A engenharia de tecidos e a medicina regenerativa possuem como objetivo principal o restabelecimento morfológico/funcional de tecidos e órgãos lesionados com a utilização de células, matrizes celulares e células tronco, controlando as respostas imunológicas/bioquímicas promovidas pelo organismo. Adicionalmente, a ciência dos materiais busca desenvolver biomateriais biocompatíveis que não promovam reações imunológicas indesejadas e proporcionem o reestabelecimento das funções do tecido/órgão. Polímeros de origem natural destacam-se como biomateriais por assemelharem-se a macromoléculas biológicas, similaridade com a matriz extracelular, menor possibilidade de estimulação de inflamação crônica e baixa ou ausência de toxicidade. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver matrizes macromoleculares originadas do óleo de soja epoxidado (OSE), analisando a relação estrutura química/atividade biológica das matrizes macromoleculares para uso como biomaterial na engenharia de tecidos. A síntese do OSE foi efetuada pela rota oleoquímica, cuja eficiência foi determinada por espectroscopia de infravermelho e o rendimento da reação de 85% determinado por ressonância magnética nuclear de prótons. A partir da análise por calorimetria exploratória diferencial, detectou-se uma diminuição da temperatura de transição vítrea do polímero do óleo de soja (POSE) em relação ao OSE, sugerindo aumento do crescimento das cadeias poliméricas do POSE. Através da análise termogravimétrica, foi possível definir o perfil de degradação do OSE, com degradação em duas etapas, e do POSE, que degrada em apenas uma etapa e demonstra maior estabilidade térmica do POSE pelo aumento das interações moleculares. A reticulação e a hidrofilicidade do POSE foram promovidas com a adição de metacrilato de 2-hidroxietila (HEMA) à formulação por enxertia do monômero pela irradiação gama. Os resultados obtidos identificaram aumento da estabilidade mecânica, da gelificação e da absorção de água com o aumento do conteúdo de HEMA. Por fim, o grau de cristalinidade estimado para esses polímeros enxertados com HEMA de 27,5% foi definido através da difratometria de raios-X. A segunda etapa caracterizou-se pelo (i) desenvolvimento de POSEs com a enxertia de HEMA nas proporções OSE/HEMA 90:10 e 65:35 com irradiação por raios gama nas doses de 50 e 100kGy, (ii) caracterização físico-química dos POSE-HEMA e (iii) análise biológica desses materiais. Através da espectroscopia de infravermelho, pode-se detectar as regiões epoxidadas do POSE, assim como o sucesso da enxertia do monômero HEMA em todas as concentrações e doses de radiação utilizadas. Através da calorimetria exploratória diferencial, calculou-se a energia de ativação (Ea) dos polímeros. A cristalinidade dos materiais foi definida por difratometria de raios-X, mostrando caráter amorfo do material, bem como um pequeno incremento na porcentagem da cristalinidade com o aumento da intensidade das doses de radiação durante a síntese e um decréscimo dessa cristalinidade com o aumento na concentração de HEMA. A análise da citotoxicidade das amostras mostrou a ausência de toxicidade dos POSE-HEMA, confirmando a eficiência das lavagens dos polímeros para retirada de resíduos do processamento. A análise da hemocompatibilidade mostrou ausência de adesão de plaquetas e os testes de crescimento celular nas matrizes foram positivos. Através dos resultados obtidos nesta pesquisa, pôde-se concluir pelo potencial de utilização dos POSE-HEMA na engenharia de tecidos. / Tissue engineering and regenerative medicine have as main objective the morphologic/functional reestablishment of injured tissues and organs using cells, scaffolds, stem cells and control of immunological/biochemical responses promoted by the body. In addition, materials science seeks to develop biocompatible biomaterials that do not promote unwanted immune responses and provide the re-establishment of the functions of the tissue/organ. Polymers of natural origin stand out as biomaterials to resemble biological macromolecules, similarity to the extracellular matrix, reduced chance of inflammation and chronic pacing low or no toxicity. This study aimed the development of macromolecular arrays originated from epoxidized soybean oil (OSE), analyzing the relationship between the chemical structure/biological activity of the macromolecular arrays for use as biomaterials in tissue engineering. The synthesis of OSE was performed through the oleochemical route, whose efficiency was determined by infrared spectroscopy and the reaction yield of 85%, determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy. From the analysis by differential scanning calorimetry, it was detected a decrease of the glass transition temperature of the epoxidized soybean oil polymer (POSE) compared with OSE, suggesting an increase of the growth of polymer chains of POSE. Thermogravimetric analysis was performed to define the OSE degradation profile, which degrades in two steps. The POSE degrades in just one step and shows higher thermal stability by the increased molecular interactions. The hydrophilicity and crosslinking of POSE was promoted by the addition of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) with the monomer grafting by gamma irradiation. The results showed an increased mechanical stability, gelation and water absorption with the HEMA content increasing. Finally, the degree of crystallinity for such polymers grafted with HEMA was 27.5%, estimated by X-ray diffractometry. The second stage was characterized by (i) developing POSEs with the grafting of HEMA in the proportions OSE / HEMA 90:10 and 65:35 irradiated by gamma rays at doses of 50 and 100kGy, (ii) physico-chemical characterization of POSE-HEMA and (iii) analysis of biological materials. By infrared spectroscopy, it was detect the epoxidized regions of POSE, as well as the successful grafting of the monomer HEMA concentrations with all radiation doses. By differential scanning calorimetry, the activation energy was calculated (Ea) of the polymers. The crystallinity of the material was defined by X-ray diffraction, showing tendency of amorphous material as well as a small percentage of the increase in crystallinity with increasing intensity of radiation doses during this synthesis and a decrease in crystallinity with the increasing concentration of HEMA. The analysis of the samples did not show cytotoxicity on POSE-HEMA and confirmed the efficiency of polymer washings to remove the processing waste. The analysis of hemocompatibility showed any platelet adhesion and the cell growth on the scaffolds was positive. From the results obtained in this research, we concluded by the potential use of POSE-HEMA in tissue engineering.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-29T15:00:54Z No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_GONCALVES_BOECKEL_PARCIAL.pdf: 676511 bytes, checksum: cb9dde990f100982c7eac5a144973b47 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-29T15:01:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_GONCALVES_BOECKEL_PARCIAL.pdf: 676511 bytes, checksum: cb9dde990f100982c7eac5a144973b47 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T15:01:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_DANIEL_GONCALVES_BOECKEL_PARCIAL.pdf: 676511 bytes, checksum: cb9dde990f100982c7eac5a144973b47 (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The present research aims to characterize the mesenchymal stem cells of adipose origin (MSCAs) and to evaluate its use on the scaffold of hyaluronic acid (HA) as a cellular compound for bone tissue engineering. Firstly, cell characterization was performed through the collection of epididymal adipose tissue, isolation, culture and in vitro expansion. Through the morphological analysis of MSCAs culture it was possible to confirm elongated fusiform characteristic, centralized nucleus, extensions and adhesion to the plastic bottle. Expansion analysis also demonstrated a high cell proliferative index during the 26 days of in vitro culture. The Flow Cytometry test allowed the identification of the main surface markers that characterize the mesenchymal stem cells (CD29 and CD90) and negative for hematopoietic markers (CD31 and CD45). Moreover, MSCAs when induced to adipogenic and osteogenic media showed plasticity, since they were able to differentiate into adipocytes and osteoblasts respectively. The cell viability test was also performed in vitro, through the M.T.T (mitochondrial activity) of MSCAs on the HA scaffold. Concentrations of 100%, 75%, 50%, 25% and 15% were evaluated on the HA scaffold at times of 24, 48 and 72 hours. The results have shown cellular viability above 60% in almost all times and concentrations. Then, 50 critical bone defects were performed in the femoral region with 2 mm in diameter (one defect per femur) in 25 Lewis rats. The grafting treatments were divided as follows: I-negative control / only the defect (C); II-HA Scaffold; III- MSCAs; IV- MSCAs + HA and V- MSCAs previously osteoinduced + HA. After 23 days the rats were euthanized and had 5 femurs used for the microtomographic (?-CT) and histomorphometric analysis and 5 femurs used for the RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) analysis. The results for the ?-CT tests in the volume of osseous tissue parameter (VOT) and the percentage of osseous tissue (POT) did not present statistical differences among all groups. However, on the osseous contact surface (SCO) and osseous surface density (DSO) parameters, we had groups IV, III and V with higher indexes and differing statistically from the negative control groups I and group II. In histomorphometry we also had groups IV, V and III with greater area of regenerated bone tissue and differing with significance from groups I and II. The results were analyzed statistically by Analysis of Variance one way (ANOVA) and the level of significance was 5% (p <0.05). Regarding RT-PCR, a statistically significant difference was observed only when we evaluated osteonectin (ON) in which group II and V were more expressive in relation to groups III and IV. Regarding osteopontin (OP) and Type I collagen (Col1A), no differences were identified among the treated groups. The results were analyzed using Kruskal-Wallis non-parametric test and the significance level set was 5% (p <0.05). / A presente pesquisa tem por objetivo caracterizar as c?lulas-tronco mesenquimais de origem adiposa (CTMAs) e avaliar seu uso sobre a matriz de ?cido hialur?nico (AH) como composto celular para engenharia tecidual ?ssea. Primeiramente, foi realizada a caracteriza??o celular atrav?s da coleta do tecido adiposo epididimal, isolamento, cultivo e expans?o in vitro. Atrav?s da an?lise morfol?gica da cultura das CTMAs foi poss?vel confirmar caracter?stica fusiforme alongada, n?cleo centralizado, prolongamentos e ades?o ? garrafa pl?stica. A an?lise de expans?o tamb?m comprovou um alto ?ndice proliferativo celular, durante os 26 dias de cultura in vitro. J? o teste de citometria de fluxo permitiu a identifica??o dos principais marcadores de superf?cie que caracterizam as c?lulas-tronco mesenquimais (CD29 e CD90) e sendo negativo para marcadores hematopoi?ticos (CD31 e CD45). As CTMAS tamb?m quando induzidas aos meios adipog?nico e osteog?nico mostraram plasticidade, j? que foram capazes de diferenciarem-se em adip?citos e osteoblastos, respectivamente. Ainda in vitro, foi realizado o teste de viabilidade celular atrav?s do MTT (atividade mitocondrial), ap?s o contato das CTMAs sobre a matriz de AH. As concentra??es de 100%, 75%, 50%, 25% e 15% foram avaliadas sobre a matriz de AH nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Os resultados comprovaram uma viabilidade celular acima de 60% em quase todos os tempos e concentra??es. Em seguida, foram realizados 50 defeitos ?sseos cr?ticos (DOC) na regi?o femoral com 2 mm de di?metro (um defeito por f?mur) em 25 ratos Lewis. Os tratamentos de enxertia realizados foram divididos da seguinte forma: I-controle negativo / apenas o defeito (C); II- matriz AH; III-CTMAs; IV-CTMAs + AH e V- CTMAs osteoinduzida + AH. Ap?s 23 dias os ratos sofreram eutan?sia e tiveram 5 f?mures utilizados para as an?lises microtomogr?ficas (?-CT) e histomorfom?trica e 5 f?mures utilizados para a an?lise por RT-PCR (Rea??o em cadeia da Polimerase em tempo Real). Os resultados para os testes por ?-CT no par?metro volume de tecido ?sseo (VTO) e porcentagem de tecido ?sseo (PTO) n?o apresentaram diferen?as estat?sticas entre todos os grupos. J?, nos par?metros superf?cie de contato (SCO) e densidade de superf?cie ?ssea (DSO) tivemos o grupo IV, III e V com maiores ?ndices e diferindo estatisticamente dos grupos controle negativo I e do grupo II. Na histomorfometria tamb?m tivemos os grupos IV, V e III com maiores ?reas de tecido ?sseo regenerado e diferindo com signific?ncia dos grupos I e II. Os resultados foram analisados estatisticamente pela An?lise de Vari?ncia de uma via (ANOVA) o n?vel de signific?ncia estabelecido foi de 5% (p < 0,05). Em rela??o ao RT-PCR, observou-se diferen?a estatisticamente significante apenas quando foi avaliada osteonectina (ON), sendo que o grupo II e V apresentaram maior express?o em rela??o aos grupos III e IV. Em rela??o ? osteopontina (OP) e ao col?geno Tipo I (Col1A) n?o foram identificadas diferen?as entres os grupos tratados. Os resultados foram analisados atrav?s do teste n?o param?trico de Kruskal-Wallis e o n?vel de signific?ncia estabelecido foi de 5% (p < 0,05).

A engenharia de tecidos e a medicina regenerativa possuem como objetivo principal o restabelecimento morfológico/funcional de tecidos e órgãos lesionados com a utilização de células, matrizes celulares e células tronco, controlando as respostas imunológicas/bioquímicas promovidas pelo organismo. Adicionalmente, a ciência dos materiais busca desenvolver biomateriais biocompatíveis que não promovam reações imunológicas indesejadas e proporcionem o reestabelecimento das funções do tecido/órgão. Polímeros de origem natural destacam-se como biomateriais por assemelharem-se a macromoléculas biológicas, similaridade com a matriz extracelular, menor possibilidade de estimulação de inflamação crônica e baixa ou ausência de toxicidade. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver matrizes macromoleculares originadas do óleo de soja epoxidado (OSE), analisando a relação estrutura química/atividade biológica das matrizes macromoleculares para uso como biomaterial na engenharia de tecidos. A síntese do OSE foi efetuada pela rota oleoquímica, cuja eficiência foi determinada por espectroscopia de infravermelho e o rendimento da reação de 85% determinado por ressonância magnética nuclear de prótons. A partir da análise por calorimetria exploratória diferencial, detectou-se uma diminuição da temperatura de transição vítrea do polímero do óleo de soja (POSE) em relação ao OSE, sugerindo aumento do crescimento das cadeias poliméricas do POSE. Através da análise termogravimétrica, foi possível definir o perfil de degradação do OSE, com degradação em duas etapas, e do POSE, que degrada em apenas uma etapa e demonstra maior estabilidade térmica do POSE pelo aumento das interações moleculares. A reticulação e a hidrofilicidade do POSE foram promovidas com a adição de metacrilato de 2-hidroxietila (HEMA) à formulação por enxertia do monômero pela irradiação gama. Os resultados obtidos identificaram aumento da estabilidade mecânica, da gelificação e da absorção de água com o aumento do conteúdo de HEMA. Por fim, o grau de cristalinidade estimado para esses polímeros enxertados com HEMA de 27,5% foi definido através da difratometria de raios-X. A segunda etapa caracterizou-se pelo (i) desenvolvimento de POSEs com a enxertia de HEMA nas proporções OSE/HEMA 90:10 e 65:35 com irradiação por raios gama nas doses de 50 e 100kGy, (ii) caracterização físico-química dos POSE-HEMA e (iii) análise biológica desses materiais. Através da espectroscopia de infravermelho, pode-se detectar as regiões epoxidadas do POSE, assim como o sucesso da enxertia do monômero HEMA em todas as concentrações e doses de radiação utilizadas. Através da calorimetria exploratória diferencial, calculou-se a energia de ativação (Ea) dos polímeros. A cristalinidade dos materiais foi definida por difratometria de raios-X, mostrando caráter amorfo do material, bem como um pequeno incremento na porcentagem da cristalinidade com o aumento da intensidade das doses de radiação durante a síntese e um decréscimo dessa cristalinidade com o aumento na concentração de HEMA. A análise da citotoxicidade das amostras mostrou a ausência de toxicidade dos POSE-HEMA, confirmando a eficiência das lavagens dos polímeros para retirada de resíduos do processamento. A análise da hemocompatibilidade mostrou ausência de adesão de plaquetas e os testes de crescimento celular nas matrizes foram positivos. Através dos resultados obtidos nesta pesquisa, pôde-se concluir pelo potencial de utilização dos POSE-HEMA na engenharia de tecidos. / Tissue engineering and regenerative medicine have as main objective the morphologic/functional reestablishment of injured tissues and organs using cells, scaffolds, stem cells and control of immunological/biochemical responses promoted by the body. In addition, materials science seeks to develop biocompatible biomaterials that do not promote unwanted immune responses and provide the re-establishment of the functions of the tissue/organ. Polymers of natural origin stand out as biomaterials to resemble biological macromolecules, similarity to the extracellular matrix, reduced chance of inflammation and chronic pacing low or no toxicity. This study aimed the development of macromolecular arrays originated from epoxidized soybean oil (OSE), analyzing the relationship between the chemical structure/biological activity of the macromolecular arrays for use as biomaterials in tissue engineering. The synthesis of OSE was performed through the oleochemical route, whose efficiency was determined by infrared spectroscopy and the reaction yield of 85%, determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy. From the analysis by differential scanning calorimetry, it was detected a decrease of the glass transition temperature of the epoxidized soybean oil polymer (POSE) compared with OSE, suggesting an increase of the growth of polymer chains of POSE. Thermogravimetric analysis was performed to define the OSE degradation profile, which degrades in two steps. The POSE degrades in just one step and shows higher thermal stability by the increased molecular interactions. The hydrophilicity and crosslinking of POSE was promoted by the addition of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) with the monomer grafting by gamma irradiation. The results showed an increased mechanical stability, gelation and water absorption with the HEMA content increasing. Finally, the degree of crystallinity for such polymers grafted with HEMA was 27.5%, estimated by X-ray diffractometry. The second stage was characterized by (i) developing POSEs with the grafting of HEMA in the proportions OSE / HEMA 90:10 and 65:35 irradiated by gamma rays at doses of 50 and 100kGy, (ii) physico-chemical characterization of POSE-HEMA and (iii) analysis of biological materials. By infrared spectroscopy, it was detect the epoxidized regions of POSE, as well as the successful grafting of the monomer HEMA concentrations with all radiation doses. By differential scanning calorimetry, the activation energy was calculated (Ea) of the polymers. The crystallinity of the material was defined by X-ray diffraction, showing tendency of amorphous material as well as a small percentage of the increase in crystallinity with increasing intensity of radiation doses during this synthesis and a decrease in crystallinity with the increasing concentration of HEMA. The analysis of the samples did not show cytotoxicity on POSE-HEMA and confirmed the efficiency of polymer washings to remove the processing waste. The analysis of hemocompatibility showed any platelet adhesion and the cell growth on the scaffolds was positive. From the results obtained in this research, we concluded by the potential use of POSE-HEMA in tissue engineering.

Introdução: A engenharia tecidual óssea com utilização de células-tronco mesenquimais é um campo de pesquisas com potencial para aplicação clínica em cirurgia plástica reparadora. Suas vantagens seriam ampliar as opções de reconstrução e diminuir a morbidade cirúrgica nas zonas doadoras. Não está definida na literatura médica a possibilidade de utilizar o osso liofilizado bovino nãodesmineralizado como estrutura tridimensional e carreadora celular para engenharia tecidual óssea. Objetivo: Avaliar o uso de células da medula óssea, com potencial osteogênico, agregadas a estrutura tridimensional de osso liofilizado bovino nãodesmineralizado para engenharia tecidual óssea, em modelo experimental heterotópico. Materiais e Métodos: Os animais doadores de células da medula óssea, assim como os animais receptores dos construtos ósseos, foram camundongos de linhagem isogênica C57Bl/6. Os construtos ósseos consistiram em osso liofilizado bovino não-desmineralizado (OL) associado a diferentes grupos celulares com potencial osteogênico, e foram implantados no plano subcutâneo no dorso dos animais, em procedimento cirúrgico compatível com a primeira etapa da confecção de retalho osteocutâneo pré-fabricado. Grupos de comparação (n=10 em cada grupo): 1) OL isoladamente (controle); 2) OL + células mononucleares da medula; 3) OL + células-tronco mesenquimais; 4) OL + células-tronco mesenquimais diferenciadas em meio osteoindutor. A aferição foi realizada após 5 semanas, com avaliação histológica e determinação da atividade de fosfatase alcalina. Resultados: A avaliação histológica não mostrou diferença entre os grupos de comparação. Em todas as amostras observou-se processo inflamatório crônico, com nítida reabsorção óssea, e com tecido conjuntivo fibroso circunjacente ao implante estendendo-se por entre as trabéculas ósseas. Não foram visualizados osteoblastos ou osteócitos viáveis, nem neoformação óssea, em nenhum dos cortes histológicos examinados. Os resultados da atividade de fosfatase alcalina também não mostraram diferença entre os grupos de comparação, com análise de variância entre grupos mostrando p=0,867. Discussão: No modelo estudado, a adição de células da medula óssea com potencial osteogênico sobre estrutura de osso liofilizado bovino não-desmineralizado não agregou propriedades osteogênicas ao material. Com isso, não se confirmou a perspectiva inicial de utilizá-lo como estrutura tridimensional e carreadora celular na engenharia tecidual óssea em sítio heterotópico. Para melhor definir o papel deste material, sugerem-se estudos subseqüentes que o avaliem em outros modelos experimentais, comparando com outros materiais de uso já estabelecido, e explorando separadamente cada etapa metodológica que possa influir no sucesso da engenharia tecidual óssea. / Introduction: Bone tissue engineering using mesenchymal stem cells is a research area with potential applicability in reconstructive plastic surgery, aiming to broaden surgical choices and decrease morbidity in donor sites. It has not been established in the medical literature whether bovine non-demineralized lyophilized bone can be used as a scaffold and cell carrier for bone tissue engineering. Objective: To assess the use of bone marrow cells with osteogenic potential seeded on a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold for bone tissue engineering in a heterotopic experimental model. Materials and Methods: The donors of bone marrow cells, as well as the receptors of the osseous constructs were isogenic line C57BI/6 mice. The constructs consisted on bovine non-demineralized lyophilized bone (LB) with addition of different cell groups with osteogenic potential, and they were implanted into subcutaneous sites on the backs of the animals in a surgical procedure compatible with an osteocutaneous flap pre-fabrication. Comparison groups (n=10 each group): 1) LB alone (control group); 2) LB + marrow mononuclear cells 3) LB + mesenchymal stem cells; 4) LB + mesenchymal stem cells differentiated in an osteoinductive medium. The constructs were harvested at 5 weeks after implantation for histological analysis and alkaline phosphatase activity test. Results: The histological analysis did not show differences among the comparison groups. In all samples, chronic inflammatory process was observed, with evident osseous resorption, and with adjacent fibrous connective tissue rich in neovessels extending through bone trabeculae. Viable osteoblasts or osteocytes , as well as new bone formation, were not observed. Likewise, results of the alkaline phosphatase activity test have not shown any difference among comparison groups, with analys of variance between groups showing p value=0.867. Discussion: In this experimental model, the addition of bone marrow cells with osteogenic potential to a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold did not add osteogenic properties to the material. Therefore, the initial perspective of using it as a scaffold for bone tissue engineering in heterotopic sites could not be confirmed. In order to better define the role of this material, further studies should be conducted, assessing it in other experimental models, comparing it with other materials currently in use and separately exploring each methodological step that might influence the success of bone tissue engineering.

Orientadora: Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2016. / A pele está sujeita a lesões por diversos fatores e dimensões. Essas lesões podem ser amenizadas e o tecido original recuperado devido às propriedades regenerativas deste tecido. Porém, nos casos em que a lesão é extensa e o paciente não possui quantidade de tecido suficiente para recompor a área perdida uma solução é o uso de substitutos dérmicos aplicados na reconstrução da ferida. Dentre os materiais disponíveis na engenharia como substitutos de pele, o colágeno e a gelatina estão entre os mais promissores devido a suas características químicas, físicas e biológicas similares a derme natural. Devido ao baixo custo em sua obtenção e grande disponibilidade, a utilização de gelatina de origem porcina, como substitutos de pele homogênea em reconstrução de tecidos vem sendo usada desde a década de 60, e atualmente novas formas de aplicação vem sendo estudadas. No presente trabalho, foram feitas caracterizações físico-químicas e biológicas da gelatina porcina, inicialmente indicada para uso como agente hemostático. Dos resultados foi possível inferir que o biomaterial apresenta estrutura e comportamento similares a outras estruturas usadas como matrizes de cultivo para células, apresentando boa interação com o biomaterial, proliferação e crescimento celular tanto ao redor, quanto em sua superfície e parede dos poros. Desta forma pode-se afirmar que o biomaterial é biocompatível, sendo possivelmente uma alternativa a matrizes para cultura celularaplicada a engenharia tecidual. / The skin is subject to injury due to various factors and dimensions. These lesions can be softened and the original tissue recovered due to the regenerative properties of this tissue. However, in cases where the lesion is extensive and the patient does not have sufficient tissue to recover the lost area, a solution is the use of dermal substitutes applied in the reconstruction of the wound. Among the materials available in engineering as skin substitutes, collagen and gelatin are among the most promising because of their chemical, physical and biological characteristics similar to natural dermis. Due to the low cost of obtaining and high availability, the use of porcine gelatine as homogeneous skin substitutes in tissue reconstruction has been used since the 1960s, and currently new forms of application have been studied. In the present work, physico-chemical and biological characterizations of porcine gelatine were made, initially indicated for use as hemostatic agent. From the results it was possible to infer that the biomaterial presents structure and behavior similar to other structures used as cell culture matrices, showing good interaction with the biomaterial, proliferation and cell growth both around and on the surface and wall of the pores. In this way it is possible to affirm that the biomaterial is biocompatible, being possibly an alternative to matrices for cellular culture applied to tissue engineering.

Evidence shows there is no ideal membrane, i.e., biocompatible, biodegradable, with adequate mechanical and physical properties that enable reorganization of periodontal tissues. Eletrospinning technique has demonstrated good processing results on scaffolds made from polymers. Nanofibrous formed by this technique have characteristics that resemble the extracellular matrix. The aim of this study was to evaluate the biocompatibility of nanofibrous polydioxanone scaffolds (PDS II®) containing metronidazole or ciprofloxacin in subcutaneous implantation model in rats Wistar. PDS II® is biocompatible polyester having various applications in the medical field. Our conceptual hypothesis considers that scaffolds with antimicrobials have similar inflammatory behavior when compared to PDS positive control. Sixty adult male rats were randomized into 6 groups: negative control (SHAM) animals with incision and surgical pocket, without scaffold; positive control (PDS) animals with PDS scaffolds; 1MET animals with one PDS scaffold containing 25%wt metronidazole; 2MET animals with two PDS scaffolds containing 25%wt metronidazole, 1CIP animals with PDS scaffolds containing 25%wt ciprofloxacin; 2CIP animals with two PDS scaffolds containing 25%wt ciprofloxacin. Animals were euthanized at 3 days (n=30) and 30 days (n=30), corresponding to initial and late inflammatory responses, respectively. Outcomes measures were the degradation of collagen fibers (Picrosirius Red and Masson´s trichrome), activity of cellular enzyme (Myeloperoxidase activity and N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity) and local oxidative profile (reactive oxygen species, lipid peroxidation, protein carbonyl, vitamin C, catalase and reduced glutathione). Dara were analyzed statistically (p<0.05) by two-way ANOVA (treatment and time). Collectively, results show that antibiotics scaffolds have a lower inflammatory response compared to PDS group. Among the nanofibers with antibiotics, the group showed better early and late inflammatory response was 2CIP. The findings of this research suggest the potential study of these scaffolds with metronidazole and ciprofloxacin in regenerative models, able to confirm the effectiveness of these artificial matrices for periodontal regeneration. / Evidências mostram que não há membranas ideais, ou seja, biocompatíveis, biodegradáveis, com propriedades mecânicas e físicas adequadas que permitam a reestruturação dos tecidos periodontais. A técnica do eletrospinning tem demonstrado bons resultados no processamento de scaffolds confeccionados a partir de polímeros. As nanofibras formadas por esta técnica possuem características que se assemelham a matriz extracelular. O objetivo do presente estudo foi avaliar a biocompatibilidade de scaffolds nanofibrosos de polidioxonona (PDS II®) contendo metronidazol ou ciprofloxacina em modelo de implantação subcutânea em ratos Wistar. A PDS II® é um poliéster biocompatível com diversas aplicações na área médica. Nossa hipótese conceitual considerou que scaffolds com antimicrobianos teriam semelhante comportamento inflamatório quando comparados ao controle positivo PDS. Sessenta ratos machos adultos foram randomizados em seis grupos: controle negativo (SHAM) - animais com incisão e loja cirúrgica, ausentes de scaffolds; controle positivo (PDS) - animais com scaffolds de PDS, 1 scaffold PDS com 25%wt de metronidazol (1MET), 2 scaffolds PDS com 25%wt de metronidazol (2MET), 1 scaffold PDS com 25%wt de ciprofloxacina (1CIP), 2 scaffolds com 25%wt de ciprofloxacina (2CIP). Os animais foram eutanasiados em 3 (n=30) e 30 dias (n=30), correspondendo a resposta inflamatória inicial e tardia, respectivamente. Os desfechos avaliados foram degradação de fibras colágenas (Picrosírius Red e Tricrômico de Masson), atividade de enzimáticas celulares (mieloperoxidase e N-Acetil β-D-Glicosaminidase) e perfil oxidativo local [espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica (LP), proteína carbolinada (PC), catalase (CAT), vitamina C (VIT.C) e glutationa reduzida (GSH)]. Os dados foram analisados estatisticamente (p<0,05) através do teste Two-way ANOVA (tratamento e tempo). Coletivamente, os resultados mostram que scaffolds com antibióticos possuem menor resposta inflamatória se comparado ao grupo PDS. Entre as nanofibras com antibióticos, o grupo que apresentou melhor resposta inflamatória inicial e tardia foi 2 CIP. Os achados desta pesquisa sugerem o potencial estudo destes scaffolds com metronidazol e ciprofloxacina em modelos regenerativos, capazes de confirmar a efetividade dessas matrizes artificiais para a regeneração periodontal.

Introdução: A engenharia tecidual óssea com utilização de células-tronco mesenquimais é um campo de pesquisas com potencial para aplicação clínica em cirurgia plástica reparadora. Suas vantagens seriam ampliar as opções de reconstrução e diminuir a morbidade cirúrgica nas zonas doadoras. Não está definida na literatura médica a possibilidade de utilizar o osso liofilizado bovino nãodesmineralizado como estrutura tridimensional e carreadora celular para engenharia tecidual óssea. Objetivo: Avaliar o uso de células da medula óssea, com potencial osteogênico, agregadas a estrutura tridimensional de osso liofilizado bovino nãodesmineralizado para engenharia tecidual óssea, em modelo experimental heterotópico. Materiais e Métodos: Os animais doadores de células da medula óssea, assim como os animais receptores dos construtos ósseos, foram camundongos de linhagem isogênica C57Bl/6. Os construtos ósseos consistiram em osso liofilizado bovino não-desmineralizado (OL) associado a diferentes grupos celulares com potencial osteogênico, e foram implantados no plano subcutâneo no dorso dos animais, em procedimento cirúrgico compatível com a primeira etapa da confecção de retalho osteocutâneo pré-fabricado. Grupos de comparação (n=10 em cada grupo): 1) OL isoladamente (controle); 2) OL + células mononucleares da medula; 3) OL + células-tronco mesenquimais; 4) OL + células-tronco mesenquimais diferenciadas em meio osteoindutor. A aferição foi realizada após 5 semanas, com avaliação histológica e determinação da atividade de fosfatase alcalina. Resultados: A avaliação histológica não mostrou diferença entre os grupos de comparação. Em todas as amostras observou-se processo inflamatório crônico, com nítida reabsorção óssea, e com tecido conjuntivo fibroso circunjacente ao implante estendendo-se por entre as trabéculas ósseas. Não foram visualizados osteoblastos ou osteócitos viáveis, nem neoformação óssea, em nenhum dos cortes histológicos examinados. Os resultados da atividade de fosfatase alcalina também não mostraram diferença entre os grupos de comparação, com análise de variância entre grupos mostrando p=0,867. Discussão: No modelo estudado, a adição de células da medula óssea com potencial osteogênico sobre estrutura de osso liofilizado bovino não-desmineralizado não agregou propriedades osteogênicas ao material. Com isso, não se confirmou a perspectiva inicial de utilizá-lo como estrutura tridimensional e carreadora celular na engenharia tecidual óssea em sítio heterotópico. Para melhor definir o papel deste material, sugerem-se estudos subseqüentes que o avaliem em outros modelos experimentais, comparando com outros materiais de uso já estabelecido, e explorando separadamente cada etapa metodológica que possa influir no sucesso da engenharia tecidual óssea. / Introduction: Bone tissue engineering using mesenchymal stem cells is a research area with potential applicability in reconstructive plastic surgery, aiming to broaden surgical choices and decrease morbidity in donor sites. It has not been established in the medical literature whether bovine non-demineralized lyophilized bone can be used as a scaffold and cell carrier for bone tissue engineering. Objective: To assess the use of bone marrow cells with osteogenic potential seeded on a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold for bone tissue engineering in a heterotopic experimental model. Materials and Methods: The donors of bone marrow cells, as well as the receptors of the osseous constructs were isogenic line C57BI/6 mice. The constructs consisted on bovine non-demineralized lyophilized bone (LB) with addition of different cell groups with osteogenic potential, and they were implanted into subcutaneous sites on the backs of the animals in a surgical procedure compatible with an osteocutaneous flap pre-fabrication. Comparison groups (n=10 each group): 1) LB alone (control group); 2) LB + marrow mononuclear cells 3) LB + mesenchymal stem cells; 4) LB + mesenchymal stem cells differentiated in an osteoinductive medium. The constructs were harvested at 5 weeks after implantation for histological analysis and alkaline phosphatase activity test. Results: The histological analysis did not show differences among the comparison groups. In all samples, chronic inflammatory process was observed, with evident osseous resorption, and with adjacent fibrous connective tissue rich in neovessels extending through bone trabeculae. Viable osteoblasts or osteocytes , as well as new bone formation, were not observed. Likewise, results of the alkaline phosphatase activity test have not shown any difference among comparison groups, with analys of variance between groups showing p value=0.867. Discussion: In this experimental model, the addition of bone marrow cells with osteogenic potential to a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold did not add osteogenic properties to the material. Therefore, the initial perspective of using it as a scaffold for bone tissue engineering in heterotopic sites could not be confirmed. In order to better define the role of this material, further studies should be conducted, assessing it in other experimental models, comparing it with other materials currently in use and separately exploring each methodological step that might influence the success of bone tissue engineering.

Introdução: A engenharia tecidual óssea com utilização de células-tronco mesenquimais é um campo de pesquisas com potencial para aplicação clínica em cirurgia plástica reparadora. Suas vantagens seriam ampliar as opções de reconstrução e diminuir a morbidade cirúrgica nas zonas doadoras. Não está definida na literatura médica a possibilidade de utilizar o osso liofilizado bovino nãodesmineralizado como estrutura tridimensional e carreadora celular para engenharia tecidual óssea. Objetivo: Avaliar o uso de células da medula óssea, com potencial osteogênico, agregadas a estrutura tridimensional de osso liofilizado bovino nãodesmineralizado para engenharia tecidual óssea, em modelo experimental heterotópico. Materiais e Métodos: Os animais doadores de células da medula óssea, assim como os animais receptores dos construtos ósseos, foram camundongos de linhagem isogênica C57Bl/6. Os construtos ósseos consistiram em osso liofilizado bovino não-desmineralizado (OL) associado a diferentes grupos celulares com potencial osteogênico, e foram implantados no plano subcutâneo no dorso dos animais, em procedimento cirúrgico compatível com a primeira etapa da confecção de retalho osteocutâneo pré-fabricado. Grupos de comparação (n=10 em cada grupo): 1) OL isoladamente (controle); 2) OL + células mononucleares da medula; 3) OL + células-tronco mesenquimais; 4) OL + células-tronco mesenquimais diferenciadas em meio osteoindutor. A aferição foi realizada após 5 semanas, com avaliação histológica e determinação da atividade de fosfatase alcalina. Resultados: A avaliação histológica não mostrou diferença entre os grupos de comparação. Em todas as amostras observou-se processo inflamatório crônico, com nítida reabsorção óssea, e com tecido conjuntivo fibroso circunjacente ao implante estendendo-se por entre as trabéculas ósseas. Não foram visualizados osteoblastos ou osteócitos viáveis, nem neoformação óssea, em nenhum dos cortes histológicos examinados. Os resultados da atividade de fosfatase alcalina também não mostraram diferença entre os grupos de comparação, com análise de variância entre grupos mostrando p=0,867. Discussão: No modelo estudado, a adição de células da medula óssea com potencial osteogênico sobre estrutura de osso liofilizado bovino não-desmineralizado não agregou propriedades osteogênicas ao material. Com isso, não se confirmou a perspectiva inicial de utilizá-lo como estrutura tridimensional e carreadora celular na engenharia tecidual óssea em sítio heterotópico. Para melhor definir o papel deste material, sugerem-se estudos subseqüentes que o avaliem em outros modelos experimentais, comparando com outros materiais de uso já estabelecido, e explorando separadamente cada etapa metodológica que possa influir no sucesso da engenharia tecidual óssea. / Introduction: Bone tissue engineering using mesenchymal stem cells is a research area with potential applicability in reconstructive plastic surgery, aiming to broaden surgical choices and decrease morbidity in donor sites. It has not been established in the medical literature whether bovine non-demineralized lyophilized bone can be used as a scaffold and cell carrier for bone tissue engineering. Objective: To assess the use of bone marrow cells with osteogenic potential seeded on a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold for bone tissue engineering in a heterotopic experimental model. Materials and Methods: The donors of bone marrow cells, as well as the receptors of the osseous constructs were isogenic line C57BI/6 mice. The constructs consisted on bovine non-demineralized lyophilized bone (LB) with addition of different cell groups with osteogenic potential, and they were implanted into subcutaneous sites on the backs of the animals in a surgical procedure compatible with an osteocutaneous flap pre-fabrication. Comparison groups (n=10 each group): 1) LB alone (control group); 2) LB + marrow mononuclear cells 3) LB + mesenchymal stem cells; 4) LB + mesenchymal stem cells differentiated in an osteoinductive medium. The constructs were harvested at 5 weeks after implantation for histological analysis and alkaline phosphatase activity test. Results: The histological analysis did not show differences among the comparison groups. In all samples, chronic inflammatory process was observed, with evident osseous resorption, and with adjacent fibrous connective tissue rich in neovessels extending through bone trabeculae. Viable osteoblasts or osteocytes , as well as new bone formation, were not observed. Likewise, results of the alkaline phosphatase activity test have not shown any difference among comparison groups, with analys of variance between groups showing p value=0.867. Discussion: In this experimental model, the addition of bone marrow cells with osteogenic potential to a bovine non-demineralized lyophilized bone scaffold did not add osteogenic properties to the material. Therefore, the initial perspective of using it as a scaffold for bone tissue engineering in heterotopic sites could not be confirmed. In order to better define the role of this material, further studies should be conducted, assessing it in other experimental models, comparing it with other materials currently in use and separately exploring each methodological step that might influence the success of bone tissue engineering.

Orientadora: Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello / Coorientadora: Profa. Dra. Ana Paula Romani / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, São Bernardo do Campo, 2018. / Neste trabalho foi avaliado o potencial uso em engenharia de tecidos de blendas de quitosana (QTS) e poli(álcool vinílico) (PVOH). O objetivo deste trabalho foi avaliar se uma blenda polimérica composta por QTS/PVOH (3:1) mantém esse potencial. Foram analisadas amostras das matérias-primas, ou seja, os polímeros puros de QTS e PVOH, além da blenda de QTS/PVOH (3:1) não reticulada, a blenda reticulada com 1% e com 5% m/m de glutaraldeído e a blenda reticulada com 1% e 5% m/m de glioxal. Foram realizadas medidas da rugosidade superficial e de degradação em condições fisiológicas por 14 dias. As medições da rugosidade superficial mostraram que, de modo geral as blendas possuem uma maior variação de rugosidade, enquanto que os polímeros puros são mais homogêneos. Entretanto, a rugosidade superficial não influenciou de maneira significativa a viabilidade e adesão celular. A reticulação com o glutaraldeído parece provocar um atraso na degradação dos filmes em condições fisiológicas. Não era desejado que houvesse a presença dos agentes reticulantes na forma livre nos filmes devido à sua toxicidade. Através das espectroscopias de FTIR e FT-Raman não foi observada a presença destes agentes. As avaliações biológicas foram feitas por meio de ensaios in vitro de citotoxicidade direta e por extrato, análise da interação de células com os biomateriais com microscópio eletrônico de varredura (MEV). Nos ensaios que envolveram cultura de células foi utilizada a linhagem de células Vero. A avaliação da morfologia celular para citotoxicidade direta não revelou nenhum efeito citotóxico significativo por parte dos biomateriais. O uso da técnica de MTT para avaliação da citotoxicidade por extrato revelou um decréscimo da viabilidade observada nas células em contato com os extratos das blendas reticuladas. A análise por MEV das amostras dos biomateriais na presença de cultura de células indicou que as blendas reticuladas com 1 % de glutaraldeído ou com glioxal possuem um melhor desempenho em relação a adesão e proliferação celular do que as não-reticuladas. Também foi estudada a forma com que as diferentes composições influenciam na adesão celular e a reticulação por glioxal parece atrasar, mas não inibir o processo. Em conclusão, a partir dos resultados obtidos, as blendas de QTS/PVOH apresentam potencial para o uso em engenharia de tecidos, com a reticulada com 1% de glutaraldeído sendo a mais promissora. / At the present work it was sought to assess the potential use in tissue engineer of chitosan (QTS) and poly(vinyl alcohol) (PVOH). Both QTS and PVOH shows advantageous characteristics to their usage as biomaterials intended for tissue engineer, and this work's objective was to evaluate if a polymeric blend composed of QTS/PVOH (3:1) retains this potencial. There were evaluated samples of the original biomaterials, that was the pure QTS and PVOH polymers, as well as the QTS/PVOH blend (3:1), the 1 % and 5 % m/m glutaraldehyde cross-linked blends and the 1 % and 5 % m/m glyoxal cross-linked blends. The superficial rugosity was measured and it was studied the degradation of the films for 14 days. The rugosity variation between the films didn't result in differences of cell adhesion and proliferation. The glutaraldehyde cross-linking slowed down the degradation of the films. It wasn't desired that there were traces of free cross-linking agents, because of their toxicity. With the FTIR and FT-Raman spectroscopy it was observed that there weren't any free cross-linking agents within the films. The biological evaluations were performed by direct and by extracts in vitro cytotoxicity essay, by observation of cell interaction with the biomaterials with scanning electron microscopy (SEM) and by surface roughness. At the essays that involved cell cultures, it was used Vero lineage cells. The direct cytotoxicity were evaluated by cell morphology and didn't reveal any significant cytotoxic effect by the biomaterials. The extract cytotoxicity showed a decrease of cell viability with the cross-linked blends extracts, but it was uncertain if this is due a cytotoxic effect or other factor. The samples SEM analysis showed that the 1 % glutaraldehyde cross-linked blend and the glyoxal cross-linked blends provided a more suitable surface for cell adhesion and proliferation than the non cross-linked ones. The surface roughness measurements revealed that, in general, the blends have more roughness variation along their surface, while the pure polymers show a more homogeneous surface. However, the surface roughness didn't influence in a significant way the cell viability. In conclusion, from the present results, the QTS/PVOH blends exhibit potencial for tissue.

A translação da regeneração pulpar com células tronco para a clinica requerirá o uso de scaffolds injetáveis. O objetivo foi estudar o comportamento de células tronco obtidas de dentes decíduos exfoliados (SHED) injetados em canais radiculares de pré-molares humanos com ápice aberto com scaffold de colágeno recombinante humano tipo I (rhC-I) e a base de nanofibras auto-organizáveis (SA). Para determinar a viabilidade e potencial de diferenciação de SHED in vitro, raízes nao instrumentadas foram posicionadas com o ápice em meio de cultura. SHED ressuspendida em rhC e SA foram injetadas nos canais (n=24, 5X105 células/mL). Os controles foram SHED e scaffolds sozinhos. Marcadores para diferenciação odontoblastica (DSPP, DMP-1 e MEPE) foram avaliados semanalmente por RT-PCR por 28 dias. Para avaliar a diferenciação odontoblástica e formação de tecido in vivo, SHED transuzida com GFP foram injetadas em canais radiculares (n=8, 106 célulass/mL) utilizando os mesmos grupos e implantadas subcutaneamente em camundongos imunodeprimidos. O controle (C+) foi um pré-molar humano extraído. Analise estatística foi feita com ANOVA (=0.05). Os marcadores de diferenciação odontoblástica aumentaram para SA e rhC-I mas nao nos controles. Crescimento de tecido pulpar-símile ( do que 60% do comprimento da raiz) foi observado em 75% dos implantes para SA e rhC-I e 0% nos controles. Analise de imunohistoquimica para GFP confirmou a origem tecidual a partir de SHED. PCNA e ensaio de TUNEL mostraram alta ativiade proliferativa e poucas células apoptóticas. Injeções de tetraciclina evidenciaram neoformação de dentina. A densidade microvascular e nomero de odontoblastos delineando a dentinta foi similar em rhC-I, SA e C+. A associação de SHED com scaffolds injetáveis foi capaz de originar um tecido pulpar capaz de produzir dentina e constitui um passo a mais frente ao objetivo de regeneração pulpar em pacientes humanos. / The translation of dental pulp regeneration with stem cells to the clinic will require the use of injectable scaffolds. The aim was to study the behavior of stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) injected in the root canal of opened-apex human premolars with either recombinant human collagen I (rhC-I) or selfassembling nanofiber (SA) scaffolds. To assess in vitro SHED viability and differentiative potential, non-instrumented roots were set with the apex in culture media. SHED were mixed in rhC-I or SA and injected into canals (n=24, 5X105 cells/mL). Controls were SHED or scaffolds alone. Odontoblastic differentiation markers (DSPP, DMP-1 and MEPE) were assessed weekly by RT-PCR for 28 days. To evaluate odontoblast differentiation and tissue formation in vivo, SHED transduced with GFP were injected in canals (n=8, 106 cells/mL) using same groups and implanted subcutaneously in immunodeficient mice. Positive control (C+) was extracted premolar. Statistic was done with ANOVA (=0.05). Odontoblastic differentiation markers increased in SA and rhC-I but not in controls. Pulp-like tissue growth ( than 60% of root length) was observed in 75% of implants for SA and rhC-I and 0% in controls. GFP staining confirmed SHEDs tissue origin. PCNA staining and TUNEL assay showed high proliferative activity and few apoptotic cells. Tetracycline injections showed newly formed dentin. Microvessel density and odontoblastic-like cell number lining dentin were similar in rhC-I, SA and C+. Injectable scaffolds and SHED allowed for the engineering of a pulp-like tissue and constitute one step forward towards the goal of dental p ulp regeneration in human patients.