Peptidase pode ser considerada, como uma subclasse das enzimas hidrolíticas que ocupam uma posição central em relação às suas aplicações na área fisiológica e também na área comercial. As peptidases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por cerca de 60% da venda mundial de enzimas. O presente trabalho visa avaliar a produção de peptidase em fermentação submersa (FSm) pelo fungo Scopulariopsis koningii, utilizando como substrato farinha de pena (FP), a caracterização bioquímica parcial, secagem do extrato bruto, purificação da peptidase e determinação de especificidade da peptidase isolada. Para avaliar a influência da farinha de pena (FP), na produção de peptidases, foram adicionadas às porcentagens de 0,2; 0,4 e 0,8% no meio de cultura. Os melhores níveis de produção de peptidases pelo fungo Scopulariopsis koningii foram obtidos nas concentrações de 0,4% e 0,8% de FP em 48h de fermentação com 1.427 U/mL. A caracterização bioquímica parcial do extrato bruto foi realizada com azocaseína 1% preparada em tampão com pH adequado. A peptidase presente no extrato enzimático apresentou atividade ótima em pH 6,5 e temperatura ótima de 55°C. A peptidase foi inibida por PMSF, indicando a presença de resíduo de aminoácido serino no sítio catalítco, e desta forma sendo classificada como serino peptidase. Entretanto, também observamos uma inibição por EDTA, sugerindo a presença de uma metalo peptidase presente no extrato bruto, desta forma podemos sugerir que o fungo S. koningii na presença do meio contendo FP secreta duas subclasses; serino e metalo peptidase, ou secreta uma serino peptidase dependente de íon. Zimograma constatou a presença de duas enzimas. A atividade enzimática do extrato bruto diminuiu significativamente quando exposta os íons Al+3, Ni2+ e Cu2+ e aumentada quando adicionados os íons Ba2+, Ca2+ e Mg2+. A purificação da metalo peptidase presente no extrato enzimático envolveu sete etapas de purificação, sendo cromatografia de troca-iônica e gel filtração determinantes, com recuperação de 6% e purificação de 3,4 vezes. Utilizando a peptidase pura (metalo) realizouse a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. A peptidase pura apresentou atividade ótima em pH 6,0 e temperatura ótima de 40°C e mostrou-se estável em ampla faixa de pH e temperatura. Foi modulada positivamente pelos íons Na+ e K+ e negativamente por Al3+ e Cu2+. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência de aminoácidos apolares do lado \"linha\" do substrato sintético na eficiência catalítica e no lado não \"linha\" grande influência de aminoácidos polares neutros e apolares. A secagem foi realizada por liofilização foram utilizados três tipos de adjuvantes: maltodextrina, manitol e glicina, em diferentes concentrações. Após a secagem foi realizado estudo da estabilidade nas temperaturas 4, 25 e 60°C por 32 dias para avaliar o desempenho dos adjuvantes na manutenção da atividade do extrato enzimático liofilizado. O adjuvante considerado mais eficaz foi a maltodextrina na concentração de 4,5% que manteve cerca de 93% da atividade do extrato enzimático liofilizado por 32 dias. / Peptidase can be considered as a subclass of hydrolytic enzymes which occupy a central position in relation to their applications in physiological area and also in the commercial area. Peptidases represent one of the three largest groups of industrial enzymes and account for about 60% of worldwide sales of enzymes. This study aims to evaluate the production of peptidase in submerged fermentation (FSm) by the fungus Scopulariopsis koningii, using as substrate feather meal (FP), the partial biochemical characterization, drying the crude extract, purification and determination of specific peptidase peptidase isolated. To evaluate the influence of feather meal (FM), in the production of peptidases, were added to the percentages of 0.2, 0.4 and 0.8% in the culture medium. The best levels of production of peptidases by the fungus Scopulariopsis koningii were obtained at concentrations of 0.4% and 0.8% of FP 48h fermentation with 1,427 U/mL. Partial biochemical characterization of the crude extract was performed with 1% azocasein prepared in buffer with appropriate pH. This in peptidase enzyme extract showed optimal activity at pH 6.5 and optimum temperature of 55°C. The peptidase was inhibited by PMSF, indicating the presence of a serine residue at amino acid catalytic site, and thus being classified as serine peptidase. However, we also observed an inhibition by EDTA, suggesting the presence of a metallo peptidase present in the crude extract, thus we suggest that the fungus S. koningii in the presence of medium containing secret FP two subclasses; serine peptidase and metal, or secretes a serine peptidase dependent ion. Zymogram found the presence of two enzymes. The enzymatic activity of the crude extract decreased significantly when exposed the Al 3+, Ni 2+ and Cu2+ ions and increased when added to Ba2+, Ca2+ and Mg2+ ions. The purification of metallo peptidase present in the enzyme extract involved seven stages of purification, and ion-exchange chromatography and gel filtration determinants, with recovery and purification of 6 % from 3.4 times. Using pure peptidase (metallo) held functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters using both the intramolecular peptide substrate fluorescence suppression. Pure peptidase showed optimal activity at pH 6.0 and optimum temperature of 40°C and was stable in a wide range of pH and temperature. The positively modulated by Na+ and K+ and negatively by Al3+ and Cu2+. Analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of nonpolar amino acid side \"line\" of the synthetic substrate in the catalytic efficiency and not on the side \"line\" great influence of nonpolar and polar neutral amino acids. The freeze drying was performed by three types of additives were used: maltodextrin, mannitol and glycine in different concentrations. After drying stability study was conducted at the temperatures 4, 25 and 60°C for 32 days to evaluate the performance of additives in maintaining the activity of the enzyme extract lyophilized. The adjuvant was found more efficacious maltodextrin in a concentration of 4.5%, which retained about 93% of the extract lyophilized enzyme activity for 32 days.

Peptidase pode ser considerada, como uma subclasse das enzimas hidrolíticas que ocupam uma posição central em relação às suas aplicações na área fisiológica e também na área comercial. As peptidases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por cerca de 60% da venda mundial de enzimas. O presente trabalho visa avaliar a produção de peptidase em fermentação submersa (FSm) pelo fungo Scopulariopsis koningii, utilizando como substrato farinha de pena (FP), a caracterização bioquímica parcial, secagem do extrato bruto, purificação da peptidase e determinação de especificidade da peptidase isolada. Para avaliar a influência da farinha de pena (FP), na produção de peptidases, foram adicionadas às porcentagens de 0,2; 0,4 e 0,8% no meio de cultura. Os melhores níveis de produção de peptidases pelo fungo Scopulariopsis koningii foram obtidos nas concentrações de 0,4% e 0,8% de FP em 48h de fermentação com 1.427 U/mL. A caracterização bioquímica parcial do extrato bruto foi realizada com azocaseína 1% preparada em tampão com pH adequado. A peptidase presente no extrato enzimático apresentou atividade ótima em pH 6,5 e temperatura ótima de 55°C. A peptidase foi inibida por PMSF, indicando a presença de resíduo de aminoácido serino no sítio catalítco, e desta forma sendo classificada como serino peptidase. Entretanto, também observamos uma inibição por EDTA, sugerindo a presença de uma metalo peptidase presente no extrato bruto, desta forma podemos sugerir que o fungo S. koningii na presença do meio contendo FP secreta duas subclasses; serino e metalo peptidase, ou secreta uma serino peptidase dependente de íon. Zimograma constatou a presença de duas enzimas. A atividade enzimática do extrato bruto diminuiu significativamente quando exposta os íons Al+3, Ni2+ e Cu2+ e aumentada quando adicionados os íons Ba2+, Ca2+ e Mg2+. A purificação da metalo peptidase presente no extrato enzimático envolveu sete etapas de purificação, sendo cromatografia de troca-iônica e gel filtração determinantes, com recuperação de 6% e purificação de 3,4 vezes. Utilizando a peptidase pura (metalo) realizouse a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. A peptidase pura apresentou atividade ótima em pH 6,0 e temperatura ótima de 40°C e mostrou-se estável em ampla faixa de pH e temperatura. Foi modulada positivamente pelos íons Na+ e K+ e negativamente por Al3+ e Cu2+. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência de aminoácidos apolares do lado \"linha\" do substrato sintético na eficiência catalítica e no lado não \"linha\" grande influência de aminoácidos polares neutros e apolares. A secagem foi realizada por liofilização foram utilizados três tipos de adjuvantes: maltodextrina, manitol e glicina, em diferentes concentrações. Após a secagem foi realizado estudo da estabilidade nas temperaturas 4, 25 e 60°C por 32 dias para avaliar o desempenho dos adjuvantes na manutenção da atividade do extrato enzimático liofilizado. O adjuvante considerado mais eficaz foi a maltodextrina na concentração de 4,5% que manteve cerca de 93% da atividade do extrato enzimático liofilizado por 32 dias. / Peptidase can be considered as a subclass of hydrolytic enzymes which occupy a central position in relation to their applications in physiological area and also in the commercial area. Peptidases represent one of the three largest groups of industrial enzymes and account for about 60% of worldwide sales of enzymes. This study aims to evaluate the production of peptidase in submerged fermentation (FSm) by the fungus Scopulariopsis koningii, using as substrate feather meal (FP), the partial biochemical characterization, drying the crude extract, purification and determination of specific peptidase peptidase isolated. To evaluate the influence of feather meal (FM), in the production of peptidases, were added to the percentages of 0.2, 0.4 and 0.8% in the culture medium. The best levels of production of peptidases by the fungus Scopulariopsis koningii were obtained at concentrations of 0.4% and 0.8% of FP 48h fermentation with 1,427 U/mL. Partial biochemical characterization of the crude extract was performed with 1% azocasein prepared in buffer with appropriate pH. This in peptidase enzyme extract showed optimal activity at pH 6.5 and optimum temperature of 55°C. The peptidase was inhibited by PMSF, indicating the presence of a serine residue at amino acid catalytic site, and thus being classified as serine peptidase. However, we also observed an inhibition by EDTA, suggesting the presence of a metallo peptidase present in the crude extract, thus we suggest that the fungus S. koningii in the presence of medium containing secret FP two subclasses; serine peptidase and metal, or secretes a serine peptidase dependent ion. Zymogram found the presence of two enzymes. The enzymatic activity of the crude extract decreased significantly when exposed the Al 3+, Ni 2+ and Cu2+ ions and increased when added to Ba2+, Ca2+ and Mg2+ ions. The purification of metallo peptidase present in the enzyme extract involved seven stages of purification, and ion-exchange chromatography and gel filtration determinants, with recovery and purification of 6 % from 3.4 times. Using pure peptidase (metallo) held functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters using both the intramolecular peptide substrate fluorescence suppression. Pure peptidase showed optimal activity at pH 6.0 and optimum temperature of 40°C and was stable in a wide range of pH and temperature. The positively modulated by Na+ and K+ and negatively by Al3+ and Cu2+. Analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of nonpolar amino acid side \"line\" of the synthetic substrate in the catalytic efficiency and not on the side \"line\" great influence of nonpolar and polar neutral amino acids. The freeze drying was performed by three types of additives were used: maltodextrin, mannitol and glycine in different concentrations. After drying stability study was conducted at the temperatures 4, 25 and 60°C for 32 days to evaluate the performance of additives in maintaining the activity of the enzyme extract lyophilized. The adjuvant was found more efficacious maltodextrin in a concentration of 4.5%, which retained about 93% of the extract lyophilized enzyme activity for 32 days.

Foram analisados alguns parâmetros que influenciam os bioprocessos, submerso e sólido, do fungo Eupenicillium javanicum na produção de peptidases. No bioprocesso submerso foram avaliados a influência de diferentes concentrações e tipos de fonte de carbono e concentrações de fonte nitrogênio no meio, pH, temperatura e tempo de incubação. No bioprocesso sólido avaliou-se a influência de dois tipos de resíduos agroindustriais, em diferentes proporções, dois tipos de fonte de nitrogênio, em diferentes concentrações, tempo e temperatura de incubação. As peptidases produzidas em ambos os bioprocessos foram caracterizadas bioquimicamente, avaliando pH e temperatura ótima, estabilidade em diferentes temperaturas e valores de pH e influência da adição de íons e inibidores na atividade da peptidase. A enzima produzida em bioprocesso sólido foi submetida ao processo de purificação utilizando métodos cromatográficos. Utilizando a peptidase pura realizou-se a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. Além disso, o extrato enzimático obtido através do bioprocesso foi submetido ao processo de microencapsulação, visando uma maior estabilidade das peptidases e facilidade no armazenamento e transporte, utilizando a técnica de Spray drying, em seguida foi avaliado o rendimento do processo e a estabilidade das peptidases das micropartículas produzidas. O fungo Eupenicillium javanicum mostrou potencial na produção de peptidases em ambos bioprocessos, produzindo peptidases da classe das metalopeptidases com alta estabilidade em diferentes valores de pH e temperatura. O processo de purificação mostrou-se viável e reprodutível. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência do lado \"linha\" da peptidase na eficiência catalítica. O processo de microencapsulação mostrou-se viável e gerou micropartículas estáveis. A peptidase produzida apresentou características que demonstram seu potencial uso nas diferentes áreas industriais. / Some parameters that influence the submerged and semi solid bioprocesses, by the fungus Eupenicillium javanicum in the peptidases production, were conducted. In submerged bioprocess was evaluated the effect of different concentrations and types of carbon source and nitrogen source in the medium, pH, temperature and incubation time. In semi solid bioprocess semi solid was evaluated the influence of two types of agroindustrial residues, in different proportions, and different concentrations of nitrogen source, temperature and of incubation time. The peptidases produced in both bioprocesses were characterized biochemically, evaluating, the optimum pH and temperature, stability at different temperatures and pH values and the influence of the addition of ions and inhibitors on peptidase activity. The enzyme produced in semi solid bioprocess was subjected to the purification process using chromatographic methods. Using pure peptidase was performed the biochemical characterization and determination of kinetic parameters, both using the fluorescence intramolecular suppression peptide substrate. Furthermore, the enzymatic extract obtained by semi solid bioprocess was subjected to microencapsulation process by using the technique of spray drying, in order to obtain greater stability, ease storage and transport of peptidases, then assessed the yield process and stability of the peptidases of microparticles produced. The fungus Eupenicillium javanicum showed potential production of peptidases in the both bioprocesses, producing peptidases that belong to the class of metallopeptidases, with high stability at different pH and temperature. The purification process was feasible and reproducible. The analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of the \"line\" side on the peptidase catalytic efficiency. The microencapsulation process was feasible and generated stable microparticles. The peptidase produced has characteristics that demonstrated it a potential use in different industrial fields.

Les ß-glucosidases són enzims que hidrolitzen enllaços b-glicosídics de disacàrids o oligosacàrids, amb una baixa regioespecificitat de manera que reconeixen específicament l'extrem glucídic no reductor i alhora tenen baixa especificitat per l'extrem reductor o aglicó. El mecanisme catalític és un doble desplaçament amb catàlisi àcid/base i formació d'un intermediari glicosil-enzim; la hidròlisi es produeix amb retenció de la configuració del carboni anomèric. En aquest treball s'ha estudiat la ß-glucosidasa Bgl3 d'Streptomyces sp. (ATCC 11238) clonada anteriorment al grup, s'ha millorat la producció de l'enzim posant-lo sota control del promotor de la T7-RNA polimerasa, i s'ha millorat el procés de purificació amb la fusió a una cua d'histidines al seu extrem N-terminal que permet l'obtenció de proteïna pura mitjançant un sol pas de purificació (columna d'afinitat). La proteïna obtinguda ha permès l'obtenció de l'estructura tridimensional de l'enzim per cristal.lografia de raigs X.S'ha caracteritzat l'activitat catalítica de la Bgl3 amb dues bateries de substrats, una que variava l'extrem no reductor per determinar l'especificitat del subseti -1, i l'altre que variava les característiques de l'aglicó amb l'objectiu d'establir una relació lineal d'energia lliure (anàlisi de Hammett). L'estudi de la dependència de l'activitat respecte a la temperatura i al pH, ha permès dilucidar aspectes del mecanisme catalític com l'energia d'activació i la variació dels pKa dels residus catalítics essencials.Per mutagènesi dirigida s'han obtingut enzims sense algun dels dos residus catalítics essencials, i s'ha comprovat la reducció de l'activitat catalítica. S'ha comprovat el paper de cada un d'aquests residus a la catàlisi per rescat químic de l'activitat dels mutants amb l'addició d'un nucleòfil extern, i posterior identificació per Ressonància Magnètica Nuclear dels productes formats.Finalment s'ha avançat en l'estudi de l'especificitat de substrat respecte l'aglicó mitjançant mutagènesi dirigida i caracterització cinètica dels mutants sobre una posició conservada del centre actiu: la cisteïna 181 de la Bgl3. / ßeta-glucosidases are enzymes that can hydrolyze ßeta-glycosidic bonds from disaccharides or oligosacharides, with a low regiospecificity, so than they recognize specifically the glucidic non-reducing extreme and they have low specificity for the reducing extreme or aglycon. The catalytic mechanism is a double displacement with catalysis acid/base and formation of an intermediary glycosil-enzyme; the hydrolysis is produced with retention of the configuration of the anomeric carbon. In this work it has studied the ß-glucosidase Bgl3 from Streptomyces sp. (ATCC 11238) cloned before in the group, it has improve the production of the enzyme expressing it under control of T7-RNA polymerase promotor, and it has improve the purity method fusing at the N-terminus of the gene, a 6 histidines tag, allowing pure protein obtaining with a sole step purification (affinity column). Protein so obtained has allowed the resolution of the 3D structure for ray X crystallography.It have characterized the catalytic activity of Bgl3 with 2 sets of substrates, one that vary his non reducing extreme to determine the specificity of subset -1, and the other set that vary the characteristics of the aglycon moiety to determine a free energy relationship (Hammett analysis). The study of the dependence between activity and temperature or pH, has show aspects of the catalytic mechanism as Energy of activation and the pKa variations of the essential catalytic residues during catalysis.Trough site directed mutagenesis, it has been obtained enzymes without any one of the two essential catalytic residues, and it has been check reduction of the catalytic activity. It has been proved the role of those residues in the catalysis with the chemical rescue of the activity of the mutant forms adding an extern nucleophile, and identifying the products with Nuclear Magnetic Resonance.Finally, it have been progress in the substrate specificity respect aglycon by means of site directed mutagenesis and kinetic characterization of the mutants over a conserved position in the active center: the cysteine 181 of the Bgl3.

Amb la realització d'aquesta tesi doctoral es volia aprofundir en el coneixement de les ADHs que pertanyen a la superfamília de les MDR, contenen zinc i són dependents de NADP(H). Les alcohol deshidrogenases (ADHs) són enzims que catalitzen l'oxidació reversible d'alcohols als corresponents aldehids o cetones, amb la conseqüent reducció de NAD o NADP. La majoria d'ADHs de llevat i vertebrats pertanyen a la superfamília de les deshidrogenases/reductases de cadena mitjana (MDR), concretament en vertebrats, tots els membres de la família ADH són metaloenzims, que contenen zinc i són MDRs.Així doncs, els objectius de la tesi s'han centrat en:1. La cristal·lització i determinació de l'estructura d'ADH8 de R. Perezi. Conèixer l'estructura de l'ADH8 ens aporta les bases de l'especificitat de cofactor d'aquest enzim, única a vertebrats, i també serveix per explicar la seva peculiarment elevada activitat envers retinal.2. La cristal·lització i resolució de l'estructura de ScADH6p. L'estructura cristal·lina de la CAD depenent de NADP(H) de S. Cerevisiae (ScAdh6p) ha estat la primera estructura tridimensional determinada per un enzim CAD així com per un membre de la superfamília de les MDRs a S. Cerevisiae. Ens proporciona un patró estructural per entendre el funcionament de la ScAdh6p que potser es podrà utilitzar com a referència per les proteïnes CAD en general. A més ha aportat informació addicional sobre l'especificitat envers el cofactor NADP(H).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-30Bitstream added on 2014-06-13T19:46:41Z : No. of bitstreams: 1 bution_ml_dr_rcla.pdf: 2579345 bytes, checksum: d33353301f6a8da2b554a3ec7b12d3f7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Foram realizados estudos comparados do proventrículo, ventrículo, íleo e túbulos de Malpighi de três espécies pertencentes ao gênero Cephalotes: C. atratus, C. pusillus e C. clypeatus, objetivando buscar relações entre elas, assim como, diferenças histoquímicas e ultra-estruturais tanto da parede como do conteúdo destas porções do trato digestivo, que pudessem ser utilizadas para a melhor compreensão da função intestinal, bem como esclarecer quais e como os recursos alimentares são aproveitados em cada parte do trato digestivo. As características ultra-estruturais do ventrículo de Cephalotes atratus, C. clypeatus e C. pusillus, mostram que o epitélio do ventrículo repousa sobre uma lâmina basal contínua e é formado basicamente por três tipos celulares, sendo estas as células digestivas, as células regenerativas e as goblet cells. Nestas formigas, o retículo endoplasmático rugoso além de atuar na produção de enzimas digestivas também está envolvido na estocagem de íons em vacúolos especializados presentes no ventrículo. Estas concreções são os esferocristais e podem estar contribuindo com a estabilização do pH e permanência das bactérias simbiontes presentes por entre as microvilosidades. Secções realizadas ao longo do íleo revelaram diferenças entre três principais regiões: proximal, mediana e distal. As especializações estruturais presentes no íleo destas três espécies de formigas resultam em implicações especialmente relacionadas com as bactérias simbiontes aí hospedadas. Também foram realizados testes para verificar a diversidade da microbiota intestinal das porções em questão, usando a técnica DGGE. Assim sendo, o perfil molecular dos simbiontes do ventrículo e íleo de Cephalotes atratus, C. clypeatus e C. pusillus foi obtido analisando a região variável V3 do gene 16S do rDNA bacteriano... / This study compared the proventriculus midgut, ileum, and Malpighian tubules of three ants of the genus Cephalotes: C. atratus, C. pusillus, and C. clypeatus, by examining histochemical and ultrastructural differences in the wall and the content of these portions that could be used to better understand the intestinal function, as well as clarify which and how food resources are used in each part of the digestive tract. The ultrastructural analysis of the midgut of Cephalotes atratus, C. clypeatus, and C. pusillus reveled that the epithelium of the midgut lays on a basal lamina and is composed basically of three cell types: digestive cells, generative cells, and goblet cells. In these ants, the rough endoplasmic reticulum, in addition to producing digestive enzymes, is involved in ion storage in specialized vacuoles present in the midgut. These concretions are spherocrystals and may contribute to stabilize the pH and to maintain symbiotic bacteria found in between microvilli. Sections along the ileum revealed differences among the three main regions: proximal, medial, and distal. The structural specializations present in the ileum of these three ants have implications especially to the symbiotic bacteria. The DGGE method was also performed to assess the diversity of the intestinal microbiota of the portions of the digestive tract. The molecular profile of the symbionts of the midgut and ileum of Cephalotes atratus, C. clypeatus, and C. pusillus was obtained using the variable region V3 of the bacterial 16S rDNA gene sequence. Two samples of C. atratus, three of C. clypeatus, and six of C. pusillus were analyzed. The results showed similarity indices from 80% to 94% between the samples of symbionts from C. atratus and C. clypeatus, despite being collected in sites geographically distant. The variability of symbionts found in the samples of C. pusillus ranged from 45%... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T17:36:07Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T17:36:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) Previous issue date: 2013 / Em nosso estudo caracterizamos a enzima ferro superóxido dismutase-A (FeSOD-A)e a proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11) em linhagens de Leishmania spp. do Novo Mundo selvagens e resistentes aos antimoniais. Ambas proteínas apresentam grande relevância no metabolismo do parasito, visto que a enzima FeSOD-A está envolvida na defesa antioxidante e KMP-11, presente na superfície da membrana dos kinetoplastídeos, pode estar relacionada ao fenótipo de resistência do parasito ao antimonial. Análise de Southern blot mostrou a presença de polimorfismos na sequência do gene FeSOD-A entre as linhagens de Leishmania avaliadas. A expressão de FeSOD-A foi analisada utilizando anticorpo policlonal (TcFeSOD) que reconheceu um polipeptídio de 26 kDa em todas as linhagens estudadas. Quantificação por qPCR mostrou que o mRNA do gene é 3,6X menos expresso na linhagem L. guyanensis resistente LgSbR, por outro lado a proteína está 2,0X mais expressa nessa linhagem. A FeSOD-A está 3,0X menos expressa em L. amazonensis resistente LaSbR, mas o nível de mRNA foi o mesmo entre as linhagens LaWTS e LaSbR. Ensaios de atividade enzimática mostraram que FESOD-A possui maior atividade nas linhagens resistentes de L. braziliensis e L. infantum chagasi (LbSbR e LcSbR) comparado com as linhagens selvagens. A análise funcional foi realizada para determinar se a superexpressão do gene FeSOD-A nas linhagens LbWTS/LbSbR e LcWTS/LcSbR iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados. Ensaios de Western blot e de atividade enzimática mostraram que o nível de expressão da proteína e atividade da FeSOD-A foram maiores nos parasitos transfectados em comparação com os não-transfectados. Análise IC50 do SbIII mostrou que a superexpressão FeSOD-A nas linhagens de LbWTS e LcWTS aumentou 1,7X e 1,6X o fenótipo de resistência ao antimônio, respectivamente. A superexpressão da enzima FeSOD-A na linhagem LbSbR reduziu o fenótipo resistência, enquanto que na linhagem LcSbR não houve alteração no fenótipo. Resultados de tolerância ao estresse oxidativo induzido por paraquat mostrou que o clone superexpressor de LbWTS apresentou maior proteção ao estresse comparado à linhagem não-transfectada. Concluindo, nossos resultados sugerem que a enzima FeSOD-A está envolvida no fenótipo de resistência de L. braziliensis e L. chagasi ao antimonial. Para o gene KMP-11 análise por Southern blot mostrou semelhante perfil de hibridização entre as diferentes espécies analisadas, com exceção da linhagem LgWTS que apresentou perfil de fragmentos diferentes. Análise de Northern blot revelou a presença de dois transcritos, 1,0 Kb e 3,0 Kb, em todas as linhagens de Leishmania spp., com exceção da linhagem LgWTS que apresentou apenas um transcrito de 1,0 Kb. Quantificação por qPCR mostrou que mRNA do gene KMP-11 está 2,9X menos expresso na linhagem de LbSbR e 1,5X mais expresso na linhagem LcSbR comparado com os respectivos pares selvagens. A expressão de KMP-11 utilizando anticorpo policlonal anti-KMP-11, mostrou que ele reconheceu um polipeptídio de 11 kDa em todas as linhagens de Leishmania spp. estudadas. Análises de densitometria mostraram que KMP-11 está 1,5X mais expressa em LcSbR comparado com o par selvagem LcWTS e 2,0X menos expressa em LbSbR comparado ao par LbWTS. Ensaios de transfecção do gene KMP-11 foram realizados nas linhagens LbWTS e LbSbR. Análise de Western blot mostrou maior expressão da proteína KMP-11 nos parasitos resistentes transfectados. Avaliação da susceptibilidade ao SbIII mostrou que a superexpressão de KMP-11 na linhagem selvagem de LbWTS não alterou o fenótipo. Por outro lado, a superexpressão dessa proteína na linhagem resistente (LbSbR) reduziu o fenótipo resistência. Ensaios in vitro e in vivo com as linhagens LbWTS não-transfectadas e os clones transfectados com KMP-11 não mostraram diferenças quanto à infectividade dos parasitos em células THP-1 e em camundongos nocaute para interferon-γ. Apenas o clone 6 apresentou menor infectividade em camundongos. Estudos adicionais são necessários para investigar melhor a possível participação da proteína KMP-11 no fenótipo de resistência ao antimonial e na infectividade dos parasitos. / In this study, we characterize the iron superoxide dismutase-A (FeSOD-A) enzyme and kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) in New World Leishmania spp. lines wild and resistant to antimonials. Both proteins are very important in metabolism of the parasite, since that FeSOD-A is involved in antioxidant defense and KMP-11, present on the surface of kinetoplastids membrane, may be related to antimony-resistance phenotype. Southern blot analysis showed the presence of polymorphisms in the FeSOD-A gene sequence between the Leishmania lines evaluated. The expression level of FeSOD-A was analyzed using polyclonal antibody (anti-TcFeSOD) that recognized a polypeptide of 26 kDa in all lines studied. Quantification by qPCR showed that the FeSOD-A mRNA is 3.6-fold less expressed in SbIII-resistant L. guyanensis line (LgSbR), on the other hand the protein is 2.0-fold more expressed in this line. FeSOD-A is 3.0-fold less expressed in L. amazonensis resistant line (LaSbR), but the level of mRNA was the same between LaWTS and LaSbR lines. Enzymatic activity assays showed that SbIII-resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi lines (LbSbR and LcSbR) present a higher FeSOD-A activity than their susceptible pairs. Functional analysis was performed to determine whether overexpression of the FeSOD-A gene in LbWTS/LbrSbR and LcWTS/LcSbR lines should alter the SbIII-resistance phenotype of transfected parasites. Western blot and enzymatic activity assays showed that the protein expression level and activity of FeSOD-A were higher in the transfected parasites compared to non-transfected ones. Analysis of IC50 for SbIII showed that the overexpression of FeSOD-A in the LbWTS and LcWTS lines increased 1.7- and 1.6-fold the SbIII-resistance phenotype, respectively. Overexpression of FeSOD-A enzyme in the LbSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype, whereas in the LcSbR line no change in phenotype was observed. Results about the tolerance of parasites to oxidative stress induced by paraquat showed that the clone from LbWTS overexpressor of FeSOD-A presented higher protection to stress compared to non-transfected lines. In conclusion, our results suggest that the FeSOD-A enzyme may be involved to antimony-resistance phenotype in L. braziliensis and L. chagasi lines. Concerning KMP-11 gene, Southern blot analysis showed similar hybridization profile between different Leishmania lines analyzed, with exception of LgWTS line that presented different profile. Northern blot analysis revealed the presence of two transcripts, 1.0 kb and 3.0 kb in all lines of Leishmania analyzed, except for LgWTS line that showed only a transcript of 1.0 kb. Quantification by qPCR showed that mRNA KMP-11 is 2.9-fold less expressed in LbSbR line and 1.5-fold more expressed in LcSbR line compared with their wild pairs. The expression of KMP-11 using anti-KMP11 polyclonal antibody, showed that it recognized a polypeptide of 11 kDa in all Leishmania lines analyzed. Densitometry analysis showed that KMP-11 is 1.5-fold more expressed in the LcSbR line compared with its wild pair and 2.0-fold less expressed in the LbSbR line compared whit its resistant pair. Transfection assays of KMP-11 gene in the LbWTS and LbSbR lines were carried out. Western blot analysis revealed expression increased of KMP-11 protein in transfected resistant parasites. Evaluation of SbIII usceptibility showed that transfection of KMP-11 in the wild LbWTS line did not alter the phenotype. On the other hand, overexpression of this protein in the resistant LbrSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype. In vitro and in vivo assays using LbWTS lines and non-transfected clones overexpressors of KMP-11 showed no difference in infectivity of the parasite in THP-1 cells and in interferon-γ knockout mice. Only the clone 6 showed lower infectivity in mice. Additional studies are needed to further investigate a possible involvement of KMP-11 protein in SbIII-resistance phenotype and in infectivity of parasites.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T19:23:03Z No. of bitstreams: 1 SARAH_RESENDE_MBCM_Final.pdf: 6553798 bytes, checksum: cb7ea34b3f0a947f3d81c20d5448938f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T19:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SARAH_RESENDE_MBCM_Final.pdf: 6553798 bytes, checksum: cb7ea34b3f0a947f3d81c20d5448938f (MD5) Previous issue date: 2013 / Cepas de Plasmodiumresistentes a diferentes drogas têm sido descritasao redor do mundo. Embora os mecanismos de desenvolvimento de resistência não sejam bem conhecidos, sabe-se que defeitos nos sistemas de reparo do DNA podem estar envolvidos. Esses defeitos estão relacionados principalmente a mutações nas enzimas do sistema de reparo de mal pareamento do DNA ou mismatch repair (MMR) e já foram descritos em populações naturais de diversos organismos. Devido ao conhecimento limitado sobre o sistema MMR de Plasmodium, faz-se necessário um amplo estudo sobre os genes que codificam as proteínas envolvidas nesse sistema. Neste trabalho, foi realizado um estudo sobre as enzimas envolvidas no sistema de reparo do mal pareamento do DNA em Plasmodium: variabilidade intra e interespecífica em Plasmodium, principalmente nos domínios funcionais, e comparação entre níveis de expressão entre cepas/isolados de P. falciparum.Os parasitos foram também avaliados quanto ao número de cópias e expressão dos genes gch-1emdr1. Foram identificadas proteínas pertencentes às classes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS1. As sequências de proteínas mostraram-se muito conservadas, tanto entre o gênero Plasmodium, quanto em relação a outros organismos distantes evolutivamente. Foi encontradaum proteína homóloga a MutS que possui os domínios I e V, mas ainda não identificada quanto à sua classificação. O gene codificador desta proteína teve sua expressão confirmada neste e em outros trabalhos. Alguns SNPs foram encontrados em cepas/isolados depositados no PlasmoDB, no entanto, o sequenciamento da região que compreende os principais domínios funcionais apontou apenas 1 SNP na proteína PMS1. Os genes estudados, em sua maioria, apresentaram-se mais expressos entre 10 e 30 horas após a sincronização. W2 e 3D7 apresentam 2 cópias do genes gch-1e mdr1. BHZ apresentou apenas 1 cópia do mdr1. Os resultados da análise de expressão desses genes ligados à resistência concordam com os resultados encontrados para o número de cópias gênicas. Este estudo fornece uma análise ampla das principais enzimas do MMR e será importante para estudos futuros do papel funcional destas enzimas e seu envolvimento no desenvolvimento de resistência às drogas. / Drug-resistant Plasmodiumstrains have been reported world wide. The mechanisms underlying resistance development are not well understood, but failure in DNA repair could be involved in this process. This failure is mainly related to mutations in the enzymes of the DNA mismatch repair (MMR). Because of the limited knowledge about the PlasmodiumMMR system, it is necessary a comprehensive study about the genes encoding proteins involved in this system. In this work, we studied the enzymes involved in the PlasmodiumMMR, considering the intraspecific and interspecific variability in Plasmodium, especially within the functional domains and comparing the expression levels between strains/isolates of P. falciparum.Parasites were also assessed for copy number and expression of the genes pfgch-1and pfmdr1. We identified proteins related to MSH2, MSH6, MLH1 and PMS1. The protein sequences were very conserved among the genus Plasmodium, as well in relation to other evolutionarily unrelated organisms. We found a putative protein homologous to MutS showing the domains I and V, butnot classified yet. The gene encoding this protein has its expression confirmed here and in other previous studies. SNPs were found in some strains/isolates deposited in PlasmoDB, however, the sequencing of the region comprising the main functional domains showed only one SNP in PMS1. The genes studied, mostly, were more expressed between 10 and 30 hours after synchronization. W2 and 3D7 showed 2 copies of the gene gch-1 and mdr1. In BHZ, only one copy of the mdr1 were founded. The results of expression of these genes related to the resistanceagree with the findings for the gene copy number. This study provides a comprehensive analysis of the major enzymes of the MMR and will be important to further functional studies of this enzymes and their role in drug resistance development.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-04T12:40:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 334749 bytes, checksum: 388e607410cac791dfc21d8a50943e71 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-04T12:40:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 334749 bytes, checksum: 388e607410cac791dfc21d8a50943e71 (MD5) Previous issue date: 1998-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este estudo objetivou analisar os efeitos do alumínio (Al), em nível tóxico, sobre o crescimento de plantas de sorgo, os teores e a exsudação de ácidos orgânicos, e a atividade de enzimas ligadas à síntese e à degradação destes ácidos, em plantas de dois cultivares de sorgo, um sensível (BR007A) e outro tolerante (BR006R) ao Al. Os pesos da matéria seca das duas partes das plantas dos dois cultivares e o comprimento da maior raiz diminuíram com o aumento das concentrações de Al na solução, tendo o cultivar sensível sido mais severamente afetado que o tolerante. Os teores de Al, tanto nas raízes quanto na parte aérea, aumentaram com os aumentos nas concentrações de Al na solução nutritiva e o cultivar sensível acumulou mais Al nas duas partes da planta. O Al acumulou-se principalmente no ápice radicular (0-5 mm). Este segmento da raiz, além de apresentar maior teor de Al que os demais segmentos analisados, no cultivar sensível, apresentou cerca de 25,0% mais Al que o cultivar tolerante. Os teores de P, K, Ca e Mg diminuíram com o aumento das concentrações de Al na solução nutritiva, nas duas partes da planta, mas os cultivares não diferiram entre si, exceto quanto ao teor de Ca na parte aérea. A aplicação de ácido málico resultou em amenização do efeito inibitório do Al sobre o alongamento radicular, mas não houve eliminação completa da toxicidade do Al, mesmo na concentração mais alta. Os teores dos principais ácidos orgânicos, encontrados nas raízes e na parte aérea, aumentaram com a exposição das plantas ao Al. Os dois ácidos orgânicos mais abundantes em sorgo e, provavelmente, os mais importantes do ponto de vista da tolerância ao Al foram os ácidos málico e t-aconítico. Dentre todos os ácidos orgânicos, o ácido málico foi aquele que, na presença de Al, sofreu o maior aumento absoluto no seu teor, sempre mais pronunciado no cultivar tolerante, sugerindo um papel importante deste ácido no mecanismo de tolerância das plantas à toxicidade de Al. O Al promoveu aumento no teor do ácido cítrico transportado na seiva xilemática, principalmente no cultivar tolerante, no qual foi cerca de 26,0% maior que no cultivar sensível. O Al, de modo geral, influenciou a atividade das enzimas estudadas, no sentido de estimular a síntese e, ou, inibir a degradação do ácido málico. Nos casos dos ácidos cítrico e t-aconítico, isto nem sempre aconteceu. No cultivar tolerante, as enzimas de síntese dos ácidos orgânicos mostraram-se mais sensíveis ao estímulo, enquanto as enzimas de degradação foram mais sensíveis ao efeito inibitório do Al tóxico. As enzimas importantes no controle da produção de ácidos orgânicos e determinantes do comportamento diferencial dos cultivares de sorgo frente ao estresse de Al parecem ser a carboxilase do fosfoenolpiruvato e, principalmente, a fumarase. / This work aimed to study effects of aluminum (Al) at a toxic level, on sorghum growth, the contents and exudation of the organic acids as well as the activities of the enzymes related to synthesis and degradation of those acids in sorghum cultivars, one of them being sensible (BR007A) and another tolerant (BR006R). The dry matter weight in both parts of the plants and the longest root length reduced with the Al concentration increases, being the sensible cultivar more severely affected than the tolerant one. The Al contents either in the roots and the aerial part increased with the increasing Al concentrations in the nutritive solution while the sensible cultivar cumulated more Al in both plant parts; Al cumulated mainly at root apex (0-5 mm). Besides presenting a higher Al content than the other segments in the sensible cultivar, the root apex showed about 25% more Al than in the tolerant cultivar. The P, K, Ca and Mg contents diminished with the increase in Al concentrations in both plant parts, although the cultivars did not differ from each other, except for Ca content in the aerial part. Application of the malic acid caused the Al inhibitory effects on the elongation of root to soften, xibut Al toxicity was not completely eliminated even at a higher concentration. The contents of the main organic acids found in the roots and the aerial part increased with plant exposure to Al. The malic and t-aconitic acids showed to be mostly abundant and probably the most important under the tolerance point of view. In Al presence the malic acid suffered the greatest absolute increase always more accentuated in the tolerant cultivar suggesting its important role on plant tolerance mechanism to Al toxicity. Al promoted an increase in the content of the citric acid transported in the xylem sap mainly in the tolerant cultivar which was 26.0% higher than the sensible cultivar. In general the Al influenced the enzyme activities by stimulating the synthesis and, or, inhibiting the malic acid degradation, which did not always occur for the citric and t-aconitic acids. In the tolerant cultivar the enzymes related to the organic acid synthesis showed to be more sensible to stimulus, whereas the ones of degradation were more sensible to the inhibitory effects from toxic Al. Those enzymes which are important in controlling the production of the organic acids and in determining the differential behavior of sorghum cultivars under Al stress appear to be a phosphoenolpyruvate carboxylase and mainly the fumarase.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T14:26:07Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T14:26:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T14:26:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T14:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DhianRenatoAlmeidaCamargo.pdf: 3559105 bytes, checksum: 559d79208eea1b927b5dfdc61f96fdc8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Noventa e dois sorotipos de Streptococcus pneumoniae já foram descritos, mas a vacina pneumocócica conjugada (PCV10) introduzida no calendário básico de vacinação do Brasil, em 2010, cobre somente os mais prevalentes no país. A substituição dos sorotipos vacinais após imunização em massa é uma grande preocupação e monitorar esse fenômeno requer métodos de sorotipagem eficientes e acessíveis. A Sorotipagem clássica de pneumococos baseada em antissoros produzidos em animais é trabalhosa, restrita a poucos laboratórios de referência, e não pode tipar isolados não capsulados. Alternativamente, os métodos de sorotipagem molecular avaliam os polimorfismos dos genes do cluster cps, que codificam enzimas chave para a síntese do CPS em Streptococcus pneumoniae. Em uma abordagem apropriada, cps-RFLP, os loci cps amplificados por PCR são digeridos com uma endonuclease gerando perfis únicos à eletroforese em gel de agarose, permitindo assim a identificação do sorotipo. Neste trabalho, nós combinamos abordagens in silico e in vitro para demonstrar que XhoII é a endonuclease mais discriminante para o método cps-RFLP, e para construir um banco de dados de perfis sorotipo-específico que acomodou a diversidade genética do lócus cps de 91 conhecidos sorotipos de pneumococos. O banco de dados de perfis cps-RFLP foi integrado ao Molecular Serotyping Tool (MST), software anteriormente publicado baseado em web-based para sorotipagem molecular. Usando XhoII, o método cps-RFLP obteve especificidade de 84,6% para sorotipagem e 100 % para sorogrupagem de pneumococos. Esta nova ferramenta pode representar uma colaboração relevante para vigilância epidemiológica em tempo real da diversidade de pneumococos em resposta a programas de imunização em massa. / Ninety-two Streptococcus pneumoniae serotypes have been described, but the pneumococcal conjugate vaccine (PCV10) introduced in the Brazilian basic vaccination schedule, in 2010, covers only the most prevalent in the country. Pneumococcal serotype-shifting after massive immunization is a major concern and monitoring this phenomenon requires efficient and accessible serotyping methods. Classical pneumococcal serotyping based on antisera produced in animals is laborious, restricted to a few reference laboratories, and cannot type non-capsulated isolates. Alternatively, molecular serotyping methods assess the polymorphisms in the cps gene cluster, which encodes key enzymes for CPS synthesis in Streptococcus pneumoniae. In one such approach, cps-RFLP, the PCR amplified cps loci are digested with an endonuclease, generating unique fingerprints on agarose gel electrophoresis, therefore allowing serotype identification. In this work, we combined in silico and in vitro approaches to demonstrate that XhoII is the most discriminating endonuclease for cps-RFLP, and to build a database of serotype-specific fingerprints that accommodates the genetic diversity within the cps locus of 91 known pneumococci serotypes. The database of cps-RFLP fingerprints was integrated to Molecular Serotyping Tool (MST), our previously published web-based software for molecular serotyping. Using XhoII, the cps-RFLP method achieved 84.6% specificity for serotyping and 100% for serogrouping of pneumococci. This new tool may represent a relevant aid to real time epidemiological surveillance of pneumococci diversity in response to mass immunization programs.