La sclérose en plaques (SEP) est une maladie autoimmune inflammatoire et neurodégénérative du système nerveux central (SNC) chez le jeune adulte résultant d’une altération ciblée de la myéline. Les premiers symptômes de la SEP sont une détérioration cognitive, des vertiges, des douleurs, de la fatigue et une perte de la vision. En condition physiologique, les axones des neurones sont entourés par une gaine de myéline synthétisée par les oligodendrocytes permettant d’accélérer la vitesse de conduction des influx nerveux et de prévenir la mort neuronale. Le modèle expérimental le plus utilisé dans l’étude des mécanismes de la SEP est le modèle de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Après une immunisation contre la glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline 35-55 (MOG35-55), les lymphocytes T Cluster of differentiation (CD)4+ helper (Th)1 et Th17 auto-réactifs induisent une réponse inflammatoire aiguë à la périphérie puis migrent dans le SNC. Ils provoquent alors une réponse inflammatoire dirigée contre la myéline, avec l’intervention descellules myéloïdes. Cela aboutit à la destruction des gaines de myéline diminuant la vitesse de conduction des influx nerveux et une perte axonale, responsables des symptômes mentionnés précédemment. A l’heure actuelle, les traitements contre la SEP peuvent ralentir la progression de la paralysie et diminuer la sévérité ainsi que l’incidence des symptômes diminuant l’inflammation. En revanche, ils n’ont pas d’effets sur les formes progressives de la maladie au cours desquellesles processus neurodégénératifs s’amplifient et dominent ceux de l’inflammation. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles thérapies qui pourront à la fois bloquer l’inflammation et promouvoir la remyélinisation et la neurorégénération. Dans cette optique, de nouvelles cibles thérapeutiques ont émergé pour traiter la SEP : le Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), le Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP), l’orexine A, leurs récepteurs ainsi queleurs analogues. En effet, ces neuropeptides présentent des activités anti-inflammatoires et neuroprotectrices. Mes travaux de thèse ont porté sur l’étude des effets d’un agoniste de VPAC2, l’un des récepteurs de VIP et PACAP, et de l’orexine A sur les processus inflammatoires et neurodégénératifs dans le modèle d’EAE ainsi que dans le modèle toxique de la cuprizone (CPZ), induisant la mort des oligodendrocytes matures et la démyélinisation indépendamment des lymphocytes T. Après une immunisation contre la MOG35-55, un traitement systémique de court durée avec BAY55-9837, un agoniste de VPAC2, diminue la sévérité de l’EAE chronique en diminuant la réponse inflammatoire à la périphérie avec une baisse de l’activation lymphocytaire, de l’activité de présentation antigénique des cellules dendritiques et des monocytes ainsi qu’une modulation de la population des lymphocytes T régulateurs. Au niveau de la moelle épinière, l’infiltration descellules immunitaires est moindre et la proportion en microglie/macrophages est plus élevée après traitement par l’agoniste de VPAC2. De plus, BAY55-9837 diminue les processus de démyélinisation et favorise ceux de remyélinisation dans le modèle de la CPZ. En parallèle, l’administration intrapéritonéale à court terme de l’orexine A diminue drastiquement la sévérité de l’EAE chronique. Le traitement ne présente pas d’effet sur la phase d’immunisation de l’EAE mais limite la phase effectriceavec une diminution de l’infiltration des lymphocytes T CD4+, des médiateurs inflammatoires, de la démyélinisation, de l’astrogliose et de l’activation microgliale au niveau du SNC. Par contre, l’administration systémique de l’orexine A ne semble pas avoir d’effet sur les phases de démyélinisation et de remyélinisation au cours du modèle de la CPZ / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). First MS symptoms are cognitive deterioration, dizziness, pain, fatigue and loss of vision. In physiological condition, the axons of neurons are surrounded by a myelin sheath synthesized by oligodendrocytes to accelerate the conduction velocity of nerve impulses and to prevent neuronal death. The most widely used experimental model of MS is the EAE model. After immunization against MOG35-55, self-reactive Th1 and Th17 cells induce an acute inflammatory response at the periphery and then migrate into the SNC. Then they induce an inflammatory response against myelin, with the intervention of myeloid cells. This results in the destruction of myelin sheaths decreasing the rate of conduction of nerve impulses and axonal loss, responsible for the aforementioned symptoms. Currently, MS treatments can slow the progression of paralysis and decrease the severity and the incidence of symptoms by targeting immune responses. However, these treatments have no effect on the progressive forms of the disease when the neurodegenerative processes amplify and dominate the inflammatory component. It is therefore necessary to find effective therapies that can both block inflammation and also promote remyelination and neuroregeneration.In this context, new therapeutic targets have emerged to treat MS: VIP, PACAP, orexin A, their receptors and their analogs. These neuropeptides have several effects such as anti-inflammatory and neuroprotective activities. My thesis works were focused on the effect of a VPAC2 receptor agonist, one of the three receptors of VIP and PACAP, and orexin A in inflammatory and neurodegenerative processes during MOG35-55-induced EAE model and toxic model using CPZ, which induces mature oligodendrocyte death and demyelination without the influence of lymphocytes.A short term and systemic treatment of BAY55-9837, a VPAC2 agonist, decreases chronic EAE severity with less activation of T lymphocytes and antigen presentation activities of dendritic cells and monocytes as well as Treg population modulation at the periphery. In the CNS, immune cell infiltration is reduced in VPAC2-treated mice compared to PBS-treated mice with an higher microglia/macrophage proportion. Moreover, VPAC2 agonist decreases demyelination processes and enhances remyelination during cuprizone model. In parallel, short term and intraperitoneal administration of orexin A decreases drastically the severity of chronic EAE. Orexin A treatment has no effect on immunization phase of EAE but limits effective phase with a lower infiltration of CD4+ T lymphocytes, inflammatory mediators, demyelination, astrogliosis and microglial activation in the CNS. In contrast, systemic administration of orexin A seems to have no effect during demyelination and remyelination phases in CPZ model.

L'épilepsie est un trouble chronique du système nerveux central qui touche 70 millions de personnes dans le monde. Un tiers des patients souffrent d'épilepsie réfractaire (ER), caractérisée par des crises récurrentes malgré l’utilisation de médicaments antiépileptiques (MAE) appropriés. Plusieurs données soutiennent un lien biologique entre la neuroinflammation et l'épilepsie chronique. De plus, des études suggèrent que certains MAE de nouvelle génération comme le brivaracétam présentent des propriétés immunomodulatrices qui pourraient contribuer à leur bénéfice dans l’ER et d’autres pathologies neurologiques. Les objectifs de cette thèse étaient tout d’abord de caractériser ex vivo le profil des cellules immunitaires périphériques, les niveaux de cytokines pro- et anti-inflammatoires et les biomarqueurs neurodégénératifs dans le sang périphérique de sujets souffrant d’épilepsie (ER vs. bien contrôlée) en comparaison à celui de donneurs sains. Par la suite, nous avons évalué l’impact du brivaracétam sur l’activation des cellules immunitaires humaines in vitro et son potentiel immunomodulateur et neuroprotecteur in vivo dans le modèle de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) active, un modèle animal de la sclérose en plaques, la pathologie inflammatoire du SNC la plus fréquente. Méthodologie : Après isolation des cellules mononucléées et du sérum à partir du sang périphérique d'adultes souffrant d'épilepsie focale et de donneurs sains, nous avons effectué des analyses par cytométrie en flux ex vivo, ELISA multiplex et technique ultrasensible de détection de biomarqueurs par technologie single molecule array (SIMOA). Nous avons comparé l'influence du brivaracétam et du lacosamide sur l'activation des cellules immunitaires périphériques humaines in vitro et in vivo dans l'EAE active induite par immunisation avec le MOG, le modèle animal le plus commun de la sclérose en plaques. Résultats : Nous avons rapporté une augmentation de la proportion des lymphocytes T CD4 dans le sang périphérique des adultes souffrant d’ER, avec une fréquence plus élevée de lymphocytes pro-inflammatoires Th17/Th1 en comparaison avec les contrôles. Nous avons également rapporté des niveaux significativement plus élevés du marqueur de lésion neuronale sNfL chez les sujets plus âgés avec l’ER par rapport aux témoins appariés pour l’âge. De plus, nous avons montré que l'administration prophylactique du brivaracétam ou du lacosamide ne retardait pas l'apparition de l'EAE mais était associée à une évolution clinique significativement moins sévère dans la phase chronique de l'EAE active chez les souris femelles C57BL/6 par rapport au contrôle (véhicule). Conclusion : Dans l'ensemble, nos données soutiennent d'une part que l’ER est associée à un profil immunitaire pro-inflammatoire des lymphocytes Th17/Th1 dans le sang périphérique et à des niveaux pathologiques de sNfL, soutenant la présence de composantes inflammatoire et neurodégénérative potentielles dans l’ER. D'autre part, les MAE de nouvelle génération (brivaracétam et lacosamide) n'altèrent pas de façon importante la réponse à l'immunisation avec le peptide MOG, mais améliorent l'évolution de l'EAE par le biais principalement de mécanismes neuroprotecteurs. / Epilepsy is a chronic central nervous system condition affecting 70 million people around the world. One third of patients suffer from drug-resistant epilepsy (DRE), characterized by recurrent seizures despite appropriate trials of anti-epileptic drugs (AEDs). Accumulating data support a biological link between neuroinflammation and chronic epilepsy. Recent studies suggest that some of the new generation AEDs, like brivaracetam, can display immunomodulatory properties that could contribute to their beneficial impact in DRE and other neurological disease. We aimed to investigate differences in immune cell populations, cytokines, and neurodegenerative biomarkers in the peripheral blood of subjects with epilepsy (DRE vs. well-controlled) compared to healthy controls and to assess the impact of brivaracétam on activation of human immune cells in vitro and its immunomodulatory and neuroprotective potential in vivo in the active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a common model of the prototypical CNS neuroinflammatory disease multiple sclerosis. Methodology: Using peripheral blood mononuclear cells and serum isolated from the peripheral blood of adults suffering from focal onset epilepsy and healthy donors, we performed flow cytometry analysis ex vivo, multiplex immunoassays, and ultrasensitive single molecule array. We compared the influence of brivaracetam and lacosamide on activation of human peripheral immune cells in vitro and in vivo in MOG-induced active EAE, the most common animal model of multiple sclerosis. Results: We observed an increased proportion of CD4 T cells in the peripheral blood compartment of adults suffering from DRE, with a higher frequency of proinflammatory Th17/Th1 cells compared to controls. We also reported significantly higher levels of the marker of neuronal injury sNfL in aging subjects with DRE compared to age-matched controls. Furthermore, we showed that prophylactic administration of brivaracetam or lacosamide did not delay EAE onset but was associated with a significantly less severe clinical course in the chronic phase of active EAE in C57BL/6 female mice compared to control (vehicle).Conclusions: Taken together, our data support that DRE is associated with a proinflammatory Th17/Th1 CD4 T cell immune profile in peripheral blood and pathological levels of sNfL, supporting both potential inflammatory and neurodegenerative components in DRE. On the other hand, the novel generation AEDs (brivaracetam and lacosamide) do not impair the response to immunization with MOG peptide but improve the course of EAE through mostly neuroprotective mechanisms.

Les leucocytes sont connus pour jouer des rôles autant bénéfiques que néfastes dans le système nerveux central. La compréhension de leur mécanisme de recrutement est donc importante afin de contrôler leur circulation à travers la barrière hémato-encéphalique. De façon générale, l'adhésion forte est reconnue comme étant une étape clé de ce recrutement. Les principales actrices qui y sont impliquées sont les chimiokines et les intégrines. Cependant, l'identité de ces dernières peut changer selon le tissu, le stimulus et la nature des leucocytes recrutés. Dans ce travail, nous nous sommes intéressé à une population de leucocytes principalement composée de granulocytes : les leucocytes en forme de bâtonnets. Notre objectif principal a été de caractériser le mécanisme d'adhésion de ces cellules, dans le cerveau, en conditions inflammatoires via l'utilisation d'anticorps neutralisants ou d'animaux déficients pour les gènes d'intérêt. Notre hypothèse a été que l'intégrine αMβ2, via sa liaison avec ICAM-1, ainsi que l'une des chimiokines liant CXCR2, sont importantes pour adhésion des granulocytes en réponse à différents produits bactériens (la toxine pertussique (PTX) et le lipopolysaccharide (LPS)) et durant l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Afin de valider cette idée, nous avons, dans un premier temps, déterminé si l'expression spatio-temporelle d'ICAM-1 est régulée par la PTX et/ou le LPS et si son absence ainsi que la neutralisation d'αMβ2 influencent le recrutement des granulocytes. En second lieu, nous avons déterminé quel ligand de CXCR2 est le plus fortement exprimé dans ces conditions et vérifié si la neutralisation de cette chimiokine, CXCL1, affecte l'adhésion des granulocytes. Nos résultats ont démontré qu'ICAM-1 peut effectivement être régulée par le LPS et la PTX, qu'en réponse à cette dernière toxine, αMβ2 semble être l'unique intégrine responsable de l'adhésion des leucocytes bâtonnets et qu'elle joue son rôle via, entre autre, ICAM-1. De plus, il s'avère que CXCL1 et CXCR2 sont importants dans l'adhésion des granulocytes en réponse à la PTX et au LPS. Finalement, non seulement la neutralisation de CXCL1 diminue cette même adhésion durant l'EAE, mais réduit également la gravité de la maladie. En conclusion, dans ce projet, nous avons contribué à mieux comprendre le mécanisme de recrutement des granulocytes dans le cerveau sous différentes conditions inflammatoires.

Un nombre alarmant de personnes signalent une maladie persistante appelée COVID longue après leur infection par le virus SRAS-CoV-2. Il y a 650 million de cas de COVID-19 dans le monde, dont 10% de ces personnes développent des symptômes persistants. Parmi les symptômes observés, on remarque une fatigue profonde, de la myalgie, des troubles cognitifs, etc. Ces symptômes sont étonnamment similaires à ceux de l'encéphalomyélite myalgique (EM), une maladie chronique débilitante. L’EM est une maladie complexe souvent caractérisée par une fatigue profonde et le malaise après-effort. Environ 70% des patients atteints d'EM décrivent des épisodes d'infections virales comme élément déclencheur. Une autre maladie qui partage des symptômes similaires à l’EM est la fibromyalgie (FM). La FM est une autre maladie chronique et débilitante qui se caractérise par une douleur musculosquelettique et une sensibilisation centrale. Il n’existe toujours pas de traitement ni de test diagnostic à ce jour. Auparavant, nous avons découvert et validé onze microARN en tant que premier panel diagnostic pour l'EM et la FM. La majorité de ces petits ARN non codants participent à la régulation de gène, l'immunité et l'inflammation. Ce projet consiste à déterminer les trajectoires cliniques des personnes atteintes de la COVID longue à l’aide d’un nouveau test pronostic constitué de 11 miARN circulants permettant de différencier les diverses séquelles de la COVID longue. Par la suite, une recherche pan-génomique a permis d’établir une signature moléculaire plus précise pour chacun des six sous-groupes COVID longue. Nous proposons que les effets du virus SRAS-CoV-2 sur les microARN de l'hôte pourraient déclencher la persistance des symptômes de la COVID longue et que l’expression différentielle de certains microARN puissent contribuer au développement de différentes séquelles à long terme. Nous avons recruté des participants âgés de plus de 18 ans ayant été infectés par le virus SRAS- CoV-2, non-hospitalisés et présentant une COVID longue de plus de six mois et des sujets sains (groupe pré-pandemie) n’ayant pas reportés d’infection. L’analyse des symptômes a été réalisée à l’aide de trois questionnaires (SF-36, MFI-20, DSQ) complétés par tous les participants. Les niveaux d’expression de 11 microARN, précédemment identifiée dans l’EM, ont été mesurés par RT-qPCR dans des échantillons de plasma et la détermination des différentes trajectoires associées à des séquelles à long terme a été réalisée par analyse des composantes principales et validée par Random Forest Model (RFM). En stratifiant les patients selon leur signature de 11 miARN, nous avons évalué l’expression globale des 2549 miARN pour chaque séquelle et identifié de nouveaux miRNA spécifiques pour chacun des groupes à l’aide de la technologie microRNA array Agilent, une biopuce de la société Agilent. Nos données préliminaires nous ont permis d’identifier une signature moléculaire spécifique à chacune des séquelles de la COVID longue. Ces résultats nous permettrons de développer un nouveau test diagnostic basé sur les miRNA afin de prédire les conséquences à la suite de l’infection par le virus SRAS-CoV-2. / An alarming number of people are reporting a persistent illness called long COVID after their infection with the SARS-CoV-2 virus. There are an estimated 650 million cases of COVID-19 worldwide, with 10% of these people developing persistent symptoms. Among the symptoms observed, we notice profound fatigue, myalgia, cognitive disorders, etc. These symptoms are strikingly similar to those of myalgic encephalomyelitis (ME), a debilitating chronic disease. ME is a complex disease often characterized by profound fatigue and post-exertional malaise. Approximately 70% of ME patients describe episodes of viral infections as a trigger. Another disease that shares similar symptoms to ME is fibromyalgia (FM). FM is another chronic and debilitating disease that is characterized by musculoskeletal pain and central sensitization. There is still no treatment or diagnostic test to date. Previously, we discovered and validated eleven microRNAs as the first diagnostic panel for ME. Most of these small non-coding RNAs participate in gene regulation, immunity and inflammation. The objective of this project was to build a new diagnostic test to differentiate the various after-effects of long COVID using miRNAs. This project consists of determining the clinical trajectories of people with long COVID using a new prognostic test made up of 11 circulating miRNAs making it possible to differentiate the various after-effects of long COVID. Subsequently, a pan-genomic search made it possible to establish a more precise molecular signature for each of the six long COVID subgroups. We recruited participants aged over 18 years who had been infected with the SARS-CoV-2 virus, who were not hospitalized and had symptoms of long COVID for more than six months and healthy subjects (pre-pandemic group) who had not reported infection. The analysis of symptoms was carried out using three questionnaires (SF-36, MFI-20, DSQ) completed by all participants. The expression levels of 11 microRNAs previously identified in EM, from plasma samples were measured by RT-qPCR and the determination of the different trajectories associated with long-term sequelae was carried out by principal component analysis (PCA) and validated by Random Forest Model (RFM). By stratifying patients according to their signature of 11 miRNAs, we evaluated the overall expression of the 2549 miRNAs for each sequelae and identified new miRNAs specific for each of the groups using the Agilent microRNA array technology, a biochip from the company Agilent. Our preliminary data allowed us to identify a molecular signature specific to each of the after-effects of long COVID. These results will allow us to develop a new diagnostic test based on miRNAs in order to predict the consequences following infection by SARS-CoV-2 viruses.

Objectifs: Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molécules d’adhérence afin de parvenir à traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et former des lésions multifocales dans le système nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polarisés en TH17 (sécrétant de l’IL-17) sont reconnus comme contribuant à la formation des lésions. Le rôle des lymphocytes CD8 TC17 est quant à lui encore mal défini. L’identification de marqueurs de surface spécifiquement exprimés par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractérisation de ces sous-populations pathogéniques et fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la SEP. Méthodologie: Nous avons identifié MCAM lors d’analyses protéomiques de cellules endothéliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractérisé le phénotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, à partir de matériel obtenu de témoins (contrôles), de patients atteints de SEP et d’animaux atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Résultats: MCAM est exprimé à la fois par les cellules endothéliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mémoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d’IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l’expression de MCAM est fortement augmentée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des poussées de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l’expression. In situ, l’expression de MCAM par les cellules endothéliales de la BHE est plus marquée au site des lésions de SEP et d’EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats périvasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 à travers les cellules endothéliales de la BHE humaine. In vivo, dépléter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ améliore les signes cliniques de l’EAE par transfert. Par ailleurs, l’expression de MCAM est régulée à la hausse à la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgénique TCR1640, un modèle animal d’EAE spontanée. Finalement, bloquer MCAM atténue les déficits neurologiques chroniques aussi bien du modèle d’EAE induite avec le MOG35-55 que du modèle d’EAE spontanée. Conclusion: Nos données démontrent que les lymphocytes encéphalitogéniques produisant de l’IL-17 et présentant une capacité effectrice et migratoire marquée expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thérapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires. / Objective: In multiple sclerosis (MS), pro-inflammatory lymphocytes use adhesion molecules to cross the blood-brain barrier (BBB) and accumulate in central nervous system (CNS) lesions. CD4 T lymphocytes polarized into auto-aggressive encephalitogenic TH17 (IL-17 secreting) are known to partake in MS lesion formation. Much less is known about the role of CD8 TC17. Identification of specific surface markers and adhesion molecules expressed by TH17 and TC17 lymphocytes would allow further characterization of these pathogenic subsets and would provide new therapeutic targets in MS. Methodology: We identified MCAM in a proteomic screen of human BBB endothelial cells (ECs) and on a subset of T lymphocytes. We characterized the phenotype and function of MCAM-expressing cells ex vivo, in vitro and in situ using human and mouse material obtained from controls, MS subjects and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) animals. Results: MCAM is expressed by human BBB-ECs and by human effector memory CD161+ and CCR6+ T lymphocytes. Both CD4 and CD8 MCAM+ lymphocytes express more IL-17, IL-22, GM-CSF and Gz B than MCAMneg lymphocytes. Moreover, MCAM is strikingly up-regulated in human on CD4+ and CD8+ T lymphocytes during MS relapses, while treatment decreases MCAM expression. In situ, MCAM+ CD8 and CD4 T lymphocytes are present in perivascular infiltrates of MS and EAE CNS specimens, while MCAM expression is up-regulated on BBB-ECs within lesions. In vitro, MCAM+ CD8 T lymphocytes display higher killing capacity of oligodendrocytes, and MCAM blockade reduces CD8 TC17 and CD4 TH17 transmigration across human BBB-ECs. In vivo, depletion of MCAM+ cells from reactivated CD4 T lymphocytes and from CD8 T lymphocytes decreases clinical symptoms in adoptive transfer EAE. Furthermore, expression of MCAM is up-regulated on CD4 and CD8 T lymphocytes in the TCR1640 transgenic mice, a model of spontaneous EAE. Finally, blocking MCAM in both MOG35-55-induced and spontaneous primary progressive EAE attenuates chronic neurological deficits. Conclusions: Our data demonstrate that encephalitogenic IL-17-producing lymphocytes with high effector and migratory capacity express MCAM, and that MCAM could serve as a biomarker for MS and a valuable target for the treatment neuroinflammatory conditions.

L'interleukine-15 (IL-15) contribue au développement et à l’activation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclérose en plaques. Des niveaux élevés de l'IL-15 ont été trouvés chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux témoins, mais aucune étude n'a examiné les effets de tels niveaux élevés sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre étude étaient 1- de caractériser l’expression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de déterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- d’évaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modèles murins de la sclérose en plaques. Nous avons établi que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite à une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont été significativement augmentées lors des co-cultures avec des cellules B alloréactives exprimant l'IL-15. Dans les modèles murins de la sclérose en plaques, nous avons détecté au sein du système nerveux central des cellules immunes exprimant l’IL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le récepteur pour cette cytokine à différents stades de la maladie. Nous avons démontré que les cellules B modulent des réponses des lymphocytes T CD8 via l’IL-15, ce qui suggère un rôle pour les cellules B dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Nous avons aussi mis en évidence la présence de cellules exprimant l’IL-15 dans le système nerveux central dans des modèles murins de cette maladie. / Interleukin-15 is a cytokine involved in the homeostatic proliferation and maintenance of CD8 T cells. Activated CD8 T cells are implicated in several autoimmune diseases, including Multiple Sclerosis (MS). Elevated levels of IL-15 have been reported in serum and on peripheral leukocytes of MS patients relative to controls, yet no study has addressed the effects of elevated IL-15 levels on CD8 T cells. To study the in vivo effects of any molecule, the animal model for MS, EAE, is used; the expression of IL-15 during the EAE disease course has not yet been elucidated. Thus the goals of our study were to characterize surface IL-15 expression on human B lymphocytes and determine the effects on human CD8 T cell functions; and to assess the in vivo expression of IL-15 in MS mouse models. We found that B cells are capable of up-regulating the expression of surface IL-15 upon CD40 stimulation, and CD8 T cell effector functions were significantly enhanced upon co-culture with alloreactive IL-15-expressing B cells. In the MS mouse models we used, we found IL-15-expressing immune cells present within the central nervous system (CNS) at various points of disease, and that CNS-infiltrating CD8 T cells were potentially responsive to IL-15. Here, we not only demonstrate the modulation of CD8 T cell responses by IL-15 presented by B cells, implying a role for B cells in MS pathogenesis, but also show the presence of IL-15-expressing cells within the inflamed CNS of EAE.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Responses of activated T cells are suppressed upon engagement of the receptor programmed cell death-1 (PD-1) with its ligands (PD-L1 and PD-L2). Experiments using the mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated that the PD-1/PD-Ls interaction contributes to attenuate disease severity. However, the expression and the role of PD-1 and PD-Ls have been partially documented in inflammatory murine models and human CNS data are still incomplete. We determined that primary cultures of human astrocytes, microglia, oligodendrocytes, or neurons expressed low or undetectable PD-L1 levels under basal conditions, but inflammatory cytokines significantly induced such expression, especially on astrocytes and microglia. Blocking PD-L1 expression in astrocytes using specific siRNA in co-culture led to significantly increased CD8 T cell responses (proliferation, cytokines, lytic enzyme). Thus, our results establish that inflamed human glial cells can express sufficient and functional PD-L1 to inhibit CD8 T cell responses. Extensive immunohistochemical analysis of post-mortem brain tissues demonstrated a significantly greater PD-L1 expression in MS lesions compared to control tissues, which co-localized with astrocyte and microglia/macrophage cell markers. However, more than half of infiltrating CD8 T lymphocytes in MS lesions did not express PD-1, the cognate receptor. Similar results were obtained in EAE mice. Even though CNS cells expressed PD-L1 at the peak of the disease, PD-1 intensity on infiltrating T cells decreased throughout EAE disease development. This reduction of PD-1 level on activated T cells prevented these cells to receive PD-L1 inhibitory signal. We also investigated whether human brain endothelial cells (HBECs), which form the blood brain barrier (BBB), can express PD-L1 or PD-L2 and thereby modulate T cells. HBECs expressed PD-L2 under basal conditions, whilst PD-L1 was not detected. Both ligands were up-regulated under inflammatory conditions. Blocking PD-L1 and PD-L2 led to increased transmigration and enhanced responses by human CD8 T cells in co-culture assays. Similarly, PD-L1 and PD-L2 blockade significantly increased CD4 T cell transmigration. Brain endothelium in normal tissues and MS lesions did not express detectable PD-L1; in contrast, all blood vessels in normal brain tissues were PD-L2-positive, while only about 50% expressed PD-L2 in MS lesions. Therefore, our results demonstrate that under basal conditions, PD-L2 expression by HBECs impedes the migration of activated immune T cells through the BBB, and inhibits their activation. However, such impact is impaired in MS lesions due to down-regulation of PD-L2 levels on the endothelium. The majority of infiltrating CD8 T cells is devoid of PD-1, thus insensitive to PD-L1 inhibitory signal providing by CNS cells once they have entered the CNS.

Dans les maladies neurodégénératives comme la sclérose en plaques, la neuro-inflammation modifie l'activité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par des altérations cellulaires et moléculaires complexes. La caractérisation de tels changements moléculaires par une approche d'étiquetage in vivo justifie la recherche d’outils de ciblage fiables et de biomarqueurs. Les stratégies pour définir in vivo ces marqueurs sont cependant compliquées par la pléthore de molécules cibles accessibles, par l’intrication des régions atteintes au sein du tissu sain et par les altérations structurales potentielles des molécules cibles étudiées par histopathologie. Le but de ce travail est de rationaliser la découverte de biomarqueurs des altérations moléculaires dans les tissus par une stratégie de sélection in vivo de répertoires de phages présentant des peptides à leur surface (phage display), les ligands présents dans les deux répertoires (sain et pathologique) étant ensuite soustraits physiquement. Cette stratégie de soustraction (« PhiSSH ») permettant d’enrichir un répertoire en ligands spécifiques est d’un intérêt majeur dans le cas de répertoires complexes tels ceux obtenus dans des sélections in vivo.Nous présentons l'application de cette stratégie dans le modèle de rat de la sclérose en plaques, l’Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), où les lésions disséminées dans le système nerveux central engendrent la sélection d’une grande quantité de clones s’associant au tissu sain, par comparaison avec les rats témoins en bonne santé. L'efficacité de la technique de soustraction a été contrôlée par séquençage massif des trois repertoires, «EAE», «SAIN», et «SOUSTRACTION». Plus de 95 % des clones communs aux répertoires EAE et contrôle sont absents du répertoire de la soustraction. Un ensemble de clones de phages et des peptides synthétisés chimiquement dessinés après l’analyse bioinformatique du répertoire de soustraction a été testé a) sur des tissus de rats EAE et sains et b) sur des cellules humaines en culture (HCMEC/D3) constituant un modèle de BHE, dans des conditions inflammatoires, (activation IL- 1ß) ou non activées. Un des clones et quatre peptide testés ont montré une association spécifique sur les cellules endothéliales de BHE dans des conditions inflammatoires. Pour identifier la cible d’un phage spécifique des lésions neuro-inflammatoires, nous avons mis en œuvre un procédé de création de liaison covalente entre ce phage et les protéines exprimées par des cellules de BHE cultivées en présence d’IL-1ß, puis effectué une analyse par spectométrie de masse. La galectine-1 est apparue comme une cible potential de ce phage. La découverte de biomarqueurs spécifiques de modifications moléculaires et cellulaires de régions inflammatoires disséminées dans les tissus sains, comme c’est le cas dans la plupart des pathologies présentant une activité neuro–inflammatoire, sera facilitée par l’utilisation de la stratégie de soustraction PhiSSH décrite dans ce document. / In neurodegenerative disorders like multiple sclerosis, neuroinflammation modifies the blood brain barrier (BBB) status by causing complex cellular and molecular alterations. Characterization of such molecular changes by an in vivo labeling approach is most challenging to generate reliable in vivo targeting tools and biomarkers. In vivo strategies to define such markers are, however, hampered by the plethora of the accessible target molecules, the vicinity of diseased target expression among healthy tissue and the potentially structural alterations of target molecules when studied by histopathology. The aim of this work is to streamline the biomarker discovery of pathological molecular tissue alterations by in vivo selection of phage displayed peptide repertoires that are further submitted to physical DNA subtraction (“PhiSSH”) of sequences encoding common peptides in both repertoires (HEALTHY and PATHOLOGY). The strategy of Subtraction allows thus the enrichment of clones specific for one repertoire and is of particular interest for complex repertoires produced by in vivo selection. We present the application of this strategy in the multiple sclerosis rat model, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) pathology, where target lesions are disseminated in the central nervous system (CNS) generating a large amount of clones binding to healthy tissue among the recovered repertoire clones binding to the lesions by comparison with healthy control rats. The efficiency of the subtraction was monitored by massive sequencing of the three repertoires, «EAE», «HEALTHY», and «SUBTRACTION». More than 95% of the clones common to EAE and Healthy repertoires were shown to be absent from the Subtraction repertoire. A set of randomly chosen clones and synthesized peptides from the EAE and subtraction repertoires were tested for differential labeling of a) diseased and healthy animal tissues and b) an in vitro BBB model, in IL-1ß challenged and resting control state culture human cells (hCMEC/D3). One of the phage clones and 4 chemically synthesized peptides showed specific binding to brain ECs in neuro-inflammatory conditions. Using a strategy of crosslinking of an EAE specific phage clone on protein targets expressed by IL-1ß activated ECs followed by mass spectrometry, we propose hypothetically Galectin-1 as a possible target of this phage. PhiSSH will be useful for in vivo screening of small peptide combinatorial libraries for the discovery of biomarkers specific of molecular and cellular alterations untangled with healthy tissues, as in most pathologies presenting neuroinflammatory activity.

L'interleukine-15 (IL-15) contribue au développement et à l’activation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclérose en plaques. Des niveaux élevés de l'IL-15 ont été trouvés chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux témoins, mais aucune étude n'a examiné les effets de tels niveaux élevés sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre étude étaient 1- de caractériser l’expression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de déterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- d’évaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modèles murins de la sclérose en plaques. Nous avons établi que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite à une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont été significativement augmentées lors des co-cultures avec des cellules B alloréactives exprimant l'IL-15. Dans les modèles murins de la sclérose en plaques, nous avons détecté au sein du système nerveux central des cellules immunes exprimant l’IL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le récepteur pour cette cytokine à différents stades de la maladie. Nous avons démontré que les cellules B modulent des réponses des lymphocytes T CD8 via l’IL-15, ce qui suggère un rôle pour les cellules B dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Nous avons aussi mis en évidence la présence de cellules exprimant l’IL-15 dans le système nerveux central dans des modèles murins de cette maladie. / Interleukin-15 is a cytokine involved in the homeostatic proliferation and maintenance of CD8 T cells. Activated CD8 T cells are implicated in several autoimmune diseases, including Multiple Sclerosis (MS). Elevated levels of IL-15 have been reported in serum and on peripheral leukocytes of MS patients relative to controls, yet no study has addressed the effects of elevated IL-15 levels on CD8 T cells. To study the in vivo effects of any molecule, the animal model for MS, EAE, is used; the expression of IL-15 during the EAE disease course has not yet been elucidated. Thus the goals of our study were to characterize surface IL-15 expression on human B lymphocytes and determine the effects on human CD8 T cell functions; and to assess the in vivo expression of IL-15 in MS mouse models. We found that B cells are capable of up-regulating the expression of surface IL-15 upon CD40 stimulation, and CD8 T cell effector functions were significantly enhanced upon co-culture with alloreactive IL-15-expressing B cells. In the MS mouse models we used, we found IL-15-expressing immune cells present within the central nervous system (CNS) at various points of disease, and that CNS-infiltrating CD8 T cells were potentially responsive to IL-15. Here, we not only demonstrate the modulation of CD8 T cell responses by IL-15 presented by B cells, implying a role for B cells in MS pathogenesis, but also show the presence of IL-15-expressing cells within the inflamed CNS of EAE.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Responses of activated T cells are suppressed upon engagement of the receptor programmed cell death-1 (PD-1) with its ligands (PD-L1 and PD-L2). Experiments using the mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated that the PD-1/PD-Ls interaction contributes to attenuate disease severity. However, the expression and the role of PD-1 and PD-Ls have been partially documented in inflammatory murine models and human CNS data are still incomplete. We determined that primary cultures of human astrocytes, microglia, oligodendrocytes, or neurons expressed low or undetectable PD-L1 levels under basal conditions, but inflammatory cytokines significantly induced such expression, especially on astrocytes and microglia. Blocking PD-L1 expression in astrocytes using specific siRNA in co-culture led to significantly increased CD8 T cell responses (proliferation, cytokines, lytic enzyme). Thus, our results establish that inflamed human glial cells can express sufficient and functional PD-L1 to inhibit CD8 T cell responses. Extensive immunohistochemical analysis of post-mortem brain tissues demonstrated a significantly greater PD-L1 expression in MS lesions compared to control tissues, which co-localized with astrocyte and microglia/macrophage cell markers. However, more than half of infiltrating CD8 T lymphocytes in MS lesions did not express PD-1, the cognate receptor. Similar results were obtained in EAE mice. Even though CNS cells expressed PD-L1 at the peak of the disease, PD-1 intensity on infiltrating T cells decreased throughout EAE disease development. This reduction of PD-1 level on activated T cells prevented these cells to receive PD-L1 inhibitory signal. We also investigated whether human brain endothelial cells (HBECs), which form the blood brain barrier (BBB), can express PD-L1 or PD-L2 and thereby modulate T cells. HBECs expressed PD-L2 under basal conditions, whilst PD-L1 was not detected. Both ligands were up-regulated under inflammatory conditions. Blocking PD-L1 and PD-L2 led to increased transmigration and enhanced responses by human CD8 T cells in co-culture assays. Similarly, PD-L1 and PD-L2 blockade significantly increased CD4 T cell transmigration. Brain endothelium in normal tissues and MS lesions did not express detectable PD-L1; in contrast, all blood vessels in normal brain tissues were PD-L2-positive, while only about 50% expressed PD-L2 in MS lesions. Therefore, our results demonstrate that under basal conditions, PD-L2 expression by HBECs impedes the migration of activated immune T cells through the BBB, and inhibits their activation. However, such impact is impaired in MS lesions due to down-regulation of PD-L2 levels on the endothelium. The majority of infiltrating CD8 T cells is devoid of PD-1, thus insensitive to PD-L1 inhibitory signal providing by CNS cells once they have entered the CNS.