Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T17:23:36Z No. of bitstreams: 1 dissertação completa.v13-FINAL IMPRESSAO.pdf: 2723996 bytes, checksum: ad47662ee3990bbd58750f161b0a7903 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T17:23:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertação completa.v13-FINAL IMPRESSAO.pdf: 2723996 bytes, checksum: ad47662ee3990bbd58750f161b0a7903 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T17:23:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertação completa.v13-FINAL IMPRESSAO.pdf: 2723996 bytes, checksum: ad47662ee3990bbd58750f161b0a7903 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T17:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertação completa.v13-FINAL IMPRESSAO.pdf: 2723996 bytes, checksum: ad47662ee3990bbd58750f161b0a7903 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A esquistossomose é uma doença parasitária causada por parasitos do gênero Schistosoma. Apesar das tentativas de controle e introdução do tratamento com praziquantel, a doença persiste. Desse modo, o desenvolvimento de uma vacina poderá contribuir para o controle da doença. Dentre outras evidências, o alto nível de proteção alcançado pela vacinação com cercárias irradiadas em camundongos e a presença de indivíduos naturalmente resistentes à infecção por Schistosoma mansoni em áreas endêmicas sugerem a existência de mecanismos que induzem proteção contra esquistossomose. Por meio de experimentos de Western-blotting bidimensional utilizando soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose e extrato proteico de vermes adultos, selecionamos a proteína fosfoglicerato mutase de S. mansoni (SmPGM) para ser testada em ensaios de imunização em camundongos, uma vez que spots correspondentes a esta proteína foram reconhecidos pelo soro de indivíduos naturalmente resistentes à infecção e também porque análises in silico do seu potencial antigênico indicaram que SmPGM é uma das proteínas de S. mansoni que mais possuem peptídeos antigênicos. A região codificadora do gene foi inserida em vetor de expressão em células de mamíferos e após certificar a expressão da proteína por Western-blotting usando anticorpo anti-His (C-term) e extrato proteico de células HEK 293T transfectadas, outra construção de DNA similar, que não expressa a proteína em fusão com 6xHis, foi usada nos ensaios de imunização gênica em camundongos. Entretanto, não houve redução no número de vermes adultos recuperados de camundongos vacinados e desafiados, bem como no número de ovos liberados nas fezes e retidos no fígado e intestino. Além disso, não houve alteração na ovoposição das fêmeas, nem no número e tamanho dos granulomas. A imunização gênica não foi capaz de induzir resposta humoral, resposta imune celular e produção de citocinas. Sendo assim, foram realizados experimentos de imunização de camundongos com dois peptídeos sintéticos de SmPGM, que também não resultou em proteção pelos parâmetros analisados. Este projeto também teve como objetivo identificar proteínas de membrana, principalmente do tegumento do parasito. Para isso, um extrato proteico de vermes adultos de S. mansoni enriquecido com proteínas de membrana foi obtido e também utilizado em experimentos de Western-blotting bidimensional. Foram detectados spots proteicos que reagiram diferencialmente aos pools de soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose. Entretanto, todos os spots imunorreativos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas. / The schistosomiasis is a parasitic disease caused by parasites of genus Schistosoma. Even with the attempts to control the disease and the introduction of the treatment with the praziquantel drug, the disease persists. Thereby, the development of one long lasting protection, based in vaccine therapy, would be a great benefit for the disease control. Among others evidences, the high protection level achieved by vaccination with irradiated cercarie in mice and the presence of naturally resistant individuals to infection by S. mansoni in endemic areas suggest the existence of mechanisms that induce protection against schistosomiasis. By the two-dimensional Western-blotting experiments using pool of serum of individuals from schistosomiasis endemic area and adult worm protein extract, we selected the protein S. mansoni phosphoglycerate mutase (SmPGM) to be tested in immunization assays in mice, since your corresponding spots were recognize by the pool of serum of naturally resistant individuals to infection and also because in silico analysis of its antigenic potential indicated that SmPGM is one of the S. mansoni proteins that have more antigenic peptides. The codion region of the corresponding gene was inserted into a plasmid vector for gene expression in mammalian cells and after ensuring the protein expression by Western blotting using anti-His (C-term) antibody and protein extract of transfected HEK 293T cells, another similar DNA construction, without the 6xHis-tag, was used to DNA immunization assays in mice. However, there was no reduction in the number of adult worms recovered from vaccinated and challenged mice, as well as in the number of eggs released in feces and retained in the liver and intestine. Furthermore, there was neither change in the female oviposition, nor in the number and area of the granulomas. The DNA immunization was not able to induce humoral, cellular immune response and cytokine production. Thus, in mice immunizations were also performed with two SmPGM synthetic peptides. This immunization protocol also resulted in lack of protective immunity against S. mansoni infection according to the analyzed parameters. This project also aimed to identify membrane proteins, mainly of the S. mansoni parasite tegument. For this, a protein extract of S. mansoni adult worms enriched with membrane proteins was obtained and also used in two-dimensional Western-blotting experiments. Protein spots that reacted differentially to the serum pools of individuals from endemic area for schistosomiasis were detected. However, all immunoreactive spots were subjected to mass spectrometry identification.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-19T12:33:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T12:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos e plantas produzem enzimas que possuem as mais diversas aplicações biotecnológicas. Uma possível e promissora aplicação dessas enzimas é o controle de nematoides, em substituição aos nematicidas químicos prejudiciais à saúde humana e animal, ao meio ambiente e à microbiota do solo. Outra possível aplicação das enzimas de fungos é o uso da dextranase na redução de dextrana na indústria sucroalcooleira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção de enzimas pelo fungo Pleurotus eryngii e pelas plantas Euphorbia milii e E. trigona, purificar e caracterizar as enzimas de E. milii, E. trigona e Pochonia chlamydosporia, e testar a atividade nematicida das enzimas das plantas E. milii, E. trigona e do fungo P. eryngii. O fungo P. eryngii e seu extrato reduziram significativamente (p<0,01) o número de larvas intactas de Panagrellus sp. após 24 horas de tratamento em 60 e 90%, respectivamente. Este efeito não está relacionado à atividade enzimática, mas sim à presença de outros metabólitos. Os ovos de Meloidogyne javanica, quando tratados com o extrato de P. eryngii, mostraram redução de 53% (p<0,01) no número de ovos intactos. A redução de ovos intactos de M. javanica é atribuída à atividade enzimática, uma vez que o extrato apresentou atividade quitinolítica e proteolítica de, respectivamente, 32,74 e 3,57 U/mL. A purificação do látex de E. trigona por cromatografia de exclusão molecular permitiu a purificação de três proteases distintas. O peso molecular das proteases foi estimado em aproximadamente: 36, 31 e 29 kDa, para a trigonina 1, 2 e 3, respectivamente. O pH e a temperatura que proporcionaram maior atividade de protease foram 4,0, 6,0 e 9,0, e temperatura de 70 °C. As proteases foram inibidas por fluoreto de fenilmetilsulfonila e iodoacetamida. O pool das três proteases presentes no látex de E. trigona reduziram significativamente (p<0,01) o número de J 2 vivas de M. incognita em 96% após 24 horas de tratamento. A purificação parcial das proteases presentes no látex de E. milii indicou que estas proteases correspondem à milina e miliina. Estas enzimas reduziram em 65,59% e 96,46% o número de larvas de Panagrellus redivivus após 24 e 48 h, respectivamente (p<0,01). A dextranase produzida pelo fungo P. chlamydosporia foi purificada à homogeneidade em duas etapas, com rendimento de 152%, fator de purificação de 6,84 e atividade específica de 358,63 U/mg. Seu peso molecular foi estimado por SDS-PAGE em 64 kDa. A enzima apresentou maior atividade a 50 °C e pH 5,0, usando tampão citrato-fosfato 100 mM, foi inibida por Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , e apresentou K M de 1,77 g/L. A dextranase madura é composta por 585 resíduos de aminoácidos, com peso molecular predito de 64,38 kDa e pI 5,96. Esta dextranase demonstrou forte semelhança filogenética em comparação à dextranase de Trichoderma harzianum. Sua estrutura consiste de dois domínios: o primeiro composto por 15 cadeias beta, e o segundo composto por uma β-hélice paralela. Esses resultados evidenciam o potencial biotecnológico desses fungos, plantas e suas enzimas extracelulares informações acerca no da controle dextranase de nematoides, produzida pelo e fornecem fungo P. chlamydosporia, que podem ser utilizadas para futuras aplicações industriais desta enzima. / Fungi and plants produce enzymes that have several biotechnological applications. A possible and promising application of these enzymes is the control of nematodes, replacing chemical nematicides harmful to human and animal health, to the environment and to the soil microbiota. Another possible application of fungi enzymes is the use of dextranase to reduce dextran content in sugar industry. The objective of this work was to investigate the production of enzymes by Pleurotus eryngii, Euphorbia milii and E. trigona, to purify and characterize the enzymes from E. milii, E. trigona and Pochonia chlamydosporia, and to test the nematicidal activity of E. milii, E. trigona and P. eryngii. P. eryngii fungus and its extract significantly reduced (p<0.01) the number of intact Panagrellus sp. larvae after 24 hours treatment in 60 and 90%, respectively. This effect is not related to enzymatic activity, but to the presence of other metabolites. M. javanica eggs, when treated with P. eryngii extract, showed a 53% reduction (p<0.01) in the number of intact eggs. The M. javanica intact eggs reduction is attributed to enzymatic activity, once the extract showed proteolytic and chitinolytic activities of, respectively, 32.74 and 3.57 U/mL. The purification of E. trigona latex with size-exclusion chromatography allowed partially purification of three distinct proteases. The molecular weight of proteases was estimated at approximately: 36, 31 and 29 kDa, for trigonin 1, 2 and 3, respectively. The pH and temperature that provided highest protease activity were 4.0, 6.0 and 9.0, and temperature of 70 °C. The proteases were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride and iodoacetamide. The pool of three proteases present in E. trigona latex reduced significantly (p<0.01) the number of live M. incognita J 2 in 96% after 24 hours treatment. The partial purification of the proteases present in E. milii latex indicated that these proteases are milin and miliin. These enzymes reduced the Panagrallus redivivus larvae number by 65.59 % and 96.46 % after 24 and 48 hours, respectively (p<0.01). Dextranase produced by the fungus P. chlamydosporia was purified to homogeneity in two steps, with a yield of 152 %, purification factor of 6.84 and specific activity of 358.63 U/mg. Its molecular weight was estimated by SDS-PAGE at 64 kDa. The enzyme presented higher activity at 50 °C and pH 5.0, using 100 mM citrate-phosphate buffer, was inhibited by Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , and presented K M of 1.77 g/L. Mature dextranase is composed of 585 amino acids residues, with a predicted molecular weight of 64.38 kDa and pI 5.96. This dextranase showed a strong phylogenetic similarity when compared to Trichoderma harzianum dextranase. Its structure consists of two domains: the first composed by 15 β strands, and the second composed by a right-handed parallel β-helix. These results evidence the biotechnological potential of these fungi, plants and their extracellular enzymes to nematodes control, and provide information about the dextranase produced by P. chlamydosporia fungus, which can be used for future industrial applications of this enzyme.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-29T13:17:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434883 bytes, checksum: e3a26bffc939f9fcea78a9252481f2cd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T13:17:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1434883 bytes, checksum: e3a26bffc939f9fcea78a9252481f2cd (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A resposta de plantas à herbivoria inclui a produção de compostos químicos de defesa como os inibidores de protease e metabólitos secundários, incluindo flavonóides, os quais tornam a folha menos aceitável, reduzindo a alimentação e com efeito negativo na fisiologia de insetos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta fitoquímica de cultivares de soja resistentes a insetos após injúrias mecânicas e por Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae); além de avaliar o desenvolvimento da lagartas-da-soja alimentadas com sojas resistentes a insetos. Esses cultivares foram injuriados mecanicamente e biologicamente, e amostras dessas plantas foram analisadas em cromatógrafo para identificação e quantificação dos flavonóides. O desenvolvimento da lagarta, incluindo mortalidade e duração da fase imatura foram determinados e os inibidores de proteases foram analisados em espectrofotômetro. Os flavonóides daidzina, rutina e quercetina foram identificados nos folíolos das cultivares de soja IAC-17, IAC-24, resistentes a insetos, e na IAC-PL1 injuriadas mecanicamente e por A. gemmataliis. As cultivares IAC-PL1, IAC-17 e IAC-24 não apresentaram resposta fitoquímica dos flavonóides, após injúria mecânica e por A. gemmatalis (P > 0,05). Também não houve resposta fitoquímica dos flavonóides rutina, daidzina, quercetina, após injúrias biológicas ou mecânicas avaliados ao longo do tempo (P > 0,05). Entre os três flavonóides identificados na soja, a daidzina foi o composto majoritário nas plantas resistentes a insetos IAC-17 e 24 (P > 0,05). Comparando esses compostos entre os três cultivares de soja, a concentração de rutina foi maior na soja resistente a inseto IAC-24 em relação à susceptível IAC-PL1 e a IAC- 17 resistente (P > 0,05). A concentração de daidzina foi maior nas cultivares de soja resistentes em relação a susceptível. A concentração de rutina foi igual entre as três cultivares de soja. A mortalidade de A. gemmatalis foi maior em cultivares de soja resistentes a insetos IAC-17 e 24. A maior duração da fase larval de ocorreu em sojas resistentes. Conclui-se que as cultivares de soja, independentemente de injurias mecânicas, produzem flavonóides como uma defesa constitutiva. O desenvolvimento de A. gemmatalis é afetada por cultivares de soja resistentes a insetos como IAC – 17 e 24. / The plant herbivory response includes the production of defensives chemical compounds such as protease inhibitors and secondary metabolites including flavonoids, which makes it less acceptable sheet feeding and reducing the negative effect on insect physiology. The objective of this study was to evaluate the phytochemical response of resistant soybean cultivars insect after mechanical injuries and caused by Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae); in addition to evaluate the development of soybean caterpillar fed with soybeans resistant to insects. These cultivars were injured mechanically and biologically, and samples of these plants were analyzed in chromatography in order to identifying and quantifying flavonoids. The development of the caterpillar its mortality and length of the immature stage were determined, and the protease inhibitors were analyzed in a spectrophotometer. The flavonoids daidzin, rutin and quercetin were identified in the leaflets of the IAC-17 and IAC-24 soybean cultivars, insect resistant, and in IAC-PL1 injured mechanically and by A. gemmatalis. The IAC-PL1, IAC-17 and IAC-24 didn’t show phytochemical response of flavonoids, after injury caused mechanically and by A. gemmatalis (P > 0.05). Also there was not phytochemical response of flavonoids rutin, daidzin, querceitna after biological or mechanical injuries assessed over time (P > 0.05). Among the three flavonoids identified in soybean, daidzin was the major compound in the resistant plants to insects, IAC-17 and 24 (P <0.05). And comparing these compounds between the three soybean cultivars, the concentration of rutin was higher in insect resistant soybeans, IAC-24, compared to susceptible IAC-PL1 and the resistant IAC- 17 (P > 0.05). The concentration of daidzin was higher in soybean cultivars resistant against susceptible. The concentration of rutin was equal between the three soybean cultivars. The mortality of A. gemmatalis, was higher in soybean cultivars resistant to IAC-17 and 24. The longest duration of larval phase occurred in resistant soybeans. It is concluded that the soybean cultivars, regardless of mechanical injuries, produce flavonoids as a constitutive defense. The development of A. gemmatalis is affected by soybean cultivars resistant to insects, such as IAC – 17 and 24.

Foram analisados alguns parâmetros que influenciam os bioprocessos, submerso e sólido, do fungo Eupenicillium javanicum na produção de peptidases. No bioprocesso submerso foram avaliados a influência de diferentes concentrações e tipos de fonte de carbono e concentrações de fonte nitrogênio no meio, pH, temperatura e tempo de incubação. No bioprocesso sólido avaliou-se a influência de dois tipos de resíduos agroindustriais, em diferentes proporções, dois tipos de fonte de nitrogênio, em diferentes concentrações, tempo e temperatura de incubação. As peptidases produzidas em ambos os bioprocessos foram caracterizadas bioquimicamente, avaliando pH e temperatura ótima, estabilidade em diferentes temperaturas e valores de pH e influência da adição de íons e inibidores na atividade da peptidase. A enzima produzida em bioprocesso sólido foi submetida ao processo de purificação utilizando métodos cromatográficos. Utilizando a peptidase pura realizou-se a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. Além disso, o extrato enzimático obtido através do bioprocesso foi submetido ao processo de microencapsulação, visando uma maior estabilidade das peptidases e facilidade no armazenamento e transporte, utilizando a técnica de Spray drying, em seguida foi avaliado o rendimento do processo e a estabilidade das peptidases das micropartículas produzidas. O fungo Eupenicillium javanicum mostrou potencial na produção de peptidases em ambos bioprocessos, produzindo peptidases da classe das metalopeptidases com alta estabilidade em diferentes valores de pH e temperatura. O processo de purificação mostrou-se viável e reprodutível. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência do lado \"linha\" da peptidase na eficiência catalítica. O processo de microencapsulação mostrou-se viável e gerou micropartículas estáveis. A peptidase produzida apresentou características que demonstram seu potencial uso nas diferentes áreas industriais. / Some parameters that influence the submerged and semi solid bioprocesses, by the fungus Eupenicillium javanicum in the peptidases production, were conducted. In submerged bioprocess was evaluated the effect of different concentrations and types of carbon source and nitrogen source in the medium, pH, temperature and incubation time. In semi solid bioprocess semi solid was evaluated the influence of two types of agroindustrial residues, in different proportions, and different concentrations of nitrogen source, temperature and of incubation time. The peptidases produced in both bioprocesses were characterized biochemically, evaluating, the optimum pH and temperature, stability at different temperatures and pH values and the influence of the addition of ions and inhibitors on peptidase activity. The enzyme produced in semi solid bioprocess was subjected to the purification process using chromatographic methods. Using pure peptidase was performed the biochemical characterization and determination of kinetic parameters, both using the fluorescence intramolecular suppression peptide substrate. Furthermore, the enzymatic extract obtained by semi solid bioprocess was subjected to microencapsulation process by using the technique of spray drying, in order to obtain greater stability, ease storage and transport of peptidases, then assessed the yield process and stability of the peptidases of microparticles produced. The fungus Eupenicillium javanicum showed potential production of peptidases in the both bioprocesses, producing peptidases that belong to the class of metallopeptidases, with high stability at different pH and temperature. The purification process was feasible and reproducible. The analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of the \"line\" side on the peptidase catalytic efficiency. The microencapsulation process was feasible and generated stable microparticles. The peptidase produced has characteristics that demonstrated it a potential use in different industrial fields.

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

No tubo digestivo das larvas de Anastrepha fraterculus e Anastrepha pickeli há &#946;-glicosidases capazes de clivar dissacarideos, &#946;-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e substratos sintéticos. As &#946;-glicosidases de A. fraterculus são pouco ativas e as de A. pickeli são bastante ativas sobre alguns compostos, entre eles linamarina, um glicosídeo cianogênico. Esse composto está presente, em altas concentrações, no fruto da mandioca do qual a larva se alimenta. A. fraterculus alimenta-se do fruto da goiaba e aparentemente consegue o carboidrato que necessita por ação de &#945;-glicosidases, que são bem mais ativas do que as &#946;. O fruto da mandioca não é tão nutritivo e A. pickeli deve aproveitar a glicose da linamarina para obter energia e consegue desintoxicar-se do aglicone tóxico. Rhynchosciara americana apresenta quatro &#946;-glicosidases nas membranas microvilares intestinais, sendo três delas &#946;-galactosidases. Dessas, duas são ativadas por Triton X-100 sendo que a glicosidase, de maior mobilidade eletroforética é ativada por este composto, com uma Ka de 4&#181;M, um &#945; de 0,5 e um &#946; de 2. &#946;-tioglicosidases foram demonstradas em afideos. Nós verificamos que ocorre a clivagem do tioglicosídeo sinigrina após separação das &#946;-glicosidases digestivas do Lepidoptera Diatraea saccharalis por cromatografia hidrofóbica. Nesse inseto, a mesma enzima é capaz de clivar O- e S-glicosídeos com atividades semelhantes. Enzimas com essas características nunca foram descritas anteriormente. Esses experimentos ilustram a viabilidade das adaptações dos insetos na utilização de compostos formados for ligações &#946;-glicosídicas, viabilizando a exploração de nutrientes normalmente inacessíveis a outros animais. / Anastrepha fraterculus and Anastrepha pickeli have in their midguts 13-glycosidases able to hydrolase dissaccharides, synthetic substrate and plant toxic &#946;-glucosides. &#946;-glycosidases from A. fraterculus have low activity and the enzymes from A. pickeli may be highly active depending on the substrate used. Linamarin, a cyanogenic &#946;-glucoside present in A. pickeli food (Manihot fruit) is easly hydrolysed by A. pickeli &#946;-glycosidases (A. fraterculus eats on guava fruits and may obtain carbohydrate through the action of &#945;-glycosidases, that are much more active them the &#946;-glycosidases). A. pickeli probably uses glucose derived from linamarinan avoiding the effects of the toxic aglycon. Rhynchosciara americana has 4 &#946;-glycosidases (3 galactosidases and I glucosidase) in their intestinal microvilar membranes. Two of these enzymes are activated by Triton X-100. In &#946; glucosidase the activation has Ka= 4&#181;M, &#945;=0,5 e &#946;=2. &#946;-thioglycosidases occur in Aphids. One digestive &#946;-glucosidase from Diatraea saccharalis resolved by hydrofobic chrornatography hydrolyses sinigrin. The same enzyme may hydrolyse O- and S-glucosides with the same efficienly. Enzymes with this specificity have never been described before. In this study we shown some adaptations of insects to use substrates with &#946;-glycosidic bonds, allowing these organisrns to explore nutrients usualy avoided by other animals.

O Brasil apresenta cerca de 10 a 17,6% da biodiversidade mundial e apenas uma fração dela é conhecida. Os fungos filamentosos são bons produtores de enzimas e despertam um grande interesse biotecnológico. O amido é o principal carboidrato de reserva das plantas. Dentre as enzimas amilolíticas estão as glucoamilases, que catalisam a hidrólise das ligações -1,4 e -1,6 das extremidades da cadeia do amido liberando glucose. Neste trabalho foram isolados 25 fungos filamentosos de amostras de materiais em decomposição da Mata Atlântica. Dos micro-organismos com alta atividade amilolítica foram selecionados e identificados Aspergillus brasiliensis e Rhizopus oryzae. Foi realizada a otimização do cultivo e caracterização das amilases do extrato bruto de ambos os fungos. Após a obtenção destes dados foi selecionado A. brasiliensis, pois, sua amilase é mais termoestável e ainda não reportada na literatura. Após purificação a enzima foi identificada como glucoamilase, a qual é monomérica com 69 kDa e contém aproximadamente 21% de carboidratos. Apresenta um domínio de ligação ao amido na porção terminal e estrutura secundária rica em -hélice. Sua atividade ótima ocorre em pH 4,5 a 60°C, seu pI é de 3,21, pode ser ativada com a adição de Mn2+, e é inibida por glucose em concentrações maiores que 0,1 M. A glucoamilase apresenta excelente estabilidade ao pH e boa estabilidade a temperatura (a 50°C mantém 67% de atividade após 7 horas; a 55°C a meia vida é de 147 minutos). Com amido de batata a enzima apresentou as seguintes constantes cinéticas (km 2,21 mg/mL; Vmáx 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). A glucoamilase foi imobilizada em DEAE-PEG com ativação de 12 vezes e possibilidade de reuso de 10 vezes com perda de apenas 31% de atividade. O derivado demostrou maior facilidade para hidrolisar a amilopectina do que à amilose. Também foi realizada uma análise de neighbor joining, que agrupou a glucoamilase de A. brasiliensis próxima às glucoamilases de espécies de Aspergillus, que são consideradas as mais derivadas. / Brazil holds about 10-17.6% of the world\'s biodiversity and just a percentage of it is known. Filamentous fungi are enzyme producers that have great biotechnological application. Starch is the main reserve carbohydrate in plants. Among the amylolytic enzymes there are the glucoamylases, that catalyze the hydrolysis of -1,4 and -1,6 linkages of the end of starch chains, and releases glucose. In this research 25 filamentous fungi from Atlantic forest decaying material samples were isolated. Among microorganisms with high amylolytic activity Aspergillus brasiliensis and Rhizoupus oryzae were selected and identified. The cultivation parameters were optimized and the enzymes of crude extract were characterized. Considering the previous data Aspergillus brasiliensis was selected because its amylases are more thermostable and it has not been described in the literature yet. After purification the enzyme was identified as a glucoamylase, which is monomeric with 69 kDa and about 21% of carbohydrates in its composition. The enzyme has a starch binding domain in the terminal position and its secondary structure is rich in -helix. The optimum pH for glucoamylase activity is 4.5, the temperature is 60ºC and its pI is 3.21. The enzyme can be activated by the addition of Mn+2, and inhibited in concentrations above 0,1M glucose. The glucoamylase has an excellent pH stability and a good temperature stability (at 50ºC 67% of the activity was retained after 7 hours; at 55°C its half-life was 147 minutes). The best kinetic values were obtained with potato starch (km 2.21 mg/mL; Vmax 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). The glucoamylase was immobilized on DEAE-PEG, with an activation of 12 times and enzyme reuse 10 times with just 31% loss of its activity. The immobilized enzyme has a greater activity on amylopectin than amylose. A neighbor joining analysis with glucoamylases from filamentous fungi species was made and Aspergillus brasiliensis glucoamylase was grouped close to the glucoamylases of Aspergillus species, which are considered the most derivative.

Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

Spiders and scorpions are efficient predators arachnid (PA) consuming preys larger than themselves. Few studies reported, molecularly, the digestion in PA. This work describes a biochemical, transcriptomic and proteomic analysis of the midgut and midgut glands (MMG) and digestive juice (DJ) from Nephilengys cruentata and Tityus serrulatus MMG. Cathepsin L, B, D and F, legumain, trypsin, astacin, carbohydrases and lipases were identified by these approaches. Peptide isomerase and ctenitoxins, which are venom proteins were identified, showing a correlation among digestive and venom enzymes. Summarily, PA relies in multi peptidase system mainly constituted of astacins for extracellular prey liquefaction and cathepsin L for intracellular digestion, describing a molecular model for digestion. Probably, during evolution, gene duplication led a diversification of astacins in the derived groups of Arachnida, like spiders, distinctly from what is observed in basal groups like scorpions. These data on Arachnida digestion will allow detailed multi disciplinary studies. / Aranhas e escorpiões são aracnídeos predadores eficientes (AP) consumindo presas maiores que eles mesmos. Poucos estudos descrevem molecularmente a digestão em AP. Neste trabalho caracterizamos bioquimicamente, por transcriptoma e proteoma o intestino e glândulas digestivas (IGD) e suco digestivo (SD) de Nephilengys cruentata e o IGD de Tityus serrulatus. Catepsinas L, B, D e F, legumaína, tripsinas, astacinas, carboidrases e lipases foram identificadas. Peptídeo isomerase e ctenitoxina foram identificadas no IGD. Estas proteínas podem indicar uma correlação entre enzimas digestivas e do veneno. Portanto, AP apresentam várias peptidases principalmente astacinas para liquefazer a presa extraoralmente e catepsinas L para digestão intracelular, descrevendo um modelo molecular para a digestão. Provavelmente, durante a evolução, eventos duplicação gênica levaram à diversificação das astacinas aracnídeos derivados, como as aranhas, diferentemente dos grupos basais, como os escorpiões. Estes dados sobre a digestão em Arachnida permitirão estudos multidisciplinares.

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O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima / Human alpha-galactosidase A (α-Gal A) is a lysosomal enzyme which is deficient in Fabry disease. Fabry disease is a sphingolipidosis which chronic kidney failure (CKF) is the most important cause of morbidity and mortality. The aim of this study was the establishment of a laboratorial protocol that allows the diagnosis of Fabry’s disease in plasma and leukocytes, the analysis of α-Gal A kinetic features in plasma and searching for potential Fabry patients in 25 individual with unknown CKF. Reproducibility and fluorescence stability of the enzymatic method were also evaluated. The assay standardization was realized with the fluorescent substrate 4- methylumbeliferil-α-D-galactopyranoside. Reproducibility was evaluated using plasma samples stored at a 4ºC, -20ºC and -70ºC, the assay was performed once a month until 6 months and fluorescence stability was evaluated until 24 hours after the end of the assay. The standardization allowed the establishment of value references to α-Gal A in Pará State, from 4 to 28 nmoles/h/mL (plasma) and 20 to 96 nmoles/h/mg protein (leukocytes). α-Gal A enzyme was thermolabile and 1 minute of preincubation at 60ºC was sufficient to decrease 71.09% of its entire activity. The activity of the α-Gal A enzyme increased progressively according to incubation time, between 15 and 180 minutes. Its activity was better at pH 4,8, the Km value for the α-Gal A enzyme was 1.007 mM, and maximum reaction velocity was 30.9 nmoles/h/mL. The best storage temperature for plasma samples was -20ºC that showed less variation until 6 months. The enzyme method is stable and even after 24 hours, at room temperature, the fluorescence remained the same. All CKF patients with unknown cause presented α-Gal A activity between normal values, therefore neither was diagnosed with Fabry disease. Understanding the kinetics of the α-Gal A enzyme and its in vitro behavior will contribute to improvements in the laboratory diagnosis of Fabry disease, and provide a diagnostic baseline for the analysis of individuals affected by mutations in this enzyme.