La thèse se décompose en deux parties. La première concerne l'utilisation du code de CFD atmosphérique Mercure Saturne pour estimer le potentiel éolien en terrain complexe. Une campagne de mesure a été menée par EDF pour disposer de données d'entrée et de validation. Une méthodologie a été développée utilisant des profils méso-échelle comme conditions limites du code CFD. Elle utilise la classification automatique pour réduire le nombre de simulations nécessaires au calcul du potentiel. La validation du code sur le cas connu de la colline d'Askervein, la méthodologie et les comparaisons avec les mesures sur le site complexe choisi sont présentées et discutées. La seconde partie concerne l'étude des sillages avec le code Mercure Saturne. Une méthode de représentation des efforts, exercés par les pales sur le vent, utilisant des termes sources a été implémentée. Ces derniers sont calculés par la méthode BEM. Deux comparaisons en soufflerie sont proposées pour la validation / This thesis is organized in two parts. The first part presents the use of the atmospheric CFD code Mercure Saturne to estimate the wind resource in complex terrain. A measurement campaign was led by EDF to obtain data for validation. A methodology was developed using meso-scale profiles as boundary conditions. Clustering of meteorological situations was used to reduce the number of simulations needed to calculate the wind resource. The validation of the code on the Askervein hill, the methodology and comparisons with measurements from the complex site are presented. The second part presents the modeling of wakes with the Mercure Saturne code. Forces, generated by the blades on the wind, are modeled by source terms, calculated by the BEM method. Two comparisons are proposed to validate the method : the first compares the numerical model with wind tunnel measurements from a small wind turbine, the second with measurements made on porous disks in an atmospheric boundary layer wind tunnel

Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind. / Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways.

Cette thèse étudie les conditions et l’ampleur des évolutions de la politique nucléaire de l’Union européenne, de 2000 à 2016. Depuis le milieu des années 1990, plusieurs événements – ou « fenêtres d’opportunité » selon la terminologie du Multiple Streams Framework – ont remis les politiques nucléaires au centre de l’attention des décideurs européens : l’adhésion de nouveaux Etats membres en 2004 ; différentes Présidences du Conseil et nominations de Commissaires ayant pris clairement position sur les questions nucléaires ; l’accident de Fukushima de mars 2011 ; et enfin, les deux sorties du nucléaire allemandes, en 2000 et 2011.La première partie de ce travail est consacrée à l’analyse de l’ampleur du changement introduit par les directives adoptées durant la période étudiée: les directives sûreté réacteur de 2009 et 2014, ainsi que la directive déchets radioactifs de 2011. La deuxième partie étudie les facteurs de stabilité qui ont empêché la mise à l’agenda ou l’adoption de certaines propositions, comme les politiques d’harmonisation des régimes de responsabilité civile ou comme les tentatives d’abolition du traité Euratom.Parmi les différentes variables testées, des coûts de mise en œuvre limités, ainsi que l’existence d’indicateurs pour un problème donné, sont apparus comme des conditions nécessaires (mais non suffisantes) pour un changement de politique.La variable la plus pertinente pour expliquer les changements contenus dans les directives adoptées est l’évolution de la place d’un problème dans les priorités des acteurs. L’accident de Fukushima n’a modifié ni les conditions objectives d’existence d’un problème, ni, sur le long terme, les priorités des Etats Membres ou du secteur nucléaire. Ainsi, les propositions post Fukushima tendant à augmenter le rôle de la Commission européenne ou une calibration plus stricte des mesures de sûreté ont donc été partiellement rejetées, pour finalement aboutir à une révision de la directive sûreté, en 2014, avec peu de changements. De même, la priorité accordée à la résolution des problèmes nationaux liés à gestion des déchets radioactifs a abouti à l’adoption d’une directive incluant des mesures plus précises.Les principaux changements ayant eu lieu dans les directives étudiées concernent leur logique instrumentale et leur calibration ; aucun changement n’a été observé dans les buts ou les orientations générales de la politique nucléaire de l’UE. La politique nucléaire de l’UE semble ainsi particulièrement stable.Cette thèse met en évidence plusieurs facteurs d’inertie des politiques et institutions d’Euratom, malgré l’action d’entrepreneurs politiques : le haut niveau de méfiance entre acteurs, la délégation de la sûreté à des agences indépendantes, la dépendance au sentier liée à la technologie nucléaire, et la flexibilité « incorporée » dans Euratom. Ces facteurs réduisent le nombre d’entrepreneurs politiques potentiellement efficaces ainsi que l’éventail de leurs stratégies pour promouvoir un changement. En plus des facteurs institutionnels, la stabilité des politiques et institutions est également promue par des veto players.Néanmoins, les problèmes récents auxquels est confronté le secteur nucléaire européen (intégration croissante de sources d’énergie renouvelable, difficultés économiques) érodent les conditions de reproduction et de stabilité des institutions d’Euratom. Cet aspect se traduit notamment dans le progressif retrait du nucléaire des communications officielles mentionnant les sources d’énergie à développer pour remplir les objectifs de l’Union.En se basant sur le MSF et sur l’institutionnalisme historique, cette thèse démontre ainsi que les évolutions de la politique nucléaire de l’UE requièrent trois conditions : l’action d’un entrepreneur politique, l’émergence d’un problème dans les priorités des principaux acteurs et, pour des changements d’orientation ou d’institution, l’érosion des mécanismes de reproduction. / The goal of this dissertation is to understand the conditions under which the nuclear policy of the European Union has evolved – between 2000 and 2016 — as well as the scope of these evolutions. From the mid-1990s onwards, various events – “windows of opportunity” in the terminology of the Multiple Streams Framework – brought nuclear energy back to the attention of European policy-makers: the accession of new member states in 2004; different Council presidencies and nomination of Commissioners with a strong position on nuclear energy; the Fukushima accident in March 2011; Germany’s first and second nuclear phase-outs (in 2000 and 2011).This PhD proceeds in two parts: First, it analyses the scope of change in policies that have been set on the agenda and finally adopted (the reactor safety and the radioactive waste management directives); second, it analyses the stability factors that have hindered the agenda-setting or the decision-making on proposals for policy change or institutional reforms (harmonisations of civil liability regimes, licensing processes, or decommissioning funds; abolition of the Euratom treaty).Among the several variables tested, low implementation costs, as well as the existence of problem indicators, may be a necessary, but not a sufficient condition for policy change.The most relevant variable accounting for the policy changes included in the adopted directives, was the evolution of the problem in place of actors’ priorities. The Fukushima accident neither modified the objective conditions of existence of a problem, nor the long-term priority of Member States or the nuclear sector. Hence the post-Fukushima proposals suggesting an increase in the role of the European Commission or a stricter calibration of safety measures have been partially rejected. Hence there was no substantial policy change in the safety directive adopted in 2014. In a similar way, the priority granted to overcoming national problems of radioactive waste management led to the 2011 radioactive waste directive, which contained more settings than the 2009 reactor safety directive .The main changes observed in the directives impacted their settings, instrumental logic and calibration; no change has been observed in the goals or orientations of the EU nuclear policy since 2000. Therefore, the EU nuclear policy seems especially stable: in many cases, policy proposals did not even make in onto the agenda of the Council.In order to account for the stability of the policy in spite of the action of policy entrepreneurs, this PhD underlines the particular “stickiness” of the Euratom institutions and policies: The high distrust among actors; the delegation of safety to independent agencies; the technological path-dependence linked to the use of nuclear energy; and the “built-in” institutional flexibility of Euratom. These factors reduce the number of potential successful policy entrepreneurs and the range of strategies of change. Not only the institutional context but also the defiance among actors has accounted for the particular stability of the European nuclear policy and for the absence of change in goals or objectives: Stability was promoted by veto players, whose actions can be taken into account by the Multiple Streams Framework.Still, the recent problems facing the nuclear sector (growing renewable energy share, economic difficulties) are eroding the conditions of stability and mechanisms of reproduction of the European nuclear institutions. This is reflected in the progressive modification of the Commission’s official positions on nuclear energy, which is no longer included in the energy sources to be developed to meet the EU’s energy objectives.Relying both on the MSF and the historical institutionalism, this PhD shows that change in the European nuclear policy requires the action of a policy entrepreneur, the erosion of reproduction mechanisms and the occurrence of a problem among the priorities of main actors.

Cette thèse aborde la conception des systèmes interactifs persuasifs (SIP). Ces systèmes sont conçus pour induire et accompagner un changement de comportement au travers de l’interaction homme-machine, sans coercition et avec une utilisation volontaire. Ces systèmes s’inscrivent dans la mouvance des technologies persuasives et leur conception repose sur des principes de persuasion et d’autres approches issues de la psychologie.Dans cette thèse, nous nous concentrons sur le domaine de l’énergie et le changement de comportement pour adopter des modes de consommation plus vertueux. En effet, un des grand défis sociétaux en lien avec la question du changement climatique, la consommation énergétique domestique représente actuellement environ un tiers de l'énergie totale mondiale consommée et ne cesse d’augmenter. Outre l’amélioration technique des appareils, il est incontournable de changer nos habitudes. Cependant, changer un processus long et difficile.Le défi est donc de concevoir une interaction homme-machine prévue pour accompagner le processus de changement et, par conséquent, pour une interaction long-terme. Pour cela, à partir d’une étude de classifications, espaces de conception et framework des systèmes persuasifs, nous proposons le framework UP+, notre contribution conceptuelle. Ce framework propose un cadre pour la conception des systèmes interactifs persuasifs structuré selon trois dimensions : deux relatives au processus de changement de comportement au niveau micro (cause-effet-causalité) et macro (long terme)) ; l’autre relative à la dimension psychologique de la motivation. Nous identifions quatre classes de fonctions de persuasion (comprendre, décider, agir et protéger) déclinées en douze sous-classes de fonctions de persuasion.En nous appuyant sur UP+, l’état de l’art des systèmes persuasifs pour l’énergie montre qu’ils se concentrent principalement que sur quelques fonctions de persuasion seulement (ex. auto-surveillance). Dans cette thèse, nous nous concentrons tout particulièrement sur l’aspect décision et causalité du comportement. Une autre contribution est l'Interface utilisateur Mondrian, une preuve-de-concept proposant un cadre d’interface qui traite de l’implication long-terme des utilisateurs. Elle doit répondre à plusieurs objectifs : capter l’attention de l’utilisateur ; offrir plusieurs niveaux d’interaction selon le contexte s’usage ; permettre l’intégration de plusieurs briques interactionnelles support de la persuasion. En particulier, nous proposons deux briques, Sliders4DM et Plan4Actions. Sliders4DM est un nouveau widget d’aide à la décision conçu pour permettre à des utilisateurs novices d’explorer et trouver un compromis satisfaisant entre plusieurs critères potentiellement incompatibles. Il s’appuie sur une approche what-if. Nous avons évalué Sliders4DM par une expérimentation qualitative (16 participants) et une comparative et quantitative (177 participants). Plan4Actions est un nouveau concept d’interface d’aide à la décision et la compréhension des effets d’un comportement à l’aide d’explications : il permet à des utilisateurs de planifier une séquence d’actions pour à la fois réduire leur consommation énergétique tout en maintenant un niveau de confort satisfaisant. Une expérimentation qualitative menée avec 13 participants montre son utilisabilité et son utilité. Nous mettons également en évidence les limites de ce travail et la nécessité de mener une évaluation à long terme dans un environnement domestique réel pour valider entièrement leur efficacité persuasive. / This thesis is about persuasive interactive systems, a subclass of interactive systems aiming at supporting sustainable behaviors. Persuasive technology is a very recent and emerging topic, which relies on persuasion to support human behavior change voluntarily without coercion and deception.In this research, we focus the design of persuasive system for promoting behaviors change with energy as application domain. In the interest of preserving the planet, reducing domestic energy use is necessary for fighting against global warming and climate change issues. The approach to save energy by introducing more efficient appliances only tackles partially the current issues. An urgent need is to motivate sustainable behaviors in energy usage. However, changing people behaviors involves a complex and difficult process.The challenge is to design interactive systems that take into account this process dimension and that keep users involved over time in the process of behavior change. Consequently, based on a review of classifications, design spaces and frameworks targeting the design of persuasive systems, we propose the UP+ framework, our first and conceptual contribution. It considers three dimensions: two related to the process aspect of behavior change, at two levels: micro (cause-effect-causality) and macro (long term)); one related to the psychological aspects of motivation.Based on the UP+ framework, we conduct a state of the art of existing persuasive systems for energy. It reveals that most of these systems covers a few persuasive functions only (e.g., self-surveillance or eco-feedback). In this work, we particularly focus on decision and causality of behavior. A second contribution is the Mondrian User Interface, a proof-of-concept of UI designed to sustain daily use and to keep inhabitants motivated in the long run. We consider thrre goals: to catch user’s attention; to offer multiple levels of user interaction depending on the context of use; to allow the integration of interactional bricks supporting persuasion. Particularly, we propose two bricks, Sliders4DM and Plan4Actions.In order to assist inhabitants in preparing a change (decision), Sliders4DM is a novel widget allowing non-specialists to find an appropriate trade-off between (possibly) conflicting criteria in the home via what-if approach. Sliders4DM is evaluated with two experiments: a qualitative one (16 participants) and a quantitative comparative one (177 participants). Plan4Actions is a novel concept of user interface for planning daily actions. The concept is empowered by the co-decision between inhabitants and the home management system. It provides inhabitants with flexibility in planning their daily actions in order to satisfy their objectives in terms of comfort and sobriety. A twofold evaluation presented a favorable assessment from 13 participants about Plan4actions’ comprehension, its usability and potential utility in the domestic context.We also discuss the limitations related to persuasive interaction covered by current works and the needs for a long-term evaluation to mesure the behavior changes. The thesis opens new perspectives for extending current research of PIS for energy. To conclude, we define our future works, which involves short-term improvements for current prototype and its deployment in real domestic context.

Le bâtiment contribue majoritairement aux enjeux de la transition energétique. Pour mieux réduire ses consommations, assurer un meilleur confort, répondre aux exigences environnementales et règlementaires, tout en minimisant le prix total, nous proposons d’outiller la conception (des phases d’esquisse à la phase de conception plus avancées, …) par des solutions offrant une vision globale du bâtiment et permettant de faire des choix optimaux. La conception en bâtiment est caractérisée par de nombreux modèles et outils de simulation experts complémentaires, mais indépendants et hétérogènes. En réponse à cette problématique d’interopérabilité, nous proposons une approche orientée service, basée sur l’Internet, pour couvrir les aspects de modèlisation globale et d’aide à la décision. Nous abordons plus particulièrement les problématiques liées aux stratégies et algorithmes de co-simulation, d’optimisation multi-objectif hybride discret/continu et l’aide à la décision multicritère. Ce travail est réalisé dans le cadre de l’ANR COSIMPHI en partenariat fort avec le CSTB. / The building contributes mostly to the challenges of energy transition. In order to better reduce consumption, ensure better comfort, answer to the environmental and regulatory requirements while minimizing the total price, we propose to equip the design (from the sketch phase to the more advanced design phases, ...) with solutions offering a global view of the building and making optimal choices. Building design is characterized by many complementary models and simulation tools but they are independent and heterogeneous. In response to this problem of interoperability, we propose a service oriented approach, based on the Internet, to cover the aspects of global modeling and decision support. We address in particular the problems related to co-simulation strategies and algorithms, multi-objective discrete hybrid optimization and multicriteria decision support. This work is carried out within the framework of the ANR COSIMPHI in strong partnership with the CSTB.

Les changements technologiques dans la communauté du calcul hauteperformance (HPC) sont importants, en particulier dans le secteurdu parallélisme massif avec plusieurs milliers de cœurs de calcul sur unGPU unique ou accélérateur, et aussi des nouveaux réseaux complexes.La consommation d’énergie de ces machines continuera de croître dans les années à venir,faisant de l’énergie l’un des principaux facteurs de coût.Cela explique pourquoi même la métrique classique"flop / s", généralement utilisé pour évaluer les applications HPC etles machines, est progressivement remplacé par une métrique centré surl’énergie en "flop / watt".Une approche pour prédire la consommation d'énergie se fait parsimulation, cependant, une prédiction précise de la performance estcruciale pour estimer l’énergie. Dans cette thèse, nouscontribuons à la prédiction de performance et d'énergie des architectures HPC.Nous proposons un modèle énergétique qui a été implémenté dans unsimulateur open source, sg. Nous validons ce modèle avec soin eten le comparant systématiquement avec des expériences réelles.Nous utilisons cette contribution pour évaluer les projetsexistants et nous proposons de nouveaux governors DVFS spécialementconçus pour le contexte HPC. / The High-Performance Computing (HPC) community is currently undergoingdisruptive technology changes in almost all fields, including a switch towardsmassive parallelism with several thousand compute cores on a single GPU oraccelerator and new, complex networks. Powering a massively parallel machinebecomesThe energy consumption of these machines will continue to grow in the future,making energy one of the principal cost factors of machine ownership. This explainswhy even the classic metric "flop/s", generally used to evaluate HPC applicationsand machines, is widely regarded as to be replaced by an energy-centric metric"flop/watt".One approach to predict energy consumption is through simulation, however, a pre-cise performance prediction is crucial to estimate the energy faithfully. In this thesis,we contribute to the performance and energy prediction of HPC architectures. Wepropose an energy model which we have implemented in the open source SimGridsimulator. We validate this model by carefully and systematically comparing itwith real experiments. We leverage this contribution to both evaluate existingand propose new DVFS governors that are part*icularly designed to suit the HPCcontext.

Au cours de ce travail, nous avons décrit et mis en œuvre la fabrication de surfaces nanostructurées d’alumine par anodisation de feuilles d’aluminium de très grande pureté. Les paramètres morphologiques caractérisant la membrane d’oxyde que sont le diamètre des pores, leur profondeur et leur espacement sont finement contrôlés par les paramètres expérimentaux. Ces surfaces nanotexturées ont permis l’étude approfondie de l’interaction solide-liquide au sein des pores et de la physique de la ligne de contact devant composer avec les nano-aspérités de surface. Ces deux éléments ont pu être appréhendés par des mesures d’angles de contact à l’équilibre et d’hystérésis de mouillage. La modélisation des résultats a montré l’inadéquation des modèles classiques de CASSIE, WENZEL ou de capillarité à cette situation. L’adjonction du terme controversé de tension de ligne permet de bonnes prévisions. Nous montrons que cette interprétation n’est pas unique ; une diminution de l’énergie de surface due à la forte courbure des pores conduit à des résultats identiques. Une investigation théorique a été menée par l’intégration des forces de VAN DER WAALS. La baisse de l’énergie de surface est prévue mais dans des proportions insuffisantes. Le modèle peut être amélioré. Les mesures d’hystérésis ont dévoilé le pouvoir adhésif des surfaces nanoporeuses. À cause des forces de capillarité dans les pores, la ligne de contact ne peut jamais reculer. Les angles d’avancée ont montré que la ligne de contact a une épaisseur négligeable devant la dizaine de nanomètre. Elle peut en outre parfaitement contourner les pores, imprimant de fortes courbures à l’interface liquide-gaz à la base de la goutte. Sa forme tridimensionnelle a été abordée au travers d’un modèle numérique restant à perfectionner. / In this work, we have described and carried out the fabrication of nanostructured alumina surfaces by anodizing highly pure aluminum foils. The pore diameter, depth and spacing are finely controled through experimental parameters. These nanotextured surfaces allowed a thorough study of the solid-liquid interactions within the pores and of the contact-line constrained by the surface nanoasperities. Equilibrium contact-angle and wetting hysteresis measurements were helpful to apprehend them. Modeling the results has revealed the inability of classical CASSIE, WENZEL and capillarity models to properly match the situation. Adding the controversial line-tension term solves the problem and provides good predictions. Anyway, this interpretation is not unique. A lower surface energy within the pores due to their strong curvature yields the same modeling quality. This case has been theoretically investigated through the integration of VAN DER WAALS’ forces. A surface-energy decrease has been calculated but it is not as strong as required. The model still can be improved. Hysteresis measurements have highlighted the nanoporous surfaces are strongly adhesive. Because of the pore size, the capillarity is very marked and keeps the contact line from receding. The advancing contact angles have shown that the contact-line thickness is negligible with respect of ten nanometres. In addition, it can circumvent the pore openings which involves strong liquid–gas interface curvatures at the drop base. The three-dimensional liquid–gas interface shape has been studied with a numerical model that still has to be enhanced.

Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven Änderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Phänomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) können in fünf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen fünf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, können so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. Für ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden für den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gewählt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angefügt. Die zur Markierung mit FlAsH nötige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellulären Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bezüglich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zunächst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkstärke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabhängig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabhängig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformationsänderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen für 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare Änderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob für die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkstärke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine äußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant stärker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine stärkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine stärkere Bewegung unterhalb von Transmembrandomäne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse für EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine größere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einflüsse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen möglich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Während eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-Änderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzuklären, wurden verschiedene Ansätze gewählt: Mit kettenverlängerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine Änderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins führte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signaländerung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu ermöglichen. Ein anderer Erklärungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformationsänderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Darüber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivität mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformationsänderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias für diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bezüglich ihrer Fähigkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verlängerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformationsänderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den ursprünglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle möglich ist, ursächlich für die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war. / A large body of experimental evidence suggests that upon receptor activation G-protein coupled receptors are subject to ligandspecific changes of receptor conformation. The aim of this study was to investigate this phenomenon using the muscarinic M2 acetylcholine receptor (M2 AChR). Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) can be subdivided into five different subtypes (M1-M5). Their involvement in various physiological processes makes them an important target of pharma-cological therapies. With the orthosteric binding site (= binding site of the endogenous ligand) being highly conserved across all five mAChR subtypes, the unselective receptor modulation can lead to severe side effects. Thus the clinical use of drugs modulating muscarinic receptors is currently limited. Allosteric modulation is one attempt to achieve subtype-selective receptor regulation. Since the allosteric binding site of mAChR is less well conserved, it is possible to selectively target one mAChR subtype. As far as allosteric modulation is concerned, the M2 AChR represents a well characterized model with a large number of allosteric modulators being available. For the M2 AChR bitopic ligands which contain an allosteric as well as an orthosteric binding block have been developed as well. In the first part of this study several FRET-sensors of the M2 AChR were designed and characterized. The cyan fluorescent protein (CFP) was fused to the C-terminus of both sensors while the FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) binding site was inserted into the N-terminal (M2i3-N) or the C terminal (M2i3-C) region of the third interacellular loop (IL). The receptor sensors were characterized concerning ligand affinity, activation of the Gi protein and -arrestin2 translocation and did not display any significant differences compared to the wildtype M2 or the M2 CFP receptor. Various orthosteric as well as allosteric ligands were investigated regarding their affinity and efficacy at both sensors. Using FRET-measurements iperoxo was proven to behave as a superagonist. The characteristics of the allosteric ligands were investigated by measuring the receptor deactivation kinetics and their maximum inhibitory effect on a pre-stimulated receptor. All allosteric test substances displayed faster deactivation kinetics compared to the antagonist atropine and similar EC50 values at both receptor sensors. When investigating the change of receptor conformation of the M2 AChR upon ligand binding there were no ligand selective differences in the FRET-signal detected for either of the 19 orthosteric ligands at both M2 sensors. This data suggest that all orthosteric ligands induced a change in receptor conformation comparable to acetylcholine (ACh). In order to correlate the efficacy of various orthosteric ligands to activate the M2 AChR in FRET-experiments with their effect on downstream signaling pathways, the translocation of  arrestin2 upon receptor activation with orthosteric ligands was investigated using confocal microscopy. Except for 5 methylfurmethiodide all orthosteric ligands induced -arrestin2 translocation to an extent which was comparable to the maximal receptor activation observed with each other ligand, respectively. In contrast 5-methylfurmethiodide evoked a half maximal receptor activation compared to the endogenous ligand ACh while only a minimal translocation of -arrestin2 was observed. The second aim of this study was to investigate the effects of allosteric ligands on the change of receptor conformation of the M2 AChR. The allosteric ligands JK 337 and seminaph more strongly influenced the M2i3-C than the M2i3-N, whilst EHW 477 behaved just the opposite way. This data suggest that the orthosteric ligands induce a conformation of the M2 AChR comparable to ACh. JK 337 and seminaph seem to evoke a greater movement underneath TM 6 compared to TM 5 whereas EHW 477 probably induces a larger movement beneath TM 5. The allosteric ligands were tested via FRET-measurements concerning their ability to activate the Gi protein and to translocate  arrestin2. The activation of the Gi protein as well as the -arrestin2 translocation were selectively influenced by all allosteric ligands. However, due to the experimental setup, a quantification of the effects was not possible. Furthermore the bitopic ligands hybrid 1 and 2 (H 1, H 2) were tested regarding their effect on the receptor conformation of the M2 AChR. While stimulation with H 1 induced FRET signals that were comparable for both receptor sensors, it wasn’t possible to detect any change in the FRET ratio neither of the M2i3-N nor of the M2i3-C with H 2. The lack of effect of H 1 and H 2 in the FRET-experiments was explored using two different approaches: Derivatives of H 1 and H 2, in which the carbon linker between the allosteric and the orthosteric building block had been elongated, were able to induce changes in the FRET ratio. Upon the removal of the allosteric building block a half-maximal activation of both receptor sensors could be detected. However, the mutation of the allosteric binding site did not result in any change of the FRET-signals upon stimulation of the receptor mutants with H 1 or H 2. These data suggest that the carbon linker, which connects the allosteric and the orthosteric building block, is not long enough to enable a simultaneous binding to the allosteric and the orthosteric binding site. Another explanation would be that upon binding of an orthoster the channel between the orthosteric and the allosteric binding site of the M2 AChR is closed because of the change in receptor conformation, hence a stable, dual-steric binding of the hybrid substances to the M2 AChR would not be possible. In the course of this study it was possible to prove the existence of a ligand selective receptor conformation of the M2 AChR with allosteric ligands using FRET-experiments. In addition a connection was found to the occurrence of a functional selctivity with allosteric ligands. The investigation of 19 orthosteric ligands regarding their influence on the receptor conformation of the M2 AChR did not reveal any evidence of the existence of a ligand selective change of the receptor conformation. Regarding the translocation of β arrestin2 induced by orthosteric ligands there was a direct correlation between the efficency of the orthosteric ligands to activate the receptor and the extend of β-arrestin2 translocation observed. With the only exception being 5-methylfurmethiodide which induced far less β arrestin2 translocation compared to the magnitude of the conformational change of the receptor. This data suggest the existence of a signaling bias for this ligand. The analysis of the dualsteric ligands H 1 and H 2 concerning their ability to activate the M2 AChR revealed that an activation of the M2 AChR could just be observed upon elongation of the linker which connects the orthosteric with the allosteric building block. This suggests that the short linker chain of the original hybrid substances inhibited a dualsteric binding to the orthosteric and the allosteric binding site and thus caused the difficency of H 1 and H 2 to activate the M2 AChR.

Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. / Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte.

Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements. For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future. / Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte.