Submitted by Gábia Leite (gabya.leite@gmail.com) on 2016-07-11T14:08:17Z No. of bitstreams: 1 Tese - Denise Morais Lopes Galeno.pdf: 1403594 bytes, checksum: 85b573886b109934233d6508fca06378 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-07-14T12:22:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Denise Morais Lopes Galeno.pdf: 1403594 bytes, checksum: 85b573886b109934233d6508fca06378 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-07-14T12:28:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Denise Morais Lopes Galeno.pdf: 1403594 bytes, checksum: 85b573886b109934233d6508fca06378 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T12:28:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Denise Morais Lopes Galeno.pdf: 1403594 bytes, checksum: 85b573886b109934233d6508fca06378 (MD5) Previous issue date: 2014-06-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Galeno D.M.L. Effects of Eugenia punicifolia (Khunt ) DC related to metabolic syndrome in experimental models . Manaus, 2014. 133p. Thesis (Ph.D.) - Graduate Program Multi - Institutional Biotechnology, Federal University of Amazonas. The Eugenia punicifolia species is a plant popularly known as "pedra-ume-caa", widely distributed in the Amazon region. In the state of Amazonas, this species has been widely used in folk medicine to treat inflammatory and hyperglycemic disorders. However, studies involving other parameters found in the metabolic syndrome (MS) have not yet been elucidated. The MS is characterized by a complex disorder, represented by a number of cardiovascular risk factors involving central adiposity, hypertension, endothelial dysfunction and insulin resistance. Studies have shown that nutritional supplementation with plants that effectively address the pathogenic mechanisms of this syndrome represents an effective improvement for the problem. This project aim was to analyze biological activities in vitro and in vivo of the aqueous extract of the leaves of E. punicifolia (EEP), emphasizing the inhibitory activity digestive enzymes, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, antioxidants, hypolipemiant, cytotoxic and anti antihypertensive effects. Enzyme inhibition assays, as well as the determination of the ACE activity in Wistars rats serum were performed by the fluorometric method and the indirect tests of cell viability, antioxidants, determining the presence of flavonoids and phenolic compounds were performed by colorimetric assays. The evaluation of the EEP on blood pressure parameters was performed by using five experimental groups, which were randomly divided into: normotensive group (2R), the hypertensive group (2R1C), enalapril hypertensive group (ENAL), extract hypertensive group 150 mg/kg/day (EEP150) and extract hypertensive group 300 mg/kg/dia (EEP300). The effects of EEP in systolic pressure were acquired indirectly by tail plethysmography in conscious rats. Biochemical parameters were measured in rat’s plasma through appropriate kits. The study has shown, for the first time, that EEP exhibited scavenging activity on ABTS·+, DPPH·, and O2·- (IC50=10.5 ± 1.2; 28.84 ± 0.54 and 38.12 ± 2.6 μg/mL, respectively). The EEP also exhibited cellular antioxidant activity in vitro concentration-dependent manner, and did not show cell cytotoxic effects. Furthermore, the EEP inhibited ACE activity (70.8%) using the concentration of 0.3 mg/mL (IC50 of 24.3 ± 0.7 mg/mL), and inhibited the activities of the enzymes α-amylase (IC50 = 122.8 ± 6.3 mg/mL), α-glucosidase (IC50 = 2.9 ± 0.1 mg/mL) and xanthine oxidase (IC50 = 23.5 ± 2.6 mg/mL). Both the EEP150 (21.7%) and the EEP300 (16.8%) reduced systolic blood pressure. The hypotensive effect of EEP correlated with the reduction of plasma ACE activity and also reduced total cholesterol (48%), triglycerides (52%), VLDL (52%) and LDL (55%). In addition, the EEP wasn’t cause renal, hepatic or neurotoxic acute or chronic toxicity. The EEP showed antioxidants, hypotensive, hypolipidemic effects and digestive enzymes and ACE were inhibited. These activities are probably related to the presence of antioxidant such as phenols and flavonoids compounds present in the extract, which act by inhibiting key enzymes of carbohydrate metabolism and angiotensin converting enzyme. These findings may support further clinical studies to further evaluate the potential of EEP on the SM. / Galeno, D.M.L. Efeitos da Eugenia punicifolia (Khunt) DC em modelos experimentais relacionados à Síndrome Metabólica. Manaus, 2014.133p. Tese (doutorado)- Programa de Pós-graduacão Multi-Institucional em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas A espécie Eugenia punicifolia é uma planta popularmente conhecida como "pedra-ume-caá”, distribuída amplamente na região amazônica. No estado do Amazonas, essa espécie tem sido bastante utilizada na medicina popular para tratar distúrbios hiperglicêmicos e inflamatórios. No entanto, estudos envolvendo outros parâmetros encontrados na síndrome metabólica (SM) ainda não foram elucidados. A SM se caracteriza por um transtorno complexo, representado por um conjunto de fatores de risco cardiovascular que envolve deposição central de gordura, hipertensão arterial, disfunção endotelial e resistência à insulina. Estudos têm evidenciado que a suplementação nutricional com plantas que atuem efetivamente com os mecanismos patogênicos desta síndrome representa um potencial eficaz para o problema. Este projeto teve como objetivo analisar atividades biológicas in vitro e in vivo do extrato aquoso das folhas da E. punicifolia (EEP), enfatizando a atividade inibitória de enzimas digestórias, enzima conversora de angiotensina (ECA), efeitos antioxidantes, hipolipemiantes, citotóxicos e anti-hipertensivos. Os ensaios de inibição enzimática, assim como a determinação da atividade da ECA no soro de ratos wistars foram realizados utilizando um método indireto fluorimétrico e os testes de viabilidade celular, antioxidantes, determinação da presença de compostos fenólicos e flavonoides por meio de ensaios colorimétricos. A avaliação do EEP sobre os parâmetros pressóricos foi realizada mediante a utilização de cinco grupos experimentais, os quais foram divididos randomicamente em: Grupo normotenso (2R), Grupo hipertenso (2R1C), Grupo hipertenso enalapril (ENAL), Grupo hipertenso extrato 150 mg/kg/dia (EEP150) e Grupo hipertenso extrato 300 mg/kg/dia (EEP300). Os efeitos do EEP na pressão sistólica foram adquiridos de forma indireta por plestimografia de cauda em ratos conscientes. Os parâmetros bioquímicos foram avaliados no plasma dos ratos por meio de kits apropriados. Nesse estudo foi mostrado, pela primeira vez, que o EEP apresentou atividade sequestradora de radicais livres nos testes de ABTS·+, DPPH· e O2·- (CI50=10,5 ± 1,2; 28,84 ± 0,54; e 38,12 ± 2,6 μg/mL, respectivamente). O EEP também exibiu atividade antioxidante celular in vitro de maneira concentração-dependente, além de não evidenciar efeitos citotóxicos celulares. Ademais, o EEP inibiu 70,8% a atividade da ECA na concentração de 0,3 mg/mL (CI50 de 24 ± 0,7 μg/mL), inibiu as atividades das enzimas α-amilase (CI50=122,8 ± 6,3 μg/mL), α-glucosidase (CI50= 2,9 ± 0,1 μg/mL) e xantina oxidase (CI50= 23,5 ± 2,6 μg/mL). O EEP150 reduziu a pressão sistólica em 21,7% e o EEP300 em 16,8%. O efeito hipotensor do EEP se correlacionou com a redução da atividade da ECA no plasma e também diminuiu o colesterol total (48%), triglicerídeos (52%), VLDL (52%) e LDL (55%). Além disso, o EEP não causou toxicidade crônica e nem aguda renal, hepática ou neurotóxica. O EEP mostrou atividades antioxidantes, hipotensores, hipolipemiantes e inibiu as enzimas digestórias e a ECA. Essas atividades provavelmente estejam relacionadas à presença de compostos antioxidantes, como fenóis e flavonoides presentes no extrato, que atuam inibindo enzimas chaves do metabolismo dos carboidratos e a enzima conversora de angiotensina. Estes achados podem fundamentar estudos clínicos posteriores para melhor avaliar o potencial do EEP sobre a SM.

Esponjas são sésseis e possuem um esqueleto constituído por elementos inorgânicos microscópicos (espículas), fibras de colágeno e/ou combinações destes dois componentes. Embora sem proteções físicas evidentes tais como conchas ou espinhos, são pouco predadas, sendo este fato atribuído principalmente a presença de metabólitos secundários ativos. Recentemente, um papel dos componentes esqueléticos como deterrente foi experimentalmente confirmado, mas sua importância relativa ainda é bastante debatida. Algumas estrelas-do-mar são consideradas como espongívoras, e a literatura existente geralmente coloca que a digestão é realizada externamente, sem ingestão do esqueleto da presa. Desta forma, neste trabalho foram verificados o comportamento alimentar da estrela-do-mar Echinaster brasiliensis em relação às esponjas, o destino dos componentes esqueléticos e seus efeitos na fisiologia do organismo. Observações de campo e experimentos em laboratório foram efetuados para determinar a estratégia de consumo utilizada pela estrela. O processo digestivo do material esquelético (espículas e/ou fibras) foi acompanhado até a eliminação. Foi verificado que E. brasiliensis se alimenta de diferentes espécies de esponjas, mas não consome apenas estes organismos, sendo mais generalista do que o suposto. As preferências no consumo das esponjas são determinados por fatores diversos, como a quantidade de matéria orgânica ou formato do organismo predado. A ingestão ocorre com a eversão do estômago, mas ao contrário do descrito para outras espécies, E. brasiliensis ingere componentes esqueléticos, sendo espículas encontradas inseridas no epitélio digestivo. Entretanto, essa ingestão é baixa e aparentemente não causa injúrias severas ao organismo, sendo as espículas descartadas no material fecal / Sponges are sessile and have a skeleton made of microscopic inorganic elements (spicules), collagen fibers and/or combinations of these two components. Although without clear physical defenses such as shells or spines, they are not preyed upon, and this is attributed mainly to the presence of active secondary metabolites. Recently, a role of skeletal components as deterrents has been experimentally confirmed, but its relative importance is still debated. Some starfishes are regarded as spongivorous, and the existing literature generally considers that the digestion is performed externally, without intake of the sponge skeleton. In this study the feeding behavior of the starfish Echinaster brasiliensis in relation to sponges, the fate of skeletal components and their effects on the starfish physiology were studied. Field observations and laboratory experiments were conducted to determine the consumption strategies used by the starfish. The digestive process of the skeletal material (spicules and/or fibers) was followed until the elimination. It was found that E. brasiliensis feeds on different species of sponges, but does not consume only these organisms, being more generalist than assumed. Preferences in the consumption of sponges were determined by several factors, such as the amount of organic matter or shape of the preyed organism. The intake occurs by the eversion of the stomach, but unlike what is described for other species E. brasiliensis ingests skeletal components, and spicules were found inserted in the digestive epithelium. However, this intake is small and apparently does not cause severe injuries to the starfishes and the spicules are discarded in fecal material

Quimotripsinas (EC 3.4.21.1) são serina proteinases que possuem 245 resíduos de aminoácidos arranjados em dois domínios duplo β-barril, sendo que o sítio ativo está localizado entre esses dois domínios. O estudo da especificidade das endopeptidases foi facilitado pelo conceito de sítio de ligação do substrato, que corresponde ao sítio ativo daquelas enzimas. Porém, sobre as quimotripsinas de insetos, praticamente não existe informação a respeito da especificidade dos diferentes subsítios dessas enzimas. O estudo da especificidade dos subsítios das quimotripsinas dos insetos Periplaneta americana, Tenebrio molitor e Diatraea saccharalis apresentaram maior eficiência de hidrólise sobre substratos que apresentam um resíduo Tyr em P1, embora as razões Phe/Tyr para os diferentes insetos sejam bastante variadas. Estas diferenças indicam diferentes especificidades para as quimotripsinas de insetos em P1. No entanto, estas diferenças parecem não seguir a posição ocupada pelo inseto na escala evolutiva e são menos evidentes do que as verificadas para as tripsinas dos mesmos insetos, onde há troca de especificidade primária. A quimotripsina de Periplaneta americana como a de Diatraea saccharalis preferencialmente clivam substratos com Pro em P2. Porém, o mesmo não acontece com a quimotripsina de Tenebrio molitor, que apresentou maior kcat/Km para o peptídeo com Ala em P2, essa preferência pode estar relacionada à conformação da Pro que difere dos demais resíduos por ser um iminoácido. Porém, as três quimotripsinas estudadas apresentaram maior kcat/Km para o peptídeo Ile em P3 indicando que esse subsítio possui um papel fundamental na discriminação dessas enzimas por substratos com resíduos de aminoácidos específicos nessa posição. As quimotripsinas de Periplaneta americana e Diatraea saccharalis apresentaram maior kcat/Km pelo peptídeo com Ser em P1\', evidenciando que a presença de um grupo hidroxila na cadeia lateral da Ser e o baixo volume da cadeia lateral do resíduo, torna o subsítio dessas enzimas mais seletivo que a quimotripsina de Tenebrio molitor que apresentou maior kcat/Km pelo peptídeo com Ala. Dessa forma, esse estudo colabora para um melhor conhecimento da especificidade dos subsítios das endopeptidases digestivas de insetos pode dar diretrizes para a purificação ou síntese de inibidores mais eficazes com ação direta nas enzimas digestivas de insetos e serem utilizados na produção de plantas transgênicas ou utilizados como bioinseticidas. / Chymotrypsins (EC 3.4.21.1) are serine proteases with 245 amino acids disposed in two double ?-barrel domains, being the active site locate between these two domains. The specificity study of endopeptidases was facilitated by the substrate binding site concept that is the active site of these enzymes. However there is not much information about the subsites specificity of insect chymotrypsins. The specificity study of insects chymotrypsins subsites of Periplaneta americana, Tenebrio molitor and Diatraea saccharalis showed higher substrate hydrolysis efficiency with Tyr in P1, however the Phe/Tyr proportion for different insects are varied. These differences have shown different specificities for insect chymotrypsins in P1. Meanwhile, this difference does not follow the position occupied by insects in evolutive scale, and it is less clear than those showed by the same insect trypsins were there is primary specificity cross. Like Diatraea saccharalis, the Periplaneta americana chymotrypsin breaks the substrate with Pro in P2. Nevertheless the same does not happen to Tenebrio molitor chymotrypsin with the higher kcat/Km for the peptide with Ala in P2, this preference may be related to the different conformation of Pro. The three studied chymotrypsins showed higher kcat/Km for the peptide with Ile in P3, what indicates that this subsite has a key role on these enzymes discrimination for substrates with specific amino acids in this position. The Periplaneta americana and Diatraea saccharalis chymotrypsins presented higher kcat/Km for the peptide with Ser in P1` evidencing that the hydroxyl group side chain presence in Ser and low side chain volume made this subsite more selective than Tenebrio molitor chymotrypsin with higher kcat/Km by Ala peptide. This study collaborates to a best knowledge about the subsite specificities of the insect digestive endopeptidases and the best inhibitors for purification or synthesis with direct action in insect digestive enzymes and to be utilized for transgenic plants or bio-insecticides production.

Bovine pancreatic ribonuclease A (RNase A, EC 3.1.27.5) has been extensively studied from the structural, mechanistic and functional points of view. Within the protein folding context, it constitutes a good model of study although a rather complicated one due to the presence in the native state of four disulphide bonds and the existence of two X-proline peptide bonds in cis conformation. Most of these studies has focused on the alteration of cysteine or proline residues to study, from a kinetic point of view, the formation of the disulphide bonds or the characterization of the species present in the heterogeneous non-reduced unfolded state, respectively. In these work we have used site-directed mutagenesis to change the characteristics of a postulated chain folding initiation site (CFIS) in RNase A / La ribonucleasa A de pàncrees boví (RNasa A, EC 3.1.27.5) ha estat extensament estudiada des de punts de vista estructurals, mecanístics i funcionals. Dins del marc del plegament proteic, la RNasa A ha estat un bon model per als estudis de plegament/desplegament proteic, malgrat que força complicat a causa de la presència en l'estat natiu de quatre enllaços disulfur i l’existència de dos enllaços peptídics X-prolina en conformació cis. La major part d'aquests estudis s'han centrat en l'alteració de residus de cisteïna o de prolina per estudiar, des d'un punt de vista cinètic, la formació dels enllaços disulfur o la caracterització de les espècies presents en l'heterogeni estat desplegat de la proteïna amb els enllaços disulfur intactes, respectivament. En aquest treball hem utilitzat la mutagènesi dirigida per oligonucleòtid per canviar les característiques d'una regió de la RNasa A postulada com a iniciadora del plegament

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed to evaluate the performance profile, digestive enzymes and metabolic effects of silver catfishes (Rhamdia quelen) in response to the partial substitution of protein source for animal protein (PB) of linseed meal in nature (FL) and demucilaged (FLD). Two hundred and forty juvenile catfish (average initial weight of 14.49 ± 1.85 g and length averaging 11.74 ± 0.61 cm) were randomly assigned to 12 cases of propylene with a working volume of 280 liters (20 fish / box) in a water recirculation system for a period of 51 days supply. During the experimental period, the water quality parameters remained within the optimum for this species. The treatments were: control diet; 17% FL (17% replacement of animal PB by PB of FL); 17%FLD (17% replacement of animal PB by PB of FLD) and 35% FLD (35 % substitution of animal PB by PB of FLD), each treatment consisted of three repetitions. The animals were fed three times daily to apparent satiation. Every 28 days samples were collected to monitor the growth. During the experimental period, growth variables (weight, total and standard length, total biomass, daily weight gain, condition factor, specific growth rate, feed conversion) and parameters of carcass (carcass yield, digestivossomático index, hepatosomatic, quotient intestinal and deposition of protein and fat) were evaluated. In addition, we determined: chemical composition (moisture, ash, fat and protein) in whole fish, blood parameters (glucose, total triglycerides, total cholesterol and total protein) in liver tissue ( glycogen, glucose, protein, free amino acids, ammonia and lactate). Activities of enzymes acid protease, amylase, trypsin and quymotripsin were also measured. The fish fed the control diet had lower levels of feed conversion (p <0.05). However, the rest of the growth parameters were not altered by the inclusion of FL and FLD. Diet 35%FLD had lower QI, moisture content, higher content of carcass fat and total fat deposited and activity of the enzyme trypsin. The blood level of triglycerides, albumin and total protein did not differ among treatments, but higher cholesterol levels (178,72 ± 10,71) and plasma glucose (62,71 ± 5,16) were found in 35%FLD treatment. The liver parameters were not affected by treatments. The composition of linseed meal after the process of demucilagen concentrated PB content and decreases to half the content of soluble fiber. Therefore, it is suggested that the FLD and FL can be used to compose part of silver catfish feed as an alternative source and cost. / Este trabalho teve por objetivo avaliar o desempenho produtivo, perfil de enzimas digestivas e efeitos metabólicos de jundiás (Rhamdia quelen) em resposta à substituição parcial da fonte proteica de origem animal pela proteína bruta (PB) dos farelos de linhaça in natura (FL) e demucilada (FLD). Duzentos e quarenta juvenis de jundiá (peso médio inicial de 14,49±1,85g e comprimento médio inicial de 11,74±0,61 cm) foram distribuídos ao acaso em 12 caixas de propileno com volume útil de 280 litros (20 peixes/caixa) em um sistema de recirculação de água por um período de sete semanas de alimentação. Durante o período experimental os parâmetros de qualidade da água mantiveram-se dentro do ideal para esta espécie. Os tratamentos avaliados foram: dieta controle; 17%FL (17% substituição da PB de origem animal pela PB do FL); 17% FLD: (17% substituição da PB de origem animal pela PB do FLD) e 35%FLD: (35% de substituição da PB de origem animal pela PB do FLD), cada tratamento consistiu de três repetições. Os animais foram alimentados três vezes ao dia, até a saciedade aparente. A cada 28 dias, foram realizadas biometrias para acompanhamento do crescimento. Durante o período experimental, foram avaliados: variáveis de crescimento (peso, comprimento total e padrão, biomassa total, ganho em peso diário, fator de condição, taxa de crescimento específico, conversão alimentar aparente) e parâmetros de carcaça (rendimento de carcaça, índices digestivossomático, hepatossomático, quociente intestinal e deposições de proteína e gordura corporal). Além disso, foram determinados: composição centesimal (umidade, cinzas, gordura e proteína) no peixe inteiro; parâmetros sangüíneos (glicose, triglicerídeos totais, colesterol total e proteínas totais) e no tecido hepático, foram determinados glicogênio, glicose, proteínas, aminoácidos livres, amônia e lactato. Também foram aferidas as atividades das enzimas protease ácida, amilase, tripsina e quimiotripsina. Os peixes alimentados com a dieta controle apresentaram menores valores de conversão alimentar (p<0,05), no entanto, o restante dos parâmetros de crescimento não foram alterados pela inclusão dos FL e FLD. A dieta 35%FLD apresentou menor QI, teor de umidade, maior teor de gordura da carcaça e gordura total depositada e atividade da enzima tripsina. Os parâmetros sanguíneos de triglicerídeos, albumina e proteínas totais não diferiram estatisticamente entre si, todavia maiores níveis de colesterol (178,72±10,71) e glicose plasmática (62,71±5,16) foram encontrados no tratamento 35%FLD. Os parâmetros hepáticos não foram afetados pelos tratamentos. A composição do farelo de linhaça após o processo de demucilagem concentrou o teor de PB e diminuiu à metade o conteúdo de fibra solúvel. Sendo assim, sugere-se que o FL e o FLD podem ser usados parcialmente para compor a ração de jundiás como fonte alternativa econômica.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1012402 bytes, checksum: e93e297eb37b3a24f8504893d77af531 (MD5) Previous issue date: 2007-07-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Protease inhibitors can reduce the digestive efficiency, to delay the development and to diminish the insect proteolytic activity resulting in increase of mortality through deficiency of free amino acids for maintenance of vital functions. The subject of this work were to evaluate if A. gemmatalis larvae feeding in artificial diets containing increasing concentrations of synthetic trypsin inhibitor bisbenzamidine affects negatively the insect performance, reduce the alimentary consumption, the digestibility, the assimilation efficiency of the food ingested and digested, the insect proteolytic activity and protein digestibility. To test these hypotheses were realized bioassays with individualized caterpillars and supplied daily with diets containing 0; 0,00095; 0,0019; 0,0038; 0,0076; 0,0152; 0,0304; 0,0608; 0,0912; 0,125 e 0,25% (w/w) of berenil during the entire larval phase. The digestion indices, the duration of larval phase and life cycle, the accumulated survival and the average of time survival, the pupae and adults weight, the body and wings of the adults moths were determined. Additionally, were evaluated the protein digestibility and the enzymatic activity of midgut extracts of A. gemmatalis exposed to berenil in diet, in the same concentrations above. All parameters assessed of life history were negatively affected with the increase of inhibitors in diet. Were verified an increase in the larval phase and life cycle duration, reduction in the pupae weight and body and wings length. There was reduction in the incorporated biomass and the relative growth rate. Otherwise, there were increases in ingestion, approximated digestion, and relative diet consumption rate and in the ingestion and excretion balance. The diet individual consumption increased until the 0.0076% of berenil, diminished with the increase of inhibitor concentration. The protein digestibility was directly proportional to berenil concentration while the proteolytic, amidolytic and esterolytic activities diminished with the increasing of inhibitor concentration. Therefore, albeit the berenil mixed in increasing concentrations in diet affects negatively in all life history parameters of insect, the caterpillars improve the diet intake. However, even so the total digestibility and the protein digestibility increase in higher inhibitor concentrations, the insect show lower enzymatic activity and, consequently, reduction in the efficiency in assimilation of ingested and digested food, indicating that the insect did not show adaptative mechanisms to prevent the inhibition of tripsina-like enzymes existents in your digestive tract. Thus, the berenil is a promising strategy to new studies with the subject of to synthesis mimicry peptides to apply in the field to control A. gemmatalis caterpillars in the soybean crops. / Inibidores de proteases podem reduzir a eficiência digestiva, retardar o desenvolvimento e diminuir a atividade proteolítica do inseto, resultando em aumento da mortalidade pela deficiência de aminoácidos livres para a manutenção das funções vitais. Este trabalho teve por objetivos avaliar se concentrações crescentes do inibidor sintético de serino- proteases, berenil, presente na dieta de A. gemmatalis afeta negativamente a performance do inseto, reduz o consumo alimentar, a digestibilidade e a eficiência na assimilação do alimento ingerido e digerido, reduz a atividade proteolítica e tríptica do inseto e reduz sua digestibilidade protéica. Para testar essa hipótese foram realizados bioensaios com lagartas individualizadas e alimentadas diariamente em dietas contendo 0; 0,00095; 0,0019; 0,0038; 0,0076; 0,0152; 0,0304; 0,0608; 0,0912; 0,125 e 0,25% (p/p) de berenil durante toda a fase larval. Foram determinados os índices digestórios, a duração do ciclo de vida e da fase larval, a sobrevivência acumulada e o tempo médio de vida, o peso das pupas e dos adultos, o tamanho corporal e das asas das mariposas adultas. Adicionalmente, foram avaliadas a digestibilidade protéica e a atividade enzimática de extratos do intestino médio de A. gemmatalis submetidas ao berenil na dieta, nas concentrações determinadas acima. Todos os parâmetros avaliados da história de vida do inseto foram afetados negativamente com o aumento da concentração do inibidor na dieta. Foi verificado aumento na duração da fase larval e do ciclo de vida, diminuição no peso das pupas, adultos, tamanho dos adultos e comprimento das asas. Houve redução na biomassa incorporada e na taxa relativa de crescimento. Por outro lado, houve aumento na ingestão, digestibilidade aproximada, na taxa de consumo relativa da dieta e no balanço entre ingestão e excreção das fezes. O consumo individual total da dieta aumentou até a concentração de 0,0076% do inibidor na dieta, decrescendo com o aumento da concentração de inibidor. A digestibilidade protéica foi diretamente proporcional à concentração de berenil enquanto as atividades proteolítica, amidásica e esterásica diminuíram com o aumento da concentração do inibidor. Desse modo, embora a presença de berenil em concentrações crescentes na dieta interfira negativamente em todos os parâmetros da história de vida do inseto, as lagartas respondem aumentando a ingestão da dieta. Contudo, mesmo que a digestibilidade total e a digestibilidade protéica aumentem em concentrações maiores de inibidor, o inseto apresenta menor atividade enzimática e, conseqüentemente, baixa eficiência na assimilação do alimento ingerido e digerido, indicando que o inseto não demonstra mecanismos adaptativos para impedir a inibição das enzimas tripsina-like presentes em seu sistema digestivo. Nesse sentido, o berenil surge como estratégia promissora para novos estudos visando a síntese de peptídeos miméticos para aplicação no campo como forma de controle de A. gemmatalis nos cultivos de soja.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-05T14:25:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 743716 bytes, checksum: 58ae3c6c0c86dd0630b89789ca61d3c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-05T14:25:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 743716 bytes, checksum: 58ae3c6c0c86dd0630b89789ca61d3c6 (MD5) Previous issue date: 2001-01-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram utilizados 256 pintos de corte, de um dia , machos, Avian Farm, por um período de 14 dias, com peso médio inicial de 48,0 g, criados em baterias aquecidas com piso de tela elevado. O delineamento experimental foi um esquema fatorial inteiramente casualizado 2 x 4 ( 2 níveis de L-glutâmico x 4 níveis de vitamina K), consistindo de 8 tratamentos, 4 repetições de 8 aves cada. Os tratamentos consistiram de uma dieta básica purificada contendo todos os L- aminoácidos indispensáveis, minerais e vitaminas (exceto a Vit. K) suplementada com a combinação de 2 níveis (6,25 e 12,5 %) de L-glutâmico (L-Glu), com 4 níveis (0,02; 0,2 2,0 e 20,0 mg/kg de dieta) de vitamina K (Vit. K). Os animais receberam as dietas e água à vontade durante todo o período experimental de 14 dias. Para o estudo enzimático o período experimental foi estendido por mais uma semana totalizando 21 dias. Não foram observados efeitos significativos da interação L-Glu X Vit. K no desempenho dos animais e na composição química e bioquímica de tibiotarsos e fêmures. Os níveis de Vit. K não afetaram os parâmetros de desempenho, composição química e características físicas (comprimento e resistência) não afetando também os teores de Proteínas Totais (PT) dos tibiotarsos e fêmures. Os níveis de L-Glu não afetaram o consumo das aves, a resistência , a composição química e os teores de PT dos ossos. As aves alimentadas com dietas experimentais contendo 12,5% de L-Glu apresentaram maior ganho de peso (172 g), melhor conversão alimentar (1,51), menor incidência de problemas de pernas (26,8%), ossos maiores (fêmures, 36,8 mm e tibiotarsos, 51,5 mm), menores teores de proteínas não colagenosas (PNC) (3,16mg% tibiotarsos, e 3,23mg%, fêmures) e maiores teores de proteínas colagenosas (PC) (27,47mg%, tibiotarsos e 27,44 mg%, fêmures) do que aquelas alimentadas com dietas suplementadas com 6,25 % de L-Glu que apresentaram ganho de peso médio de 158g, conversão alimentar de 1,60, 100 % de incidência de problemas de pernas, tibiotarsos medindo 47,4 mm e fêmures 32,1 mm, teores de PNC de 4,03 mg% (tibiotarso) e 4,02 mg% (fêmur) e teores de PC de 26,60 mg% (tibiotarso) e 26,58 mg%, (fêmur). Observou-se efeito quadrático dos níveis de Vit. K nos teores de PNC e PC, sendo que para PNC o efeito foi decrescente e para PC crescente. Os animais alimentados com dietas suplementadas com 12,5% de L-Glu apresentaram maior espessura do osso compacto e maior diâmetro do canal medular, do que aqueles alimentados com 6,25% de L-Glu. As diferenças observadas entre os tratamentos em relação aos níveis de Vit. K não foram significativas. O menor comprimento médio do disco epifisário e alto nível de organização foi obtido com 12,5% de L-Glu, independente dos níveis de Vit. K. Em relação ao peso dos órgão e características histológicas do intestino delgado observou-se que o máximo de peso relativo para os órgãos (fígado, pâncreas e intestino) foi encontrado no 14 o dias de idade. O peso absoluto aumentou continuamente durante o período experimental e os parâmetros morfométricos (altura de vilo, profundidade de cripta e espessura de membrana) aumentaram com a idade. 0 perfil de enzimas digestivas apresentou- se da seguinte forma: as atividades de α-amilase e lipase tanto no quimo como no pâncreas, quando expressa por 100 g de peso corporal aumentaram com a idade. A atividade de tripsina no quimo não se alterou com a idade, e no pâncreas a maior atividade foi observada no 21 o dia de idade / In order to study the effects of L-glutamic (L-Glu) acid and vitamin K (Vit. K) on growth, leg abnormalities, bone biochemical and chemical composition, development of the digestive tract and activities of digestive enzymes, one experiment was conducted with 246 day old chicks, male, Avian Farm, fed purified L-aminoacid diets with two levels (6.25 and 12.5 %) of (L-Glu) combined with four levels (0.02; 0.2; 2.0 and 20.0 mg/kg of diet) of menadione sodium bisulfite (Vit. K). The trial was a 2 x 4 factorial in a completely randomized design using 4 replicates of 8 chicks each. Chicks were fed the experimental diets and water ad libitum from one to 14 days of age. For the study development of chick digestive tract and activities of digestive enzymes, the experimental period was from 1 to 21 days of age. No significant L-Glu X Vit. K interaction was observed on growth and biochemical and chemical composition and bone strenght of tibiotarsus and femur. No significant L-Glu X Vit. K interaction and no Vit. K effects were observed in the chick performance. Chicks fed 12.5 % showed higher weigth gains, better feed/gain rations and lower incidence of leg problems than those fed 6.25% L-Glu. Feed consumption was not affected by the levels of L-Glu. Chicks fed with 12.5 % de L-Glu and 2.0 mg of Vit. K/kg of diet showed the lowest leg abnormalities incidence (14.3 %). L-Glu, at 12.5 % level, improved performance and xireduced the incidence of leg problems. The data obtained confirmed that the dietary level of nonspecific ntrogen is important for the normal chick development. The ash, Ca, P and Mg contents, Ca:P ratio of the femur and tibiotarsus ash and bone strenght were not affected by the levels of L-Glu and Vit K studied. Chicks fed 12.5 % L-Glu had longer femur than those fed 6.25 % L-Glu. Based upon the data observed in this experiment, it appears that leg abnormalities of young chicks fed purified diets is not associated with the mineral contents of femur but, probably, could be relates with the organic matrix of the bone. Chicks fed 6,25 % de L-Glu showed higher levels of non collagen proteins (NCP) and lower contents de colagenous proteins (CP) in femur and tibiotarsus than those fed 12,5 % de L-Glu. It was observed quadratic effects of levels of vitamin K in the contents of NCP and CP of femur and tibiotarsus. Chicks fed 12.5 % L-Glu had longer length of compact bone and longer diameter of medular chanel than those fed 6.25 % de L-Glu. No Vit. K effects were observed on parameters studied. The lower lenght of epifhyseal growth plate and better plate organization level were observed with chicks fed 12.5 % of L-Glu independently of the Vit. K levels. Chicks fed 6.25 % of L-Glu and 0.2 mg of Vit. K/kg of diet showed presence of cartilage in the bone diafise. Examination of the morphology of the small intestine showed that morphometric values increased with age. The maximal relative weights of pancreas, liver and intestine were at 14 days of age. Absolute weights increased linearly during the experimental period. The results observed showed that specific activities of amylase and lipase of chymo were not changed among 14 and 21 day of age. But activities expressed per kg body weigth increased with age. Specific activities of trypsin did not change during the experimental period. But specific activites of trypsin per kg body weigth showed a maximum value at 21 st day and the activities on day 7 and 14 did not change. Specific activities of amylase of pancreas were higher at 14 th day than the other ages. Specific activities of lipase of pancreas were higher at hatching. Amylase and lipase activities per kg body weigth increased with age. Specific activities of trypsin of pancreas did not change during the experimental period. But when expressed per kg of body weigth, the maximal values were obtained at 14 th day. The activities on day 7 and 21 were similar.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseLML.pdf: 2667217 bytes, checksum: 81c5f5f84c2576087e998384f6444ab7 (MD5) Previous issue date: 2003-07-10 / Universidade Federal de Minas Gerais / The biological growth is reflected on metabolical adjustments, which are sustained by the nutritional status and is function of feeding. Pintado (Pseudoplatystoma corruscans) is a carnivorous fish appreciated by the fillet, in sportive fishing and presents good aquaculture potential, in spite of the rearing technology is not well established. This work aimed to study adaptive aspects of digestion, metabolic processes and intestinal morphology of juvenile pintado fed on different protein and energy levels. In the first set of experiments, fish were submitted to isoenergetic diets (4,000 kcal GE/kg) with different protein levels (20, 30 40 and 50% CP), and digestive enzymes, metabolites and intestine morphology were analyzed. In the second step, fish were submitted to isoproteic diets (31,5% CP) and different amounts of crude energy (3,500; 3,850 and 4,200 kcal GE/kg), and digestive enzymes and metabolites were analyzed. Crude extract from stomach, anterior, medium and posterior intestine were used to assay unspecific protease, trypsin, chymotrypsin, lipase and amylase. Blood was used to hematimetric analysis. Plasma, liver, white muscle and kidney samples were used to glucose, lactate, pyruvate, ammonia, urea (acid extracts), free amino acids, triglycerides, free fatty acids (neutral extracts), glycogen and total protein (alkaline extracts) determination; and assays of glutamate dehydrogenase plus arginase. The best weight gain percent was achieved by the fish fed on 40% CP followed by 30, 50 and 20% respectively. Fish fed lower amounts of energy (3,500 kcal/kg) reached weight gain higher than the other treatments. Metabolic profile was reflected in the fish yield and it was possible to verify through it that the poor as well as the richer diets in crude protein impaired the metabolism of pintado. Likely, the amount of essential amino acids were not supplied by the lower CP (20%), and the largest (50%) leaded to metabolical rearrangements as the neoglycogenesis to hold the glucemia and support energetic demands. Surplus of dietary energy probably leads the fish to decreasing of food intake and drives them to consuming the bulk of energetical molecules with consequent growth loss. The higher proteolytic activities were observed in stomach, where lipolytic and amylolytic activities were also detected. This fact highlights the role of that structure in the digestive processes of pintado. Proteolytic activities were not responsive to CP levels but supplying essential amino acids requirements as function of energetic demands. This picture suggests this group of enzymes is constitutive and allow us to assume the species is well fitted to utilize protein in spite of its dietary amount. Lipase also seems to be a constitutive enzyme, changing its activity just as function of food intake instead of diet lipid level. Amylase is less active in pintado than the most omnivorous species. Its activity, however seems to be function of the dietary glycogen content. Considering the lower digestive enzyme activities in the small intestine and its short size, it is reasonable to assume that the main role of such structure is the nutrient uptake. The histological analyzes strength that assumption, as the morphological responses are evidently adaptive to the CP dietary levels. The number of mucus producer cells (goblet cells) increased in consonance with the fold sizes and thickness of the muscularis, furthering the motility of the folds and optimizing the absorptive processes. The great variation of protein, lipid and carbohydrate here assayed allow us to assume that the optimizations of pintado diets are very dependent of the best ratios of them. / O crescimento é reflexo das interações metabólicas dependentes dos ajustes conseqüentes ao estado nutricional. O pintado, Psuedoplatystoma corruscans, é um Siluriforme carnívoro que, pela qualidade da sua carne e esportividade na pesca, apresenta amplo potencial para a aqüicultura, mas sua tecnologia de produção ainda é incipiente. O presente trabalho teve como objetivo o estudo dos aspectos adaptativos dos processos digestivos, metabólicos e da morfologia do intestino de juvenis de pintado, submetidos a variações nos teores de proteína e energia da dieta. Para a investigação das enzimas digestivas e metabolismo intermediário, os animais foram submetidos a dietas isoenergéticas (4.000 kcal EB/kg) com diferentes teores de proteína bruta (20, 30, 40 e 50%); mesmos tratamentos utilizados para as análises histológicas no intestino. Na segunda etapa, os peixes foram submetidos a dietas isoprotéicas (31,5% PB) com variação no teor de energia bruta (3.500, 3.850, 4.200 e 4.550 kcal EB/kg). Os extratos enzimáticos do estômago, intestino anterior, médio e posterior foram utilizados na determinação das atividades de protease inespecífica, tripsina, quimiotripsina, amilase e lipase. O sangue foi utilizado nas determinações hematimétricas. O plasma e as amostras de fígado, músculo branco e rim foram usados na quantificação de glicose, lactato, piruvato, amônia, uréia (extratos ácidos), aminoácidos livres, triglicerídeos, ácidos graxos livres (extratos neutros), glicogênio, proteína total (extratos alcalinos), e da atividade das enzimas GDH e arginase. A melhor porcentagem de ganho de peso foi apresentada pelos animais arraçoados com 40% PB, seguidos pelos grupos que receberam 30, 50 e 20% PB na dieta, respectivamente. Os peixes arraçoados com o menor teor energético, 3.500 kcal EB/kg apresentaram ganho de peso muito superior aos demais. Em função da quantificação dos metabólitos e seu reflexo no desempenho produtivo, verificou-se que tanto a carência como o excesso de proteína na dieta é extremamente prejudicial ao metabolismo de pintado. A menor quantidade (20% PB) provavelmente não atendeu às exigências em aminoácidos essenciais, e a maior (50% PB) conduziu a rearranjos metabólicos de um quadro gliconeogênico, para manutenção da glicemia e suportar a demanda energética. O excesso de energia na dieta provavelmente levou à diminuição da ingestão alimentar conduzindo ao consumo de suas reservas gliconeogênicas e depreciando o crescimento. As maiores atividades proteolíticas foram observadas no estômago, onde também foram observadas atividades lipolítica e amilohidrolítica, destacando o papel desta estrutura no processo digestivo da espécie. As proteases praticamente não foram responsivas aos teores de proteína na dieta, e só apresentaram-se aumentadas em função do aporte energético das dietas isoprotéicas na tentativa de suprir suas necessidades em aminoácidos essenciais. Este quadro sugere que estas enzimas sejam de caráter constitutivo, possibilitando à espécie o melhor aproveitamento da proteína, independente da sua quantidade na dieta. A lipase também esboçou um caráter constitutivo, variando apenas em função do consumo alimentar, não respondendo à variação do conteúdo de lipídeos na dieta. A amilase, embora com atividades inferiores àquelas apresentadas pelos peixes onívoros ou herbívoros, apresentou-se como uma enzima indutiva, respondendo à variação do conteúdo de amido na dieta, e não ao de glicogênio, como proposto para peixes carnívoros. Considerando as baixas atividades enzimáticas e a pouca extensão do intestino, supõe-se que seu papel esteja direcionado para a absorção de nutrientes, hipótese reforçada pelas análises histológicas que evidenciaram respostas adaptativas morfológicas em função da quantidade de PB na dieta, aumentando o número de células produtoras de muco, altura das vilosidades intestinais e da espessura da túnica muscular no sentido de intensificar a motilidade das vilosidades intestinais, otimizando os processos absortivos. Em função da grande variação nutricional ensaiada assume-se que a otimização da alimentação para o pintado ainda está na dependência da melhor razão entre proteína, energia e carboidratos na dieta.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2072.pdf: 685014 bytes, checksum: c0ee00556cb312d584c6d96e86a8b2f8 (MD5) Previous issue date: 2008-11-07 / Financiadora de Estudos e Projetos / The knowledge on digestive enzymes allows understanding same aspects of animal nutritional needs and dietary components effects on the activity of those enzymes. Considering the lack on the information about proteolytic and enzymes from the gut wall versus digesta in P.mesopotamicus, it is interesting to see the behavior, distribution and production dynamic of those enzymes. Initially the investigation of digestive processes was proposed in the gut wall and digesta of pacu juveniles over distinct time intervals (0,5; 2; 6; 12 and 24 hours) following the last feeding. At a second time, the digestive aspects in the wall and digesta of pacu were investigated in fish fed with four levels of crude protein (20, 26, 32 and 38%). The digestive, unespecific-proteolytic enzymes, trypsin, chymotrypsin and amylase were assayed in all sections of digestive tract (stomach, piloric cecae, foregut and hindgut) in the first and in the second experiment. The results from the first experiment have shown that pacu presents digestive enzyme activity from the post-prandial moment until 24 hours post-feeding, either in the gut wall or in digesta. However, such enzymatic activity is much differentiated, either to different enzymes types or to different gut sections. In the second experiment our results have shown that digestive amylase and proteases were responsive to the levels of dietary carbohydrate and protein. Moreover, the enzymatic secretion may be direct or conversally proportional to specific substrat of diet and dependent on the enzyme and the gut section. In conclusion the protein production is impaired by fasting longer than 12 hours and the enzyme gut content from all gut is not emptied in consequence of feeding. The alkaline protease content is proportional to its gut wall content. The digestive enzyme of pacu are induced by dietary protein and carbohydrate concentrations. / O conhecimento sobre as enzimas digestivas permite entender alguns aspectos da necessidade nutricional dos animais e o efeito dos componentes da dieta sobre a atividade dessas enzimas. Considerando-se a carência de dados em relação às enzimas proteolíticas e amilohidrolítica na parede versus quimo de P. mesopotamicus, surge o interesse pelo seu comportamento, distribuição e dinâmica de produção destas enzimas de forma associada. Inicialmente foi proposta a investigação dos aspectos digestivos da parede e do quimo de juvenis de pacu em diferentes intervalos (0,5; 2; 6; 12 e 24 horas) após a última alimentação. Em um segundo momento foram investigados os aspectos digestivos na parede e no quimo de juvenis de pacu arraçoados com quatro níveis de proteína bruta (20, 26, 32 e 38 %). Foram analisadas enzimas digestivas proteolíticas inespecíficas, tripsina, quimiotripsina e amilase de todas as seções do trato digestório (estômago, cecos pilóricos, intestino anterior e posterior) tanto no primeiro quanto no segundo experimento. Os resultados obtidos no primeiro experimento indicaram que o pacu apresenta atividade enzimática digestiva desde o período pós-prandial até 24 horas após a alimentação, tanto na parede quanto na luz. Porém, essa atividade enzimática apresenta-se de maneira diferenciada, quer para os diferentes tipos de enzimas quer nas diferentes seções do trato. No segundo experimento os resultados indicaram que a amilase e as proteases digestivas foram responsivas aos níveis de carboidrato e proteína da dieta e que a secreção enzimática pode ser direta ou inversamente proporcionais ao teor do substrato específico da dieta dependendo da enzima e da seção do trato digestório. Concluímos que a produção de protease é prejudicada por jejuns superiores a 12 horas e que o conteúdo de enzimas da parede de todo o trato não se esgota em função da alimentação sendo o teor de protease alcalina da luz proporcional ao teor da parede. As enzimas digestivas de pacu são induzidas pela concentração de proteína e carboidrato da dieta.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6599.pdf: 2881840 bytes, checksum: f0c91115276cbdeae047c039f2676980 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The sugar cane represents one of the most Important agricultural segments in Brazil, which is the largest producer and exporter of sugar in the world as well the second largest ethanol producer. The Sphenophorus levis (Curculionidae) is an important sugarcane pest which lacks effective methods of control. The larvae of this insect feed the sugar cane plant decreasing productivity and causing the plant death. In view of identify the insect digestive arsenal enzymes, a transcriptome study was previously performed from S. levis larvae. Thereby, an invertase (P-fructofuranosidases class) coding sequence was identified and characterized. Considering the scarcity of functional studies on insect P-fructofuranosidases and their apparent non-occurrence among coleopterans, the aim of the present study was to investigate the occurrence and characterize the P-fructofuranosidase transcript identified. To validate that the P-fructofuranosidase sequence (herein denominated Sl-fi-fruct) is indeed encoded by the S. levis genome, PCRs were performed using genomic DNA extracted from the larval fat body as well as DNA from the midgut with microbial content. Amplification of Sl-fi-fruct gene using larval fat body DNA indicated its presence in the insect's genomic DNA. Quantitative PCR (qRT-PCR) analyses indicated that the production of mRNA only occurs in the midgut and reaches the greatest expression level in 30-day-old larvae, which is the expected pattern for digestive enzymes. Chromatography of glycosidases from S. levis midguts showed two enzymes acting as P-fructofuranosidase, indicating the presence of a Sl-fi-fruct isoform or a P-fructofuranosidase from insect intestinal microbiota. Moreover, it was found that a-glucosidases do not act on sucrose hydrolysis. Phylogenetic analyses indicated this enzyme to be similar to enzymes found in other coleopteran and lepidopteran P-fructofuranosidases, but also closely similar to bacterial enzymes, suggesting potential horizontal gene transfer. Despite this, the enzyme seems to be restricted to different groups of bacteria, which suggests distinct origin events. The Sl-fi-fruct gene was cloned in Pichia pastoris to produce the recombinant enzyme (rSl-P-fruct). Molecular weight of the recombinant protein was about 64 kDa, indicating possible glycosylation, since the theoretical weight was 54.8 kDa. The substrate specificity test revealed that rSl-P-fruct hydrolyzes sucrose and raffinose, but not melibiose or maltose, thereby confirming invertase activity. The pH curve revealed greatest activity at pH 5.0, demonstrating rSl-P-fruct to be an acidic P-fructofuranosidase. The enzymatic characterization was done and the optimum temperature was 50 °C, thermal resistance at 36 °C and pH maximum resistance at 6.0. The Michaelis-Menten curve showed Km=20.02 μM, Kcat=520.9 s-1 and Vmax=105.7 μM.s-1. 5 mM of SDS and MgCl2 cause inhibition of rSl-β-fruct activity. The present study expands the concept of the occurrence of P-fructofuranosidase in insects. Despite the few descriptions of this gene in the animal kingdom, it is possible to state that P-fructofuranosidase is crucial to the establishment of some insects throughout their evolutionary history, especially members of the Lepidoptera and Coleoptera clades. Considering the rSl-P-fruct potential to industrial application, they are promising if the thermal properties are improved. / O coleóptero Sphenophorus levis é uma Importante praga da cana-de-açúcar, para o qual ainda não existe um método de controle adequado. Considerando a Importância da cultura canavieira no Brasil, maior produtor e exportador de açúcar e segundo maior produtor de etanol no mundo, um estudo transcriptômico das larvas do inseto foi realizado anteriormente a este trabalho para a identificação do seu arsenal digestivo. Dentre as prováveis enzimas digestivas, foram identificadas sequências que codificam uma enzima da classe das P-frutofuranosidases. O sequenciamento do clone de cDNA foi totalizado e verificou-se a presença de sinal de poliadenilação e cauda poli-A característica de eucariotos, bem como uma região codificadora para um provável peptídeo sinal para secreção da enzima. A comparação da sequência proteica deduzida com o banco de dados do NCBI aponta maior similaridade com invertases bacterianas. A amplificação do gene da P-frutofuranosidase de S. levis (Sl-fi-fruci) por PCR a partir de DNA genômico, livre de contaminação bacteriana, sugere que S. levis realmente codifica uma P-frutofuranosidase. Comparando-se sequências de aminoácidos de P-frutofuranosidases de coleópteros, observam-se regiões conservadas entre membros da família Curculionidae. O ensaio bioquímico das glicosidases intestinais de S. levis mostrou que existem provavelmente duas P-frutofuranosidases responsáveis pela digestão de sacarose. Portanto, o inseto pode apresentar uma isoforma da Sl-fí-fruct ou se beneficiar de uma invertase produzida pela própria microbiota. As análises de expressão via PCR quantitativo em tempo real revelaram que o gene é expresso em intestino médio, nas fases de alimentação do inseto, característica de uma enzima digestiva. As análises filogenéticas indicaram que Sl-P-fruct é similar a outras P-frutofuranosidases de lepidópteros e coleópteros, mas se apresenta mais próxima das enzimas bacterianas. Essa proximidade se dá a grupos distintos de bactérias, quando comparada com enzimas de lepidópteros, levando-nos a propor um evento de transferência horizontal independente do que ocorreu em lepidópteros. A fase aberta de leitura (ORF) codificadora da enzima, excluindo o peptídeo sinal, foi clonada no plasmídeo pPICZa-A para sua produção heteróloga em Pichia pastoris. A enzima produzida (rSl-P-fruc) apresentou-se glicosilada, com massa molecular aproximada de 65 kDa. Os ensaios de especificidade ao substrato confirmaram que a enzima é uma P-frutofuranosidase. A rSl-P-fruc apresentou pH de maior atividade próximo a 5,0 e temperatura de atividade máxima próxima a 50 °C. Os ensaios de termoestabilidade e resistência térmica sugerem uma baixa capacidade térmica para rSl-P-fruc, que se desnatura com facilidade. Os sais Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e MgCl2 provocam inibição da rSl-P-fruc na concentração de 1 mM. As constantes cinéticas estimadas para a rSl-P-fruct foram Km = 20,02 mM, Vmax = 105,7 |iM.s-1 e kcat = 520,9 s-1. O presente estudo expande o conceito da ocorrência de P-frutofuranosidases em coleópteros. Apesar dos poucos relatos desse gene no reino animal, é possível afirmar que a P-frutofuranosidase é importante e vem sendo mantida entre algumas espécies de lepidópteros e coleópteros. Tratando-se das potencialidades que a rSl-P-fruct apresenta para uma aplicação industrial, observa-se um potencial positivo caso haja melhorias em sua estabilidade térmica.