Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-26T13:10:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_11_04_16_digital_Adriane Borges.pdf: 2262044 bytes, checksum: dbae9d1c06e8de343e9296fef77dafc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-26T13:10:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_11_04_16_digital_Adriane Borges.pdf: 2262044 bytes, checksum: dbae9d1c06e8de343e9296fef77dafc2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / FACEPE / Enterobacter aerogenes e Enterobacter cloacae são importantes patógenos causadores de Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS), podendo apresentar diferentes genes de virulência e de resistência a antimicrobianos. O objetivo desse estudo foi caracterizar e comparar genomicamente isolados de E. aerogenes e E. cloacae multidrogas resistentes (MDR), provenientes de um Hospital público de Recife-PE entre 2011 e 2013, através da investigação de genes relacionados à resistência a antimicrobianos e à virulência, como também analisar o perfil plasmidial e relação clonal dos isolados. Portanto, este estudo foi dividido em três etapas: (1) caracterizar fenotipicamente e genotipicamente 51 isolados de E. aerogenes e E. cloacae provenientes de infecção ou colonização em pacientes de um hospital público de Recife-PE, Brasil, através de perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, análises de genes de β-lactamase por PCR e sequenciamento de DNA, perfil plasmidial e ERIC-PCR; (2) realizar o primeiro sequenciamento genômico de 2 isolados de E. aerogenes, blaKPC-2 positivos, provenientes de colonização (Ea5A) e de infecção (Ea7A) em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) de um mesmo hospital, além de análise comparativa com 2 cepas de E. aerogenes sequenciadas anteriormente e (3) realizar sequenciamento genômico de 2 isolados de E. cloacae, blaCTX-M-15 positivos, provenientes de infecções: Ec2A (secreção ocular) e Ec7A (hemocultura) em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva neonatal (UTI neo) de um mesmo hospital, além de análise comparativa com cepas de E. cloacae sequenciadas anteriormente. Em ambas as espécies houve detecção de altas taxas para ESBL (41%) e carbapenemases (18% para E. cloacae e 88% para E. aerogenes), com identificação das variantes: blaTEM-1, blaCTX-M-15 e blaKPC-2. Os isolados apresentaram disseminação clonal, com E. cloacae blaCTX-M positivo disseminado na UTI neonatal e E. aerogenes blaKPC positivo na UTI e em outros setores do hospital. Foi visto que apesar dos isolados apresentarem relação clonal pela ERIC-PCR apresentaram diferentes perfis plasmidiais e de resistências, além de, diferentes genes de resistência. O sequenciamento genômico permitiu a detecção de: (1) vasto arsenal de genes de resistência a beta-lactâmicos, assim como, genes de resistência a outras classes de antimicrobianos, (2) diversos genes de virulência relacionados a adesinas fimbriais, sideróforos, cápsula e biofilme e (3) cinco tipos de sistemas de efluxo e quatro tipos de sistemas de secreção, relacionados pricipalmente à resistência e virulência, respectivamente. Em relação à análise comparativa dos genomas, foi visto que apesar de serem clones pela ERIC-PCR e provenientes do mesmo setor hospitalar, ambas as espécies apresentaram diferenças sutis no quantitativo de genes totais, genes de resistência, genes de virulência, sistemas de efluxo e secreção, além de características exclusivas de cada isolado. Também foi possível detectar que dentre os isolados de E. aerogenes, foi visto que o isolado proveniente de colonização (Ea5A), apresentou genes de virulência potenciais para estabelecer a infecção, além de elementos genéticos móveis capazes de transmitir diversos genes para outras bactérias presentes na microbiota entérica do paciente, o que reforça a importância da colonização no contexto de IRAS. Considerando os isolados de E. cloacae sequenciados genomicamente, o isolado proveniente de hemocultura (Ec7A) mostrou maior número de determinantes de resistência (beta-lactamases e sistemas de efluxo) que o isolado proveniente de secreção ocular, o que pode dificultar o tratamento e consequentemente favorecer a evolução para estágios mais severos como sepse e choque séptico. Os resultados aqui apresentados evidenciam o vasto arsenal de genes de resistência e virulência albergados pelos isolados de E. aerogenes e E. cloacae o que pode facilitar o estabelecimento da infecção e dificultar o tratamento.

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:05:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kota_DanielJiro_M.pdf: 555074 bytes, checksum: 910a5d4735f12d01edac8766de74e9c5 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A bactéria Enterobacter cloacae tem se destacado como importante agente de infecção hospitalar, muitas vezes levando ao óbito de pacientes imunodeprimidos. Estudando as propriedades de virulência desta bactéria em nosso laboratório, foi detectado que 18% das amostras estudadas demonstraram atividade citotóxica sobre células Vero. A citotoxina, de peso molecular de 100 KDa, foi purificada da amostra com maior atividade citotóxica (118.9) por cromatografia de troca iônica e exclusão molecular, não mostrou atividade letal em camundongos e não causou acúmulo de fluido em intestino de camundongos recém-nascidos. Além disso, não apresentou atividade leucotóxica. Quanto à sua propriedade hemolítica, constatou-se que a toxina purificada apresentou atividade hemolítica sobre eritrócitos de coelho, carneiro e boi, sendo não hemolítica sobre eritrócitos humanos, com presença ou ausência de ~mercaptoetanol. O mecanismo de ação desta toxina parece estar relacionado com o comprometimento da mitocôndria, o que ativaria a via apoptótica e a lise da membrana das células Vero. Quand~ aquecida por 100°C por 30 minutos, esta perdeu toda sua atividade citotóxica, demonstrando ser termolábil. Apesar da similaridade em sua citotoxicidade sobre as células Vero com os efeitos causados por verotoxinas, os genes STX (Shiga-Toxin) 1 e 2 e VT (Verotoxin)1 e 2, característicos de verotoxinas, não foram amplificados pela PCR / Abstract: The bacterium Enterobacter cloacae has been recognized as an important infectious agent in hospitaIs, sometimes leading patients to obit. Studying its virulence properties in our laboratory, 18% of the strains were characterized as cytotoxic against Vero cells. The cytotoxin was purified from the most cytotoxic strain (118.9) by means ionic exchange and molecular exclusion chromatography techniques respectively, increasing its relative activity in 62.5%. The purified toxin did not display either lethal activity nor did it cause fluid accumulation in neonatal mice intestine. Furthermore, no leukotoxic activity was detected and regarding its hemolytic activity, the purified toxin showed hemolytic activity against rabbit, bovine and sheep erythrocytes, but not against human erythrocytes, with or without beta-mercaptoethanol. The toxicity mechanism seems to be associated with a failure in the mitochondria's function, which would activate the apoptotic pathway and membrane lyses. When heated for 100°C for 30 minutes, the toxin lost completely its cytotoxicity. Despite the fact that the toxin displayed similar effects in Vero cells compared to verotoxins, PCR did not amplified the STXl and -2 and VTl and 2 genes, found in verotoxin expressing strains / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Polymicrobial interactions are an important, yet understudied area of research. Candida albicans is the most common human fungal pathogen. The bacterial genus, Enterobacter, is a source of nosocomial acquired infections and increased drug resistance. Our lab has previously discovered that Enterobacter preferentially adheres to C. albicans hyphae. From an E. cloacae transposon library screen, six candidates displayed reduction in C. albicans attachment. These candidates were identified genetically and characterized for involvement in attachment to C. albicans. A fluorescent plasmid was introduced into E. cloacae to measure and observe adherence to C. albicans in planktonic and biofilm growth. In vivo experiments using Caenorhabditis elegans showed no significant differences in microbial burden or nematode survivability exposed to Candida and Enterobacter. Candida-Enterobacter co-infections were observed microscopically within C. elegans. This study highlights the complex dynamics of C. albicans-E. cloacae interactions, underscoring the importance of understanding polymicrobial relationships in research and clinical settings.

INTRODUÇÃO: O tratamento das infecções relacionadas à assistência à saúde, causadas por enterobactérias, representa um desafio crescente, em função do aumento da prevalência de resistência aos betalactâmicos, em particular às cefalosporinas de terceira e quarta gerações e carbapenêmicos. Os mecanismos de resistência mais relevantes a essas classes de antimicrobianos, em enterobactérias, é a produção de betalactamases de espectro ampliado e carbapenemases. Os objetivos do estudo foram: (1) determinar a frequência e caracterizar betalactamases de espectro ampliado (ESBL); (2) determinar a frequência e caracterizar o gene blaKPC-2; (3) avaliar a relação clonal entre isolados produtores de ESBL ou KPC, uma coleção de isolados do gênero Enterobacter cultivadas de casos de infecções relacionadas aos cuidados com a saúde diagnosticadas em pacientes atendidos em hospitais da cidade de São Paulo. MÉTODOS: Foram estudadas 141 isolados do gênero Enterobacter quanto à produção de ESBL pelo método de Jarlier e colaboradores, concentrações inibitórias mínimas para cefotaxima, cefepima e ceftazidima pelo método da diluição em ágar, halo de inibição para ertapenem pelo método de Kirby-Bauer e presença de genes que codificam ESBL ou KPC, por PCR. RESULTADOS: A frequência de isolados produtores de ESBL, quando utilizado o método de Jarlier e colaboradores foi de 22,7%. Os genes que codificam cefotaximases foram detectados em 34,4% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, e houve predomínio do grupo da CTX-M-8, enquanto os genes que codificam variantes SHV foram detectados em 18,7% dos produtores de ESBL. Os genes blaTEM-1 e blaOXA-1 foram detectados em 62,5%; 12,5% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, mas não são ESBLs. Não houve detecção do gene que codifica a enzima BES-1 na amostragem. O gene blaKPC-2 foi detectado em três dos 15 isolados produtores de ESBL e resistentes ao ertapenem. Os perfis obtidos por ERIC-PCR sugerem a disseminação de um clone de E. aerogenes entre instituições hospitalares. CONCLUSÕES: Os determinantes genéticos de ESBLs predominantes na amostragem analisada são derivados de blaCTX-M. A presença de grupos clonais em instituições hospitalares distintas, evidencia disseminação entre hospitais. A presença de KPC em Enterobacter é reportada pela primeira vez em São Paulo / INTRODUCTION: The treatment of healthcare associated infections caused by enterobacteria represents a growing challenge due to the increasing prevalence of beta-lactam resistance, particularly to third and fourth generations cephalosporins and carbapenems. The main mechanisms of resistance to these antimicrobial classes are the production of extended spectrum beta-lactamases and carbapenemases. The objectives of this study were: (1) determine the frequency and characterize extended spectrum beta-lactamases; (2) determine the frequency and characterize blaKPC; (3) evaluate the clonal relation among ESBL or KPC producers, in a collection of Enterobacter isolates cultivated from cases of healthcare associated infections in patients from hospitals located in the city of São Paulo. METHODS: A total of 141 Enterobacter isolates were studied concerning ESBL production using the method from Jarlier and colleagues, minimum inhibitory concentrations for cefotaxime, ceftazidime and cefepime by agar dilution method, inhibition zone for ertapenem by by Kirby-Bauer method and the presence of genes coding for ESBLs or KPCs, by PCR. RESULTS: The frequency of ESBL producers using Jarlier´s method was 22.7%. Genes coding for cefotaximases were detected in 34.4% of isolates with a positive test for ESBl and CTX-M-8 group was predominant, but blaSHV variants were also detected in 18.7% of the ESBL producres. blaTEM-1, and blaOXA-1 genes were detected in 62.5%; 12.5% of all isolates with a positive phenotypic test for ESBL, but there are not ESBLs. The blaKPC-2 gene was detected in three among 15 ESBL producers that were also resistant to ertapenem. ERIC-PCR profiles suggest the dissemination of an E. aerogenes clone among hospitals. CONCLUSIONS: The predominant ESBL determinants in the sample analyzed derive from blaCTX-M. The presence of the same clonal groups in different hospitals indicates inter-hospital dissemination. The presence of KPC producing Enterobacter is reported for the first time in São Paulo

INTRODUÇÃO: Nas últimas três décadas E. aerogenes e E. cloacae vem sendo reportado como importante patógeno de infecção relacionada a assistência à saúde e vem cada vez mais apresentando resistência a vários antibióticos incluindo os carbapenêmicos. Poucos estudos, entretanto, avaliaram os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em espécies de Enterobacter no Mundo e no Brasil. OBJETIVO: Avaliar a presença de genes codificadores de carbapenemases, genes de ?- lactamases de espectro estendido e de bomba de fluxo AcrAB-TolC e alteração de proteínas de membrana externa de 44 isolados de E. aerogenes e 8 isolados de E. cloacae resistentes aos carbapenêmicos de 03 hospitais brasileiros. MATERIAL E MÉTODOS: Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi realizado o teste de microdiluição em caldo, com os antibióticos: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigeciclina e Polimixina B e para Fosfomicina foi realizado o teste de diluição em ágar, segundo CLSI. Foi realizado PCR para identificar os genes codificadores de Serino Beta-lactamase da Classe A de Ambler (blaKPC, blaIMI e blaGES), de Metalo-beta-lactamase da Classe B de Ambler (bla IMP, blaVIM, blaGIM, blaSIM, blaSPM e blaNDM), de Oxacilinases da Classe D de Ambler (bla OXA-48), as ESBL (blaTEM, blaCTX e blaSHV) e da bomba de efluxo AcrAB-TolC. A tipagem molecular foi feita pela técnica de PFGE, as proteínas de membrana externa pelo método de SDS-PAGE e a atividade da bomba de efluxo por meio da determinação da CIM dos carbapenêmicos com e sem inibidor Carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTADOS: No período de 2005 a 2011, foram analisados, 130 isolados de Enterobacter spp, 105 (80,8%) dos isolados foram identificados como Enterobacter aerogenes, destes 44 (41,9%) apresentaram resistência ao Imipenem, Ertapenem ou Meropenem e 25 (19,2%) foram identificados como Enterobacter cloacae, destes 8 (32,0%) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Os isolados de E. aerogenes apresentaram CIMs que variaram de 2 a 128ug/mL para Imipenem, 4 a 64ug/mL para Meropenem e para Ertapenem 1 a >=128 ug/mL e os isolados de E. cloacae apresentaram CIMS que variaram de 8 a 64?g/mL para Imipenem, 2 a 16ug/mL para Meropenem e 8 a 64 ug/mL para Ertapenem. Todos isolados foram sensíveis a Fosfomicina, Polimixina B e Tigeciclina. A única carbapenemase identificada foi KPC, que estava presente em ambos isolados e em todos hospitais estudados. Os 39 isolados de E. aerogenes apresentaram 5 clones diferentes, sendo o clone A predominante. Os 5 isolados de E. aerogenes do Hospital de Itapecerica da Serra pertenciam ao mesmo clone. Os 8 isolados de E. cloacae apresentaram 2 clones diferentes. E a maioria dos isolados analisados apresentarou mecanismos de resistência aos carbapenêmicos como: gene blaKPC associado com o gene blaTEM e/ou blaCTX, associado com diminuição ou ausência de proteína 35-36kDa e 39 kDa. CONCLUSÃO: Em nosso estudo foi observado alta resistência aos carbapenêmicos nos isolados de E. aerogenes e E. cloacae nos 3 hospitais estudados. Os mecanismos observados que contribuíram para a resistência aos carbapenêmicos foram: a presença de KPC, ESBL e impermeabilidade da membrana para os isolados de E. aerogenes e para os isolados de E. cloacae foi observado também como mecanismo o gene da bomba de efluxo AcrART. Para os isolados de E. aerogenes, não foi observado o gene da bomba de efluxo, mas todos isolados analisados apresentaram atividade da bomba de efluxo para os carbapenêmicos, possivelmente nos indicando a presença de outra bomba de efluxo ainda não identificada / INTRODUCTION: In the last three decades, E. aerogenes and E. cloacae have been reported as important opportunistic pathogens in humans. They have been showing an increase resistance to multiple antibiotics including carbapenem. Few studies, however, evaluated the mechanisms of resistance to carbapenem in Enterobacter species in the world and in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the presence of genes encoding carbapenemases, genes of beta- lactamases of extended spectrum and AcrAB TolC- efflux pump and amendment of outer membrane proteins of 44 isolates of E. aerogenes and 8 isolates of E. cloacae carbapenems resistant of 03 Brazilian hospitals. METHODS: To determine the minimum inhibitory concentration (MIC), microdilution broth test was performed for the followings antibiotics: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigecycline and Polymyxin B and agar dilution for Fosfomycin, according to CLSI. PCR was performed to identify the genes encoding Serino Beta-lactamase Class A Ambler (blaKPC, blaIMI and blaGES) of Metallo-beta-lactamase Class B Ambler (blaIMP, blaVIM, bla GIM, blaSIM, blaSPM and blaNDM) of Oxacilinases Class D Ambler (blaOXA-48), the ESBL (blaTEM, blaSHV and blaCTX) and efflux pump AcrAB-TolC. Molecular typing was performed by PFGE, outer membrane proteins by SDS-PAGE method and the activity of the efflux pump by carbapenem´s MIC by agar diluition with and without inhibitor Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTS: In the period from 2005 to 2011, 130 isolates of Enterobacter spp were analyzed, 105 (80.8%) isolates were identified as Enterobacter aerogenes, of these 44 (41.9%) were resistant to Imipenem, Meropenem or Ertapenem and 25 (19.2%) were identified as Enterobacter cloacae, and 8 (32.0%) showed resistance to carbapenems. The isolated E. aerogenes presented MIC ranging from 2 to 128?g /ml for Imipenem, 4 to 64ug /ml for Meropenem and Ertapenem 1 to >= 128 mg /mL. E. cloacae isolated showed MIC ranged from 8 to 64ug / ml for Imipenem, 2 to 16ug / ml for Meropenem and 8 to 64 mg / mL to Ertapenem. All isolates were susceptible to fosfomycin, polymyxin B and tigecycline. The only carbapenemase identified was KPC, which was present in both isolated and in all hospitals studied. The 39 isolates of E. aerogenes presented five different clones, the clone A being predominant. The five isolates of E. aerogenes in the Hospital of Itapecerica da Serra belong to same clone. Eight isolates of E. cloacae showed two different clones. Most of the isolates analyzed showed resistance mechanisms to carbapenems like: blaKPC gene associated with blaTEM gene and / or blaCTX associated with a decreased or absent protein 35- 36kDa and 39 kDa. CONCLUSION: In our study, we observed high carbapenem resistance in isolates of E. aerogenes and E. cloacae in the three studied hospitals. The observed mechanisms that contributed to resistance to carbapenems were: the presence of KPC, ESBL and impermeability of the membrane in E. aerogenes and in E. cloacae isolates. E. cloacae presented also that gene of the efflux pump AcrART. Among E. aerogenes, the gene wasn´t observed, but all isolates analyzed demonstrated active efflux pump to carbapenems possibly indicating the presence of other efflux pump still unidentified

Wong Man Yung. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2006. / Includes bibliographical references (leaves 106-120). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgements --- p.i / Abstract --- p.ii / Table of Contents --- p.vi / List of Figures --- p.xi / List of Plates --- p.xiii / List of Tables --- p.xv / Abbreviations --- p.xvi / Equations --- p.xviii / Chapter 1. --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Water disinfection --- p.1 / Chapter 1.2 --- Bacterial species --- p.2 / Chapter 1.2.1 --- Staphylococcus saprophyticus --- p.2 / Chapter 1.2.2 --- Enterobacter cloacae --- p.3 / Chapter 1.3 --- Disinfection methods --- p.4 / Chapter 1.3.1 --- Physical methods --- p.4 / Chapter 1.3.1.1 --- UV-C irradiation --- p.4 / Chapter 1.3.1.2 --- Solar disinfection --- p.5 / Chapter 1.3.2 --- Chemical methods --- p.6 / Chapter 1.3.2.1 --- Chlorination --- p.6 / Chapter 1.3.2.2 --- Ozonation --- p.7 / Chapter 1.3.2.3 --- Mixed disinfectants --- p.8 / Chapter 1.3.3 --- Other disinfection methods --- p.8 / Chapter 1.4 --- Advanced oxidation processes (AOPs) --- p.9 / Chapter 1.5 --- Photocatalytic oxidation (PCO) --- p.10 / Chapter 1.5.1 --- PCO process --- p.12 / Chapter 1.5.2 --- Photocatalysts --- p.14 / Chapter 1.5.2.1 --- Titanium dioxide (P25) --- p.15 / Chapter 1.5.2.2 --- Silver sensitized P25 (Ag/P25) --- p.16 / Chapter 1.5.2.3 --- Silicon dioxide doped titanium dioxide (SiO2-TiO2) --- p.17 / Chapter 1.5.2.4 --- Copper(I) oxide sensitized P25 (Cu2O/P25) --- p.18 / Chapter 1.5.3 --- Irradiation sources --- p.19 / Chapter 1.5.4 --- PCO disinfection mechanisms --- p.20 / Chapter 1.6 --- Bacterial defense mechanisms against oxidative stress --- p.22 / Chapter 2. --- Objectives --- p.25 / Chapter 3. --- Materials and Methods --- p.26 / Chapter 3.1 --- Chemicals --- p.26 / Chapter 3.2 --- Bacterial culture --- p.26 / Chapter 3.3 --- Photocatalytic reactor --- p.27 / Chapter 3.4 --- PCO efficacy test --- p.30 / Chapter 3.5 --- Optimization of PCO conditions --- p.31 / Chapter 3.5.1 --- Effect of P25 concentrations --- p.31 / Chapter 3.5.2 --- Effect of UV intensities --- p.32 / Chapter 3.5.3 --- Combinational study of P25 concentrations and UV intensities --- p.32 / Chapter 3.5.4 --- Effect of stirring rates --- p.32 / Chapter 3.5.5 --- Effect of initial cell concentrations --- p.33 / Chapter 3.6 --- PCO disinfection using different photocatalysts --- p.33 / Chapter 3.6.1 --- Effect of CU2O/P25 concentrations --- p.33 / Chapter 3.6.2 --- Effect of CU2O powder on the two bacterial species --- p.33 / Chapter 3.7 --- Transmission electron microscopy (TEM) --- p.34 / Chapter 3.8 --- Catalase (CAT) test --- p.37 / Chapter 3.9 --- Superoxide dismutase (SOD) activity assay --- p.39 / Chapter 4. --- Results --- p.40 / Chapter 4.1 --- Efficacy test --- p.40 / Chapter 4.2 --- PCO disinfection under UV irradiation --- p.40 / Chapter 4.2.1 --- Control experiments --- p.40 / Chapter 4.2.2 --- Optimization of PCO conditions using P25 as a photocatalyst --- p.42 / Chapter 4.2.2.1 --- Effect of P25 concentrations --- p.42 / Chapter 4.2.2.2 --- Effect of UV intensities --- p.45 / Chapter 4.2.2.3 --- Combinational study of P25 concentrations and UV intensities --- p.48 / Chapter 4.2.2.4 --- Effect of stirring rates --- p.54 / Chapter 4.2.2.5 --- Effect of initial cell concentrations --- p.57 / Chapter 4.2.3 --- Comparison of PCO inactivation efficiency between S. saprophyticus and E. cloacae --- p.60 / Chapter 4.2.4 --- PCO disinfection using different photocatalysts --- p.62 / Chapter 4.2.4.1 --- Control experiments --- p.62 / Chapter 4.2.4.2 --- Ag/P25 --- p.62 / Chapter 4.2.4.3 --- SiO2-TiO2 --- p.64 / Chapter 4.2.4.4 --- Cu2O/P25 --- p.64 / Chapter 4.3 --- PCO disinfection under visible light irradiation --- p.66 / Chapter 4.3.1 --- Effect of Cu2O/P25 concentrations --- p.67 / Chapter 4.3.2 --- Effect of CU2O powder on the two bacterial species --- p.70 / Chapter 4.4 --- Feasibility use of indoor light (fluorescent lamps) for PCO disinfection --- p.71 / Chapter 4.5 --- Transmission electron microscopy (TEM) --- p.74 / Chapter 4.5.1 --- Morphological changes induced by PCO using P25 as a photocatalyst --- p.74 / Chapter 4.5.2 --- Morphological changes induced by PCO using Cu2O/P25 as a photocatalyst --- p.77 / Chapter 4.6 --- Catalase (CAT) test --- p.80 / Chapter 4.7 --- Superoxide dismutase (SOD) activity assay --- p.82 / Chapter 5. --- Discussion --- p.83 / Chapter 5.1 --- Efficacy test --- p.83 / Chapter 5.2 --- PCO disinfection under UV irradiation --- p.83 / Chapter 5.2.1 --- Optimization study --- p.84 / Chapter 5.2.1.1 --- Effect of P25 concentrations --- p.84 / Chapter 5.2.1.2 --- Effect of UV intensities --- p.85 / Chapter 5.2.1.3 --- Combinational study of P25 concentrations and UV intensities --- p.86 / Chapter 5.2.1.4 --- Effect of stirring rates --- p.86 / Chapter 5.2.1.5 --- Effect of initial cell concentrations --- p.87 / Chapter 5.2.2 --- Comparison of PCO inactivation efficiency between S. saprophyticus and E. cloacae --- p.88 / Chapter 5.2.3 --- PCO disinfection using different photocatalysts --- p.89 / Chapter 5.2.3.1 --- Ag/P25 --- p.89 / Chapter 5.2.3.2 --- SiO2-TiO2 and Cu2O/P25 --- p.90 / Chapter 5.3 --- PCO disinfection under visible light irradiation --- p.90 / Chapter 5.3.1 --- Effect of Cu20/P25 concentrations --- p.91 / Chapter 5.3.2 --- Effect of CU2O powder on the two bacterial species --- p.92 / Chapter 5.4 --- Feasibility use of fluorescent lamps for PCO disinfection --- p.93 / Chapter 5.5 --- Transmission electron microscopy (TEM) --- p.95 / Chapter 5.5.1 --- Morphological changes induced by PCO using P25 as a photocatalyst --- p.95 / Chapter 5.5.2 --- Morphological changes induced by PCO using CU2O/P25 as a photocatalyst --- p.96 / Chapter 5.6 --- Catalase (CAT) test --- p.98 / Chapter 5.7 --- Superoxide dismutase (SOD) activity assay --- p.99 / Chapter 6. --- Conclusion --- p.101 / Chapter 7. --- References --- p.106 / Chapter 8. --- Appendix --- p.121

INTRODUÇÃO: Nas últimas três décadas E. aerogenes e E. cloacae vem sendo reportado como importante patógeno de infecção relacionada a assistência à saúde e vem cada vez mais apresentando resistência a vários antibióticos incluindo os carbapenêmicos. Poucos estudos, entretanto, avaliaram os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em espécies de Enterobacter no Mundo e no Brasil. OBJETIVO: Avaliar a presença de genes codificadores de carbapenemases, genes de ?- lactamases de espectro estendido e de bomba de fluxo AcrAB-TolC e alteração de proteínas de membrana externa de 44 isolados de E. aerogenes e 8 isolados de E. cloacae resistentes aos carbapenêmicos de 03 hospitais brasileiros. MATERIAL E MÉTODOS: Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi realizado o teste de microdiluição em caldo, com os antibióticos: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigeciclina e Polimixina B e para Fosfomicina foi realizado o teste de diluição em ágar, segundo CLSI. Foi realizado PCR para identificar os genes codificadores de Serino Beta-lactamase da Classe A de Ambler (blaKPC, blaIMI e blaGES), de Metalo-beta-lactamase da Classe B de Ambler (bla IMP, blaVIM, blaGIM, blaSIM, blaSPM e blaNDM), de Oxacilinases da Classe D de Ambler (bla OXA-48), as ESBL (blaTEM, blaCTX e blaSHV) e da bomba de efluxo AcrAB-TolC. A tipagem molecular foi feita pela técnica de PFGE, as proteínas de membrana externa pelo método de SDS-PAGE e a atividade da bomba de efluxo por meio da determinação da CIM dos carbapenêmicos com e sem inibidor Carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTADOS: No período de 2005 a 2011, foram analisados, 130 isolados de Enterobacter spp, 105 (80,8%) dos isolados foram identificados como Enterobacter aerogenes, destes 44 (41,9%) apresentaram resistência ao Imipenem, Ertapenem ou Meropenem e 25 (19,2%) foram identificados como Enterobacter cloacae, destes 8 (32,0%) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Os isolados de E. aerogenes apresentaram CIMs que variaram de 2 a 128ug/mL para Imipenem, 4 a 64ug/mL para Meropenem e para Ertapenem 1 a >=128 ug/mL e os isolados de E. cloacae apresentaram CIMS que variaram de 8 a 64?g/mL para Imipenem, 2 a 16ug/mL para Meropenem e 8 a 64 ug/mL para Ertapenem. Todos isolados foram sensíveis a Fosfomicina, Polimixina B e Tigeciclina. A única carbapenemase identificada foi KPC, que estava presente em ambos isolados e em todos hospitais estudados. Os 39 isolados de E. aerogenes apresentaram 5 clones diferentes, sendo o clone A predominante. Os 5 isolados de E. aerogenes do Hospital de Itapecerica da Serra pertenciam ao mesmo clone. Os 8 isolados de E. cloacae apresentaram 2 clones diferentes. E a maioria dos isolados analisados apresentarou mecanismos de resistência aos carbapenêmicos como: gene blaKPC associado com o gene blaTEM e/ou blaCTX, associado com diminuição ou ausência de proteína 35-36kDa e 39 kDa. CONCLUSÃO: Em nosso estudo foi observado alta resistência aos carbapenêmicos nos isolados de E. aerogenes e E. cloacae nos 3 hospitais estudados. Os mecanismos observados que contribuíram para a resistência aos carbapenêmicos foram: a presença de KPC, ESBL e impermeabilidade da membrana para os isolados de E. aerogenes e para os isolados de E. cloacae foi observado também como mecanismo o gene da bomba de efluxo AcrART. Para os isolados de E. aerogenes, não foi observado o gene da bomba de efluxo, mas todos isolados analisados apresentaram atividade da bomba de efluxo para os carbapenêmicos, possivelmente nos indicando a presença de outra bomba de efluxo ainda não identificada / INTRODUCTION: In the last three decades, E. aerogenes and E. cloacae have been reported as important opportunistic pathogens in humans. They have been showing an increase resistance to multiple antibiotics including carbapenem. Few studies, however, evaluated the mechanisms of resistance to carbapenem in Enterobacter species in the world and in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the presence of genes encoding carbapenemases, genes of beta- lactamases of extended spectrum and AcrAB TolC- efflux pump and amendment of outer membrane proteins of 44 isolates of E. aerogenes and 8 isolates of E. cloacae carbapenems resistant of 03 Brazilian hospitals. METHODS: To determine the minimum inhibitory concentration (MIC), microdilution broth test was performed for the followings antibiotics: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigecycline and Polymyxin B and agar dilution for Fosfomycin, according to CLSI. PCR was performed to identify the genes encoding Serino Beta-lactamase Class A Ambler (blaKPC, blaIMI and blaGES) of Metallo-beta-lactamase Class B Ambler (blaIMP, blaVIM, bla GIM, blaSIM, blaSPM and blaNDM) of Oxacilinases Class D Ambler (blaOXA-48), the ESBL (blaTEM, blaSHV and blaCTX) and efflux pump AcrAB-TolC. Molecular typing was performed by PFGE, outer membrane proteins by SDS-PAGE method and the activity of the efflux pump by carbapenem´s MIC by agar diluition with and without inhibitor Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTS: In the period from 2005 to 2011, 130 isolates of Enterobacter spp were analyzed, 105 (80.8%) isolates were identified as Enterobacter aerogenes, of these 44 (41.9%) were resistant to Imipenem, Meropenem or Ertapenem and 25 (19.2%) were identified as Enterobacter cloacae, and 8 (32.0%) showed resistance to carbapenems. The isolated E. aerogenes presented MIC ranging from 2 to 128?g /ml for Imipenem, 4 to 64ug /ml for Meropenem and Ertapenem 1 to >= 128 mg /mL. E. cloacae isolated showed MIC ranged from 8 to 64ug / ml for Imipenem, 2 to 16ug / ml for Meropenem and 8 to 64 mg / mL to Ertapenem. All isolates were susceptible to fosfomycin, polymyxin B and tigecycline. The only carbapenemase identified was KPC, which was present in both isolated and in all hospitals studied. The 39 isolates of E. aerogenes presented five different clones, the clone A being predominant. The five isolates of E. aerogenes in the Hospital of Itapecerica da Serra belong to same clone. Eight isolates of E. cloacae showed two different clones. Most of the isolates analyzed showed resistance mechanisms to carbapenems like: blaKPC gene associated with blaTEM gene and / or blaCTX associated with a decreased or absent protein 35- 36kDa and 39 kDa. CONCLUSION: In our study, we observed high carbapenem resistance in isolates of E. aerogenes and E. cloacae in the three studied hospitals. The observed mechanisms that contributed to resistance to carbapenems were: the presence of KPC, ESBL and impermeability of the membrane in E. aerogenes and in E. cloacae isolates. E. cloacae presented also that gene of the efflux pump AcrART. Among E. aerogenes, the gene wasn´t observed, but all isolates analyzed demonstrated active efflux pump to carbapenems possibly indicating the presence of other efflux pump still unidentified

INTRODUÇÃO: O tratamento das infecções relacionadas à assistência à saúde, causadas por enterobactérias, representa um desafio crescente, em função do aumento da prevalência de resistência aos betalactâmicos, em particular às cefalosporinas de terceira e quarta gerações e carbapenêmicos. Os mecanismos de resistência mais relevantes a essas classes de antimicrobianos, em enterobactérias, é a produção de betalactamases de espectro ampliado e carbapenemases. Os objetivos do estudo foram: (1) determinar a frequência e caracterizar betalactamases de espectro ampliado (ESBL); (2) determinar a frequência e caracterizar o gene blaKPC-2; (3) avaliar a relação clonal entre isolados produtores de ESBL ou KPC, uma coleção de isolados do gênero Enterobacter cultivadas de casos de infecções relacionadas aos cuidados com a saúde diagnosticadas em pacientes atendidos em hospitais da cidade de São Paulo. MÉTODOS: Foram estudadas 141 isolados do gênero Enterobacter quanto à produção de ESBL pelo método de Jarlier e colaboradores, concentrações inibitórias mínimas para cefotaxima, cefepima e ceftazidima pelo método da diluição em ágar, halo de inibição para ertapenem pelo método de Kirby-Bauer e presença de genes que codificam ESBL ou KPC, por PCR. RESULTADOS: A frequência de isolados produtores de ESBL, quando utilizado o método de Jarlier e colaboradores foi de 22,7%. Os genes que codificam cefotaximases foram detectados em 34,4% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, e houve predomínio do grupo da CTX-M-8, enquanto os genes que codificam variantes SHV foram detectados em 18,7% dos produtores de ESBL. Os genes blaTEM-1 e blaOXA-1 foram detectados em 62,5%; 12,5% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, mas não são ESBLs. Não houve detecção do gene que codifica a enzima BES-1 na amostragem. O gene blaKPC-2 foi detectado em três dos 15 isolados produtores de ESBL e resistentes ao ertapenem. Os perfis obtidos por ERIC-PCR sugerem a disseminação de um clone de E. aerogenes entre instituições hospitalares. CONCLUSÕES: Os determinantes genéticos de ESBLs predominantes na amostragem analisada são derivados de blaCTX-M. A presença de grupos clonais em instituições hospitalares distintas, evidencia disseminação entre hospitais. A presença de KPC em Enterobacter é reportada pela primeira vez em São Paulo / INTRODUCTION: The treatment of healthcare associated infections caused by enterobacteria represents a growing challenge due to the increasing prevalence of beta-lactam resistance, particularly to third and fourth generations cephalosporins and carbapenems. The main mechanisms of resistance to these antimicrobial classes are the production of extended spectrum beta-lactamases and carbapenemases. The objectives of this study were: (1) determine the frequency and characterize extended spectrum beta-lactamases; (2) determine the frequency and characterize blaKPC; (3) evaluate the clonal relation among ESBL or KPC producers, in a collection of Enterobacter isolates cultivated from cases of healthcare associated infections in patients from hospitals located in the city of São Paulo. METHODS: A total of 141 Enterobacter isolates were studied concerning ESBL production using the method from Jarlier and colleagues, minimum inhibitory concentrations for cefotaxime, ceftazidime and cefepime by agar dilution method, inhibition zone for ertapenem by by Kirby-Bauer method and the presence of genes coding for ESBLs or KPCs, by PCR. RESULTS: The frequency of ESBL producers using Jarlier´s method was 22.7%. Genes coding for cefotaximases were detected in 34.4% of isolates with a positive test for ESBl and CTX-M-8 group was predominant, but blaSHV variants were also detected in 18.7% of the ESBL producres. blaTEM-1, and blaOXA-1 genes were detected in 62.5%; 12.5% of all isolates with a positive phenotypic test for ESBL, but there are not ESBLs. The blaKPC-2 gene was detected in three among 15 ESBL producers that were also resistant to ertapenem. ERIC-PCR profiles suggest the dissemination of an E. aerogenes clone among hospitals. CONCLUSIONS: The predominant ESBL determinants in the sample analyzed derive from blaCTX-M. The presence of the same clonal groups in different hospitals indicates inter-hospital dissemination. The presence of KPC producing Enterobacter is reported for the first time in São Paulo

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-28T09:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1338198 bytes, checksum: 5403979ea8250d61a6a0c78ac9f2e904 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T09:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1338198 bytes, checksum: 5403979ea8250d61a6a0c78ac9f2e904 (MD5) Previous issue date: 2008-07-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Quando em alta densidade populacional, muitas bactérias são capazes de coordenar a expressão de genes via produção e recepção de sinais químicos, por meio de mecanismo denominado quorum sensing. O objetivo deste trabalho foi obter mutantes HalI - das estirpes psicrotróficas isoladas do leite cru refrigerado, 068 e 071 de Hafnia alvei e 067 de Enterobacter cloacae. O gene halI codifica a sintase responsável pela produção de acil homoserina lactonas (AHLs) que são as moléculas sinalizadoras de quorum sensing em H. alvei e E. cloacae. Para obtenção dos mutantes, foi utilizado o vetor suicida pGP704, onde foi clonado o gene halI. Em seguida este gene foi interrompido com o gene que codifica a proteína gentamicina- 3-acetiltransferase, que confere resistência ao antibiótico gentamicina e o plasmídeo foi denominado pGP704halI068::Gm. A transformação das estirpes psicrotróficas com esse vetor resultou em transformantes resistentes a 25 μg mL -1 de gentamicina, mas que ainda produziam AHL, constatada por meio da indução da estirpe monitora de AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. A inativação da expressão do gene halI no DNA cromossômico foi obtida após nova transformação desses transformantes com o vetor pUT::Tn5, pertencente ao mesmo grupo de compatibilidade de pGP704. O uso deste sistema de incompatibilidade propiciou a seleção de estirpes onde ocorreu a recombinação homóloga entre o gene halI interrompido pelo gene que confere resistência a gentamicina com o gene halI presente no DNA cromossômico. A confirmação da recombinação do gene halI inativado e clonado no plasmideo com o gene halI cromossômico, foi feita selecionando-se os transformantes em ágar Luria Bertani contendo 50 μg mL -1 de canamicina e gentamicina. Por ensaio de indução de C. violaceum CV026, foi confirmado que os transformantes resistentes a canamicina e gentamicina não induziram a produção do pigmento violaceína pela estirpe monitora. A inativação do gene halI no cromossoma torna essas estirpes ferramentas importantes para elucidação da regulação da expressão de genes pelo mecanismo de quorum sensing. / When population density is high, several bacteria are able to coordinate gene expression by production and reception of chemical signals by means of a mechanism called quorum sensing. The scope of this work was to produce HalI - mutants from psychotrophic bacterias found in fresh cooled milk, 068 and 071 of Hafnia alvei and 067 of Enterobacter cloacae. The halI gene encondes the synthase responsible for the production of acyl-homoserine lactones (AHLs) which are the signaling molecules of quorum sensing for H. alvei and E. cloacae. In order to produce the mutants, it was used the suicide vector pGP704, where the halI gene was cloned. After that, this gene was interrupted with a gene that encodes the protein gentamicin 3-acetyltransferase, responsible for giving resistance to the gentamicin antibiotic. This vector was called pGP704halI068::Gm. The transformation of psychotrophic strain with such vector resulted in transformants cells resistant to 25 μg mL -1 of gentamicin, but they would still produce AHL. AHL production was confirmed by the induction of the monitored strain of AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. Expression inactivation of the hall gene in the chromosomic DNA was achieved after new transformation of former transformants with the pUT::Tn5 vector, which belong to the same compatible group of pGP704. The use of this system of incompatibility provided the selection of strain that showed homologous recombination between the hall gene interrupted by the gene that affords resistance to gentamicin and the hall gene of the present chromosomal DNA. Recombination assurance of the halI gene inactivated and cloned in the plasmidium with the halI chromosomic gene was done by selecting the transformants in Luria- Bertani agar containing 50 μg mL -1 of kanamicyn and gentamicin. By means of an induction trial of C. violaceum CV026, it was confirmed that the transformants resistant to kanamicyn and gentamicin did not induced the production of the violacein pigment by the strain being monitored. Inactivation of the halI gene in the chromosome makes these strains important tools for elucidating gene expression regulation by the quorum sensing mechanism. / Dissertação antiga

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:45Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10833.pdf: 1360435 bytes, checksum: a345766b88aa33fb633cad88c29a3a08 (MD5) / Conselho Nacional para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introducao: A hiper-producao de AmpC associada a impermeabilidade de membrana externa em Enterobacter spp. pode contribuir no fenotipo de resistencia a cefalosporinas de quarta geracao e aos carbapenemicos. O objetivo do estudo foi caracterizar os mecanismos de resistencia a cefepima e a ertapenem em 11 amostras de E. cloacae subespecie cloacae isoladas de hemoculturas no Hospital sao Paulo. Materiais e Metodos: O perfil de sensibilidade foi avaliado por disco difusao e pela tecnica de diluicao em agar, de acordo com o CLSI. A analise das proteinas de membrana externa (OMPs) foi realizada pela tecnica de SDS-PAGE. A similaridade genetica foi avaliada pela tecnica de PFGE e o coeficiente similaridade entre os padroes de PFGE obtidos foi calculado pelo programa Bionumerics. Os isolados foram tambem testados contra cefepima, ertapenem, imipenem e meropenem na presenca e na ausencia dos inibidores de bomba de efluxo PAƒÀN (25 ƒÊg/ml) e reserpina (20 ƒÊg/ml), pela tecnica de diluicao em agar. Foram realizados testes de hidrolise, disco-aproximacao para a deteccao fenotipica de ESƒÀL e testes de inducao para a deteccao de AmpC induzida. A presenca de genes codificadores de ESƒÀL, carbapenemases e AmpC plasmidiais foram avaliados pela tecnica de PCR e confirmadas por sequenciamento, bem como a presenca de integrons. Os niveis de expressao de ampC, ompC e ompF foram medidos pela PCR em tempo real. Resultados: Todos os isolados de E. cloacae subespecie cloacae foram resistentes as cefalosporinas, aztreonam, associacoes com inibidores de ƒÀ-lactamases, tetraciclina, ciprofloxacina e amicacina por disco difusao. A tecnica de diluicao em agar demonstrou altas CIMs para cefotaxima (CIM50, > 256 ƒÊg/mL), ceftazidima (CIM50, 256 ƒÊg/mL) e cefepima (CIM50, 256 ƒÊg/mL). Todos os isolados foram sensiveis a imipenem (CIM50, 0.25 ƒÊg/mL) e meropenem (CIM50, 0.25 ƒÊg/mL). Entretanto, 7 isolados apresentaram CIMs de 4 ƒÊg/ml para ertapenem, 3 isolados foram resistentes (CIMs de 8 ƒÊg/ml) e um isolado foi sensivel (CIM de 2 ƒÊg/ml). Quatro padroes de PFGE foram encontrados entre os isolados de E. cloacae subespecie cloacae multirresistentes. Pelo programa Bionumerics, 3 clusters foram observados com coeficiente de similaridade acima de 80%. Todas as amostras foram positivas para ESƒÀL no teste de hidrolise e no disco aproximacao. Os resultados da PCR apresentaram amplificacao para blaTEM e blaCTX-M. Hiperexpressao do gene ampC foi detectado em todos os isolados pela qRT-PCR. Somente uma amostra apresentou uma pequena diminuicao da expressao de OmpC. Atraves do gel de SDS-PAGE foi observado um perda de uma proteina de 43 kDa quando comparado ao controle sensivel. Nenhuma reducao significativa nas CIMs para ƒÀ-lactamicos foi observado na presenca dos inibidores de bomba de efluxo. Conclusoes: Os resultados mostraram que a hiper-producao de AmpC associada a producao de ESBL sao os responsaveis pelos altos niveis de resistencia a cefepima e a perda de uma proteina de 43 kDa associada a hiper-producao de AmpC provavelmente foram os responsaveis pela diminuicao da sensibilidade a ertapenem verificada entre os isolados de E. cloacae subespecie cloacae. / Background: The overproduction of AmpC in Enterobacter spp. can contribute to resistance phenotype to fourth-generation cephalosporins and to carbapenens. The mechanisms of resistance to cefepime and ertapenem were studied among 11 E. cloacae subespecie cloacae clinical isolates from blood cultures isolated at Sao Paulo Hospital. Methods: Susceptibility testing by disk diffusion and agar dilution techniques was performed according to CLSI. Analysis of outer membrane protein (OMP) was performed by SDS-PAGE. The genetic relatedness was evaluated by PFGE and the dendogram was obtained by Bionumerics program. The isolates were also tested against cefepime, ertapenem, imipenem and meropenem with and without of PAƒÀN (25 ƒÊg/ml) and reserpine (20 ƒÊg/ml), an efflux pump inhibitors by agar dilution. Genes for ESƒÀLs, carbapenemases and plamidial AmpCs were screened by PCR and confirmed by sequencing. The expression level of ampC, ompC and ompF genes was measured by real time PCR (qRT-PCR). Results: All isolates were resistant to cephalosporins, aztreonam, ƒÀ-lactamases association inhibitors, tetraciclin, ciprofloxacin and amikacin, by disk diffusion. All isolates showed high resistant phenotype to cefotaxime (MIC50, > 256 ƒÊg/mL), ceftazidime (MIC50, 256 ƒÊg/mL), and cefepime (MIC50, 256 ƒÊg/mL) but they were susceptible to imipenem (MIC50, 0.25 ƒÊg/mL) and meropenem (MIC50, 0.25 ƒÊg/mL). Seven isolates showed ertapenem MICs of 4 ƒÊg/ml, while other three isolates showed MICs of 8 ƒÊg/ml and one isolate showed MIC of 2 ƒÊg/ml. Four clusters were founded by the Bionumerics program. The PCR results showed amplification for blaTEM and blaCTX-M. Hyperexpression of ampC was detected in all isolates by qRT-PCR. Only one sample showed a decreased in the OmpC expression. The loss of an OMP of 43 kDa was observed for all isolates in the SDS-PAGE technicque compared to the susceptible control. No significant reduction for â-lactam’s MICs was observed in the presence of PAâN. Conclusions: The results showed that the hyperproduction of AmpC coupled with ESBL production were responsible for the high resistant rates to cefepime. The hyperproduction of AmpC coupled with the loss of an OMP of 43 kDa is likely to be responsible for the reduced susceptibility to ertapenem in the E. cloacae subespecie cloacae isolates, which seems not to be associated with efflux systems. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações