas the IL-2 production will be more useful to monitor combined therapies with calcineurin inhibitors and MMF. For MMF monotherapy, the CEM response, a new parameter described by our group, was more effective than the evaluation of IMPDH activity. In our opinion pharmacodynamic parameters are needed to evaluate individual biological effect and to complement pharmacokinetics, especially in multidrug low toxicity immunosuppressive therapies.

La presente Tesis Doctoral se elaboró tras la publicación de tres artículos en revistas médicas indexadas, consiguiendo un factor de impacto de 3.7 (en espera de concretar el de la revista "Liver Transpl.") Los trabajos presentados se refieren a los factores pronóstico de la evolución del injerto hepático tras el trasplante, es por ello que permiten la discusión conjunta. Actualmente el déficit de donantes ha provocado el estudio del donante marginal, es decir el donante con edad avanzada o obeso y con hígado esteatósico. Estos estudios fueron concebidos con el fin de profundizar en el conocimiento de los donantes marginales y su evolución tras el trasplante.

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es analizar cual es la frecuencia y la relevancia clínica de la persistencia de células linfoides T y de células mieloides originarias del receptor (quimerismo mixto) tras un trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos. La hipótesis de trabajo es comprobar si el estudio secuencial y cuantitativo del patrón de quimerismo mixto en linfocitos T y en neutrófilos permite predecir el rechazo del injerto alogénico o la recidiva leucémica, respectivamente.Para ello se ha estudiado el quimerismo hemopoyético en dos grupos de pacientes:1. Pacientes tratados con un trasplante alogénico en el que se eliminan de forma parcial los linfocitos T del inóculo (alo-TSP/ELT) mediante selección positiva de las células CD34+.2. Pacientes que recibieron un trasplante alogénico con acondicionamiento de intensidad reducida de tipo "no mieloablativo" (alo-TIR "no mieloablativo").En nuestros estudios hemos aplicado una técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el análisis automatizado de fragmentos de ADN repetitivos en tandem o microsatélites (PCR/STR multiplex), la cual permite analizar cuál es el componente del donante y del receptor en diferentes líneas celulares, así como un estudio cuantitativo de cada una de ellas. Las muestras analizadas fueron obtenidas de forma secuencial a partir de la sangre periférica. Para el análisis del quimerismo mediante PCR/STR utilizamos un preparado comercial (AmpFlSTR Profiler Plus PCR; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) que analiza nueve STR: D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, y un segmento del gen de la amelogenina para distinguir el cromosoma X o Y. La separación y detección de los productos amplificados por PCR se llevó a cabo mediante un secuenciador automático de ADN (ABI Prism 310 automated DNA sequencer; Applied Biosystems). El tamaño de los fragmentos se detecta automáticamente mediante dos métodos informáticos (ABI Prism GeneScan 2.0 y GenoTyper; Applied Biosystems). La tinción con diferentes colores permite identificar alelos de tamaño muy similar. Por último, la cuantificación del quimerismo mixto se efectúa calculando el porcentaje de componente del donante y del receptor utilizando unas fórmulas matemáticas específicas. Se considera quimerismo mixto cuando el porcentaje de linfocitos T o de neutrófilos del receptor es superior al 5%. La sensibilidad de la PCR/STR se sitúa entre el 1-5%.Las conclusiones de los dos estudios incluidos en esta Tesis Doctoral fueron:1. La técnica de la PCR/STR permite realizar un análisis secuencial y cuantitativo del quimerismo hemopoyético tras el trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos con un nivel de sensibilidad suficiente. 2. La eliminación de linfocitos T del producto de leucaféresis mediante selección positiva de las células CD34+ se asocia a un aumento significativo de la frecuencia de quimerismo mixto en linfocitos T, el cual puede ser predictivo de fallo de implante. En este mismo contexto, el quimerismo mixto mieloide se asocia a recidiva leucémica en pacientes con hemopatías malignas que afectan a esta línea celular (ej. leucemia mieloide crónica).3. El régimen de acondicionamiento "no mieloablativo" con fludarabina e irradiación corporal total 2 Gy permite alcanzar un implante hemopoyético completo y mantenido, pero con un retraso significativo del injerto en el compartimiento linfoide T, por lo que puede ser útil en pacientes con enfermedades malignas con índice proliferativo bajo o en remisión, pero ineficaz para el control de enfermedades hematológicas malignas en progresión.

Se planteó la siguiente hipótesis de trabajo: la isquemia caliente que sufren los donantes a corazón parado altera negativamente la expresión de ciertos genes citoprotectores y de regeneración tisular. Con los siguientes objetivos: Determinar la expresión de genes citoprotectores durante el trasplante renal y a los cinco días postrasplante. Establecer el efecto de diferentes tiempos de isquemia caliente y del tratamiento inmunosupresor sobre la expresión estos genes.El modelo experimental de trasplante renal incluye cuarenta pares de cerdos en dos grupos de donantes a corazón parado y latiente. El período de isquemia fría es el mismo para todos los grupos, mientras que la isquemia caliente se divide en tres grupos: 30, 45 y 90 minutos. La terapia inmunosupresora consiste en ciclosporina, excepto en un grupo de donantes a corazón latiente que fue tratado con azatioprina. Los perfiles de expresión de TGF-beta 1, TSP-1, HIF-1, NOS2, NOS3, HO-1, y 18s rRNA se determinaron por PCR cuantitativa en las biopsias corticales recogidas tras la inducción anestésica, tras la isquemia caliente, tras la reperfusión en el receptor y al quinto día posterior al trasplante.Globalmente los resultados de la presente tesis muestran que tiempos cortos de isquemia caliente afectan a la expresión génica de factores implicados en la supervivencia celular, así como de factores parcialmente responsables de la regeneración tisular. Este estudio ayuda a explicar la mayor frecuencia de retraso de función del injerto que se observa en los pacientes con órganos de donantes a corazón parado. FUENTES:1. Expression of transforming growth factor-beta 1 and hypoxia-inducible factor-1beta in an experimental model of kidney trasplantation. Lario S, Mendes D, Bescós M, Iñigo P, Campos B, Alvarez R, Alcaraz A, Rivera-Fillat F, Campistol JM. Transplantation 2003; 75: 1647-1654.2. Thrombospondin-1 mRNA expression in experimental kidney transplantation with heart- and non-heart beating donors. Lario S, Bescós M, Campos B, Mur C, Luque P, Alvarez R, Campistol JM. J Nephrol 2007; 20: 588-595. / "Expression of cytoprotective genes during experimental kidney transplantation with heart- and non-heart beating donors."TEXT:Background: Ischemia-reperfusion (IR) is a risk factor for delayed graft function, a clinical syndrome more frequently observed in non-heart beating donors (NHBD). Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) activates transcription of several genes implicated in cell survival, such vascular endothelial growth factor (VEGF), and tissue repair, such transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms. TGF-beta 1 has a central role in the restoration of renal function after ischemia-reperfussion. The aim of the present study was to characterize TGF-beta 1 and HIF-1 beta related genes during renal transplantation with heart (HBD) and non-heart beating donors (NHBD).Methods: The experimental pig model of kidney transplantation comprised heart beating donors (HBD, n=9) and NHBD (n=22). Cortical biopsies were collected after anesthetic induction (basal), after warm ischemia (WI), after cold ischemia (CI), after 1 hour of reperfusion (1R) and five days (5D) after transplantation. Immunosupressive therapy consisted of cyclosporine, except one HBD group treated with azathioprine. Thrombospondin-1, TGF-&#61538;1 and HIF-1beta controlled genes (VEGF, HO-1, NOS-2, NOS-3) mRNA expression was determined by real-time PCR. Results: TGF-beta 1 expression increased after the cold ischemia period in HBD and remained unaltered during surgical process in all NHBD groups. HIF-1 beta and VEGF expression were not greatly modified in biopsies obtained during surgery in neither HBD nor NHBD groups. All groups showed a significantly increase in TGF-beta 1 and HIF-1beta expression and a down-regulation of VEGF five days after transplantation, independently of the immunosupressive treatment. There were no statistically differences among the groups at five days, although the increase of TGF-beta 1 was more pronounced in HBD groups, especially in those animals treated with azathioprine. TSP-1 mRNA was significantly increased at 5D in NHBD animals but was unchanged in the HBD group. HO-1 was upregulated in HBD (p<0.05) and NOS2 mRNA was significantly increased in both groups. No difference in NOS3 expression was observed at 5D.Conclusions: The initial up-regulation of TGF-beta 1 observed in HBD just after cold ischemia could have a positive action on epithelial tubular regeneration. Warm ischemia has a detrimental effect on TGF-beta 1 expression during the early phases of renal transplantation, having no effect on VEGF and HIF-1&#61537; expression. The up-regulation of TGF-&#61538;1 and HIF-1&#61537; observed in the days after transplantation could have a positive effect on tubular repair. TGF-&#61538;1 expression was lower in animals treated with cyclosporine, probably related to cellular toxicity or arteriolar vasoconstriction, explaining in part the frequent and severe delayed graft function observed in non-heart beating renal transplantation. The increased TSP-1 expression in NHBD may indicate a compensatory response to the reported diminished TGF-beta1 expression. The augmented NOS2 and HO-1 expression in HBD could have a positive effect on the recovery of kidney function.

El trasplante hepático es el tratamiento definitivo de las enfermedades hepáticas terminales; existe un desequilibrio crónico entre la oferta de donantes y la demanda de órganos. El donante a corazón parado es una alternativa para incrementar el pool de donantes. Nuestro modelo experimental consiste en realizar un trasplante de hígado introduciendo un periodo de recirculación normotérmica (RN) entre la parada cardíaca (fallecimiento del animal donante) y la extracción del órgano en el donante. Ello permite revertir o evitar las lesiones hepáticas producidas tras la isquemia caliente. Si se administran sustancias citoprotectoras (L-arginina, S-adenosil metionina y glicina) de la lesión por isquemia-reperfusión (IR) durante dicho periodo de RN, aumenta el efecto beneficioso. Dichas sustancias actúan a través de distintos mecanismos, y nuestra hipótesis es conocer si administradas conjuntamente son capaces de mejorar todavía más la viabilidad del injerto hepático tras un periodo prolongado de isquemia caliente (60 minutos).El diseño del estudio consiste en un grupo control o grupo 1 (periodo de RN de 30 minutos sin adición de sustancias) y 4 grupos de estudio: grupo 2 (periodo de RN de 30´ mas ARG), grupo 3 (periodo de RN de 30´ mas ARG-GLI), grupo 4 (periodo de RN 30´ mas ARG-SAMe) y grupo 5 (periodo de RN 30´ mas ARG-SAMe-GLI). Nuestros objetivos fueron: Evaluar si el empleo conjunto de sustancias citoprotectoras de la lesión por isquemia-reperfusión, después de 60 minutos de isquemia caliente, tienen acción aditiva sobre la viabilidad del injerto hepático en términos de:1- Flujos hepáticos y extracción hepática de oxígeno.2- Recuperación de la carga energética y el acúmulo de purinas en tejido hepático. 3- Función hepática: preservación de la célula endotelial y del hepatocito. 4- Cambios histológicos: necrosis de la vía biliarLas conclusiones del estudio son:1.- Se confirma que, independientemente del tiempo de isquemia caliente, el flujo sanguíneo hepático y la extracción hepática de oxígeno se correlacionan de forma evidente con la viabilidad del órgano obtenido.La arginina se ha mostrado como la sustancia más eficaz a añadir durante el proceso de obtención del órgano, puesto que:2.- Es capaz de mejorar la carga energética, así como de reducir la acumulación de purinas.3.- Reduce la lesión tisular a nivel endotelial y hepatocelular con intensidad parecida, tanto por sí sola como asociada a otras sustancias citoprotectoras.4.- Todo ello se traduce en una necrosis biliar que, aunque existe en todos los grupos de estudio, es de menor intensidad cuando se utiliza la arginina.

a) INTRODUCCIÓN, HIPÓTESIS DE TRABAJO, OBJETIVOS:La esterilidad afecta a un 15% de las parejas que desean tener descendencia. Distintas estadísticas señalan que las alteraciones de la trompa de Falopio son el factor responsable de dicha esterilidad en el 15-50% de casos.El factor tubárico es de difícil solución: en general. Los resultados de la microcirugía no son lo brillantes que en un principio se esperaba. Por otra parte, a pesar de la simplificación actual de las técnicas de FIV, los resultados obtenidos son pobres.En el momento actual, gracias tanto al desarrollo en las técnicas quirúrgicas como al descubrimiento y generalización del uso de la ciclosporina, estamos asistiendo a un desarrollo espectacular en el campo del trasplante de órganos.Teniendo en cuenta todo ello y las perspectivas de que se desarrollen nuevas posibilidades de inmunosupresión, nosotros nos propusimos demostrar: 1º) que el trasplante de trompa y ovario es técnicamente factible y 2º) que la ciclosporina constituye un logro en este sentido y abre esperanzadoras perspectivas para el trasplante genital.Así pues hemos marcado los siguientes objetivos, necesarios para contrastar la viabilidad del trasplante de órganos genitales:1.- Analizar los embarazos conseguidos tras la realización del trasplante.2.- Analizar la permeabilidad tubárica post-intervención, en los casos en que no haya habido embarazo.3.- Estudiar la función ovárica tras el trasplante de dicho órgano para comprobar su viabilidad.4.- Verificar si el análisis de dicho funcionalismo puede constituir un marcador para el control post-trasplante de la función ovárica.5.- Valorar la eficacia del tratamiento inmunosupresor con ciclosporina, mediante estudio histológico de la trompa de Falopio y del ovario, analizando diversos parámetros en animales inmunosuprimidos, comparando los resultados obtenidos con los observados en animales inmunocompetentes.b) MATERIAL Y MÉTODOS:1.-Animal de experimentación.Hemos utilizado conejas adultas jóvenes de raza neozelandesa, de aproximadamente 2,5-3 kg de peso y que nunca habían estado en contacto con el macho.2.- Protocolo de trabajo.Se establecieron dos grupos de animales, decidiéndose de manera aleatoria si un animal sería utilizado como receptor o como donante. Tras esta decisión, se incluía, también de manera aleatoria, al animal receptor en uno de los dos grupos siguientes:A: Animales trasplantados que recibían tratamiento inmunosupresor.B: Animales trasplantados que no recibían tratamiento inmunosupresor.Además se utilizaron otros dos grupos de animales:C: Animales a los que solo se les extirpó un anejo.D: Animales a los que se les extirparon los dos anejos.Estos dos grupos fueron utilizados como controles.El calendario de trabajo fue el siguiente: a los 2, 7 y 30 días de la intervención se realizaron los controles hormona/es que más adelante se detallan. A partir del día 30 se puso a los animales en contacto con el macho, con una periodicidad de aproximadamente 15 días. Tras el coito, se administraban 100 UI de HCG. Si después de tres contactos con el macho: la coneja no quedaba gestante era sacrificada y sometida a una laparotomía donde se extirpaban los órganos trasplantados. Si el animal moría antes del fin del estudio se le practicaba una autopsia, en el curso de la cual eran extirpados los órganos trasplantados.Se realizaron los siguientes controles.a) Control hormonalLos días 2, 7 y 30 del postoperatorio se determinaron los niveles de Estradiol, Progesterona y FSH de acuerdo con el siguiente esquema:-Determinación basal-Administración de 100 UI de HCG-Determinación a las dos horas-Determinación a las 24 horasEn los animales de los grupos C y D estas determinaciones se realizaron sólo una vez.b) Control histológicoEstudio macroscópico: Coloración, tamaño y peso de ovarios y trompa. Permeabilidad tubárica. Existencia de adherencias.Estudio microscópico: Se valoraba la existencia y aspecto de folículos y cuerpos amarillos ováricos, el estado de las anastomosis y la existencia de infiltración inflamatoria.3.- InmunosupresiónComo fármaco inmunosupresor se ha utilizado la ciclosporina. la primera dosis de 10 mg/kg se administró unas dos horas antes de la intervención. Esta dosis se repitió diariamente durante los primeros 15 días del estudio y posteriormente se redujo a la mitad.4.- Técnica quirúrgicaLas intervenciones se han llevado a cabo con técnicas de microcirugía.La intervención se inicia por el animal que será utilizado como donante, aunque este primer tiempo quirúrgico es similar en ambos casos; el primer paso practicado es la apertura de la hoja posterior del peritoneo parietal en las proximidades del nacimiento de los vasos ováricos, realizándose a continuación una cuidadosa disección de la vena y arteria ováricas, en una extensión de aproximadamente 1,5 a 2 centímetros. Una vez completada se practica la sección del meso tubo-ovárico a partir del ligamento infundíbulo-pélvico hasta los vasos ováricos y desde estos hasta la unión tubo-uterina. La zona elegida para la anastomosis es la porción más proximal de la trompa. Al finalizar este primer tiempo se repiten en el animal receptor los mismos pasos que se acaban de describir para el donante.Tras completar la preparación del campo operatorio en el receptor se trabaja de nuevo sobre el donante y se colocan sendos "clamps" vasculares a nivel de la porción proximal de la trompa y del inicio de los vasos ováricos, seccionando inmediatamente después dichas estructuras, con lo que se libera totalmente el injerto.Después de obtener el injerto se vuelve a trabajar sobre el receptor extirpando el anejo izquierdo de dicho animal, colocando unos "clamps" de doble pinza en vasos y trompa. Se traslada el órgano a trasplantar a este animal y se introducen los extremos de la arteria y trompa en la segunda pinza del "clamp" correspondiente y se inicia la anastomosis vascular. Una vez realizada se procede a realizar la anastomosis tubárica que, técnicamente, es mucho más sencilla.Tras completar el tiempo quirúrgico del trasplante propiamente dicho, se procede a practicar la ligadura de la trompa y la exéresis del ovario contralaterales y se cierra el abdomen.c) RESULTADOSDe los animales utilizados 27 fueron incluidos en el grupo A, mientras que 23 lo fueron en el grupo de animales que no recibieron tratamiento inmunosupresor. Los grupos C y D estaban compuestos por 10 animales cada uno de ellos. Los diferentes grupos fueron comparables entre si, no encontrándose diferencias en el peso de los animales, ni tampoco en el tamaño o peso de los genitales internos. Asimismo, tampoco se encontraron diferencias en parámetros tan importantes para el resultado de la intervención como la duración de la misma o del período en que los animales permanecieron bajo el efecto de las drogas anestésicas ni en el tiempo en que los órganos trasplantados permanecieron en estado de isquemia. Donde sí hubo diferencias fue en los hallazgos del estudio histológico. Así, a nivel macroscópico se encontró que el injerto era fácilmente identificable en casi el 90% de los animales del grupo A, mientras que en casi el 75% de los animales inmunocompetentes fue imposible identificarlo de manera adecuada. También los animales de este último grupo presentaban mayor cantidad de adherencias y de mayor gravedad que las presentadas en los animales del grupo A. El injerto, o la zona correspondiente al mismo, presentaba una coloración normal en el 63% de los animales del grupo A, mientras que tenía aspecto necrótico en más del 50% de los animales no inmunosuprimidos. Las anastomosis vasculares fueron permeables en casi el 90% de los animales del grupo A, mientras que estaban trombosadas en más del 80% de los animales del grupo B; algo similar ocurría con las anastomosis tubáricas, aunque aquí el porcentaje de permeabilidad en los animales del grupo A se reducía al 63% de los casos. Los resultados microscópicos confirman los anteriores y mientras que casi el 75% de los animales del grupo A presentaban una histología tubárica normal o casi normal, el injerto no resultaba identificable, ni siquiera microscópicamente, en el 73% de los animales pertenecientes al grupo B, ocurriendo algo similar en el caso del ovario.Los niveles obtenidos en las determinaciones de los niveles de estradiol y progesterona realizadas en los animales del grupo A son claramente superiores a los niveles de las mismas hormonas observados en el grupo B, sobre todo a partir de las realizadas el séptimo día. Por otra parte, aunque los niveles observados en los animales del grupo A son comparable a los observados en el grupo C, los observados en el grupo B presentan una clara tendencia a hacerse comparables a los observados en el grupo D.Las diferencias encontradas en los parámetros histológicos y hormonales lógicamente se han de traducir en mejores resultados funcionales. Así, mientras seis de los animales del grupo A quedaron gestantes, ninguno de los del grupo B se embarazó. Este número supone un 20% de gestaciones sobre el total de animales de grupo A, pero representa casi un 40% de los animales de dicho grupo que sobrevivieron lo suficiente como para poder ser puestos en contacto con el macho.Los animales del grupo A que quedaron gestantes no mostraron diferencias con respecto a los animales del mismo grupo que no quedaron gestantes ni en el peso, ni en el tamaño de los genitales. Aunque los animales que no quedaron gestantes tenían medias de duración de la intervención y del período de isquemia ligeramente superiores a las encontradas en los animales que se embarazaron, las diferencias no alcanzan la significancia estadística.Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los animales gestantes y no gestantes en los parámetros histológicos valorados: identificabilidad del injerto o presencia de adherencias, coloración, permeabilidad vascular o tubárica, ni en el estudio microscópico de la trompa ni en el del ovario.Las diferencias en los niveles de estradiol tampoco fueron significativas, pero los niveles del grupo de gestantes fueron superiores a los encontrados en el de no gestantes. Los niveles de progesterona presentaron una distribución similar, con niveles más elevados en el grupo de gestantes. Con la FSH ocurría lo contrario, siendo los niveles superiores en el grupo de animales que no se embarazaron.d) CONCLUSIONESDel análisis de los resultados obtenidos en este trabajo se pueden obtener las siguientes conclusiones, referidas siempre al animal de experimentación:1.- El trasplante homólogo, vascularizado, de trompa y ovario, utilizando procedimientos microquirúrgicos, es técnicamente factible si se dispone del utillaje adecuado para ello; su realización, además, no entraña un grado de dificultad inaceptablemte alto.2.- Se constata una alta tasa de viabilidad del trasplante, encontrando casi un 40% de gestaciones y más del 60% de casos con permeabilidad tubárica demostrada en el grupo de animales que recibieron tratamiento inmunosupresor.3.- Se comprueba que existe (en el grupo de animales inmunosuprimidos): a) baja tasa de formación de adherencias; b) alta tasa de permeabilidad vascular; c) bajo porcentaje de aparición de alteraciones histológicas.4.- La función ovárica tras el trasplante en los animales que quedaron gestantes (grupo inmunosuprimido) es comparable a la de ovarios normales no trasplantados, hallando valores basales similares a los presentados por animales no trasplantados y una respuesta ovárica comparable a la de estos cuando se estimula la ovulación con Gonadotrofina Coriónica.5.- La determinación seriada de los niveles de hormonas esteroideas producidas por el ovario es un buen marcador del grado de normalidad de la función de dicho órgano y de la posibilidad de gestación.6.- Tanto la trompa como el ovario son rechazados de manera vigorosa cuando no se utiliza un fármaco inmunosupresor, comprobándose en el grupo de animales no inmunosuprimidos la existencia de infiltración inflamatoria, trombosis vascular, necrosis y, posteriormente, práctica desaparición del órgano trasplantado. / Disease affecting the capacity of the Fallopian Tube to allow free passage of spermatozoa and ova accounts for about one quarter to one half of all cases of infertility in women. The results of treatment of these diseases are almost universally bad even when modern assisted reproductive technologies are used.In the future one possibility for selected patients might be homograft transplantation of tubes from healthy women.A rabbit model was developed for microsurgical en bloc vascularized adnexal allograft. Transplantation of tube and ovary from donors to tubo-oophorectomized recipients was technically successful in fifty rabbits. After surgery animals were allocated by random into two groups: in the animals of group A 10 mg/kg/day of cyclosporine for immunosuppression was begun on the day of surgery and were given for fifteen days and then lowered to 5mg/kg/day throughout the experiment; the animals in group 8 not did not receive immunosuppressive therapy. In group A, sixteen animals survived the transplant procedure and six animals became pregnant (37%). No pregnancies were seen in group B. In group A hormonal secretion of ovary was normal and comparable with this found in normal animals. In group B the levels of ovarian steroid hormones were very low and comparable to those seen in oophorectomized rabbits. These results suggest that microsurgical tubal transplantation with an appropriate immunosuppressive regimen warrants further investigation as potential treatment for certain infertility problems in humans.

En trasplante hepático (TH), la lesión por isquemia-reperfusión (I/R) es la causa principal tanto del mal funcionamiento como del fallo primario del injerto hepático. Y si esto ocurre en hígados sanos, aun son mayores los casos de mal función o fallo primario cuando el injerto es esteatósico, ya que estos hígados toleran peor que los normales la lesión por I/R. Además, la esteatosis es la causa del mayor número de hígados no aptos para el trasplante, acentuando la problemática de la falta de injertos para TH. Por ello, es evidente la necesidad de desarrollar estrategias protectoras para minimizar los efectos adversos de la lesión por I/R en hígados esteatósicos. Los efectos perjudiciales del Sistema Renina-Angiotensina (RAS) y de la proteína transportadora de retinol tipo 4 (RBP4) en varias patologías están bien documentados pero no se sabe si estarían implicados en la lesión por I/R en TH. Por otro lado, el precondicionamiento isquémico (PCI) basado en la inducción de breves periodos de I/R, reduce la lesión por I/R asociada a TH, pero se desconocen en gran parte sus mecanismos protectores. En la presente tesis se investigó el papel del RAS y del RBP4 en la lesión por I/R en injertos esteatósicos y no esteatósicos sometidos a TH, así como su implicación en los beneficios del PCI. Además de esto, se evaluaron los mecanismos de protección de estrategias farmacológicas o quirúrgicas, como el PCI capaces de modular el RAS y el RBP4 en ambos tipos de injertos. Para alcanzar estos objetivos, se utilizó el modelo experimental de TH ortotópico utilizando ratas de la cepa Zucker. Los resultados obtenidos indicaron que la Angiotensina II, principal efectora del RAS, está implicada en la lesión por I/R en injertos hepáticos no esteatósicos, pero no en los beneficios del PCI. Asimismo se demostró que los antagonistas de los receptores de la Angiotensina II protegieron a los injertos no esteatósicos a través de la sobrerregulación de la ERK1/2. Estas estrategias no fueron de utilidad en presencia de esteatosis. En el caso de los injertos hepáticos esteatósicos se ha señalado por primera vez la implicación de la Angiotensina 1-7 (Ang 1-7), otro potente efector del RAS, en la lesión por I/R, demostrando propiedades perjudiciales de la Ang 1-7 no conocidas anteriormente. Además se describió un nuevo mecanismo protector del PCI, en el cual el PCI, a través de AMPK, induce la generación de RBP4, que a su vez reduce la sobre-expresión del PPARγ, protegiendo así a los injertos esteatósicos. Esto señaló por primera vez un efecto beneficioso del RBP4 que no había sido descrito anteriormente en ninguna patología. Adicionalmente, se describieron las siguientes estrategias terapéuticas específicas para los injertos esteatósicos: el antagonista del receptor de la Ang 1-7 redujo el daño trasplante, reduciendo asÍ la lista de espera en TH. Estos hallazgos también podrían contribuir a nuevas aplicaciones del PCI en la práctica clínica en TH, ya que los mecanismos protectores descritos del PCI refuerzan su papel como estrategia protectora y muestran al PCI como una estrategia quirúrgica sencilla que puede ejercer los mismos efectos beneficiosos que varias de las estrategias farmacológicas propuestas. / Numerous steatotic livers are discarded as unsuitable for transplantation because of their poor tolerance of ischemia-reperfusion (I/R). The injurious effects of renin-angiotensin system (RAS) and retinol-binding protein 4 (RBP4) in various pathologies are well documented. Ischemic preconditioning (PC) based on brief periods of I/R protects steatotic liver grafts against I/R injury, but the responsible mechanism is poorly understood. The aims of this doctoral thesis were: a) to investigate the role of RAS and RBP4 in I/R injury associated with non-steatotic and steatotic liver transplantation and the benefits of PC in such situations, and b) to examine protective mechanisms of pharmacological or surgical strategies such as PC, able to modulate RAS and RBP4 in both type of grafts. For this, Zucker rats were submitted to liver transplantation with or without preconditioning. Our results showed that Angiotensin II, the main effector of RAS, is involved in I/R injury in non-steatotic grafts, but not in the benefits of PC. Thus, Angiotensin II receptor antagonists protected non-steatotic grafts against damage and this protection was associated with ERK 1/2 over-expression. These strategies were ineffective in steatotic grafts. In the presence of steatosis, Angiotensin 1-7 (Ang 1-7), another effector of RAS, played a role in I/R injury in steatotic grafts. Additionally, it has been described that PC through AMPK, induced RBP4 and this in turn reduced PPARγ, thus protecting steatotic grafts against I/R injury. Results obtained herein also led to describe the following therapeutic strategies specific for steatotic grafts: Ang 1-7 receptor antagonists reduced hepatic damage through reduction of peroxynitrite formation; and therapies that induce RBP4, such as PCI of pretreatment with RBP4, as well as PPARγ antagonists, also protected steatotic grafts against I/R injury in liver transplantation. In terms of clinical application, these therapies might open new avenues for steatotic liver transplantation and improve the initial conditions of donor livers with low steatosis that are available for transplantation. Such therapies could also increase the use of numerous steatotic livers currently discarded for transplantation, thus reducing the risk of death of those patients on liver transplant waiting lists.

El trasplante hepático es la solución para personas que sufren enfermedades hepática terminales o insuficiencia hepática aguda. La principal limitación para la aplicación del trasplante es la falta de órganos respecto a la demanda. El trasplante hepático con injerto de tamaño reducido se desarrolló para aumentar el número de órganos disponibles y así disminuir la lista de espera. Además del síndrome de isquemia/reperfusión (I/R) asociado al proceso de trasplante, es necesario un proceso de regeneración para la viabilidad del injerto. El síndrome de I/R también tiene efectos sistémicos nocivos en el pulmón. El precondicionamiento isquémico (PC) es una estrategia quirúrgica útil frente a la lesión por I/R en modelos de I/R normotérmica y trasplante hepático con 8 y 16 horas de isquemia, con buenos resultados en la clínica, en resección de tumores, pero se desconoce su efecto en el modelo de trasplante hepático con injerto de tamaño reducido en la rata. En la presente tesis se ha demostrado que el PC es una estrategia útil frente a la lesión por I/R y que favorece la regeneración asociada al modelo de trasplante hepático de tamaño reducido en la rata, modulando factores de crecimiento, como el factor de crecimiento hepatocitario (HGF) y el factor de crecimiento transformante-beta (TGF-beta), modulando la producción de radicales libres (RLO) (por parte de las células de kupffer) y todo esto cursa a través de la disminución de la IL-alfa y con una implicación del óxido nítrico (NO). Sin embargo, el PC no ejerce su papel protector mediante cambios en el sistema productor de RLO xantina/xantina oxidasa, cambios en los niveles de las citoquinas TNF-alfa y IL-6, ni mediante la preservación del metabolismo energético. Por otra vía independiente del NO, el PC estimula la expresión de la Heat shock protein (HSP) 70 y HO-1, estimulando la regeneración en el caso de la HSP70 y disminuyendo la lesión y estimulando la regeneración en el caso de la HO-1. Por otro lado, el PC fue capaz de conferir protección a nivel pulmonar, así la disminución de la IL-1alfa se tradujo en una disminución en los niveles de TNF-alfa plasmáticos y un aumento del receptor soluble de TNF-alfa de tipo 2 (sTNFR2), que es capaz de inactivar el TNF-alfa libre en la circulación sanguínea, evitando los efectos nocivos del TNF-alfa a nivel pulmonar. / Reduced-size liver transplantation (RSLT) was developed to arise the number of available liver grafts In addition to ischemia/reperfusion (I/R) injury associated to liver transplantation, the reduced grafts have to overcome a necessary regeneration process. I/R injury has deleterious systemic effects, leading to pulmonary complications. Ischemic preconditioning (IP) is able to protect liver against I/R injury and lung damage in conventional rat liver transplantation. Recently, has been published its clinical application in tumour resections. In the present thesis work, it has been demonstrated the IP is able to reduce I/R injury and stimulate regeneration associated to RSLT. IP modulated growth factors, as hepatocyte growth factor and transforming growth factor-beta and the stress oxidative production, and it was related to the reduction of IL-1alpha levels . Nitric oxide (NO) was implicated in the benefits of IP. However, PC has not any effect on xanthine/xanthine oxidase system, neither on IL-6 and TNF-alpha levels and energetic metabolism. By another pathway independent of NO, IP induced heat shock protein 70 (HSP70) and haem-oxygenase-1 (HO-1). HO-1 protected against I/R injury and liver regeneration, whereas the benefits resulting from HSP70 were mainly related to hepatocyte proliferation. On the other hand, IP was able to confer lung protection. In this line, reduction of IL.-1alpha levels was associated with lower TNF-alpha and higher soluble receptor TNF-alpha type 2 (sTNFR2) plasma levels.

La presència de cèl·lules del donant en el receptor després del trasplantament d'un òrgan sòlid ha estat objecte de controvèrsia des de mitjans del segle XX. Tot va començar amb el descobriment de l'acceptació de trasplantaments de pell entre bessons bovins bivitel·lins amb anastomosis vasculars. L'evolució marcada de les tècniques de trasplantament i la disminució del rebuig amb l'aparició de la immunosupressió han permès perllongar la vida de l'empelt i augmentar el nombre de trasplantaments amb èxit. No obstant encara subsisteix un índex massa elevat de rebuig agut que compromet la supervivència de l'empelt a mig-llarg termini. Arribats a aquest punt, algunes experimentacions han suggerit que el microquimerisme podria ser una opció per a disminuir la incidència d'aquest tipus de rebuig en els pacients trasplantats. Els resultats descrits en aquesta tesi permeten en primer lloc demostrar l'existència d'aquest microquimerisme a nivell molecular en els pacients trasplantats de ronyó, de cor o de fetge. En segon lloc, es va correlacionar la presència de microquimerisme al segon mes post-trasplantament amb una més baixa incidència de rebuig agut en pacients trasplantats de ronyó i una tendència similar per als pacients amb trasplantament de cor. Tenint en compte l'absència d'episodis de rebuig a 4 anys en els pacients amb microquimerisme, aquest podria ser considerat com a factor precoç de pronòstic del rebuig agut a mig termini, suposant així la classificació dels pacients en grups de risc de rebuig en funció de l'absència o la presència de microquimerisme als dos mesos. / The presence of a few circulating donor cells in recipient's blood was first thought to be only an epiphenomenon of solid organ transplantation, also called microchimerism, but several authors have suggested that these circulating cells may contribute to tolerance induction. This study aims to assess the rate of microchimerism after kidney transplantation and determine its influence on acute rejection in a 4-year follow-up. A total of 84 single-kidney recipients were included for microchimerism detection and quantification 2, 6, 12, and 18 months after transplantation by specific detection of non-shared STR, VNTR, human leukocyte antigen-A, -B, -DRB1, and SRY alleles. Kinetic establishment of microchimerism was monitored in a double kidney transplanted recipient for 150 min after declamping and after 7 days. Microchimerism was detected in 56.2% of kidney recipients 2 months after transplantation (M2): this fell to 30.1% at 12 months. In renal calcineurin inhibitor-based immunosuppression cohort (n_73), the microchimerism negative group (n_32) showed 37.9% biopsy-proven acute rejection (BPAR), whereas in the microchimerism-positive group (n_41), no recipient did (P_0.001). Regardless of immunosuppression, BPAR incidence was 35.6% and 4.9%, respectively (P_0.001). Multivariate study showed microchimerism as a protective factor against BPAR (odds ratio: 8.3; 95% confidence interval: 1.8 to 37.9; P_0.006), blinding other well-known rejection-risk variables. Microchimerism M2 presence did not correlate with a multifactorial critical outcome such as late graft loss. Microchimerism was frequent after kidney transplantation and correlated with a significantly lower incidence of rejection. We propose that early microchimerism monitoring could help early detection of low rejection-risk recipients.