Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431140-Texto+Completo-0.pdf: 1654374 bytes, checksum: 1465b8ac4be5cfbe78bdaa126071ddf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Guanosine monophosphate (GMP) reductase catalyzes the reductive deamination of GMP to inosine monophosphate (IMP). GMP reductase plays an important role in the conversion of nucleoside and nucleotide derivatives of guanine to adenine nucleotides. In addition, as a member of the purine salvage pathway, it also participates in the reutilization of free intracellular bases. Here we present cloning, expression and purification of Escherichia coli guaC-encoded GMP reductase to determine its kinetic mechanism, as well as chemical and thermodynamic features of this reaction. Initial velocity studies and isothermal titration calorimetry demonstrated that GMP reductase follows an ordered bi-bi kinetic mechanism, in which GMP binds first to the enzyme followed by NADPH binding, and NADP+ dissociates first followed by IMP release. The isothermal titration calorimetry also showed that GMP and IMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles showed groups with apparent pK values of 6. 6 and 9. 6 involved in catalysis, and pK values of 7. 1 and 8. 6 important to GMP binding, and a pK value of 6. 4 important for NADPH binding. Primary deuterium kinetic isotope effects demonstrated that hydride transfer contributes to the rate-limiting step, whereas solvent kinetic isotope effects arise from a single protonic site that plays a modest role in catalysis. Multiple isotope effects suggest that protonation and hydride transfer steps take place in the same transition state, lending support to a concerted mechanism. Pre-steady-state kinetic data suggest that product release does not contribute to the rate-limiting step of the reaction catalyzed by E. coli GMP reductase. / A enzima guanosina monofosfato (GMP) redutase catalisa a deaminação redutiva do GMP à inosina monofosfato (IMP). GMP redutase possui um papel importante na conversão dos nucleosídeos e nucleotídeos derivados de guanina a nucleotídeos de adenina. Além desse fato, como parte da via de salvamento de purinas, também participa da reutilização de bases livres intracelulares. Nesse trabalho, mostramos a clonagem, a expressão e a purificação da GMP redutase codificada pelo gene guaC de Escherichia coli a fim de determinar seu mecanismo cinético; bem como as características químicas e termodinâmicas da reação catalisada. Estudos de velocidade inicial e titulação de calorimetria isotérmica demonstraram que a GMP redutase possui um mecanismo cinético bi-bi ordenado, no qual o GMP liga primeiro à enzima, seguido pela ligação do NADPH; o NADP+ se dissocia primeiro, seguido pela liberação do IMP. A titulação calorimétrica também mostrou que a ligação do GMP e IMP são processos termodinamicamente favoráveis. Perfis de pH demonstraram grupos com valores de pK aparentes de 6,6 e 9,6 envolvidos na catálise, valores de pK de 7,1 e 8,6 importantes para ligação do GMP e um valor de pK de 6,4 importante para ligação do NADPH. Efeito isotópico primário demonstrou que a transferência do hidreto contribui para a etapa limitante da reação, enquanto que os efeitos isotópicos do solvente provêm de um único local de protonação que possui um papel modesto na catálise. Efeito isotópico múltiplo sugere que as etapas de protonação e transferência do hidreto ocorrem no mesmo estado de transição, fornecendo evidência de um mecanismo concerted. Os dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação do produto não contribui para a etapa limitante da reação catalisada pela GMP redutase de E. coli. Em conjunto, os resultados mostram que a reação catalisada pela GMP redutase segue um mecanismo sequencial e ordenado, onde a transferência do hidreto e do próton ocorrem no mesmo estado de transição. Os resultados aqui apresentados foram os primeiros a evidenciar o mecanismo cinético da GMP redutase, bem como, os resíduos fundamentais para catálise e/ou ligação, além de fornecer informações sobre o estado de transição da reação.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:19:51Z : No. of bitstreams: 1 santos_eao_me_ilha.pdf: 4044422 bytes, checksum: c62efee73c7a71e03187bde6c4a67542 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Celulose e hemicelulose são os polissacarídeos mais encontrados em todo o mundo. Em plantas, a celulose e a hemicelulose estão situados entre a lignina formando as fibras de celulose. As enzimas hemicelulolíticas produzidas por micro-organismos têm atraído uma grande atenção desde a década passada, particularidade devida as suas características biotecnológicas em vários processos industriais como indústrias de alimentos, ração animal, etanol e papel e celulose. Assim neste trabalho foram isoladas linhagens fungicas de duas regiões de Cerrado, na qual oito linhagens fúngicas foram analisadas quanto ao perfil de produção enzimática sob fermentação em estado sólido, utilizando resíduo agroindustrial como substrato. Foram determinadas atividade enzimática para xilanase e CMCase. A melhor atividade enzimática para xilanase obteve-se a partir do fungo mesofílico Neosartorya spinosa P2D19 com 20,6 U ml-1 (133,0 U/g), após 72 horas de cultivo sob fermentação em estado sólido. A enzima mostrou-se mais ativa em pH 5,0, porém cerca de 85% da atividade foi mantida em pH 7,5. A temperatura ótima dessa xilanase foi em 60° C / Cellulose and hemicellulose are polysaccharides found all over the world. In plants, the cellulose and hemicellulose are localed between the lignin forming the cellulose fibers. Hemicellulolytic enzymes produced by microorganisms has attracted great attention over the past decade due to its special features in several biotechnological industrial processes such as food industries, animal feed, ethanol and pulp and paper. In this study, fungal strains were isolated from two Cerrado areas, from which eight fungal strains were analyzed for enzyme production profile in solid fermentation state using agro industrial residue as substrate. Enzyme activity was determined for xylanase and CMCase. The highest xylanase enzyme activity was obtained with fungi mesophilic Neosartorya spinosa strain P2D16 with 20.6 U.ml-1 (133 U/g) after 72 hours of cultivation under solid fermentation state. The enzyme was more active at pH 5.0, although of its 85% activit was maintained at pH 7.5. The optimum temperature for xylanase activity was 60° C

Conforme a previsão do governo brasileiro, até 2019, o óleo diesel (B0) receberá o aumento de 10% de biodiesel, compondo a mistura B10. O biodiesel, devido a sua natureza renovável e sustentável, impulsiona estudos prevendo a estabilidade durante o armazenamento. Neste sentido, o biodiesel utilizado no Brasil é composto por metil ésteres de cadeias longas de ácidos graxos derivados da transesterificação de óleos vegetais ou gorduras animais. Além da possibilidade de degradação química, a natureza das moléculas também o tornam mais suscetível à biodegradação. O objetivo do trabalho foi avaliar a capacidade deteriogênica (crescimento, degradação e detecção de genes) relacionado com a degradação de combustíveis pelo fungo filamentoso Pseudallescheria boydii e pela levedura Meyerozyma guilliermondii em diesel puro (B0); biodiesel puro (B100) e na mistura B10, em meio mineral durante estocagem simulada. Foram incubados por 45 dias a 30°C frascos contendo proporções (1:6, 2:3 e 2:1) de combustível (B0, B10 e B100) em relação ao meio mínimo mineral BH com inóculo de 104 esporos mL-1 de Pseudallescheria boydii. Para a avaliação de Meyerozyma guilliermondii, 102 células mL-1 foram acrescentadas a 5 mL de B10 ou B100 e 30 mL de meio mínimo mineral BH, incubados em agitação (120 rpm) a 28°C por 10 dias. Para o acompanhamento da formação de biomassa foi realizado o método gravimétrico. A curva de crescimento da levedura foi estimada pela contagem de UFC mL-1. A fase aquosa foi analisada pelas metodologias de produção de lipase, medidas de pH e de tensão superficial, IE24 e GC-MS com SPME. A detecção de genes funcionais foi realizada por PCR. A degradação de ésteres e hidrocarbonetos foi avaliada por IV e RMN. Em relação ao fungo filamentoso, as medidas de biomassa produzida ao longo dos 45 dias indicaram maior produção de biomassa no combustível B10. Quanto à levedura, não se obteve diferença significativa na curva de crescimento entre B10 e B100. Em ambos os fungos não houve produção significativa de biossurfactante, mas foi detectada produção de lipase e os genes P450 e de lipase foram amplificados. A emulsificação da fase oleosa foi observada apenas no experimento com a levedura. Os compostos identificados na fase aquosa por cromatografia com os dois fungos foram: álcoois, ésteres, ácidos, sulfurados, cetonas e fenóis. Ambos microrganismos cresceram às expensas de diesel e biodiesel e meio mínimo mineral. Pseudallescheria boydii degradou os hidrocarbonetos e ésteres do combustível e biocombustível, respectivamente. / According to the Brazilian government's forecast, until 2019, diesel oil (B0) will receive a 10% increase in biodiesel, composing the B10 blend. Biodiesel due to its renewable and sustainable nature boosts studies predicting stability during storage. In this sense, the biodiesel used in Brazil is composed of methyl esters of long chains of fatty acids derived from transesterification of vegetable oils or animal fats. In addition to the possibility of chemical degradation, the nature of the molecules also make it more susceptible to biodegradation. The aim of this work was to evaluate the deteriogenic potential (growth, degradation and detection of genes) related to the degradation of fuels such as pure diesel (B0), pure biodiesel (B100) and the B10 blend of Pseudallescheria boydii and Meyerozyma guilliermondii in mineral medium during storage. Different ratios (1: 6, 2: 3 and 2: 1) of fuel (B0, B10 and B100) with respect to the minimal mineral medium BH were incubated for 45 days at 30°C with inoculum of 104 spores mL-1. For the evaluation of Meyerozyma guilliermondii, 102 cells mL-1were added to 5 mL of B10 or B100 and 30 mL of minimal BH mineral medium, incubated with shaking (120 rpm) at 28°C for 10 days. We estimates the yeast growth curve by the count of CFU mL-1. We analyzed the aqueous phase by any methodologies as lipase production, pH and surface tension measurements, IE24 and GC-MS with SPME. The detection of functional genes for hydrocarbon degradation was performed by PCR. The degradation of esters and hydrocarbons was evaluated by IR and NMR. In relation to the filamentous fungus, the biomass measurements produced during the 45 days indicated higher biomass production in the B10 fuel. As for yeast, there was no significant difference in the growth curve between B10 and B100. In both fungi, there was no significant production of biosurfactant, but production of lipase and the P450 and lipase gene was detected. Oily emulsification was observed only in the yeast experiment. We identified degradation products by the chromatography in the aqueous phase. The compounds identified were alcohols, esters, acids, sulfur, ketones and phenols. Both microorganisms grew at the expense of diesel, biodiesel and minimal mineral medium. Meyerozyma guilliermondii e Pseudallescheria boydii degradated hydrocarbons and esters of fuel and biofuels, respectivelly.

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Janete Aparecida Desidério / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: André Ricardo de Lima Damásio / Banca: Igor Polikarpov / Resumo: O clone metagenômico B5pl37 (inserto de 23 Kb) foi obtido por meio de uma prospecção por PCR para o conjunto gênico de "Policetídeos Sintases tipo II" (PKSII) em uma biblioteca cosmidial de amostra de solo de bosque de eucaliptos (S.E.). As PKSII são responsáveis pela produção de inúmeras moléculas bioativas, dentre os quais se destacam os antibióticos policetídicos. Parte da sequência do inserto (cobertura de 27-43%) apresentou similaridade de 77-78% com bactérias da família Streptomycetaceae (ferramenta BlastN, Genbank). Além da PKS II, a anotação gênica permitiu identificar genes relacionados à degradação de compostos lignocelulósicos importantes para a produção de combustíveis de segunda geração (2G): uma β- glicosidase, uma celulase e uma "Multicopper oxidase" (MCO). Considerando a importância industrial destes genes, este trabalho teve como objetivo a caracterização in silico e in vitro/vivo dos mesmos. As análises in silico auxiliaram a identificar a arquitetura do sítio ativo (modelo de estrutura proteica obtida por homologia) e famílias enzimáticas (com base em agrupamentos fenéticos com sequências de enzimas de atividade conhecida). Quanto às análises in vitro/vivo, foram realizados experimentos de expressão em vetor pET28a em Escherichia coli para as enzimas celulase (linhagens de E.coli BL21; C41 e Artics) e β-glicosidase (E.coli BL21), enquanto o gene MCO foi submetido à síntese in vitro para um estudo posterior. Foi feita a caracterização cinética da β-glicosidase (melhor rendimento na expressão e purificação), que obteve os parâmetros catalíticos: Vmax de 0,79 μM/min; km de 0,46 mM.. Os respectivos valores de temperatura e pH ótimos para a enzima foram 37°C e pH7-7,5; e a enzima foi capaz de manter uma atividade acima de 80% para uma faixa de pH 6,5-8,0 e temperatura 35- 40°C. Com relação à PKSII, foram iniciados os processos preparatórios para a... / Abstract: The Clone metagenomic B5pl37 (insert of 23kb length) was obtained by a PCR prospect for gene set "Polyketide Synthases type II" (PKSII) in a library cosmidial eucalyptus grove soil sample (SE). The PKSII are responsible for producing many bioactive molecules, among which the antibiotics were noticeable. Part of the sequence of the insert (27-43% coverage) showed similarity of 77-78% with bacteria Streptomycetaceae family (BLASTN tool, Genbank). In PKS II gene annotation was possible to identify genes related to the degradation of lignocellulosic important compounds for the production of second generation biofuel (2G): A β-glucosidase, a cellulose and a Multicopper oxidase (MCO). Considering the industrial importance of these genes, this study aimed to characterize in silico and in vitro /in vivo thereof. The in silico analyzes helped identify the architecture of the active site (protein structure obtained by homology) and enzyme families (based on phenetic groups with sequences of known enzyme activity). The in vitro / vivo experiments were performed in pET28a expression vector in Escherichia coli for cellulase (E. coli strains BL21; Artics and C41) and β-glucosidase (E. coli BL21), while the gene MCO in vitro synthesis for a subsequent study it was submitted. We had done the kinetic characterization of β- glucosidase (best performance in the expression and purification), which obtained the catalytic parameters: Vmax 0.79 uM / min; km from 0.46 mM. The respective temperature and the pH optimum for the enzyme was 37 ° C and pH7-7,5; and the enzyme was able to maintain an activity above 80% at a pH of 6.5-8.0 and temperature range 35-40 ° C. With respect to PKSII, the preparatory processes have been started to insert the expression in the same host specialized for expression of Streptomyces coelicolor antibiotic M1152 (courtesy of Juan P. Gomez-Escribano, John Innes Centre, Norwich, UK). Cosmidial exchange vector was carried out ... / Doutor

Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2014. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-02T13:00:36Z No. of bitstreams: 1 2014_ManuellaRodriguesDeSouzaMello.pdf: 681269 bytes, checksum: 245580771537987e3030e85ea75ecfa7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-02T13:01:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ManuellaRodriguesDeSouzaMello.pdf: 681269 bytes, checksum: 245580771537987e3030e85ea75ecfa7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-02T13:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ManuellaRodriguesDeSouzaMello.pdf: 681269 bytes, checksum: 245580771537987e3030e85ea75ecfa7 (MD5) / O recente aparecimento de bactérias produtoras de enzimas carbapenemases representa um problema de saúde pública relacionado com a ineficiência no tratamento de infecções nosocomiais. Além do aumento de isolados humanos, muitas pesquisas apontam o crescente número de bactérias multirresistentes não somente em ambientes hospitalares, mas também em isolados de animais, ambientes e afluentes. Entretanto, estudos direcionados para o potencial zoonótico ainda são limitados. O objetivo do presente estudo foi identificar cepas de Enterobacteriaceae e P. aeruginosa produtores de enzimas carbapenemases circulantes em ambientes veterinários. Foram isoladas 17 amostras provenientes de clínicas veterinárias e submetidas ao teste de difusão em disco com imipenem, ertapenem e meropenem. 11 cepas sugestivas da presença de carbapenemases, com halo ≤22 mm no antibiograma, foram submetidas ao Teste de Hodge Modificado. Todas as amostras foram negativas para o teste de Hodge Modificado. Apesar de não ter sido detectada fenotipicamente a expressão da enzima carbapenemase, a resistência aos carbapenêmicos pode estar relacionada a outro mecanismo de resistência adquirido. Portanto, considerando os crescentes relatos da disseminação de carbapenemases, em especial a KPC, o mapeamento das áreas onde bactérias multirresistentes estão presentes é vital para a elaboração de medidas de controle e manutenção da salubridade da população. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The recent emergence of bacteria producing carbapenemase enzyme represents a public health issue related to the inefficiency in the treatment of nosocomial infections. In addition to the increased human isolates, current studies indicate the increasing number of multidrug-resistant bacteria not only in hospital settings, but also present in isolates from animals, common areas and affluents. However, studies on the zoonotic potential are still limited. The aim of this study was to identify strains of Enterobacteriaceae and P. aeruginosa producing carbapenemase enzymes in veterinary environments. 17 samples from veterinary clinics were isolated and examined through the disk diffusion test with imipenem, meropenem and ertapenem. 11 strains suggesting of the presence of carbapenemase with halo ≤ 22 mm on antibiograma were submitted to the modified Hodge test. All samples were negative for the modified Hodge test. Despite the expression of carbapenemase enzyme has not been phenotypically detected, the carbapenem resistance may be related to another mechanism of acquired resistance. Therefore, considering the increasing reports of the spread of carbapenemases, especially KPC, the mapping of areas where multidrug-resistant bacteria are present is vital for the development of control measures and maintenance of the population health.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-04T10:47:40Z No. of bitstreams: 1 MARY-ANN ELVINA XAVIER.pdf: 1811588 bytes, checksum: b6a72e0cbefad213d4d0806947b0b504 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-21T13:44:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MARY-ANN ELVINA XAVIER.pdf: 1811588 bytes, checksum: b6a72e0cbefad213d4d0806947b0b504 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-21T13:44:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARY-ANN ELVINA XAVIER.pdf: 1811588 bytes, checksum: b6a72e0cbefad213d4d0806947b0b504 (MD5) / Com o intuito de desenvolver novos materiais para tratamento do câncer, o objetivo deste trabalho foi associar dois componentes, sendo um com atividade anticarcinogênica comprovada: o BTCI e nanopartículas de maghemita recobertas por dextrana (MagDex) e caracterizar magnética e biofisicamente o complexo formado. A atividade antitumoral do BTCI foi comprovada contra células MCF-7 e essa molécula associada às nanopartículas biocompatíveis pode ser direcionada para um local sítio específico e lisar células tumorais no processo de magnetohipertermia. A caracterização do complexo foi feita pelos métodos: microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, espalhamento de luz dinâmico (diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta e polidispersividade), fluorescência (número de sítios e constante de associação), dicroismo circular, ensaios enzimáticos colorimétricos para avaliação da atividade inibitória do BTCI, birrefrigência magnética estática, ensaios de associação do inibidor. De acordo com análises de diâmetro hidrodinâmico, o BTCI complexou com as nanopartículas de MagDex. A constante de associação do complexo foi de 104 M-1 em pH 4,0 e 103 M-1 em pH 7,4 e pH 10,0. Segundo os parâmetros termodinâmicos, nessas três condições de pH, a associação do complexo foi espontânea, dirigida entropicamente com contribuições de associações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio. A associação de BTCI a MagDex não alterou o conteúdo das estruturas secundárias, nem a atividade inibitória do BTCI complexado contra suas enzimas cognatas de forma expressiva. Adicionalmente, BTCI-MagDex manteve as características magnéticas de MagDex, como a maior resposta de susceptibilidade magnética a campos de (300 Oe), mesmo após diluições. O ensaio de sedimentação magnética sugere que 80% do BTCI associa às nanopartículas. Em conclusão, os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que BTCI-MagDex apresenta características físico-químicas que favorecem a estabilidade e atividade do BTCI e a manutenção das propriedades magnéticas das nanopartículas, condição esta que é fundamental para estudos futuros que visem a aplicação desse sistema na terapia contra o câncer. / In order to develop new materials for the treatment of cancer, the objective was to associate two components, one with proven anticancer activity: the BTCI and maghemite nanoparticles coated with dextran (MagDex) and magnetic and biophysically characterize the complex formed. The antitumor activity of BTCI was proven against MCF-7 cells and this molecule associated with biocompatible nanoparticles can be targeted to a specific site location and kill tumor cells in the process of magnetohipertermia. The characterization of the complex was made by the methods: transmission electron microscopy and scanning electron microscopy, dynamic light scattering (hydrodynamic diameter, zeta potential and polydispersity), fluorescence (number of sites and association constant), circular dichroism, enzymatic colorimetric assays for assessment inhibitory activity of BTCI, static magnetic birefringence, tests of association of the inhibitor. According to analysis of hydrodynamic diameter, BTCI formed a complex with MagDex nanoparticles. The association constant of the complex was 104 M-1 at pH 4.0 and 103 M-1 at pH 7.4 and pH 10.0. According to the thermodynamic parameters, these three pH conditions, the association of the complex was spontaneous, entropically driven with contributions from hydrophobic associations and hydrogen bonding. The association of BTCI-MagDex did not alter the content of secondary structures, nor the inhibitory activity of the complexed BTCI against their cognate enzymes significantly. Additionally, BTCI-MagDex kept MagDex magnetic characteristics, such as susceptibility response to magnetic fields (300 Oe), even after dilution. The test of magnetic sedimentation suggests that 80% of BTCI associated with nanoparticles. In conclusion, the results suggest that BTCI-MagDex has physicochemical characteristics that favor the stability and activity of BTCI and maintenance of the magnetic properties of nanoparticles, a condition which is critical for future studies aimed at applying this system in therapy against cancer.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-24T13:27:47Z No. of bitstreams: 1 2012_AnaCarollineRibeirodeToledoPinto.pdf: 1319633 bytes, checksum: bc40b50d797b11f2563013e434756f8f (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-10-01T13:48:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AnaCarollineRibeirodeToledoPinto.pdf: 1319633 bytes, checksum: bc40b50d797b11f2563013e434756f8f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-01T13:48:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AnaCarollineRibeirodeToledoPinto.pdf: 1319633 bytes, checksum: bc40b50d797b11f2563013e434756f8f (MD5) / A cana de açúcar é a segunda cultura mais abundante no país, e tem como resíduo o bagaço de cana, o qual é constituído por células vegetais que possuem uma parede celular composta por celulose, hemicelulose e pectina, além da lignina. A biomassa lignocelulósica armazena grande quantidade de energia química, que pode ser convertida em diversas outras fontes energéticas. Fungos filamentosos são microrganismos capazes de produzir e secretar enzimas variadas para utilizar a parede celular vegetal como fonte de carbono. Nesta dissertação foi analisado o secretoma de Aspergillus oryzae crescido em estado sólido de bagaço de cana como fonte de carbono. Foram testadas duas soluções para a extração do secretoma, a) tampão acetado de sódio 0,25mM, pH 5,0 e b) tampão acNa 0,25mM, pH 5,0, 0,1%Tween 80. As amostras foram submetidas às análises enzimáticas, eletroforéticas e por espectrometria de massas (LC-MS/MS). As análises enzimáticas e eletroforéticas mostraram que não houve diferença entre os dois métodos de extração. Além disso, o detergente Tween 80 aparenta aumentar a extração de proteínas vindas do bagaço de cana, o que não é desejável para a análise por espectrometria de massas. A comparação do secretoma de A. oryzae em estado sólido com o secretoma deste em cultura submersa usando meio contendo bagaço mostrou diferenças significativas, sendo o secretoma em estado sólido mais diversificado enquanto o secretoma em cultura submersa apresentou maior abundância de determinadas proteínas. A análise do secretoma produzido em estado sólido por espectrometria de massas permitiu a identificação de 47 proteínas não redundantes, sendo 19 relacionadas à degradação de biomassa lignocelulósica. O polimorfismo enzimático em A. oryzae pode ter sido a justificativa para o baixo número de identificações. As proteínas intracelulares identificadas podem ter sido consequência do processo de extração, mas podem também ter sido secretadas por vias não convencionais, da mesma forma que ocorre em protozoários. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The sugarcane crop is the second more abundant crop in Brazil, and has as waste sugarcane bagasse, which is constituted by plant cells with a cell wall composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The lignocellulosic biomass stores a large amount of chemical energy, which can be converted to another sources of energy. Filamentous fungi are a group of organisms that are able to secrete a variety of proteins to disrupt cell wall structure for further carbon assimilation. In this work, Aspergillus oryzae was submitted to solid state-fermentation and it was analyzed two different solutions for extraction of proteins secreted by the fungus as follows: a) 0.25 mM sodium acetate buffer, pH 5; b), 0.25 mM sodium acetate buffer, pH 5, 0.1% Tween 80. The samples were analyzed by enzymatic assays, electrophoretical profile and mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. Enzymatic and electrophoretical analysis showed that there were no differences between extraction with sodium acetate buffer and the extraction buffer with Tween 80. Moreover, Tween 80 seems to increase sugarcane bagasse proteins solubilization in the sample, which is not desirable for MS analysis. The comparison between A.oryzae’s secretome in solid-state culture and in submerged culture using sugarcane bagasse as carbon source showed remarkable differences, being the solid-state secretome more complex and the submerged-culture secretome with some more abundant proteins. Mass spectrometry analysis of solid-state secretome allowed the identification of 47 non redundant proteins, and 19 of them were related with biomass degradation. The high degree of enzymatic polymorphisms in A. oryzae might be the reason of few identified proteins. Intracellular proteins may be a consequence of extraction process, but they could be secreted in an unconventional secretion pathway, as those ones observed in protozoan parasites.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-24T12:59:02Z No. of bitstreams: 1 2012_PedroAlvesMartins.pdf: 2817452 bytes, checksum: e51e7a47a4726d306b0c4fcecf8ab2e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T12:06:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PedroAlvesMartins.pdf: 2817452 bytes, checksum: e51e7a47a4726d306b0c4fcecf8ab2e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T12:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PedroAlvesMartins.pdf: 2817452 bytes, checksum: e51e7a47a4726d306b0c4fcecf8ab2e2 (MD5) / Os fungos filamentosos quando submetidos ao crescimento em meios contendo material lignocelulósico, são capazes de produzir diferentes tipos de enzimas extracelulares responsáveis por catalisar a hidrólise de celulose, hemicelulose e outros polissacarídeos encontrados nas paredes celulares vegetais. Algumas dessas enzimas podem ser aplicadas comercialmente em processos industriais, como nas indústrias alimentícia, têxtil, papeleira e também na produção de bioetanol. O fungo filamentoso mesofílico e de distribuição cosmopolita Aspergillus niger é saprófita e apresenta potencial biotecnológico como produtor de enzimas hidrolíticas O presente trabalho tem como objetivo a purificação de xilanases de A. niger bem como a análise do seu secretoma (conjunto de proteínas secretadas) após seis dias de crescimento em meio sintético suplementado com 1% de bagaço de cana como única fonte de carbono. Uma fração xilanolítica (Xyl) previamente purificada por cromatografia de exclusão molecular revelou ser composta por polipeptídeos distintos apresentando diferentes pIs como demonstrado por eletroforese bidimensional (2-DE). A fim de aperfeiçoar a purificação de Xyl e separar possíveis isoformas, Xyl foi submetido às cromatografias de troca aniônica (CTA) em pH 8,5 e de troca catiônica (CTC) em pH 5,0. A CTA separou uma fração contendo apenas dois polipeptídeos como demonstrado por 2-DE. Um spot foi identificado como sendo uma endo-1,4-β-xilanase e o outro não pôde ser identificado. A xilanase presente na fração purificada exibiu um Km de 6.46 mg/ml e uma Vmax de 1.984 UI.mL-1 para xilana solúvel. A fim de ser submetido à análise proteômica,o secretoma foi primeiramente submetido à digestão tríptica tanto em solução quanto após separação eletroforética em gel de poliacrilamida. Os peptídeos resultantes foram analisados por LC-MS/MS-Orbitrap em modo Data Dependent Acquisition. A abordagem de digestão em gel propiciou a identificação de 55 proteínas comparada à identificação de apenas 14 proteínas utilizando a digestão em solução. A maioria das proteínas identificadas pertence à classe das hidrolases, sendo as xilanases as mais abundantes. Estes resultados correspondem aos ensaios enzimáticos realizados e à composição esperada do secretoma: um arsenal de enzimas capazes de promover a hidrólise do substrato e prover meios para o desenvolvimento e crescimento do fungo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / When submitted to growth in media containing lignocellulosic materials, filamentous fungi are able to produce different kinds of extracellular enzymes, which are responsible to catalyze the hydrolysis of cellulose, hemicellulose and other polysaccharides found on plant cell wall. Some of these enzymes can be commercially applied to industrial processes, such as the ones used on food, paper and textile industry as well as on the production of bioethanol. Aspergillus niger, a mesophilic and saprophytic filamentous fungus, possesses biotechnological potential as a producer of hydrolytic enzymes. The present work aims at purifying xylanases from A. niger and analyzing its secretome (group of secreted proteins) after six days of growth on synthetic medium supplemented with 1% sugarcane bagasse as the only carbon source. A xylanolytic fraction (Xyl) previously purified by molecular exclusion chromatography was shown to be composed of different polypeptides bearing different pIs as demonstrated by two-dimensional electrophoresis (2-DE). In order to improve Xyl purification and to separate possible xylanase isoforms, Xyl was submitted to both Anion Exchange Chromatography (AEC) at pH 8.5 and Cation Exchange chromatography (CEC) at pH 5.0. The AEC approach could successfully isolate a fraction containing two different polypeptides as demonstrated by 2-DE. One spot was identified as an endo-1,4-β-xylanase and the other couldn’t be identified. This xylanase in the purified fraction exhibited a Km of 6.46 mg/ml and a Vmax of 1.984 IU.mL-1 for soluble xylan. For proteomic analysis, the secretome was firstly submitted to In-solution trypsin digestion or alternatively to SDS-PAGE followed by trypsin digestion of gel slices. Resulting peptides were then analyzed by LC-MS/MS-Orbitrap using Data Dependent Acquisition mode. Overall, the In-gel digested samples provided identification of 55 proteins comparing to only 14 identified proteins in In-solution digested samples. Most proteins identified in A. niger secretome belonged to the hydrolase class, being xylanases the most abundant ones. These findings correspond to experimental enzymatic assays and the expected secretome composition: an arsenal of enzymes capable of hydrolyzing the substrate and providing ways for the fungi growth and development.