Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se estima que la enfermedad de Chagas, producida por Trypanosoma cruzi, afecta a más de ocho millones de personas en la actualidad, principalmente en Latinoamérica. En Chile, el área endémica se extiende desde la Región de Arica hasta la Región de O’Higgins, resaltando la Región de Coquimbo por un alto reporte de triatominos. El parásito infecta a mamíferos, destacándose como reservorio doméstico el perro (Canis lupus familiaris). En Chile existen pocos estudios recientes sobre prevalencia en perros y ninguno en carga parasitaria, por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la infección por T. cruzi en perros de sectores rurales de la Región de Coquimbo, Chile, utilizando PCR en tiempo real para su cuantificación. Se dispuso de 380 muestras de sangre de perros muestreados en el año 2015 de ocho poblados rurales de la Región de Coquimbo. El parásito fue detectado en 29 de las 380 muestras (7,6% de infección) y dentro de las muestras positivas, todas tuvieron menos de 1 parásito equivalente/mL. Si bien las cargas parasitarias fueron bajas, el nivel de positividad en los perros indica que T. cruzi circula en sectores rurales cercanos al hombre. No se encontraron diferencias según edad, condición corporal, provincia o sexo respecto al estatus de infección. Respecto a las cargas parasitarias se encontró lo mismo, a excepción del sexo donde si hubo diferencias indicando que las cargas parasitarias en hembras fueron mayores. Los perros de este estudio fueron infectados después de la interrupción vectorial declarada en 1999, y existe cierto riesgo de que la transmisión haya sido vectorial. Es por esto, que se recomienda mantener a los perros dentro o fuera del hogar, pero no en ambos espacios. / It is estimated that Chagas disease, produced by Trypanosoma cruzi, affects more than eight million people today, mainly in Latin America. In Chile, the endemic area extends from the Arica Region to the O'Higgins Region, highlighting the Coquimbo Region due to a high report of triatomines. The parasite infects mammals, with the dog (Canis lupus familiaris) standing out as a domestic reservoir. In Chile there are few recent studies on prevalence in dogs and none in parasite load, therefore, the objective of this study was to evaluate T. cruzi infection in dogs from rural areas of the Region of Coquimbo, Chile, using real time PCR for its quantification. There were 380 blood samples of canines sampled in 2015 from eight rural villages in the Coquimbo Region. Of the 380 samples, the parasite was detected in 29 (7.6% of infection) and within the positive samples, all had less than 1 equivalent parasite / mL. Although parasitic loads were low, the level of positivity in dogs indicates that T. cruzi circulates in rural areas near human settlements. No differences were found according to age, body condition, province or sex concerning the infection status. Regarding parasitic loads, the same was found, except for sex where there were differences indicating that parasitic loads in females were higher. The dogs in this study were infected after the vectorial interruption declared in 1999, and there is some risk that the transmission has been vectorial. This is why it is recommended to keep dogs inside or outside the home, but not in both spaces. / CONICYT-FONDECYT 1140650, 1180940, 3170799

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es causada por Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Durante la transmisión congénita el parásito alcanza al feto atravesando la barrera placentaria formada por trofoblasto, tejido conectivo fetal y láminas basales. La tasa de transmisión congénita es baja, por lo que podrían existir factores antiparasitarios locales. El trofoblasto, epitelio de revestimiento en contacto con la sangre materna, experimenta proliferación, diferenciación y muerte celular durante su recambio; este proceso es considerado parte de la inmunidad innata. En la presente Memoria de Título, hemos analizado la diferenciación celular del trofoblasto en respuesta al parásito T. cruzi. Para determinar si el recambio epitelial es un mecanismo antiparasitario local, hemos estandarizado la infección con T. cruzi en una línea celular de trofoblasto, BeWo. Así, hemos determinado que las condiciones óptimas de infección son por una parte una incubación de 24 horas y concentraciones de parásitos en una relación 1:0,1 y 1:1. En estas células se analizó la diferenciación celular mediante la determinación de la secreción y expresión de la hormona gonadotrofina coriónica humana mediante espectrofotometría, Western blot e inmunofluorescencia. Adicionalmente se analizó la fusión celular mediante ensayo de fusión de dos colores y re-distribución de desmoplaquina. El parásito induce diferenciación celular en el trofoblasto. Estos resultados, juntos con resultados previos realizados en el mismo laboratorio sugieren que T. cruzi induce aceleramiento del recambio del trofoblasto, lo que podría constituir un mecanismos antiparasitario local de la placenta humana. / Proyectos FONDECYT 1120230 y ANILLO ACT-112

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / A más de cien años de su descripción, la enfermedad de Chagas continúa siendo considerada una enfermedad compleja, con diversas manifestaciones clínicas, las que han sido relacionadas con la variabilidad genética presente en Trypanosoma cruzi. La cardiopatía chagásica corresponde a la forma clínica más grave de la enfermedad en fase crónica, siendo causa principal de muerte y discapacidad en los individuos infectados. Dentro de este contexto, el presente trabajo busca establecer una asociación entre los linajes de T. cruzi y la presencia de patología cardíaca en individuos con enfermedad de Chagas crónica. Para ello se realizó genotipificación mediante la técnica de hibridación con sondas DNA-DNA, a partir de los productos de PCR convencional obtenidos desde muestras de sangre periférica de la población en estudio, correspondientes a 25 individuos chagásicos crónicos con cardiopatía y a 25 individuos chagásicos crónicos sin cardiopatía, procedentes de distintas localidades de la lV Región de Coquimbo, Chile. El 36% (9) de los pacientes no cardiópatas presentaban infección con un solo linaje de T. cruzi, las cuales fueron: Tc l (1 muestra), Tc ll (1 muestra), Tc V (4 muestras) y Tc Vl (3 muestras), mientras que, el 4% corresponde a infecciones mixtas con: Tc ll + Tc V + Tc Vl (1 muestra). El 40% (10) de los pacientes cardiópatas presentaban infección simple por: Tc V (9 muestras) y Tc Vl (1 muestra), mientras que, el 12% (3) de ellos presentó infecciones mixtas, correspondientes a: Tc ll + Tc V + Tc Vl (2 muestras) y Tc l + Tc ll + Tc Vl (1 muestra). Utilizando el test exacto de Fisher se determinó que existe asociación estadísticamente significativa entre la presencia de cardiopatía en pacientes chagásicos crónicos y la infección específica por Tc V (p-value=0,01), mientras que, para Tc l, Tc ll y Tc Vl no fueron significativos (p-value=1,00; p-value=1,00; p-value=0,65, respectivamente). Además, se sugiere que la presencia de cardiopatía en pacientes chagásicos crónicos es independiente (p-value=0,60) del tipo de infección encontrada en estos individuos, sea ésta simple o mixta. En conclusión, la infección menos predominante en ambos grupos en estudio fue la producida por el genotipo Tc l, mientras que, la presencia de cardiopatía chagásica crónica estaría relacionada con la infección específica por T. cruzi V. / Proyecto Fondecyt 1120382

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas congénita es una patología endémica en América Latina, la que se presenta con una menor frecuencia en otros países. Se asocia a partos prematuros, abortos y patología placentaria. Los mecanismos de infección e invasión tisular del parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi) son poco claros. Para estudiar parte de estos mecanismos, se incubaron ex vivo explantes de vellosidades coriónicas humanas sanas con el parásito. La infección exitosa de los explantes de vellosidades coriónicas humanas fue determinada por detección del parásito mediante inmunofluorescencia y PCR. Los efectos de la infección con el parásito se determino mediante métodos inmunohistoquímicos, histoquímicos, bioquímicos y de biología molecular. T. cruzi induce destrucción y desprendimiento del sinciciotrofoblasto, desorganización selectiva de las láminas basales y desorganización del colágeno I del tejido conectivo fetal. Estos resultados sugieren una actividad proteolítica del parásito sobre las láminas basales y tejido conectivo como mecanismo de infección al feto con T. cruzi. Adicionalmente, el parásito induce apoptosis en las vellosidades coriónicas. Los efectos observados son función del número de parásitos utilizados / Financiamiento: Proyectos Biecentenario Anillo ACT 29 y ACT 112 , Bicentenario Redes de Cooperación entre Anillos RED 07, Fondecyt 1180166

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Se estandariza la prueba de PCR en tiempo real (Q-PCR) para el diagnóstico de la enfermedad y evaluar las estimaciones de validación. La prueba está dirigida a la amplificación del ADN satelital del parásito T. cruzi y presenta un límite de detección de 0,005 equivalentes genómicos de parásito. Se evalúa el método con un panel de muestras de sangre de pacientes con diagnóstico serológico conocido (utilizado como gold estándar), pero de estadio clínico no determinado. El ensayo presenta una sensibilidad clínica de 83% y una especificidad de 100%, determinando una buena concordancia. Asimismo, la prueba es capaz de detectar ADN de parásito en muestras de heces de triatominos. La prueba demuestra ser eficiente para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas y podría ser aplicada en la fase aguda y crónica, incluso cuando el nivel de parasitemia en sangre es bajo. Además, cuando los métodos convencionales no son concluyentes, la prueba de Q-PCR permite una detección temprana y oportuna de la infección por Trypanosoma cruzi.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Triatoma infestans es el principal vector de la enfermedad de Chagas en Chile. Tradicionalmente se le ha asociado a ambientes domiciliarios, pero en los últimos años se ha detectado su presencia en ambientes silvestres, en sectores suburbanos de algunas comunas de las regiones Metropolitana y de Valparaíso. Frente a estos nuevos hallazgos, surgió la inquietud de caracterizar morfológicamente estas nuevas poblaciones, y compararlas con triatominos criados en condiciones de laboratorio, los que se asemejan a aquellos que habitan ambientes domiciliarios. Mediante morfometría geométrica se estudiaron las cabezas de ninfas de estadio V de T. infestans provenientes de laboratorio y de los focos silvestres de Calera de Tango, Región Metropolitana y Putaendo, Región de Valparaíso. Se analizaron 49 ejemplares criados en condiciones de laboratorio correspondientes a la generación número cuarenta y ocho de T. infestans, capturados en domicilios de la Región de Coquimbo durante el año 1960 y 50 ejemplares de los focos silvestres, 28 de los cuales de Calera de Tango y los 22 restantes de Putaendo, capturados entre Noviembre del año 2008 y Diciembre del año 2009. No se observaron diferencias significativas de tamaño ni conformación entre las cabezas de los individuos de laboratorio y los individuos de los focos silvestres, ni entre los individuos de Calera de Tango y los de Putaendo. De los resultados del estudio se concluye que las tres poblaciones analizadas no difieren significativamente en cuanto a su morfometría / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1070960

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, es un parásito protozoo, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, patología endémica en Latino América. La transmisión de esta enfermedad es producida por un insecto vector triatomino que, luego de alimentarse de la sangre de un mamífero, deposita sus deyecciones con las formas infectivas del parásito (tripomastigotes) las que ingresan al torrente sanguíneo a través de la lesión cutánea generada por el insecto. Una vez dentro, el parásito invade macrófagos y se divide al adoptar la forma amastigote. Luego de replicarse, los amastigotes retoman nuevamente la forma de tripomastigotes, se liberan del macrófago y por vía sanguínea o linfática invaden corazón, ganglios y otros tejidos. Las drogas usadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son efectivas durante la fase aguda de la infección; sin embargo, su efectividad es sólo parcial en la enfermedad crónica y generan diversos efectos secundarios. Para establecer una infección crónica, algunos parásitos resisten el estrés oxidativo y reparan el daño al DNA, generado por especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS/RNS) producidas por las células del sistema inmune del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría con la capacidad de reparación del DNA, donde la vía de reparación por escisión de bases (BER) juega un rol fundamental. En el inicio de esta vía participan DNA glicosidasas que reconocen bases nucleotídicas alteradas en el DNA, catalizando la hidrólisis del enlace N-glicosídico, originando un sitio abásico apurínico/apirimidínico. En esta memoria de título se determinó el efecto de la sobreexpresión de las DNA glicosidasas TcNTH1 and TcOGG1 en epimastigotes expuestos a estrés oxidativo. Se crearon dos líneas de epimastigotes de T. cruzi recombinantes para las glicosilasas TcNTH1 y TcOGG1 A diferencia de lo descrito para enzimas ortólogas de humanos, ambas DNA glicosidasas fueron localizadas principalmente en el núcleo del parásito. Por otra parte, no se evidenciaron diferencias significativas en la viabilidad de epimastigotes transfectados y controles expuestos a peróxido de hidrogeno. Nuestros resultados confirman la presencia de la vía BER en T. cruzi. Como ha sido observado en estudios realizados en células de otros organismos eucariontes, la sobrexpresión de DNA glidosidasas no incrementa la viabilidad celular frente a agentes oxidantes. En un futuro cercano se espera purificar y caracterizar ambas DNA glicosidasas, así como estudiar la viabilidad de tripomastigotes transfectados / - FONDECYT 1090124 - FONDECYT 11100053 - Proyecto - Bicentenario Anillo ACT 112

Proyecto de Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Debido a la gran importancia eco-epidemiológica y clínica de los linajes de Trypanosoma cruzi, en este estudio se analizaron 229 muestras de Triatoma infestans (56,3%) y Mepraia spinolai (43,7%) silvestres infectados por este protozoo, provenientes de seis localidades de la zona endémica de Chile. Se utilizó la técnica de DNA blot, para la detección de la región hipervariable de los minicírculos del kDNA a través de sondas específicas marcadas para los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI. TcI resultó el linaje más abundante en ambas especies de triatominos y en la mayoría de las localidades, seguido de TcII. El linaje TcV se detectó exclusivamente en T. infestans de la localidad de Calera de Tango. Además, se observó una mayor cantidad y tipos de infecciones mixtas en esta última especie, asociado a un índice de diversidad de Shannon Weaver significativamente mayor. Finalmente, también se encontraron diferencias significativas en la proporción de los linajes TcI, TcV y TcVI según estación del año, siendo todos más frecuentes en verano. Este estudio es la primera descripción de los linajes de T. cruzi circulando en las localidades de El Maqui, El Sobrante y El Atajo. Además muestra por primera vez una mayor diversidad de linajes y proporción de infecciones mixtas en T. infestans por sobre M. spinolai, y se analizan sus posibles causas e impactos. / Fondecyt 1100339 y 1120122

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas constituye un problema de salud pública en el continente americano. De acuerdo a la OMS existirían 18.000.000 personas con esta parasitosis. Brasil con 5.000.000 y Argentina con 2.200.000 infectados, son los países más afectados. En Chile se estiman que existen actualmente 200.000 chagásicos crónicos. Existen características clínicas regionales de la Enfermedad de Chagas, siendo la cardiopatía y las megaformaciones las principales manifestaciones en la etapa crónica. El diagnóstico es abordado desde el punto de vista clínico-epidemiológico y se orienta en función de la etapa de la infección. En los casos agudos, debido a la elevada parasitemia, los métodos de elección son parasitológicos y en la etapa crónica, por las fluctuantes y bajas parasitemias, la detección de T. cruzi es más compleja. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en sangre periférica de individuos chagásicos, ha permitido aumentar la sensibilidad diagnóstica. Recientemente, se ha aplicado PCR en deyecciones de triatominos alimentados mediante xenodiagnóstico (XD) en chagásicos crónicos sometidos a tratamiento quimioterapéutico. Con el fin de conocer la sensibilidad y precocidad de la detección de kDNA de T. cruzi en deyecciones de triatominos alimentados mediante XD en pacientes con enfermedad de Chagas crónica, a 25 infectados con XD (+) (Grupo I) y 25 infectados con XD (-) (Grupo II), se aplicó PCR al pool de deyecciones de triatominos incubados durante 30, 60 y 90 días. En todos los casos con XD (+) se detectó la banda específica de 330 pb. Mientras a los 60 días el XD era positivo en el 84% de los casos, PCR tuvo un 100% de positividad. En el Grupo II, de chagásicos con XD (-) a los 30, 60 y 90 días, 9 casos (36%) tuvieron PCR positivo. Los resultados permiten concluir que PCR aplicado en deyecciones de triatominos es una herramienta más precoz para detectar T. cruzi que el XD, ya que a los 30 días, XD y PCR tienen un 44% y un 92% de positividad, respectivamente. El 100% de los casos es pesquisado mediante PCR a los 60 días, mientras que el XD necesita 90 días para obtener el mismo resultado. El XD actúa como un medio de cultivo biológico para amplificar T. cruzi, lo que permite aplicar PCR en las deyecciones, por esta razón, ambas técnicas son complementarias / Financiamiento: Proyectos DI SAL 03/06-2 y Fondecyt 1040731

Biólogo con mención Medio Ambiente / En la relación parásito-hospedero se ha evidenciado que ciertos parásitos pueden producir distintos cambios en sus hospederos, incluyendo alteraciones fisiológicas, morfológicas y/o conductuales. Un ejemplo de lo anterior ocurre con individuos del insecto hematófago Mepraia spinolai infectados con el parásito protozoo Trypanosoma cruzi, agente causante de la enfermedad de Chagas en humanos. Al estar infectados, estos insectos presentan cambios en sus rasgos de historia de vida, incluyendo menor peso y tamaño, mayor tiempo de desarrollo y menor sobrevivencia con respecto a individuos no infectados; sin embargo, se desconoce las consecuencias a nivel poblacional que puede conllevar esta infección parasitaria. Mepraia spinolai es el principal vector silvestre de la enfermedad de Chagas en Chile, por lo que su estudio es de alta relevancia en salud pública. Debido a lo anterior, el objetivo de esta investigación fue realizar un análisis demográfico utilizando tablas de vida y matrices demográficas para evidenciar experimentalmente el efecto del estado de infección con T. cruzi sobre distintos parámetros demográficos de M. spinolai al comparar dos cohortes (cohorte infectada versus cohorte control) en condiciones óptimas de laboratorio. Los rasgos de historia de vida (i) sobrevivencia, (ii) fertilidad y (iii) tiempo de desarrollo de cada estadio fueron utilizados para calcular la Tasa Intrínseca de Crecimiento (r), la Tasa Finita de Crecimiento (λ), la Tasa Neta de Reproducción (Ro) y el Tiempo Generacional (Tg). Adicionalmente, se realizó un análisis de sensibilidad de λ a las tasas vitales. Los parámetros demográficos mostraron un tendencia similar en el crecimiento poblacional en ambas cohortes, sugiriendo que en insectos infectados ocurren efectos compensatorios a nivel individual que se traducen en ausencia de diferencias a nivel poblacional. / In parasite-host relationship it has been evidenced that certain parasites can produce different changes in their hosts, including physiological, morphological and/or behavioral alterations. An example of this occurs with individuals of the hematophagous insect Mepraia spinolai infected with the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, causative agent of Chagas disease in humans. When infected, these insects present changes in their life history traits, including lower weight and size, longer development time and less survival with respect to uninfected individuals; however, the consequences at population level that can carry this parasitic infection are unknown. Mepraia spinolai is the main wild vector of Chagas disease in Chile, so its study has high relevance in public health. Because of this, the objective of this study was to carry out a demographic analysis using life tables and demographic matrices to evaluate experimentally the effect of T. cruzi infection on different demographic parameters of M. spinolai by comparing two cohorts (infected cohort versus control cohort) under optimal laboratory conditions. The life history traits (i) survival, (ii) fertility and (iii) development time of each stage were used to calculate the Intrinsic Rate of Increase (r), the Finite Rate of Increase (λ), the Net Reproductive Rate (Ro) and Generational Time (Tg). In addition, a sensitivity analysis of λ to vital rates was performed. Demographic parameters showed the same trend of population growth in both cohorts, suggesting that in infected insect individuals occur compensatory effects that result in absence of differences at the population level. / Financiamiento: CONICYT-FODECYT 1140521 y 1170367