Submitted by Natalia Cristine Dias Dos Santos null (santos.nataliacris@gmail.com) on 2018-01-04T14:17:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertação.pdf: 3720898 bytes, checksum: 25acdc7e7879412ae2dcd73e6d9407ea (MD5) / Approved for entry into archive by Laura Akie Saito Inafuko (linafuko@assis.unesp.br) on 2018-01-08T15:30:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_ncd_me_assis.pdf: 3720898 bytes, checksum: 25acdc7e7879412ae2dcd73e6d9407ea (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-08T15:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_ncd_me_assis.pdf: 3720898 bytes, checksum: 25acdc7e7879412ae2dcd73e6d9407ea (MD5) Previous issue date: 2017-11-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Vários estudos têm apontado que a interação de plasma rico em plaquetas (PRP) com células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano (CT-TAs) é capaz de otimizar o processo regenerativo, estimulando a angiogênese e o recrutamento de células para o local da lesão. O avanço no conhecimento sobre os aspectos físico-químicos do gel de PRP, bem como na interação e no comportamento das CT-TAs quando associadas ao gel poderão resultar em aplicações práticas em processos de regeneração tecidual. Em função disso, objetivou-se analisar diferentes parâmetros relativos a aspectos morfológicos, físico-químicos e estrutural do gel de PRP isolado ou em associação com CT-TAs (PRP/CT-TAs). As análises dos géis foram realizadas por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e da técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Também foi avaliada a viabilidade e migração das CT-TAS após associação ao gel de PRP. Os resultados mostraram que as CT-TAs continuam viáveis, mantendo suas propriedades, assim como o gel de PRP, após a associação. Não foram observadas alterações estruturais nos géis de PRP isolado e PRP/CT-TAs, preservando os perfis físico-químicos das amostras. Concomitantemente com estes resultados, observou-se que o gel de PRP pode proporcionar um ambiente favorável às células, permitindo proliferação e migração celular. Os resultados obtidos permitem concluir que o gel de PRP pode ser usado como um potencial scaffold, mantendo as células viáveis quando encapsuladas, preservando os aspectos físico-químicos das CT-TAs e do PRP quando em associação. Além disso, pode-se propor que gel de PRP exerce efeitos positivos sob as CT-TAs, estimulando a proliferação e a viabilidade celular. / Several studies have shown that the platelet-rich plasma (PRP) in association with human adipose-derived mesenchymal stem cells (h-AdMSCs) is able to optimize the regenerative process, stimulating angiogenesis and the recruitment of cells to the lesion site. Advancing in the knowledge of the physico-chemical aspects of PRP-gels, as well as in the interaction and behavior of h-AdMSCs when associated to the gel will result in practical applications in tissue regeneration processes. Therefore, the aim of this study was to evaluate different morphological, physic-chemical and structural parameters of the isolated PRP-gel or in association with h-AdMSCs (PRP/h-AdMSCs). The PRP-gels were submitted to scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy technique (FTIR). The h-AdMSCs viability and migration after association with the PRP-gel were also evaluated. The results showed that as h-AdMSCs remain viable, retaining their properties, as the PRP gel, after association. There were no structural changes in the PRP gels isolated and PRP/h-AdMSCs, so maintaining the physical-chemical profiles of the samples. Additionally to these results, it was observed that the PRP-gel can provide a favorable environment for cells, allowing its proliferation and migration. In summary, it is possible to conclude that PRP-gel can be used as a potential scaffold, maintaining cell viability when encapsulated and preserving the physical-chemical aspects of h-AdMSCs and PRP when in association. In addition, it may be proposed that PRP gel exert chemotatic effects for h-AdMSCs, stimulating cell proliferation and viability.

Orientador: Osmir Batista de Oliveira Junior / Abstract: A regeneração óssea caracteriza-se por ser um processo fisiológico complexo que envolve a participação coordenada entre angiogênese e osteogênese. Envolve um processo de múltiplas etapas que inclui migração, proliferação e diferenciação de vários tipos de células, como células endoteliais, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos. Sabe-se que os biomateriais sintéticos têm demonstrado ser uma excelente alternativa ao reparo ósseo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do Biosilicato de sódio (BS) e dos compósitos 3D de 30% de hidroxiapatita e ácido poliláctico (3D 30% HA / PLA) e 30% hidroxiapatita e ácido poli (ácido láctico-co-glicólico) (30% HA / PLGA), e em defeitos críticos na calvária de ratos. Cento e vinte ratos machos de 90 dias com 350g de massa corporal em média foram aleatoriamente divididos em grupos de acordo com materiais de enxerto e tempo de análise, apresentando 6 animais em cada um. Os defeitos de tamanho crítico foram criados empregando-se uma trefina de 8 mm de diâmetro interno e preenchidos com os materiais mencionados ou apenas o coágulo sanguíneo como controle. Após 14 (T1), 30 (T2), 60 (T3), 90 (T4) e 120 dias (T5) dias do procedimento cirúrgico, a regeneração óssea foi avaliada por radiografia, microtomografia computadorizada (μ-CT) e histologia. A avaliação macroscópica mostrou biocompatibilidade em torno da área de interesse entre os biomateriais e ossos adjacentes. As imagens de μ-CT e de raios-x revelaram uma considerável formação ... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: The process of bone regeneration requires a coordinated coupling between osteogenesis and angiogenesis involveing a multistep process that includes migration, proliferation, and differentiation of several types of cells such as endothelial, fibroblasts, osteoblasts and osteoclasts. It is known that synthetic biomaterials have been proven to be an excellent alternative to bone repair. Thus, the aim of this study is to evaluate the effect of calcium and sodium Biosilicate (BS), a 3D scaffold of hydroxyapatite and polylactic acid (30% HA / PLA) and a hydroxyapatite and poly (lactic-co-glycolic acid) (30% HA / PLGA) composites in critical-sized calvarial defects. One hundred and twenty 90 days old male rats with 350g of body mass on average were randomly divided into groups (n = 6) according to graft materials and analysis time. Critical-size defects were created by means of a 8 mm inner diameter trephine bur and were filled with a 3D 30% HA/PLGA scaffold, 30% HA/PLA, BS or blood clot as control. After 15 (T1), 30 (T2), 60 (T3), 90 (T4) and 120 (T5) days of the cirurgical procedure, bone regeneration was evaluated by histology, x-ray and micro-computed tomography (µ-CT). Macroscopic evaluation showed no significant inflamation around the interest area. µ-CT results indicates that 30% HA/PLA and 3D 30% HA/PLGA composites were not fully degraded and images revealed considerable bone formation in 90 days and 120 days in relation to these materials. On the other hand, BS presented a ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Hamilto Akihissa Yamamoto / Coorientador: José Carlos Sozua Trindade Filho / Coorientador: Eunice Deffune / Banca: Juliany Gomes Quitzan / Banca: Paulo Roberto Kawano / Banca: Wagner José Fávaro / Banca: Renata Aparecida de Camargo Bittencourt / Resumo: A engenharia de tecidos tem se mostrado promissora para o tratamento de lesões e doenças da uretra. No presente estudo, foi demonstrada a caracterização das células de músculo liso de bexiga de coelhos e seu implante em matrizes acelulares de aorta de suínos para reparo de lesão na uretra de coelhos. Aortas de dez suínos foram obtidas, descelularizadas e colocadas em cultura com células de músculo liso provenientes de bexiga de dez coelhos, para servirem como modelo no reparo de tecido uretral. As aortas foram descelularizadas com sodium dodecyl sulfate (SDS) a 0,1% e tiveram seu coeficiente de rigidez testado, cujos resultados demonstraram a mesma resistência antes e depois do processo. As células de músculo liso cultivadas foram caracterizadas por citometria de fluxo com o anticorpo anti-CD90 e por imunocitoquímica usando o anticorpo Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (- SMA). Com os resultados da citometria de fluxo excluiu-se a possibilidade da presença de células-tronco mesenquimais ou fibroblastos junto à cultura de células de músculo liso, enquanto que com a imunocitoquímica comprovou-se o perfil das células de músculo liso. A viabilidade das células foi mantida em 99,31% quando em contato com a matriz, demonstrando que o modelo proposto é um excelente biomaterial para uso como scaffold de células. Seu uso na reconstrução de uretra com lesões complexas pode ser considerado com otimismo, podendo resolver problemas relacionados à quantidade insuficiente de tecido na região / Abstract: Tissue engineering has shown promise for treatment in urethras injuries and diseases. In the present study, we demonstrated the rabbits smooth muscle cells of the bladder characterization and their implantation in an acellular porcine aorta for repairing injuries in rabbits urethras. Ten porcine abdominal aortas were obtained and placed in culture with rabbit bladders smooth muscle cells from ten animals to serve as a template for the repair of urethral tissue. The aortas were deccelularized with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and had a coefficient of stiffness test, whose results showed the same resistance before and after the process. The smooth muscle cultured cells were characterized by flow cytometry with anti-CD90 antibody and by immunocytochemistry using Anti-Alpha Smooth Muscle Actin (-SMA) antibody. The results of flow cytometry excluded the possibility of the presence of mesenchymal stem cells or fibroblasts by the smooth muscle cells culture, whereas immunocytochemistry confirmed the profile of smooth muscle cells. When in contact with the matrix, cell viability was maintained at 99.31%, demonstrating that the proposed model is an excellent biomaterial for use as cell scaffold. Its use in urethral complex lesions reconstruction can be seen with optimism and solve problems related to insufficient quantities of urinary tissue / Doutor

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: Um dos objetivos da Medicina e superar os danos causados ao organismo por doencas, senilidade e traumas, restabelecendo um equilibrio normo-funcional. Nas perdas teciduais, inumeros autores afirmam que o substituto gideal h e o proprio tecido saudavel, de mesma origem ou o tecido produzido por Engenharia Tecidual (ET). Porem, ainda sao necessarias muitas pesquisas para a utilizacao in vivo. Objetivo: Avaliar tres suplementos hemoderivados, empregados em meios de cultivo, quanto a proliferacao celular e o dano celular de celulas-tronco de origem dentaria. Metodos: Foram realizados cinco experimentos a partir de dentes terceiros molares em desenvolvimento. Apos a digestao enzimatica, as celulas-tronco adultas foram cultivadas em quatro diferentes meios de cultivo. Meio I, isento de suplemento hemoderivado; meio II, suplementado com FBS (heterologo); meio III, suplementado com soro humano homologo; meio IV, suplementado com soro humano autologo. Essas culturas foram analisadas comparativamente quanto a proliferacao celular, submetidas a testes com marcadores Von Kossa e Alizarina Vermelha durante quatro semanas (avaliadas semanalmente) e a cada duas semanas quanto as unidades formadoras de colonias (UFCs). No 28o dia as quatro culturas foram submetidas ao teste do gcometa h, analisando-se possivel dano no DNA celular. Os resultados foram submetidos a analise estatistica de Variancia de Friedman, estabelecendo-se significancia para (p) . a 5%. Resultados: O meio de cultivo IV atingiu uma proliferacao celular superior ao Meio I, demonstrando um resultado significante (p*=0,0074). O meio de cultivo II, mostrou proliferacao superior ao meio I e desenvolvimento semelhante ao meio III, porem nenhum demonstrou significancia em relacao ao meio IV. Os resultados do teste do cometa evidenciaram um menor dano celular nas culturas do meio IV em relacao ao meio II e meio III. As UFCs foram numerosas nos meios IV e III respectivamente, havendo maior indice de mineralizacao no meio IV do que nos meios II e III. Conclusao: O meio de cultivo suplementado com hemoderivado autologo favoreceu significativamente a proliferacao celular. O hemoderivado humano mostrou-se viavel como suplemento nas culturas de celulas-tronco dentarias humanas. / Introduction: One among many aims of medicine is to overcome injuries inflicted to the organism by diseases, aging and trauma, re-establishing the usual functions. About tissues losses, several authors claim that the ideal replacement is the healthy tissue itself, originated from the same source or developed by Tissue Engineering (TE). However, much research is needed before in vivo application. Objective: To evaluate three different kinds of sera supplies used in stem cell culture media, as to cellular proliferation and cellular injuries on dental stem cell. Methods: Five experiments were made utilizing incompletely developed third molar teeth. After enzymatic digestion, the adult stem cells were cultivated in four different kinds of culture media. Medium I, serum free (SF); medium II, supplied with FBS (heterologous serum- HeS); medium III, supplied with homologous human serum (homologous serum- HoS) and medium IV, supplied with autologous human serum (autologous serum . AuHS).These cultures were analyzed comparatively as to cellular proliferation; they were submitted Von Kossa (VK) and Alizarin Red (AR) markers tests for four weeks (checked weekly), and each two weeks checked for Colonies Forming Unities (CFUs). On the 28th day, all four cultures were submitted to comet assay, and were inspected for possible cellular DNA injuries. The results underwent a non-parametric statistical Friedman fs variance test, with significance (p) . 5%. Results: Culture medium IV reached a cellular proliferation rate higher than medium I, showing a significant result (p*=0,0074). Culture medium II presented a superior proliferation result than medium I, and similar to medium III, although neither of them presented significant result when compared to medium IV. The comet assay fs results showed minor cellular DNA injury in the medium IV cultures, when compared to medium II and III cultures. The CFUs were numerous in the media IV and III cultures, respectively, and there was higher mineralization rate in the medium IV than in the media II and III. Conclusion: The culture medium supplied with AuHS significantly improved cellular proliferation. Human sera proved to be a viable supply to human dental stem cell culture. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-05-25 / INTRODUÇÃO: O plasma rico em plaquetas (PRP) é a concentração autóloga de plaquetas em pequeno volume de plasma, obtido por centrifugação do sangue total com anticoagulante, sendo considerada importante fonte de fatores de crescimento (FC). A sua utilização enfatiza a regeneração tecidual. OBJETIVO: Obter o plasma rico em plaquetas (PRP) por meio de centrífuga de bancada. MÉTODOS: Foram coletos 40ml de sangue total de oito voluntários, para 72 testes, divididos em três grupos (grupos controle, de uma centrifugação, e de duas centrifugações), com variação da força de centrifugação em 200, 400 e 800g. RESULTADOS: Verificou-se que a concentração, no Grupo Duas Centrifugações, apresentou média inferior ao mensurado no Grupo Controle. O Grupo Uma Centrifugação, com a força centrifuga relativa de 200g, apresentou os maiores valores de contagem (417.750/μl), bem como as maiores concentrações de plaquetas (99,03%), que equivaleu a 1,99 vezes o aumento no número das plaquetas do GCt, enquanto que forças de centrifugação superiores foram insuficientes para o enriquecimento. CONCLUSÃO: Obteve-se o plasma rico em plaquetas (PRP), a partir de centrifuga de bancada, com maior concentração na força de 200g. / BACKGROUND: Platelet-rich plasma is an autologous concentration of autologous platelets in a small volume of plasma, obtained by centrifugation of the whole blood, and have been considered to be a rich source of growth factors. OBJECTIVE: Establish a method to prepare a platelet-rich plasma by centrifugation. METHODS: In this study 40 ml from the whole blood was obtained from eight volunteers, and seventy-two tests were performed in three groups (control, one spin, and two spins), changing the intensity performing from 200, 400 and 800g, to establish the method that achieves the optimal platelet enrichment and concentration. RESULTS: The optimal platelet concentration enrichment obtained with the group of two spins was inferior than values was obtained with the group of one spin. In those groups of one spin the enrichment of 99.03% of the platelet concentration was obtained with the relative centrifuge force of 200g. CONCLUSION: Platelet-rich plasma with high platelets counts can be prepared using the method of centrifugation, with highest concentration with the force of 200g. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.

Introdução: O uso de telas de polipropileno para reforço em cirurgias para correção de prolapso vaginal apresenta taxas de complicação de até 25%. Trata-se de doença de alta prevalência, acometendo até 30% das mulheres, cujas opções atuais de tratamento foram reduzidas após a descontinuação da fabricação dos reforços tradicionais por diversos fabricantes. Uma alternativa é a utilização de matrizes sintéticas de outros materiais e com outras configurações, possibilitando inclusive cultura de células em seu leito. A eletrofiação possibilita a produção e reprodução em larga escala dessas matrizes a partir de polímeros solúveis expostos a um campo elétrico. Objetivos: Estabelecer parâmetros de produção de matrizes com fibras híbridas e randômicas através de eletrofiação, demonstrar sua reprodutibilidade e implantar tal tecnologia em solo brasileiro. Testar as seguintes características teóricas das matrizes híbridas produzidas com acido polilático (PLLA): maior força tênsil nos testes biomecânicos e biocompatibilidade mantida para cultura celular. Estudar a influência da cultura de células-tronco mesenquimais derivadas de adipócitos (CTDA) sobre as propriedades mecânicas das matrizes estudadas. Avaliar a influência da hidrólise na perda de força tênsil das matrizes em experimentos de até 90 dias. Métodos: Foram produzidas matrizes de PLLA dissolvidos em diclorometano (DCM) nas configurações de fibras randômicas, alinhadas e um novo método foi desenvolvido para produção de matrizes híbridas. Foram realizados microscopia eletrônica, testes biomecânicos, testes de atividade metabólica e biocompatibilidade com cultivo de células-tronco derivadas de adipócitos, além de testes de degradação em meio de cultura por 90 dias para comparar as matrizes. Análise de variância (ANOVA) com teste de Tukey foram utilizados para comparação dos resultados obtidos nos experimentos quando aplicáveis. Resultados: A produção de matrizes híbridas foi possível ajustando-se os parâmetros de eletrofiação. Imagens de microscopia comprovaram o alinhamento e hibridização das fibras. Testes uniaxiais mostraram que as matrizes híbridas foram 3 a 4 vezes mais resistentes a tração do que as matrizes randômicas (p < 0,0001) preservando sua biocompatibilidade e afinidade celular. A incorporação de células às matrizes híbridas e o experimento de degradação mostraram quedas nas propriedades mecânicas de força tênsil máxima das matrizes híbridas a partir de 14 dias em meio de cultura, mas sempre se mantendo acima das propriedades dos tecidos nativos pelo período estudado de até 90 dias. Conclusões: Foi possível o desenvolvimento de nova técnica de eletrofiação para produção de matrizes híbridas de fibras alinhadas e randômicas com maior força tênsil, ainda sim mantendo sua afinidade celular. Tais matrizes enfraqueceram no período de 90 dias estudado, sem contudo apresentar valores abaixo dos fisiológicos, mostrando-se como opção promissora para substituição de telas de polipropileno em clínica. Estudos com animais são necessários para confirmar essa hipótese / Introduction: Traditional reinforcement techniques for pelvic organ prolapse use mainly polypropylene meshes with complication rates up to 25%. It is a common disease with prevalence up to 30%, with reduced options of treatment after withdrawing of major companies from this market. An alternative is the use of synthetic matrices from other materials with other configurations, possibly with cell culture added. Electrospinning is a reproducible technique that uses solved polymers exposed to intense electric field to produce sheets like that. Objectives: Establish parameters to electrospin hybrid and random fibres and setup this technology in Brazil. Prove following theoretical characteristics of hybrid poly- L-lactide (PLLA) matrices: higher tensile strength in biomechanical tests with comparable biocompatibility. Study adipose derived stem cells (ADSC) culture impact over biomechanical properties of these matrices. Check hydrolysis influences on tensile strength up to 90 days. Methods: PLLA solved in dichloromethane (DCM) was electrospun in random fibres, align fibres and a novel method was developed to produce hybrid fibres. Electron microscopy (SEM), biomechanical tests, metabolic activity and biocompatibility with adipose-derived stem cells and additionally, degradation test up to 90 days in culture medium were performed to compare matrices. ANOVA with Tukey test of differences was used to compare experiment results. Results: The production of hybrid matrices was possible adjusting electrospinning parameters, SEM confirmed fibre\'s alignment and hybridization, uniaxial tests showed that hybrid matrices were 3 to 4 times stronger than random ones (p < 0,0001) maintaining its biocompatibility and cell affinity. Both cell incorporation to hybrid matrices and degradation experiment showed mechanical properties drop (ultimate tensile strength) after 14 days in culture medium but always keeping it above physiologic range up to 90 days studied. Conclusions: Development of new technique of electrospinning of hybrid matrices of align and random fibres was possible, with higher tensile strength and keeping the same cell affinity. These matrices showed drop in mechanical strength along 90 days of study but always above the natural tissues range being a promising option to polypropylene meshes in clinic. Further studies with animals are needed to confirm this hypothesis

A engenharia de tecido pulpar tem como objetivo substituir a polpa dentária inflamada ou necrosada por um tecido saudável e funcional, capaz de formar nova dentina para reparar a estrutura dentária perdida. Assim, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a habilidade de diferenciação de célulastronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED) em odontoblastos funcionais, demonstrando a formação de tecido mineralizado in vivo; e estudar o efeito de VEGF em SHED com relação à estimulação de vias de sinalização celular (STAT3, AKT e ERK), proliferação, migração, formação de estruturas tubulares e diferenciação em células endoteliais. O início do processo de mineralização de SHED tratadas com dexametasona, ácido ascórbico \'beta\' - glicerofosfato pôde ser detectado por meio da produção da enzima fosfatase alcalina a partir da segunda semana de cultura, mas a expressão de RNAm para DSPP só foi observada após 28 dias de indução. Utilizando-se o modelo de fatias de dentes e matrizes condutivas implantadas no dorso de camundongos imunodeprimidos, demonstrou-se a diferenciação de SHED em células semelhantes a odontoblastos, as quais tiveram imunomarcação positiva com o anticorpo DMP-1. A deposição de dentina, seguindo um ritmo centrípeto de crescimento, numa taxa de 14,1 µm por dia também foi demonstrada por meio da marcação com tetraciclina. O tratamento das SHED com VEGF estimulou a fosforilação de ERK e AKT e a diminuiu a fosforilação de STAT3 em um período de uma hora, provavelmente por meio de sua ligação com os receptores VEGFR-1 e NP-1 presentes nestas células. Além disso, VEGF intensificou a organização das SHED em estruturas tubulares, havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado a partir do 5o dia de tratamento. Entretanto, VEGF não estimulou a proliferação nem a migração destas células. Os resultados de RT-PCR mostraram que SHED cultivadas em fatias de dentes e matrizes condutivas expressaram VEGFR-2 já após o primeiro dia de estímulo com VEGF. Ademais, os quatro marcadores de células endoteliais (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 e Caderina-VE) foram observados após 21 dias sob estímulo de VEGF, resultado ainda mais evidente aos 28 dias. In vivo, observou-se que SHED transfectadas com o gene LacZ foram capazes de formar estruturas semelhantes a vasos sangüíneos quando implantadas em camundongos, mas a presença de sangue no seu interior não pôde ser observada após 21 dias de implante. Portanto, SHED podem ser estimuladas a se diferenciar em odontoblastos funcionais, capazes de produzir estrutura mineralizada semelhante à dentina. Ademais, VEGF interfere nas vias de sinalização STAT3, ERK e AKT e estimula a formação de estruturas tubulares e a diferenciação de SHED em células endoteliais, mas não a proliferação e migração de SHED. Acreditamos que tecnologia igual ou semelhante à empregada neste estudo poderá eventualmente fornecer ferramentas clínicas para tratamentos endodônticos que visem à regeneração de um tecido pulpar completo e formação de tecido dentinário num futuro não muito distante. / Dental pulp tissue engineering aims to replace the inflamed or necrotic pulp by a healthy and functionally competent tissue able to form new dentin in order to repair lost structure. The purposes of this work were: to evaluate the differentiation ability of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) into functional odontoblasts, showing the formation of mineralized tissue in vivo; and to study the effect of VEGF on SHED with regards to the stimulation of cell signaling pathways (STAT3, AKT and ERK), the proliferation, migration, capillary sprouting, and the differentiation into endothelial cells. The beginning of the mineralization process of SHED treated with dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate could be detected through the production of alkaline phosphatase after the second week of culture, but the expression of DSPP mRNA was only observed after 28 days of induction. Using the tooth slice and scaffold model implanted in the dorsum of immunocompromised mice, the differentiation of SHED into odontoblast-like cells, which were immunostained with DMP-1 antibody, was demonstrated. Dentin deposition following a centripetal rhythm, in a rate of 14.1 µm per day, was also shown through the tetracycline labeling. VEGF treatment of SHED stimulated the ERK and AKT phosphorilation, and decreased the phosphorilation of STAT3 over 1 hour period, presumably due to its binding to VEGFR-1 and NP-1 receptors in these cells. In addition, VEGF enhanced SHED organization into tubular structures, with statistically significant difference between the treated group and the non-treated one after the 5th day of treatment. However, VEGF did not stimulate proliferation and migration of these cells. RT-PCR results demonstrated that SHED seeded in the tooth slices and scaffolds expressed VEGFR-2 after the first day of VEGF stimulation. Moreover, the four endothelial cell markers (VEGFR-1, VEGFR-2, CD31 and VE-Cadherin) were observed after 21 days of VEGF stimulation, and this result was even clearer after 28 days. In vivo, SHED transduced with LacZ gene were able to give rise to blood vessel-like structures when implanted in immunocompromised mice, but the presence of blood flow was not observed after 21 days of implantation. Therefore, SHED can be stimulated to differentiate into functional odontoblasts, which in turn are able to produce mineralized structure resembling dentin. Furthermore, VEGF interferes with the STAT3, ERK and AKT signaling pathways, and stimulates the formation of tubular structures and the differentiation of SHED into endothelial cells, but does not stimulate SHEDs proliferation and migration. We believe that the same technology employed in this study or a similar one can eventually provide clinical tools for the endodontic treatments aiming at regenerating a complete pulp tissue and forming a dentin tissue in a near future.

INTRODUÇÃO: Apesar dos primeiros relatos sobre o uso clínico de células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC) sugerirem que esta abordagem seja factível e efetiva na reconstrução de partes moles, não existem na literatura ensaios clínicos randomizados e com inclusão de controles. Assim sendo, foi objetivo deste estudo investigar se um novo protocolo para o isolamento de ADSC e seu uso em conjunto com os enxertos de gordura é de fato capaz de aumentar a sobrevivência destes enxertos. MÉTODOS: Pacientes com microssomia craniofacial (n=18) foram selecionados e randomicamente distribuídos para o grupo EC (com suplementação de ADSC) ou o grupo EE (sem suplementação de ADSC). Para o grupo EC, ADSC imediatamente isoladas a partir de metade do volume lipoaspirado foram utilizadas para o enriquecimento de células progenitoras do enxerto. A quantidade de tecido adiposo transplantado foi determinada pela simetria com o lado não afetado, não sendo realizado qualquer tipo de supercorreção. O número total de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos de gordura foi calculado, e através de citometria de fluxo estas células foram examinadas quanto à presença de marcadores de superfície para células mesenquimais. Tomografia computadorizada foi realizada para avaliar ambas as hemifaces no pré-operatório e no pós-operatório de seis meses. A espessura do revestimento de partes moles em quatro diferentes pontos de referência e o volume das hemifaces foram calculados. Morbidade geral e variáveis transoperatórias foram registradas. RESULTADOS: Para ambos os grupos o volume médio injetado foi de aproximadamente 28 mL. O número médio de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos foi 5,6 x 105 e 9,9 x 105 células por mL de tecido adiposo (p=0,015). Análise de citometria de fluxo revelou que ADSC foram positivas para marcadores de células mesenquimais (>95% para CD 73 e CD 105). No pós-operatório de seis meses, o índice de espessura média nos pontos de 1 a 4 foi de 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), e 1,00 (p=0,04) no grupo EC, e 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), e 0,84 (p=0,59) no grupo EE. Para o grupo EC o volume de gordura mantido após seis meses foi de 84 % e para o grupo EE foi de 51 % (p=0,003). Nenhuma complicação foi detectada. CONCLUSÕES: Estes resultados sugerem que o isolamento e a suplementação de ADSC é efetivo, seguro e superior à lipoenxertia convencional para o aumento de partes moles da face em pacientes portadores de microssomia craniofacial / INTRODUCTION: Although first reports of the clinical use of adipose-derived stromal cells (ADSC) suggest that this approach may be feasible and effective for soft tissue reconstruction, there is a lack of randomized, controlled clinical trials in the literature. Hence, this study aimed to investigate whether a novel protocol for isolation of ADSC and their use in combination with fat tissue could really improve the long-term retention of the grafts. METHODS: Patients with craniofacial microsomia (n=18) were selected and randomly assigned to group EC (with supplementation of ADSC) or group EE (without supplementation of ADSC). For group EC, ADSC freshly isolated from half of the aspirated fat sample were used to enrich for progenitor cells in the graft. Amount of transplanted adipose tissue was determined by trying to obtain symmetry with the unaffected side without any overcorrection. Number of viable cells isolated before and after the supplementation of the grafts was calculated, and these cells were examined for mesenchymal cell surface markers using flow cytometry. Computed tomography was performed to assess both hemifaces preoperatively and at six months postoperatively. Soft tissue thicknesses at four different reference points and the hemifaces volume were calculated. Overall morbidity and surgical variables were recorded. RESULTS: For both groups mean injected volume was 28 mL. Average number of viable cells isolated before and after supplementation of the grafts was 5,6 x 105 and 9,9 x 105 cells per mL of fat tissue (p=0,015). Flow cytometry analysis revealed that the ADSC were positive for mesenchymal cell markers (>95% for CD 73 and CD 105). At six months postoperatively, average thickness ratio at points 1 to 4 was 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), and 1,00 (p=0,04) in group EC, and 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), and 0,84 (p=0,59) in group EE. For group EC surviving fat volume at six months was 84 % and for group EE it was 51 % (p=0,003). No complications were detected. CONCLUSIONS: These results suggest that this strategy for isolation and supplementation of ADSC is effective, safe and superior to conventional lipoinjection for facial recontouring in patients with craniofacial microsomia