Espécies de Phytophthora tem se destacado ao longo da história devido ao seu potencial destrutivo, se iniciando com a devastadora P. infestans na Irlanda e se estende até os dias de hoje com P. nicotianae em citros e P. plurivora em faia. Uma característica importante deste grupo de patógenos é que as medidas de controle da doença se baseiam na prevenção da entrada do patógeno na área visto que, uma vez instalado, o produtor precisa conviver com o mesmo, pois não se dispõem de métodos efetivos de controle. Neste sentido, a busca por métodos de controle torna-se primordial. O endofítico radicular Piriformospora indica, tem-se destacado em vários patossistemas devido a sua habilidade de induzir resistência contra patógenos, aumentar a tolerância à estresses abióticos e promover o crescimento de plantas. Taxtomina A, produzida por Streptomyces scabies, é capaz de ativar mecanismos de defesa de plantas, os quais são efetivos contra agentes patogênicos. Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito de P. indica e da taxtomina A sobre P. nicotianae em citros e P. plurivora em faia. Ambos foram avaliados quanto ao seu efeito direto sobre os patógenos em questão. O indutor de defesa vegetal Bion® foi utilizado em alguns ensaios para fins de comparação. Plântulas de citros e faia foram tratadas com concentrações crescentes de taxtomina e parâmetros fisiológicos, bioquímicos e de controle da doença foram avaliados. Taxtomina A não apresenta efeito direto sobre os patógenos avaliados. Os dados de incidência da doença em plântulas de faia tratadas com taxtomina A nas concentrações de 10, 25, 50 e 100 μg se mostraram consistentes com a quantidade de DNA do patógeno no sistema radicular, demonstrando que, aparentemente, a toxina induziu suscetibilidade nas plântulas de faia. Em citros, para os parâmetros fisiológicos e bioquímicos avaliados, em linhas gerais, a taxtomina A nas concentrações de 50 e 100 μg demonstrou potencial de aplicação no patossistema citros - P. nicotianae. Quando avaliada a mortalidade de plantas inoculadas com o patógeno e tratadas com taxtomina, bem como, quando quantificado o DNA do oomiceto no sistema radicular, as referidas concentrações também apresentaram os melhores desempenhos. Plântulas das mesmas espécies foram submetidas a inoculação com P. indica, sendo avaliados os efeitos na promoção de crescimento, na atividade de enzimas e de genes relacionados ao processo de defesa, bem como, no controle da doença. Não foi observado efeito direto do endofítico radicular sobre os patógenos avaliados. Quando plântulas de citros foram inoculadas com P. indica e depois com P. nicotianae, não foi observada promoção de crescimento e controle da doença. As análises histológicas e moleculares demonstraram a presença do endofítico no sistema radicular de plântulas de citros e faia. Análises bioquímicas revelaram apenas aumentos pontuais no teor de proteínas e na atividade da β-1,3-glucanase e da peroxidase no tratamento com P. indica + P. nicotianae. Os genes PR-1.4, PR-1.8, PR-β-glucosidase e Hsp70 foram induzidos em plântulas inoculadas com P. indica e com o patógeno, bem como no tratamento com Bion® e patógeno, porém em menor magnitude. O endofítico P. indica ativa o sistema de defesa de plântulas de citros, no entanto, os mecanismos ativados não são efetivos para o controle da doença na interação citros - P. nicotianae. / Phytophthora species has been important throughout history because of its destructive potential, starting with the devastating P. infestans in potatos in Ireland and extending to the present day with Phytophthora nicotianae on citrus and Phytophthora plurivora on beech. An important feature of this group of pathogens is that the disease control measures are based upon prevention of pathogen entry into the area since, once installed, producers have to live with it, because they do not have effective methods of control. Accordingly, the search for control methods becomes essential. The root endophytic fungus Piriformospora indica has been shown to induce resistance against pathogens, increase tolerance to abiotic stresses and promote the growth of plants. On the other hand, the phytotoxin thaxtomin A, produced by Streptomyces scabies, is able to activate plant defense mechanisms, which are effective against pathogens. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of P. indica and thaxtomin A on the control of P. nicotianae on citrus and P. plurivora on beech. Both were assessed for their direct effect on these pathogens. The plant defense inducer Bion® was used in some tests for comparison. Besides that, seedlings of citrus or beech were treated with P. indica or increasing concentrations of thaxtomin and physiological / biochemical parameters as well as those related to induction of resistance and disease control were evaluated. The results showed that thaxtomin A did no exhibit any direct effect on the pathogens. The incidence of disease on beech seedlings treated with thaxtomin A, in concentrations of 10, 25, 50 and 100 ug, were consistent with the amount of DNA of the pathogen in the root tissue, demonstrating that, apparently, the toxin induced susceptibility in the seedlings. In citrus, for the physiological and biochemical parameters evaluated, in general, the thaxtomin in the concentrations of 50 and 100 ug showed potential for application in the citrus pathosystem - P. nicotianae. When the mortality of the seedlings treated with thaxtomin and inoculated with the pathogen as well as the oomycete DNA amount in the root system were evaluated these concentrations also had the best performances. As mentioned above, seedlings of beech or citrus were also inoculated with the endophyte and its effect on growth promotion, enzyme activities, the expression of genes related to defense process and on disease control was measured. There was no direct effect of the root endophyte on the pathogens. When citrus seedlings were inoculated with P. indica and then with P. nicotianae, there was no growth promotion or disease control. Histological and molecular analysis showed the presence of the endophytic fungus inside the root system of citrus and beech seedlings. Biochemical analyzes revealed only occasional increases in protein content and the activities of β-1,3-glucanase and peroxidase in the treatment with P. indica + P. nicotianae in citrus seedlings. The genes PR-1.4, PR- 1.8, PR-β-glucosidase and Hsp70 were induced in seedlings inoculated with P. indica and challenged with the pathogen as well as in the treatment with the resistance inducer Bion® plus pathogen, but to a lesser magnitude. Finally, the endophytic P. indica is able to active defense system in citrus, however, the activated mechanisms seems not to be effective in controlling the disease in the interaction citrus - P. nicotianae.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

Bactérias do gênero Methylobacterium são encontradas em associação com espécies vegetais, onde são capazes de promover o crescimento, aumentar a atividade fotossintética e reduzir o ataque de patógenos ao hospedeiro. Além de conferir estas vantagens para a planta hospedeira, estas bactérias podem também produzir biopolímeros (PHA e PHB). Desta forma, o objetivo deste trabalho foi anotar o genoma de Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 e avaliar o seu transcriptoma em estágios iniciais de interação com Citrus sinensis. A análise do genoma mostrou que SR1.6/6 pode produzir auxina, reduzir o estresse da planta alterando os níveis de etileno, apresenta sistema de monitoramento de populacional pelo sistema quorum sensing (QS) e um metabolismo metilotrófico completo. A análise do transcriptoma evidenciou que os exsudatos radiculares de C. sinensis induzem a expressão de genes de resposta ao estresse oxidativo, seguido da indução de genes de adesão e biofilme durante a colonização da planta hospedeira. A interação entre M. mesophilicum SR1.6/6 e a planta hospedeira envolve mecanismos de reconhecimento e adaptação ao estresse, antes mesmo de ocorrer o primeiro contato físico entre a célula bacteriana e a planta hospedeira, seguido da indução de genes de biofilme bacteriano. Além disso, foi estudada uma metodologia para a realização de mutações genéticas em Methylobacterium spp. que permitirá a obtenção de mutantes relacionados com a interação com a planta. / Methylobacterium genus are found in association with plant species, where they are able to promote plant growth, increase the photosynthetic activity and reduce the incidence of pathogens to the host. In addition to providing these benefits to the host plant, these bacteria can also produce biopolymers (PHA and PHB). Thus, the aim was to annotate the genome of Methylobacterium mesophilicum SR1.6 / 6 and assess their transcriptome in the early stages of interaction with Citrus sinensis. Genome analysis showed that SR1.6 / 6 can produce auxin, reduce plant stress by altering ethylene levels, presents population monitoring system (QS) and a complete methylotrophic metabolism. The transcriptomic analysis showed that C. sinensis exudates induce the expression of genes related to oxidative stress followed by induction of adhesion and biofilm genes during colonization of the host plant. The interaction between M. mesophilicum SR1.6 / 6 and the host plant involves recognition mechanisms and adaptation to stress, even before the first physical contact occurs between the bacterial cell and the host plant, followed by the induction of bacterial biofilm genes. Furthermore, a method has been studied for carrying genetic mutations in Methylobacterium spp. allowing the obtaining of mutants related to interaction with the plant.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CorrelacaoMetalobicaFungos.pdf: 2029628 bytes, checksum: 8feab0d533f4d04b3afb09538d403b20 (MD5) Previous issue date: 2016-06-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os fungos endofíticos são uma fonte promissora de metabólitos secundários com aplicações biotecnológicas. Esses micro-organismos habitam o interior dos tecidos vegetais sem causar nenhum dano ao hospedeiro e como fruto dessa interação podem produzir algumas das substâncias sintetizadas pelas plantas hospedeiras. Neste contexto o uso de fungos endofíticos como fonte de biomoléculas em substituição as de planta representa vantagens econômicas e ambientais. Espécies da família Amaryllidaceae produzem alcaloides e outros metabólitos com atividades biológicas. Entre estas espécies destacam-se Crinum americanum L. E Hymenocallis littoralis (Jacq.) Salisb. No entanto, não há dados sobre fungos endofíticos de espécies da família. Diante dos exposto o objetivo deste trabalho foi investigar o potencial biotecnológico de fungos endofíticos de C. americanum e H. littoralis em comparação com as plantas hospedeiras e estudar a interação entre endofíticos e a planta hospedeira. Como resultados foram isolados 94 fungos endofíticos das duas espécies de Amaryllidaceae investigadas, dos quais 49 foram identificados e pertencem aos gêneros Colettotrichum, Acremonium, Trichoderma e Fusarium. Constatou-se que do total das linhagens analisadas 56 apresentaram lipídios em seus extratos, 21 cumarinas, 29 anronas e 2 apresentaram alcaloides. Foram selecionadas 12 linhagens de fungos endofíticos que apresentaram os melhores resultados na detecção de classes de metabólitos e os extratos foram analisados por Cromatografia em Camada Delgada e por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas em comparação com os extratos metanólicos das plantas hospedeiras. Constatou-se a correlação ente as classes de metabólitos detectados nos extratos dos fungos endofíticos e das plantas hospedeiras, indicando que estes micro-organismos são capazes de produzir algumas das mesmas substâncias que as plantas hospedeiras e a avaliação da atividade antimicrobiana destacou alguns extratos com atividade contra Candida parapsilosis. O extrato metanólico das folhas de H. littoralis e do fungo endofítico MIBA 0796 apresentaram os resultados mais relevantes com percentual de inibição acima de 60% contra a levedura. Com o estudo da interação entre fungos endofíticos de C. americanum e a planta hospedeira pode-se constatar que os micro-organismos ocorrem no interior das células vegetais e em condições favoráveis se desenvolveram e ocuparam também os espaços intercelulares. Esta localização dos endofíticos nos tecidos vegetais pode facilitar a troca de material genético entre o vegetal e os micro-organismos o que explicaria a correlação metabólica constatada nesta pesquisa. / The endophytic fungi are a promising source of secondary metabolites with biotechnological applications. These microorganisms inhabit the interior of plant tissues without causing any damage to the host and as a result of this interaction can produce some of the substances synthesized by the host plant. In this context the use of endophytic fungi as a source of biomolecules in the replacement of plant represents economic and environmental advantages. Species in the Amaryllidaceae family produce alkaloids and other metabolites with biological activities. Among these species include Crinum americanum L. and Hymenocallis littoralis (Jacq.) Salisb. However, no data on endophytic fungi from species of the family were found. In the view of the above stated the aim of this work was to scrutinize the biotechnological potential of endophytes of C. americanum and H. littoralis as compared to host plants and to study the interactions between endophytes and host plant. As results 94 endophytic fungi were isolated from two species of the investigated Amaryllidaceae, of which 49 were identified and belonging to the Colettotrichum class, Acremonium, Trichoderma and Fusarium. It was noted that of the total strains tested 56 showed lipids in its extracts, 21coumarins, 29 anthrones and 2 showed alkaloids. 12 strains of endophytic fungi were selected which presented the best results in the detection of classes of metabolites and the extracts were analyzed by Thin-layer chromatography and by Gas chromatography-mass spectrometry in comparison with the methanolic extracts of host plants. It was noted the correlation between the classes of metabolites detected in extracts of the endophytic fungi and host plants, indicating that these micro-organisms are able to produce some of the same substances that the host plants and the assessment of antimicrobial activity highlighted some extracts with activity against Candida parapsilosis. The methanolic extract of leaves of H. littoralis and endophytic fungus MIBA 0796 presented the most relevant outcomes with percentage of inhibition above 60% against yeast. With the study of the interaction between C. americanum endophytes and the host plant it can observe that microorganisms act within the plant cells and in favorable conditions develop and occupy intercellular spaces as well. This location of the Endophytes in plant tissues may facilitate the exchange of genetic material between plants and microorganisms explaining how metabolic correlation found in this research.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 577759 bytes, checksum: 8b7270200348b4cbbdc4f40d5e821098 (MD5) Previous issue date: 2010-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed to study the diversity of endophytic bacteria associated to Coffea arabica L. fruit during their development. Seven monthly collections were conducted, following coffee fruit development in homogeneous stand of Catuai Vermelho coffee cultivar plantation. Each sample was processed according to protocol aiming to obtain total DNA from the endophytic bacterial community, associated to each stage of fruit development. The strategy of rDNA16S amplification through the Nested-PCR technique and DGGE discrimination were applied. The total population of endophytic bacteria and the phylos Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria (alpha, beta and gamma classes) were investigated. The analysis of each gel, representing the evolution of a population along time, was carried out using the program Bionumerics®. The existence of endophytic bacteria associated to coffee fruit since the first month of their development was confirmed, by using the universal primer for Eubacteria. Based on the similarity between the distribution pattern of the OTUs on the rays representing the two final months of fruit development, it was inferred that the populations tend to stabilize. Less similarity between the endophytic populations, present in the different phases of fruit development, was confirmed in the phylo Firmicutes, while the beta-Proteobacteria displayed greater similarity among the different phases of fruit development. Amplification of the rDNA by Nested PCR and DGGE discrimination were found to be adequate to distinguish the alteration dynamics among the phylo populations and the bacterial classes studied. / Neste trabalho foi estudada a diversidade de bactérias endofíticas associadas a frutos de Coffea arabica L. durante o seu desenvolvimento. Foram realizadas sete coletas mensais, acompanhando o desenvolvimento dos frutos em cafeeiros de um talhão homogêneo de lavoura do cultivar Catuaí Vermelho. Cada amostra foi processada seguindo protocolo para obter o DNA total da comunidade bacteriana endofítica, associada a cada estádio de desenvolvimento do fruto. Foi empregada a estratégia de amplificação do rDNA16S pela técnica de Nested-PCR e discriminação em DGGE. A população total de bactérias endofíticas e os filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria (classes alfa, beta e gama) foram investigados. A análise de cada gel, representando a evolução de uma população ao longo do tempo, foi realizada empregando o programa Bionumerics®. Demonstrou-se a existência de populações de bactérias endofíticas associadas aos frutos de café desde o primeiro mês de seu desenvolvimento, com emprego do primer universal para Eubacteria. Pela maior similaridade entre o padrão de distribuição das UTOs nas raias que representam os dois meses finais de desenvolvimento dos frutos inferiu-se que as populações tendem para a estabilização. A menor similaridade entre as populações endofíticas, presentes nas diferentes fases de desenvolvimento dos frutos, foi constatada no filo Firmicutes, enquanto as beta- Proteobacteria exibiram maior similaridade entre as diferentes fases de desenvolvimento dos frutos. A amplificação do rDNA por Nested PCR e discriminação em DGGE mostrou-se adequada para a distinção da dinâmica de alterações nas populações entre os filos e as classes de bactérias estudadas.

Bactérias endofíticas provavelmente desenvolveram uma relação com planta hospedeira através de processos coevolucionários, podendo influenciar de alguma forma na fisiologia da planta. Na literatura, há muitos relatos sobre espécies de Bacillus endofíticos, no entanto, poucos se referem a espécie B. thuringiensis (Bt). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi isolar, identificar e caracterizar Bt de mandioca. Todos os isolados identificados como Bt produziram cristais pontuais e apenas um isolado, IIRAC22, produziu cristais amorfos maiores. Esse isolado apresentou genes cry4A, cry4B e cry10 e toxicidade a larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, evidenciando ser Bt var. israelensis. Todos os isolados produziram quitinase, sugerindo que elas podem ter ação controladora sobre fungos fitopatogênicos e insetos. Houve também produção de pectinase, enzimas envolvidas na penetração de planta hospedeira e estabelecimento como endófito. Esses Bt endofíticos podem levar ao desenvolvimento de produtos biotecnológicos para controle de insetos. / Endophytic bacteria probably developed a relationship with their plant host through coevoltionary processes what could influence in the physiology of the plant. In the literature, there are many reports about endophytic Bacillus species, however, few reports cite endophytic B. thuringiensis (Bt). Thus, the aim of the present work was to isolate, identify and characterize Bt from cassava. All the isolates identified as Bt were able to produce punctual crystals, but only one isolate, IIRAC22, produced large amorphous crystals. This isolate presented cry4A, cry4B and cry10 genes and toxicity against larvae of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus, evidencing to be Bt var. israelensis. All the isolates produced quitinase, suggesting that they can control phytopathogeni fungi and insects. There was also pectinase production, enzyme involved in the penetration of plant hosts and establishment as endophytes. These endophytic Bt can take to the development of biotechnological products for the control of insect.

Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

Espécies de Phytophthora tem se destacado ao longo da história devido ao seu potencial destrutivo, se iniciando com a devastadora P. infestans na Irlanda e se estende até os dias de hoje com P. nicotianae em citros e P. plurivora em faia. Uma característica importante deste grupo de patógenos é que as medidas de controle da doença se baseiam na prevenção da entrada do patógeno na área visto que, uma vez instalado, o produtor precisa conviver com o mesmo, pois não se dispõem de métodos efetivos de controle. Neste sentido, a busca por métodos de controle torna-se primordial. O endofítico radicular Piriformospora indica, tem-se destacado em vários patossistemas devido a sua habilidade de induzir resistência contra patógenos, aumentar a tolerância à estresses abióticos e promover o crescimento de plantas. Taxtomina A, produzida por Streptomyces scabies, é capaz de ativar mecanismos de defesa de plantas, os quais são efetivos contra agentes patogênicos. Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito de P. indica e da taxtomina A sobre P. nicotianae em citros e P. plurivora em faia. Ambos foram avaliados quanto ao seu efeito direto sobre os patógenos em questão. O indutor de defesa vegetal Bion® foi utilizado em alguns ensaios para fins de comparação. Plântulas de citros e faia foram tratadas com concentrações crescentes de taxtomina e parâmetros fisiológicos, bioquímicos e de controle da doença foram avaliados. Taxtomina A não apresenta efeito direto sobre os patógenos avaliados. Os dados de incidência da doença em plântulas de faia tratadas com taxtomina A nas concentrações de 10, 25, 50 e 100 μg se mostraram consistentes com a quantidade de DNA do patógeno no sistema radicular, demonstrando que, aparentemente, a toxina induziu suscetibilidade nas plântulas de faia. Em citros, para os parâmetros fisiológicos e bioquímicos avaliados, em linhas gerais, a taxtomina A nas concentrações de 50 e 100 μg demonstrou potencial de aplicação no patossistema citros - P. nicotianae. Quando avaliada a mortalidade de plantas inoculadas com o patógeno e tratadas com taxtomina, bem como, quando quantificado o DNA do oomiceto no sistema radicular, as referidas concentrações também apresentaram os melhores desempenhos. Plântulas das mesmas espécies foram submetidas a inoculação com P. indica, sendo avaliados os efeitos na promoção de crescimento, na atividade de enzimas e de genes relacionados ao processo de defesa, bem como, no controle da doença. Não foi observado efeito direto do endofítico radicular sobre os patógenos avaliados. Quando plântulas de citros foram inoculadas com P. indica e depois com P. nicotianae, não foi observada promoção de crescimento e controle da doença. As análises histológicas e moleculares demonstraram a presença do endofítico no sistema radicular de plântulas de citros e faia. Análises bioquímicas revelaram apenas aumentos pontuais no teor de proteínas e na atividade da β-1,3-glucanase e da peroxidase no tratamento com P. indica + P. nicotianae. Os genes PR-1.4, PR-1.8, PR-β-glucosidase e Hsp70 foram induzidos em plântulas inoculadas com P. indica e com o patógeno, bem como no tratamento com Bion® e patógeno, porém em menor magnitude. O endofítico P. indica ativa o sistema de defesa de plântulas de citros, no entanto, os mecanismos ativados não são efetivos para o controle da doença na interação citros - P. nicotianae. / Phytophthora species has been important throughout history because of its destructive potential, starting with the devastating P. infestans in potatos in Ireland and extending to the present day with Phytophthora nicotianae on citrus and Phytophthora plurivora on beech. An important feature of this group of pathogens is that the disease control measures are based upon prevention of pathogen entry into the area since, once installed, producers have to live with it, because they do not have effective methods of control. Accordingly, the search for control methods becomes essential. The root endophytic fungus Piriformospora indica has been shown to induce resistance against pathogens, increase tolerance to abiotic stresses and promote the growth of plants. On the other hand, the phytotoxin thaxtomin A, produced by Streptomyces scabies, is able to activate plant defense mechanisms, which are effective against pathogens. Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of P. indica and thaxtomin A on the control of P. nicotianae on citrus and P. plurivora on beech. Both were assessed for their direct effect on these pathogens. The plant defense inducer Bion® was used in some tests for comparison. Besides that, seedlings of citrus or beech were treated with P. indica or increasing concentrations of thaxtomin and physiological / biochemical parameters as well as those related to induction of resistance and disease control were evaluated. The results showed that thaxtomin A did no exhibit any direct effect on the pathogens. The incidence of disease on beech seedlings treated with thaxtomin A, in concentrations of 10, 25, 50 and 100 ug, were consistent with the amount of DNA of the pathogen in the root tissue, demonstrating that, apparently, the toxin induced susceptibility in the seedlings. In citrus, for the physiological and biochemical parameters evaluated, in general, the thaxtomin in the concentrations of 50 and 100 ug showed potential for application in the citrus pathosystem - P. nicotianae. When the mortality of the seedlings treated with thaxtomin and inoculated with the pathogen as well as the oomycete DNA amount in the root system were evaluated these concentrations also had the best performances. As mentioned above, seedlings of beech or citrus were also inoculated with the endophyte and its effect on growth promotion, enzyme activities, the expression of genes related to defense process and on disease control was measured. There was no direct effect of the root endophyte on the pathogens. When citrus seedlings were inoculated with P. indica and then with P. nicotianae, there was no growth promotion or disease control. Histological and molecular analysis showed the presence of the endophytic fungus inside the root system of citrus and beech seedlings. Biochemical analyzes revealed only occasional increases in protein content and the activities of β-1,3-glucanase and peroxidase in the treatment with P. indica + P. nicotianae in citrus seedlings. The genes PR-1.4, PR- 1.8, PR-β-glucosidase and Hsp70 were induced in seedlings inoculated with P. indica and challenged with the pathogen as well as in the treatment with the resistance inducer Bion® plus pathogen, but to a lesser magnitude. Finally, the endophytic P. indica is able to active defense system in citrus, however, the activated mechanisms seems not to be effective in controlling the disease in the interaction citrus - P. nicotianae.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

Bactérias do gênero Methylobacterium são encontradas em associação com espécies vegetais, onde são capazes de promover o crescimento, aumentar a atividade fotossintética e reduzir o ataque de patógenos ao hospedeiro. Além de conferir estas vantagens para a planta hospedeira, estas bactérias podem também produzir biopolímeros (PHA e PHB). Desta forma, o objetivo deste trabalho foi anotar o genoma de Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 e avaliar o seu transcriptoma em estágios iniciais de interação com Citrus sinensis. A análise do genoma mostrou que SR1.6/6 pode produzir auxina, reduzir o estresse da planta alterando os níveis de etileno, apresenta sistema de monitoramento de populacional pelo sistema quorum sensing (QS) e um metabolismo metilotrófico completo. A análise do transcriptoma evidenciou que os exsudatos radiculares de C. sinensis induzem a expressão de genes de resposta ao estresse oxidativo, seguido da indução de genes de adesão e biofilme durante a colonização da planta hospedeira. A interação entre M. mesophilicum SR1.6/6 e a planta hospedeira envolve mecanismos de reconhecimento e adaptação ao estresse, antes mesmo de ocorrer o primeiro contato físico entre a célula bacteriana e a planta hospedeira, seguido da indução de genes de biofilme bacteriano. Além disso, foi estudada uma metodologia para a realização de mutações genéticas em Methylobacterium spp. que permitirá a obtenção de mutantes relacionados com a interação com a planta. / Methylobacterium genus are found in association with plant species, where they are able to promote plant growth, increase the photosynthetic activity and reduce the incidence of pathogens to the host. In addition to providing these benefits to the host plant, these bacteria can also produce biopolymers (PHA and PHB). Thus, the aim was to annotate the genome of Methylobacterium mesophilicum SR1.6 / 6 and assess their transcriptome in the early stages of interaction with Citrus sinensis. Genome analysis showed that SR1.6 / 6 can produce auxin, reduce plant stress by altering ethylene levels, presents population monitoring system (QS) and a complete methylotrophic metabolism. The transcriptomic analysis showed that C. sinensis exudates induce the expression of genes related to oxidative stress followed by induction of adhesion and biofilm genes during colonization of the host plant. The interaction between M. mesophilicum SR1.6 / 6 and the host plant involves recognition mechanisms and adaptation to stress, even before the first physical contact occurs between the bacterial cell and the host plant, followed by the induction of bacterial biofilm genes. Furthermore, a method has been studied for carrying genetic mutations in Methylobacterium spp. allowing the obtaining of mutants related to interaction with the plant.