Introdução: A nefropatia diabética (ND) é uma das principais complicações crônicas do diabete melito (DM), sendo que cerca de 25 a 40% dos pacientes com DM tipo 1 e 20 a 50% dos pacientes com DM tipo 2 desenvolvem ND ao longo da vida, dependendo da origem étnica. Estudos de agregação familiar mostram uma importante concordância para o desenvolvimento de ND em algumas famílias e reforçam a hipótese de que existem fatores genéticos envolvidos na sua patogênese. O sistema endotelina tem sido relacionado na patogênese da hipertensão arterial e desordens renais. A endotelina-1 (ET-1) regula a vasoconstrição e proliferação celular nos tecidos através da ativação do receptor tipo A (ETRA). Em tecidos de rins normais, ET-1 e ETRA estão mais expressos em vasos e em menor intensidade no glomérulo. Em modelos animais com DM, a expressão de ET-1 é cinco vezes maior, sugerindo uma potencial associação entre o sistema endotelina e ND. No presente estudo, avaliamos a associação de polimorfismos do gene da ET-1 (EDN1) e ETRA (EDNRA) com a ND em pacientes com DM tipo 2 e a expressão da ET-1 e ETRA em biópsias de rins de pacientes com ND, Nefropatia por IgA e tecido de rins normais. Materiais e Métodos: O estudo de genética, um estudo caso controle a partir de um estudo transversal, com 548 pacientes brancos com DM tipo 2. Os casos foram considerados pacientes com proteinúria (excreção urinária de albumina (EUA) > 200 mg/min ou 174 mg/24h, em coleta de 24h ou em amostra de urina respectivamente) ou em diálise e controles pacientes com normoalbuminúria (EUA < 20mg/min ou < 17 mg/l) e DM tipo 2 por mais de 5 anos. Foram genotipados dois polimorfismos (SNP) do gene da EDN1 (rs1800541 or T- 1370G; rs57072783 or Lys198Asn) e cinco do gene do EDNRA (rs6842241; rs4835083; rs4639051; rs5333 and rs5343). A análise de haplótipos foi realizada através do programa PHASE versão 2.1. A frequência dos alelos, genótipos e haplótipos foi comparada entre casos e controles. O equilíbrio de Hardy-Weinberg de cada SNP foi testado através do teste do c² de Pearson. No estudo de imunohistoquimica, analisamos a expressão da ET-1 e ETRA em treze biópsias de pacientes com DM tipo 2 e ND, dez biópsias de pacientes proteinúricos por Nefropatia por IgA e treze amostras de tecido de rim normal que realizaram nefrectomia por tumor. Resultados: Considerando um modelo dominante, a presença do alelo T do rs57072783 (TT/TG vs. GG) foi protetor contra DN (OR = 0.69; IC 95% 0.48-0.99, P = 0.049), enquanto a presença do alelo G do rs1800541 (GG/GT vs. TT) foi associado com OR = 0.60 (IC 95% 0.41-0.88, P=0.009). Entretanto na análise multivariada, somente o genótipo GG/GT do rs1800541 permaneceu com associação independente com a ND (P = 0.046). A expressão da ET-1 em biópsias de pacientes com ND e Nefropatia por IgA estava aumentada nas células endoteliais de capilares glomerulares e capilares peri tubulares quando comparado com controles (P = 0,001). A expressão do ETRA também foi mais intensa na ND e Nefropatia por IgA em relação aos controles (P = 0,019). Pacientes com mais altos níveis de proteinúria tiveram maior expressão do ET-1 mas não do ETRA. Conclusão: Neste estudo mostramos que SNPs do gene da EDN1 podem estar associados com aumentado risco para ND em pacientes brancos com DM tipo 2. Também observamos uma maior expressão da ET-1 e do ETRA em pacientes com ND e Nefropatia por IgA, sugerindo um potencial papel do sistema endotelina na ND e provavelmente em outras doenças glomerulares não relacionadas ao DM.

Introdução: Os fitoesteróis são indicados no tratamento da hipercolesterolemia. Embora sua ação sobre a redução do colesterol já tenha sido exaustivamente estudada, não se encontra bem elucidada na literatura, a forma como atua sobre biomarcadores inflamatórios e endoteliais em indivíduos hipercolesterolêmicos. Objetivo: Avaliar o efeito do fitoesterol adicionado ao leite de soja sobre as concentrações plasmáticas de lípides e biomarcadores, além de alterações em vias transcricionais envolvidos na patogênese da aterosclerose em células linfomononucleares em indivíduos moderadamente hipercolesterolêmicos. Metodologia: Foram estudados 38 pacientes, recrutados no Ambulatório do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Inicialmente, os pacientes foram submetidos a um período basal de três semanas para avaliar a aderência e tolerabilidade ao leite de soja padrão (Placebo). Foram orientados a manter os hábitos alimentares e a atividade física. Receberam 400 mL/dia de leite de soja padrão ou enriquecido com fitoesteróis (1,6 g/dia) por dois períodos de quatro semanas em que o estudo foi randomizado, cego e cruzado. Resultados: O peso corporal foi mantido durante o estudo. O tratamento com fitoesterol reduziu o colesterol total em 5,5 % (P<0,001), a lipoproteína de baixa densidade (LDL) em 6,4 % e os triglicérides em 8,3 % (P<0,05) e aumentaram as concentrações de campesterol e sitosterol no plasma em 18,9% e 21,6%, respectivamente. Não houve alteração nos valores de lipoproteína de alta densidade (HDL). Com relação aos biomarcadores de aterosclerose, os fitoesteróis provocaram redução apenas na endotelina-1 em 11 % (P<0,05). Esta ação foi independente da redução do LDL-C. Não houve alteração no RNAm para 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A redutase e receptor de LDL. Conclusão: Os fitoesteróis são eficientes na redução da concentração plasmática do colesterol total, triglicérides, LDL-C e da endotelina-1, sendo esta última independente da redução do colesterol / Background: Phytosterols are recommended in the treatment of moderate hypercholesterolemia. Although their mechanisms of action on cholesterol reduction has been exhaustively studied, other activities, such as their effects on inflammatory arterial markers and on endothelial function, have not yet been fully investigated. Objective: To evaluate the efficacy of phytosterols added to soy milk on the reduction of plasma lipids, on biomarkers involved in the pathogenesis of atherosclerosis and on transcriptional changes in 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMGCoA) reductase and low density lipoprotein receptor in moderately hypercholesterolemic individuals. Design: Moderately hypercholesterolemic patients (n=38, mean age 58 y) were initially followed over a 3-wk baseline period to evaluate their adherence to the program and their tolerance to the added milk. Patients received soy milk (400 mL/d) or soy milk + phytosterol (1.6 g/d) for 2 periods of 4-wk each. The study was randomized, blinded and crossed. Results: Body weight was maintained during the study. Phytosterol treatment reduced the total cholesterol concentration 5.5 % (P < 0.001), low density lipoprotein (LDL) 6.4 % and triglycerides 8.3 % (P<0.05), without modifying high density lipoprotein (HDL). Phytosterol reduced plasma endothelin-1 by 11 % (P<0.05), independently of LDL-C lowering activity. No effects on LDL receptor or on HMGCoA reductase mRNA expression in mononuclear blood cells were found. Sitosterol and campesterol plasma concentrations increased with phytosterol consumption by 18.9% and 21.6%, respectively. Conclusions: Phytosterol effectively lowered plasma total cholesterol, LDL-C, triglycerides and endothelin-1 concentration. The reduction in endothelin-1 concentration was independent of the decrease in the LDL-C concentration

As mulheres na fase reprodutiva apresentam menor incidência de doenças cardiovasculares (DCV), em relação aos homens de mesma idade. Porém, essa vantagem desaparece na pós-menopausa, sugerindo que os hormônios sexuais femininos exercem algum efeito cardioprotetor. Um dos mecanismos propostos para explicar essa proteção é o fato dos estrógenos promoverem a produção de importantes fatores vasoativos pelo endotélio vascular, entre eles o óxido nítrico e a prostaglandina I2. Com a diminuição da quantidade de estrógenos circulante, as mulheres na pós-menopausa, estão mais suscetíveis à disfunção endotelial e a doenças cardiovasculares. Estudos têm demonstrado que a terapia de reposição hormonal (TRH) utilizada por mulheres na pós-menopausa combate os sintomas deste período, melhora o quadro de disfunção endotelial e o perfil lipídico e aumenta a síntese de fatores vasoativos, que auxiliam na prevenção da DCV. Entretanto a TRH vem sendo questionada por grandes estudos como o WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) e o HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), que mostraram um risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e endometrial em mulheres fazendo uso da TRH. Entre as terapias alternativas para combater os sintomas indesejáveis da menopausa e as implicações mórbidas que acompanham esse período, sem expor as pacientes aos efeitos colaterais da TRH, a literatura aponta os fitoestrógenos, principalmente os extraídos da soja (Glycine max). O objetivo geral deste estudo é avaliar a ação das isoflavonas da soja, que vem sendo utilizadas por mulheres na pós-menopausa, na produção de óxido nítrico, prostaglandina E2 e endotelina-1, por células endoteliais, utilizando um modelo \"in vitro\", células endoteliais da linhagem ECV304. / During their reproductive years, women have a lower incidence of coronary heart disease (CHD) compared to men of similar age. However, this advantage disappears in post-menopause, suggesting that female sex hormones exert some cardio protective effect. One of the mechanisms proposed to explain this protection is the fact that estrogens promote the production of important vasoative factors by vascular endothelium, including nitric oxide and prostaglandin I2. By decreasing circulating estrogen, women in post-menopause are more susceptible of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases. Studies have shown that the hormone replacement therapy (HRT) used by post-menopausal women in combating the symptoms of this period, improve endothelial dysfunction and lipid profile and increases the synthesis of vasoative factors, which help in the prevention of CHD. Meanwhile the HRT has been questioned by two large trials, the WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) and HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), which showed an increased risk of developing breast cancer and endometrial cancer in women using HRT. Among the alternative therapies to combat the symptoms of menopause and undesirable morbid implications that accompany this period, without exposing the patients to the side effects of HRT, the literature suggests the phytoestrogens, especially those from the soybean (Glycine max). The aim of this study is to evaluate the effect of isoflavones from soy, which are used by women in post-menopause, in the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and endothelin-1 by endothelial cells, using an \"in vitro\" model: human endothelial cell line ECV304.

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Orientador: Marcos Renato de Assis / Resumo: A expectativa de vida diminui com artrite reumatoide (AR) devido ao aumento da mortalidade por doenças cardiovasculares. Isto se deve, possivelmente, à disfunção endotelial resultante da intensa atividade inflamatória relacionada à AR. Evidências tem apontado para um possível envolvimento do sistema renina-angiotensina (SRA) nos danos cardiovasculares inerentes à AR. Acredita-se que a participação do SRA agrave o comprometimento endotelial decorrente de inflamações sistêmicas através da ativação do receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1) pela angiotensina II (Ang II). Por outro lado, a literatura também reporta a influência dos hormônios andrógenos, principalmente da testosterona, nas ações da Ang II sobre os tecidos vasculares. Assim, o objetivo do presente estudo é investigar os efeitos da artrite induzida por adjuvante (AIA) sobre o equilíbrio redox, a função endotelial e as respostas da aorta de ratos à Ang II, bem como, verificar se esses efeitos podem ser influenciados pela redução dos níveis circulantes de testosterona. Para isto, ratos Wistar machos adultos foram submetidos à falsa-castração e falsa-imunização (Controles), castração seguida de falsa-imunização (ORX), falsa-castração seguida de imunização (ORX) e castração seguida de imunização (ORX+AIA). Ao final do experimento, segmentos de aorta torácica foram desafiadas em cubas de órgãos isolados com acetilcolina (ACh), Ang II, KCl e nitroprussiato de sódio e, das curvas concentração resposta obtidas, calculou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Life expectancy of patients with rheumatoid arthritis (RA) is lower due to increased mortality in consequence of cardiovascular diseases. Presumably, this occurs due to endothelial dysfunction resulting from severe inflammatory activity related to RA. Evidence has demonstrated a possible involvement of the renin-angiotensin system (RAS) in the cardiovascular injury inherent to RA. The RAS involvement is considered to worsen the endothelial impairment due to systemic inflammation through angiotensin II type 1 receptor (AT1) activation of Ang II. (Ang II). Additionally, previous studies also observed that androgen hormones, mainly the testosterone, modulate the Ang II actions in cardiovascular tissues. Thus, the aim of the present study is to investigate the effects of adjuvant-induced arthritis (AIA) on systemic redox balance, endothelial function and rat aorta responses to Ang II, as well as, whether these effects may be influenced by the reduction of circulating levels of testosterone. For this, adult male Wistar rats were submitted to false-castration and false-immunization (Controls), castration followed by false-immunization (ORX), false-castration followed by immunization (ORX) and castration followed by immunization (ORX + AIA) . At the end of the experiment, thoracic aorta segments were challenged in isolated organ bath with acetylcholine (ACh), Ang II, KCl and sodium nitroprusside and, from the concentrantion-response curves obtained were calculated pEC50 and maximal ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As mulheres na fase reprodutiva apresentam menor incidência de doenças cardiovasculares (DCV), em relação aos homens de mesma idade. Porém, essa vantagem desaparece na pós-menopausa, sugerindo que os hormônios sexuais femininos exercem algum efeito cardioprotetor. Um dos mecanismos propostos para explicar essa proteção é o fato dos estrógenos promoverem a produção de importantes fatores vasoativos pelo endotélio vascular, entre eles o óxido nítrico e a prostaglandina I2. Com a diminuição da quantidade de estrógenos circulante, as mulheres na pós-menopausa, estão mais suscetíveis à disfunção endotelial e a doenças cardiovasculares. Estudos têm demonstrado que a terapia de reposição hormonal (TRH) utilizada por mulheres na pós-menopausa combate os sintomas deste período, melhora o quadro de disfunção endotelial e o perfil lipídico e aumenta a síntese de fatores vasoativos, que auxiliam na prevenção da DCV. Entretanto a TRH vem sendo questionada por grandes estudos como o WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) e o HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), que mostraram um risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e endometrial em mulheres fazendo uso da TRH. Entre as terapias alternativas para combater os sintomas indesejáveis da menopausa e as implicações mórbidas que acompanham esse período, sem expor as pacientes aos efeitos colaterais da TRH, a literatura aponta os fitoestrógenos, principalmente os extraídos da soja (Glycine max). O objetivo geral deste estudo é avaliar a ação das isoflavonas da soja, que vem sendo utilizadas por mulheres na pós-menopausa, na produção de óxido nítrico, prostaglandina E2 e endotelina-1, por células endoteliais, utilizando um modelo \"in vitro\", células endoteliais da linhagem ECV304. / During their reproductive years, women have a lower incidence of coronary heart disease (CHD) compared to men of similar age. However, this advantage disappears in post-menopause, suggesting that female sex hormones exert some cardio protective effect. One of the mechanisms proposed to explain this protection is the fact that estrogens promote the production of important vasoative factors by vascular endothelium, including nitric oxide and prostaglandin I2. By decreasing circulating estrogen, women in post-menopause are more susceptible of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases. Studies have shown that the hormone replacement therapy (HRT) used by post-menopausal women in combating the symptoms of this period, improve endothelial dysfunction and lipid profile and increases the synthesis of vasoative factors, which help in the prevention of CHD. Meanwhile the HRT has been questioned by two large trials, the WHI (Writing Group for the Women\'s Health Initiative Investigators) and HERS (Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study), which showed an increased risk of developing breast cancer and endometrial cancer in women using HRT. Among the alternative therapies to combat the symptoms of menopause and undesirable morbid implications that accompany this period, without exposing the patients to the side effects of HRT, the literature suggests the phytoestrogens, especially those from the soybean (Glycine max). The aim of this study is to evaluate the effect of isoflavones from soy, which are used by women in post-menopause, in the production of nitric oxide, prostaglandin E2 and endothelin-1 by endothelial cells, using an \"in vitro\" model: human endothelial cell line ECV304.

LIMA, V.V. Papel da O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) nas alterações vasculares associadas a altos níveis de endotelina-1. 2012. 106 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. A O-Glicosilação com N-acetilglucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: UDP-NAc transferase (OGT) e O-GlcNAcase (OGA). A enzima OGT catalisa a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina ou treonina das proteínas alvo. Por outro lado, a OGA catalisa a remoção hidrolítica de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvos da O-GlcNAc, e recentemente demonstramos que a expressão de proteínas modificadas com O-GlcNAc está aumentada em artérias de ratos com hipertensão DOCA-sal. Considerando que a produção de endotelina-1 (ET-1) encontra-se aumentada na vasculatura de diferentes modelos de hipertensão sensível ao sal, nós investigamos a hipótese de que o aumento da resposta vascular contrátil induzida pela ET-1 é decorrente da hiperativação da via RhoA/Rho cinase, mediada pelo aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc. Durante a realização de nossos experimentos, demonstramos que a exposição de aortas ou células do músculo liso vascular (CMLV) à ET-1 (0,1 mol/L) aumenta a vasoconstrição para fenilefrina (PE) e serotonina, bem como os níveis de proteínas O-GlcNAc, além de modular a expressão das enzimas OGT e OGA. A infusão de ET-1 (2 pmol/Kg/min) por 14 dias também promoveu aumento dos níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc e da resposta contrátil da aorta à PE. O tratamento de aortas ou CMLV com ST045849 (inibidor da OGT, 100 µMol/L) ou atrasentan (antagonista do receptor ETA, 1 mol/L), preveniu o aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc induzido pela ET-1. Além disso, o tratamento com atrasentan por cinco semanas (atrasentan - 5 mg/kg/dia, por via oral) normalizou os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc em ratos DOCA-sal e também diminuiu a resposta contrátil da aorta à PE. A transfecção de CMLV com siRNA para OGT aboliu o efeito da ET-1 sobre os níveis de proteínas O-GlcNAc. Considerando que o aumento nas contrações da aorta à PE, após o tratamento com PUGNAc (inibidor seletivo da OGA) ou ET-1, foi abolido pelo inibidor de Rho cinase (Y-27632, 1 mol/L) e que a ET-1 ativa a via de sinalização da RhoA/Rho cinase, decidimos investigar se aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc ativa/modula a via RhoA/Rho cinase. A incubação de CMLV com ET-1 não mudou a expressão protéica das formas totais de ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 ou MLC, porém aumentou a expressão das formas fosforiladas da MYPT-1 (Tre853), CPI-17 (Tre38) e MLC (Tre18/Ser19). Estes efeitos não foram observados quando CMLV foram tratadas com ST045849, atrasentan ou previamente transfectadas com o siRNA para OGT. Também observamos que a ET-1 aumentou a atividade e a expressão protéica da RhoA, assim como a expressão da PDZ-Rho GEF e p115-Rho GEF. Este efeito foi abolido, quando CMLV foram previamente transfectadas com siRNA para OGT, incubadas com o inibidor da OGT ou tratadas com o antagonista de receptores ETA. Em conclusão, nossos dados fornecem evidências de que a ET-1 aumenta os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc, resultando na ativação da via RhoA/Rho cinase e no aumento da reatividade vascular. É possível que o aumento de proteínas O-GlcNAc, induzido pela ET-1, possa representar um novo mecanismo para a disfunção vascular induzida por este potente peptídeo. / LIMA, V.V. O-GlcNAcylation contributes to the vascular effects of ET-1 via activation of RhoA/Rho-kinase pathway. 2012. 106 f. Ph.D. Thesis - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Glycosylation with O-linked -N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification that plays a key role in signal transduction pathways. The cycling of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: UDP-NAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Whereas OGT catalyses the addition of O-GlcNAc to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, OGA catalyses the hydrolytic cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified target. Proteins with an important role in vascular function are targets for O-GlcNAcylation and we have recently shown that the vascular content of O-GlcNAc-proteins is augmented in arteries from DOCA-salt rats. Since endothelin-1 (ET-1) production is increased in the vasculature of salt-sensitive forms of hypertension, we tested the hypothesis that O-GlcNAc contributes to the vascular effects of ET-1, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. Incubation of rat aortas or vascular smooth muscle cells (VSMCs) with ET-1 (0,1 mol/L) produced a time-dependent increase in O-GlcNAc levels, decreased expression of O-GlcNAc transferase (OGT) and -N-acetylglucosaminidase (OGA), key enzymes in the O-GlcNAcylation process. Overnight treatment of aortas with ET-1 increased phenylephrine (PE) vasoconstriction. ET-1 effects were not observed when vessels were previously instilled with anti-OGT antibody or after incubation with an OGT inhibitor (ST045849, 100 mol/L). Aortas from DOCA-salt rats, which exhibit increased pre-pro-ET-1 expression, displayed increased contractions to PE and augmented levels of O-GlcNAc proteins. Treatment of DOCA-salt rats with atrasentan (ETA antagonist) abrogated augmented vascular levels of O-GlcNAc and prevented increased PE vasoconstriction. Aortas from rats chronically infused with low rate of ET-1 (2 pmol/Kg/min, 14days) exhibited increased O-GlcNAc-proteins and enhanced PE responses. These changes are similar to those induced by PUGNAc (OGA inhibitor which increases O-GlcNAc levels). ET-1 as well as PUGNAc augmented contractions to PE in endothelium-denuded rat aortas, an effect that was abolished by the Rho kinase inhibitor Y-27632 (1 mol/L). Incubation of VSMCs with ET-1 did not change expression of ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 or MLC, but increased phosphorylation levels of MYPT-1 (Thr853), CPI-17 (Thr38) and MLC (Thr18/Ser19). The effects of ET-1 on MYPT-1, CPI-17 and MLC phosphorylation were prevented by the OGT inhibitor and OGT siRNA transfection, as well as by atrasentan. ET-1 increased RhoA expression and activity in VSMCs, and this effect was abolished by OGT siRNA transfection and OGT inhibition. ET-1 also augmented expression of PDZ-Rho GEF and p115-Rho GEF in VSMCs and this was prevented by OGT siRNA, OGT inhibition (ST045849) and ETA receptor blockade (atrasentan, 1 mol/L). In conclusion, our data strongly suggest that ET-1 augments O-GlcNAc levels and this modification contributes to increase vascular contractile responses, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. We speculate that the modulatory effect of ET-1 on O-GlcNAcylation may represent a novel mechanism underlying the vascular effects of the peptide.

A Hipertensão Arterial Pulmonar (HAP) é uma patologia grave e incapacitante, caracterizada por modificações bioquímicas, morfofuncionais e estruturais que gera aumento progressivo da resistência vascular pulmonar (RVP), da pressão arterial pulmonar média (PAPm) e alterações no ventrículo direito (VD) que culminam com a insuficiência cardíaca direita (ICD), seguida de óbito. O efeito do exercício físico aeróbio sobre o estresse oxidativo e sobre o metabolismo do óxido nítrico (NO) e endotelina-1 (ET-1), no tecido pulmonar é desconhecido. Assim, este estudo teve como objetivo verificar a influência de um protocolo de exercício físico sobre o estresse oxidativo pulmonar e o seu papel modulador no metabolismo do NO e da ET-1 em ratos com HAP. Para isso, foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos experimentais (5-7 animais): CS (controle sedentário), MS (monocrotalina sedentário), CT (controle treinado) e MT (monocrotalina treinado). Os animais dos grupos CT e MT participaram de duas semanas de pré-treinamento em esteira adaptada para ratos. No final desse período, os animais dos grupos MS e MT receberam dose única (60 mg/Kg) intraperitoneal de monocrotalina (MCT), enquanto que os animais dos grupos CS e CT, receberam salina na mesma dose. Em seguida, os animais dos grupos CT e MT foram submetidos a três semanas de treinamento aeróbio, com frequência de cinco vezes por semana e utilização de 60% do VO2 máximo. Análises ecocardiográficas foram realizadas 24 horas após a última sessão de exercício físico aeróbio. Os parâmetros de tempo de aceleração/tempo de ejeção do fluxo pela artéria pulmonar (TAC/TEJ), volume sistólico (VS), débito cardíaco (DC), excursão sistólica do plano do anel da tricúspede (TAPSE), fração de enchimento (FEC), mudança da área fracional (FAC), índice de performance do miocárdio (IPM) e velocidade de enchimento rápido/lento do ventrículo direito (E/A) foram analisados e, em seguida, os ratos foram mortos por sobrecarga anestésica, confirmada por deslocamento cervical. Seus órgãos (coração, fígado e pulmão) foram coletados para realização posterior das análises. A massa do coração foi utilizada para analisar a hipertrofia cardíaca (HC) e a massa do fígado, para analisar a congestão hepática. O lobo direito do pulmão foi separado para realização das análises bioquímicas e moleculares e, o lobo esquerdo para realização das análises imuno-histoquímicas. A administração de MCT promoveu hipertrofia do VD, redução dos parâmetros TAC/TEJ, DC, VS e TAPSE, sendo que o exercício físico aeróbio acentuou essa redução nas análises do TAC/TEJ e DC. Nos demais parâmetros ecocardiográficos e na congestão hepática, não encontramos diferenças significativas entre os grupos experimentais. Nos resultados bioquímicos encontramos aumento da concentração do radical superóxido (O2.-) nos grupos MCT, principalmente no grupo MT, inalteração da concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e da atividade da enzima NADPH Oxidase (NOX). Em relação às enzimas antioxidantes, encontramos redução da atividade da superóxido dismutase (SOD) nos animais que participaram do protocolo de treinamento físico e inalteração da sua expressão por Western Blot. A catalase (CAT), por sua vez, teve sua atividade reduzida nos animais que receberam MCT e também na sua expressão no grupo MS quando comparado ao CS. Já o grupo MT teve aumento da expressão da CAT quando comparado ao grupo MS.Em relação à atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) houve aumento nos grupos que receberam a MCT, principalmente no grupo MT. Encontramos ainda, redução nos danos oxidativos a proteínas e lipídios nos grupos que receberam MCT. O metabolismo do NO também foi afetado, uma vez que evidenciamos redução da atividade da óxido nítrico sintase (NOS) nos animais que participaram do protocolo de treinamento aeróbio e também naqueles que receberam a MCT. A concentração de nitritos totais e da expressão de enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) não apresentaram diferenças significativas entre os diferentes grupos experimentais. Houve aumento na marcação da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e na nitrotirosina em arteríolas pulmonares dos animais que receberam MCT, sendo mais acentuada nos animais do grupo MT. Ainda, não encontramos alterações significativas na expressão do receptor A (ET-A) da ET-1, mas sim, redução da expressão do receptor B (ET-B). Em conclusão, o modelo experimental de HAP induzido por MCT, foi reproduzido nesse estudo e a realização do protocolo de treinamento físico mostrou-se incapaz de atenuar e/ou reverter as alterações no metabolismo do NO e da ET-1, bem como o aumento do estresse oxidativo causados pela droga, no tecido pulmonar. Na verdade, em muitas análises, foram encontrados efeitos prejudiciais do exercício físico, potencializando a progressão e severidade da doença. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a serious and disabling condition characterized by biochemical, morphological, functional and structural alterations, which generate a progressive increase in pulmonary vascular resistance (PVR) and in mean pulmonary arterial pressure (mPAP), together with changes in right ventricle (RV). This scenario leads to right heart failure, followed by death. The effects of aerobic exercise on oxidative stress, metabolism of nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1) in lung tissue are unknown. This study aimed to verify the influence of a physical exercise protocol on pulmonary oxidative stress and also the modulatory role of exercise in the metabolism of NO and ET-1 in rats with PAH. Then, 28 male Wistar rats were used, divided into four groups (5-7 animals/group): SC (sedentary control), SM (sedentary monocrotaline), TC (trained control), and TM (trained monocrotaline). Animals of TC and TM groups participated in two weeks of pre-training on a treadmill adapted to rats. At the end of this period, the animals of TM and SM groups received a single injection (60 mg/kg, i.p.) of monocrotaline (MCT), whereas animals of SC and TC groups received saline at the same volume. Then, the animals of TC and TM groups underwent three weeks of aerobic training, five times a week, using 60% of maximum VO2. Echocardiographic analysis was performed 24 hours after the last aerobic exercise session. The parameters of acceleration /ejection time of pulmonary artery flow (AT/ET), stroke volume (SV), cardiac output (CO), tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE), filling fraction (FF), fractional area change (FAC), myocardial performance index (MPI) and fast/slow rate of right ventricular filling (E/A ratio) were analyzed, and then rats were euthanized with anesthetic overload, confirmed by cervical dislocation. Heart, liver and lungs were collected to perform later analysis. Heart mass was used to analyze cardiac hypertrophy (CH), and liver mass to analyze hepatic congestion. The right lobe of lung was separated to biochemical and molecular measurements and the left lobe to perform immunohistochemical analysis. The administration of MCT promoted RV hypertrophy, and reduced AT/ET, CO, SV, and TAPSE. However, aerobic exercised groups had an accentuated reduction in the analysis of the AT/ET and CO. We found no significant differences between the experimental groups in other echocardiographic parameters and liver congestion analysis. Biochemical results showed increased concentrations of superoxide radical (O2.-) in the MCT group, especially in the TM group, with no changes in hydrogen peroxide concentration (H2O2) and NADPH oxidase enzyme activity (NOX). Regarding the antioxidant enzymes, we found reduced activity of superoxide dismutase (SOD) in animals that underwent physical training protocol, with no changes in expression by Western blot. Catalase (CAT), in turn, reduced its activity in animals that received MCT and in its expression in the SM group, when compared to SC. However, animals in TM group had increased expression of CAT when compared to SM group. Regarding the activity of glutathione peroxidase enzyme (GPx) there was an increase in the groups that received MCT, mainly in the TM group. The groups that received MCT presented reduction in oxidative damage to proteins and lipids. NO metabolism was also affected, once reduction in the activity of nitric oxide synthase (NOS) was observed in animals that participated in the aerobic training protocol and also in those who received MCT. The concentration of total nitrites and the endothelial nitric oxide synthase enzyme (eNOS) expression showed no significant differences between the different experimental groups. There was an increase in the immunohistochemical analysis of the inducible nitric oxide synthase enzyme (iNOS) and nitrotyrosine in pulmonary arterioles of animals that received MCT, being more pronounced in the animals of TM group. Although no significant changes in the A receptor of ET-1 (ET-A) expression were identified, it was detected a decrease in the B receptor of ET-1 (ETB) expression. In conclusion, the experimental model of PAH induced by MCT was reproduced in this study and physical training protocol execution proved to be unable to mitigate and/or reverse changes in the metabolism of NO and ET-1, as well as the increased oxidative stress caused by the drug in lung tissue. In fact, in many analyzes, harmful effects of exercise were found, contributing to progression and severity of the disease.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A síndrome dos ovários policísticos é uma desordem frequente e complexa, com grande variabilidade fenotípica, predominando os sinais de disfunção ovariana. Alterações metabólicas, inflamatórias e vasculares vinculadas à resistência à insulina são muito prevalentes nessa desordem podendo manifestar-se precocemente. O objetivo principal deste estudo foi investigar a presença de alterações microvasculares em mulheres jovens e não obesas portadoras da síndrome dos ovários policísticos, através de videocapilaroscopia periungueal e dosagem dos níveis séricos de endotelina-1. O objetivo secundário foi verificar a existência de associações entre os achados vasculares, níveis séricos de androgênios, parâmetros clínicos, bioquímicos, metabólicos e inflamatórios relacionados ao risco cardiovascular. Em estudo observacional, transverso e controlado avaliamos 12 mulheres com diagnóstico de síndrome dos ovários policísticos, segundo os critérios estabelecidos pelo consenso de Rotterdam e nove voluntárias saudáveis. A idade (22,82,3 X 24,62,7), o índice de massa corporal (22,53,4 X 23,73,1) e a circunferência da cintura (7510,1 X 77,38,1) foram semelhantes nos dois grupos. As portadoras da síndrome apresentavam hiperandrogenismo clínico. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos quando analisados os níveis séricos de estradiol, testosterona total, androstenediona ou o índice de testosterona livre, entretanto a SHBG mostrou-se significativamente mais baixa no grupo de estudo (p=0,011). A glicemia de jejum, insulina, HOMA-IR e o perfil lipídico foram normais e sem diferença entre os grupos. A amostra com síndrome dos ovários policísticos não apresentava intolerância à glicose ou Diabetes Mellitus pelo teste oral de tolerância à glicose. Os níveis séricos dos marcadores inflamatórios (leucócitos, ácido úrico, adiponectina, leptina e proteína c reativa) e do marcador de função endotelial avaliado também foram similares nos dois grupos. A velocidade de deslocamento das hemácias no basal e após oclusão foram significativamente menores nas pacientes de estudo (p=0,02), mas o tempo para atingir a VDHmax e os parâmetros relativos à morfologia e densidade capilar foram semelhantes. Não observamos correlação entre a velocidade de deslocamento das hemácias e níveis plasmáticos de endotelina-1, androgênios ou parâmetros de resistência insulínica. A velocidade de deslocamento das hemácias associou-se positivamente aos níveis plasmáticos de estradiol (r= 0,45, p<0,05) e negativamente aos de colesterol total e LDL colesterol (r= -0,52, p<0,05; r=-0,47, p<0,05, respectivamente). Em conclusão nossos resultados fornecem evidência adicional de dano precoce à função microvascular em mulheres portadoras de síndrome dos ovários policísticos. Através da capilaroscopia periungueal dinâmica, demonstramos que mulheres jovens com moderado hiperandrogenismo, sem obesidade, RI, hipertensão ou dislipidemia, já apresentam disfunção microvascular nutritiva, caracterizada por redução na velocidade de fluxo das hemácias no basal e após oclusão. Estes achados micro-circulatórios não foram acompanhados de elevações nos níveis plasmáticos de endotelina-1. / Polycystic ovary syndrome is a frequent and complex disorder, showing a great phenotypic variability, with predominance of signs of ovarian dysfunction and, more particularly, of hyperandrogenism and oligo-anovulatory cycles. This disorder shows a high prevalence of insulin resistance -related metabolic, inflammatory and vascular alterations, which may present at early stages. The main purpose of this study was to investigate the presence of microvascular alterations in young and non-obese women with polycystic ovary syndrome through periungueal videolaparoscopy and dosage of endothelin-1 serum levels. The secondary purpose was to verify further associations between vascular findings, serum androgen levels, and clinical, biochemical, metabolic and inflammatory parameters related to cardiovascular risk. We conducted an observational, transversal and controlled study to evaluate 12 women who, according to Rotterdam criteria, were diagnosed with polycystic ovary syndrome, and also nine healthy volunteers. Our selective process excluded from both groups women with smoking habits, as well as those who had made use of oral contraceptive, metformin or antilipemic drugs within three months prior to the beginning of the study. The age range (22,82,3 X 24,62,7), body mass index (22,53,4 X 23,73,1), and waist circumference (7510,1 X 77,38,1) were similar in both groups. Our patients with polycystic ovary syndrome presented clinical hyperandrogenism. Analysis of serum estradiol, total testosterone, androstenedione levels or testosterone free index disclosed no significant differences between the groups, although SHBG appeared to be expressively lower in the studied group (p=0.003). Fasting blood glucose test, insulin level, HOMA-IR and lipid profile showed normal results, and without difference between the groups. As disclosed by the oral glucose tolerance test, the group with PCOS did not present tolerance to either glucose or diabetes mellitus. When evaluated, the serum levels of inflammatory markers (leukocytes, uric acid, adinopectin, leptin and c-reactive protein) and of endothelial function marker (endothelin-1) were also similar in both groups. The red blood cell velocity at baseline and peak were significantly lower in patients with PCOS (p=0.02), although the timeframe to reach blood cell velocity at baseline and peak and the parameters referring to morphology and capillary density were similar between the groups. No association was observed between the speed of movement of red blood cells and plasma levels of endothelin-1, androgens or insulin resistance parameters. The velocity of movement of red blood cells was positively related to estradiol plasma levels (rho= 0.45, p<0.05) and negatively to the levels of total cholesterol and LDL cholesterol (rho= -0.52, p<0.05; rho=-0.47, p<0.05 respectively). Taken together, our results provide an additional evidence of early lesion to microvascular function in women with polycystic ovary syndrome. By using a simple procedure, namely the dynamic nailfoldvideocapillaroscopy, we demonstrated that young women with mild hyperandrogenism, who do not present obesity, insulin resistance, high blood pressure or dyslipidemia, already show a nutritional microvascular dysfunction, characterized by a reduced speed of red blood cells flow at basal level and after occlusion. Such microcirculatory findings were not accompanied by an increase of endothelin-1 plasma levels.

LIMA, V.V. Papel da O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) nas alterações vasculares associadas a altos níveis de endotelina-1. 2012. 106 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. A O-Glicosilação com N-acetilglucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: UDP-NAc transferase (OGT) e O-GlcNAcase (OGA). A enzima OGT catalisa a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina ou treonina das proteínas alvo. Por outro lado, a OGA catalisa a remoção hidrolítica de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvos da O-GlcNAc, e recentemente demonstramos que a expressão de proteínas modificadas com O-GlcNAc está aumentada em artérias de ratos com hipertensão DOCA-sal. Considerando que a produção de endotelina-1 (ET-1) encontra-se aumentada na vasculatura de diferentes modelos de hipertensão sensível ao sal, nós investigamos a hipótese de que o aumento da resposta vascular contrátil induzida pela ET-1 é decorrente da hiperativação da via RhoA/Rho cinase, mediada pelo aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc. Durante a realização de nossos experimentos, demonstramos que a exposição de aortas ou células do músculo liso vascular (CMLV) à ET-1 (0,1 mol/L) aumenta a vasoconstrição para fenilefrina (PE) e serotonina, bem como os níveis de proteínas O-GlcNAc, além de modular a expressão das enzimas OGT e OGA. A infusão de ET-1 (2 pmol/Kg/min) por 14 dias também promoveu aumento dos níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc e da resposta contrátil da aorta à PE. O tratamento de aortas ou CMLV com ST045849 (inibidor da OGT, 100 µMol/L) ou atrasentan (antagonista do receptor ETA, 1 mol/L), preveniu o aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc induzido pela ET-1. Além disso, o tratamento com atrasentan por cinco semanas (atrasentan - 5 mg/kg/dia, por via oral) normalizou os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc em ratos DOCA-sal e também diminuiu a resposta contrátil da aorta à PE. A transfecção de CMLV com siRNA para OGT aboliu o efeito da ET-1 sobre os níveis de proteínas O-GlcNAc. Considerando que o aumento nas contrações da aorta à PE, após o tratamento com PUGNAc (inibidor seletivo da OGA) ou ET-1, foi abolido pelo inibidor de Rho cinase (Y-27632, 1 mol/L) e que a ET-1 ativa a via de sinalização da RhoA/Rho cinase, decidimos investigar se aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc ativa/modula a via RhoA/Rho cinase. A incubação de CMLV com ET-1 não mudou a expressão protéica das formas totais de ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 ou MLC, porém aumentou a expressão das formas fosforiladas da MYPT-1 (Tre853), CPI-17 (Tre38) e MLC (Tre18/Ser19). Estes efeitos não foram observados quando CMLV foram tratadas com ST045849, atrasentan ou previamente transfectadas com o siRNA para OGT. Também observamos que a ET-1 aumentou a atividade e a expressão protéica da RhoA, assim como a expressão da PDZ-Rho GEF e p115-Rho GEF. Este efeito foi abolido, quando CMLV foram previamente transfectadas com siRNA para OGT, incubadas com o inibidor da OGT ou tratadas com o antagonista de receptores ETA. Em conclusão, nossos dados fornecem evidências de que a ET-1 aumenta os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc, resultando na ativação da via RhoA/Rho cinase e no aumento da reatividade vascular. É possível que o aumento de proteínas O-GlcNAc, induzido pela ET-1, possa representar um novo mecanismo para a disfunção vascular induzida por este potente peptídeo. / LIMA, V.V. O-GlcNAcylation contributes to the vascular effects of ET-1 via activation of RhoA/Rho-kinase pathway. 2012. 106 f. Ph.D. Thesis - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Glycosylation with O-linked -N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification that plays a key role in signal transduction pathways. The cycling of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: UDP-NAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Whereas OGT catalyses the addition of O-GlcNAc to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, OGA catalyses the hydrolytic cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified target. Proteins with an important role in vascular function are targets for O-GlcNAcylation and we have recently shown that the vascular content of O-GlcNAc-proteins is augmented in arteries from DOCA-salt rats. Since endothelin-1 (ET-1) production is increased in the vasculature of salt-sensitive forms of hypertension, we tested the hypothesis that O-GlcNAc contributes to the vascular effects of ET-1, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. Incubation of rat aortas or vascular smooth muscle cells (VSMCs) with ET-1 (0,1 mol/L) produced a time-dependent increase in O-GlcNAc levels, decreased expression of O-GlcNAc transferase (OGT) and -N-acetylglucosaminidase (OGA), key enzymes in the O-GlcNAcylation process. Overnight treatment of aortas with ET-1 increased phenylephrine (PE) vasoconstriction. ET-1 effects were not observed when vessels were previously instilled with anti-OGT antibody or after incubation with an OGT inhibitor (ST045849, 100 mol/L). Aortas from DOCA-salt rats, which exhibit increased pre-pro-ET-1 expression, displayed increased contractions to PE and augmented levels of O-GlcNAc proteins. Treatment of DOCA-salt rats with atrasentan (ETA antagonist) abrogated augmented vascular levels of O-GlcNAc and prevented increased PE vasoconstriction. Aortas from rats chronically infused with low rate of ET-1 (2 pmol/Kg/min, 14days) exhibited increased O-GlcNAc-proteins and enhanced PE responses. These changes are similar to those induced by PUGNAc (OGA inhibitor which increases O-GlcNAc levels). ET-1 as well as PUGNAc augmented contractions to PE in endothelium-denuded rat aortas, an effect that was abolished by the Rho kinase inhibitor Y-27632 (1 mol/L). Incubation of VSMCs with ET-1 did not change expression of ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 or MLC, but increased phosphorylation levels of MYPT-1 (Thr853), CPI-17 (Thr38) and MLC (Thr18/Ser19). The effects of ET-1 on MYPT-1, CPI-17 and MLC phosphorylation were prevented by the OGT inhibitor and OGT siRNA transfection, as well as by atrasentan. ET-1 increased RhoA expression and activity in VSMCs, and this effect was abolished by OGT siRNA transfection and OGT inhibition. ET-1 also augmented expression of PDZ-Rho GEF and p115-Rho GEF in VSMCs and this was prevented by OGT siRNA, OGT inhibition (ST045849) and ETA receptor blockade (atrasentan, 1 mol/L). In conclusion, our data strongly suggest that ET-1 augments O-GlcNAc levels and this modification contributes to increase vascular contractile responses, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. We speculate that the modulatory effect of ET-1 on O-GlcNAcylation may represent a novel mechanism underlying the vascular effects of the peptide.