A fosforilação da histona 3 na serina 10 (H3S10) e a acetilação da histona 3 lisina 14 (H3K14) tem sido relacionadas com a formação da memória em paradigmas de medo condicionado. Estudos demonstram que o exercício é capaz de melhorar o desempenho em testes de memória além de modular marcadores epigenéticos. O objetivo desse estudo foi investigar o efeito de um protocolo de corrida em esteira (20min/dia durante 2 semanas) sobre os níveis de acetilação da H3K14 e de fosforilação da H3S10 em hipocampo de ratos expostos ou não expostos a um contexto de aprendizado.Ratos Wistar de 3 meses de idade foram submetidos a um protocolo de exercício crônico (grupo exercitado) ou submetidos a esteira desligada (grupo sedentário) e após parte dos animais foram expostos a um contexto de aprendizado (esquiva inibitória). Os animais foram eutanasiados por decapitação e os níveis da fosforilação da serina 10 e da acetilação da lisina 14 na histona 3 (H3 foram avaliados em hipocampos. A ANOVA de duas vias mostrou um efeito significativo dos fatores “contexto de aprendizado” e “exercício” nos níveis de acetilação da H3K14, assim como uma interação entre esses fatores. Houve uma diminuição nos níveis de acetilação 24h após o treino da esquiva inibitória (30 minutos após o teste) no hipocampo do grupo submetido ao contexto de aprendizado. Além disso, o exercício crônico aumentou os níveis de acetilação no hipocampo dos ratos expostos ao contexto de aprendizado. Os níveis de fosforilação da H3S10 não foram alterados pelo contexto de aprendizado nem pelo exercício. Nossos dados apoiam a hipótese de que a modulação da acetilação na H3K14 em hipocampo de ratos pode estar relacionada,pelo menos em parte, aos efeitos do exercício sobre memória aversiva. / The phosphorylation of histone H3 at serine 10 (H3S106) and acetylation of histone 3 at lysine 14 (H3K14) have been linked to memory processes in fear conditioning paradigms. Some studies demonstrated that exercise was able to improve the performance in memory tasks and modulate epigenetic markers. The aim of this study was to investigate the effect of treadmill exercise protocol (20min/day during 2 weeks) on H3K14 acetylation and H3S10 phosphorylation levels in hippocampi from rats exposed or not exposed to learning context. Wistar rats with 3-months-old were submitted to chronic exercise protocol (exercised group) or left on the treadmill turned off (sedentary group) and after it, some animal were exposed to learning context (inhibitory avoidance). Rats were euthanized by decapitation and the levels of serine 10 phosphorylation and lysine 14 acetylation on histone 3 (H3) were evaluated in hippocampi. Two-way ANOVA showed a significant effect of “learning context” and “exercise factors” on acetylation levels of H3K14, as well as an interaction between these factors. There was a decrease in acetylation levels twenty four hours after inhibitory avoidance training (30 minutes after test), in hippocampus from exposed to learning context groups. Besides, the chronic exercise increased acetylation levels in hippocampi from rats exposed to learning context. The H3S10 phosphorylation levels were not altered by of learning context and exercise. Our data support the hypothesis that the modulation on acetylation levels of H3K14 acetylation in hippocampus might be related, at least partially, to exercise effects on aversive memory.

A epigenética é considerada como a interface entre os componentes genéticos, o ambiente externo e o estilo de vida. Estudos recentes sugerem uma relação entre o processo de envelhecimento cerebral e o desequilíbrio de mecanismos epigenéticos, contudo, estes dados ainda não são conclusivos. Ainda, tem sido demonstrado que o exercício físico parece alterar marcadores epigenéticos em hipocampo de ratos adultos jovens. Sabe-se que o grau de neuroplasticidade varia com a idade e que as estruturas encefálicas podem responder diferentemente à exposição ao exercício. Assim, este trabalho teve como objetivo central investigar o impacto do exercício físico sobre parâmetros epigenéticos em hipocampo e estriado de ratos Wistar em diferentes fases do desenvolvimento. Na primeira etapa, avaliou-se os efeitos do processo de envelhecimento e do exercício físico sobre parâmetros de metilação, conteúdo das enzimas DNA metiltransferase 1 (DNMT1) e DNA metiltransferase 3b (DNMT3b) e níveis de metilação da histona H3-K9 em hipocampos de ratos Wistar adultos jovens (3 meses) e envelhecidos (20 meses). Os animais foram submetidos a diferentes protocolos de exercício físico: sessão única, que constituiu em corrida em esteira durante 20 minutos, ou treinamento crônico, caracterizado pela corrida em esteira por 20 minutos durante duas semanas. Ainda, no intuito de verificar os efeitos agudos e tardios do exercício, os animais foram decapitados 1 ou 18 horas após a sessão única ou o último treino do protocolo crônico. Observou-se um perfil de hipometilação global nos animais envelhecidos, uma vez que este grupo apresentou uma redução no conteúdo hipocampal da enzima DNMT1 e nos níveis de metilação da histona H3-K9. A sessão única de exercício reduziu agudamente o conteúdo hipocampal das enzimas DNMT1 e DNMT3b no grupo adulto jovem, um indicativo de aumento da atividade transcricional e expressão gênica. No entanto, não afetou estes marcadores no grupo envelhecido. Além disto, a sessão única de exercício induziu uma redução nos níveis de metilação da histona H3-K9 no grupo adulto jovem, enquanto que, no grupo envelhecido induziu um aumento neste parâmetro em ambos os tempos testados. Ainda, o protocolo crônico reduziu de forma persistente este parâmetro no grupo adulto jovem, mas não alterou em ratos envelhecidos. Na segunda etapa, analisou-se o efeito destes mesmos protocolos de exercício sobre a atividade global da enzima Histona Desacetilase (HDAC) em estriado de ratos Wistar em diferentes fases do desenvolvimento, adolescentes (25 dias), adultos jovens (3 meses) e envelhecidos (20 meses). A sessão única de exercício induziu efeitos persistentes na atividade da HDAC nos adolescentes, visto que o grupo exercitado apresentou uma diminuição neste parâmetro em ambos os tempos testados, sugerindo um aumento nos níveis de acetilação de histonas e ativação da maquinaria transcricional. No entanto, o exercício não alterou a atividade desta enzima nos demais grupos, ratos adultos jovens e envelhecidos. Estes resultados sugerem que o exercício físico moderado de corrida em esteira é capaz de induzir mudanças epigenéticas em encéfalo de ratos, o que pode alterar a atividade transcricional, e assim, modular a expressão de genes específicos envolvidos com a função cerebral. Além disso, demonstramos que a modulação epigenética em resposta ao exercício ocorre de forma protocolo e idade-dependentes. / Epigenetics is considered as the interface between the genetic components, the external environment and lifestyle. Recent studies suggest a relationship between the brain aging process and the imbalance of epigenetic mechanisms, however, these data are not conclusive. Moreover, it has been shown that exercise seems to alter epigenetic markers in the hippocampus of adult rats. It is known that the neuroplasticity degree varies with age and that the brain structures may respond differently to exercise exposure. Therefore, this work was mainly aimed to investigate the impact of physical exercise on epigenetic parameters in the hippocampus and striatum of rats at different stages of development. In the first moment, we evaluated the effects of the aging and exercise on methylation parameters, DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and DNA methyltransferase 3b (DNMT3b) content and histone H3-K9 methylation levels in hippocampi from young adult (3 months) and aged (20 months) Wistar rats. The animals were subjected to different exercise protocols: a single session, which consisted in running on a treadmill for 20 minutes, or chronic training, characterized by running on a treadmill for 20 minutes during two weeks. Moreover, in order to examine the acute and delayed effects of exercise, the animals were decapitated 1 or 18 hours after the single session or the last training session of chronic protocol. It was observed a global hipomethylation profile in the aged animals, since this group showed a reduction on hippocampal DNMT1 enzyme content and on histone H3-K9 methylation levels. The single exercise session acutely reduced hippocampal content of DNMT1 and DNMT3b enzymes in the young adult group, an indicative of increased transcriptional activity and gene expression. However, did not affect these markers in the aged group. Furthermore, the single exercise session induced a reduction on histone H3-K9 methylation levels in the young adult group, while in the aged group, increased this parameter in both tested times. Moreover, the chronic protocol also reduced persistently this parameter in the young adult group, but did not alter in the aged rats. In the second moment, it was analyzed the effect of these same exercise protocols on the global enzyme Histone Deacetylase (HDAC) activity in the striatum of Wistar rats at different stages of development, adolescents (25 days), young adult (3 months) and aged (20 months). The single exercise session induced persistent effects on HDAC activity in the adolescents, given that the exercised group showed a decrease in this parameter in both time points evaluated, suggesting increased levels of histone acetylation and transcriptional machinery activation. However, the exercise did not alter this enzyme activity in the other groups, young adult and aged rats. These results suggest that moderate exercise treadmill running it is able to induce epigenetic changes in rat brain, which might alter the transcriptional activity, and thus might modulate the expression of specific genes involved with the brain function. Furthermore, we demonstrated that epigenetic modulation in response to exercise occurs in a protocol and age-dependent manner.

Jean Piaget desenvolveu, a partir dos anos 60, uma teoria de adaptação e evolução das especies que unifica o todo o funcionamento do organismo, desde seu comportamento ate as modificacoes geneticas, sob um paradigma cibernetico e interativo. Tal modelo, ignorado a epoca, tem se mostrado cada vez mais coerente com as descobertas da Biologia Moderna. Este trabalho procura mostrar a congruencia do modelo de Piaget as evidencias levantadas Biologia do seculo XXI e extrair dai algumas consequência para a Psicologia e para outras areas do conhecimento e da ação humanas / Jean Piaget developed, from the sixties onward, a theory for adaptation and evolution of species that unifies under a cybernetic and interactive paradigm the entire living being functioning, from the behavior to the genetic modifications. This model, ignored at the time, has become ever more consistent with the findings of modern biology. This work aims to show the congruence of Piaget\'s model to the evidence raised Biology of the XXI century and then extract some consequence for psychology and other areas of knowledge and human action

Introdução: Leiomiomas uterinos ou miomas são tumores benignos que se desenvolvem no miométrio e acometem cerca de 50% da população feminina. Têm como principais sintomas, sangramento excessivo e dor pélvica inespecífica. Convencionalmente o estrogênio é considerado o responsável pelo início da proliferação tumoral, mas recentes evidências clínicas e bioquímicas sugerem que a progesterona apresenta um papel importante no desenvolvimento desses tumores. Além disso, mecanismos epigenéticos parecem estar envolvidos na etiologia dos leiomiomas uterinos, como a metilação de DNA e acetilação de histonas. Somente nos EUA são realizadas 240 mil histerectomias/ano para tratar essa doença sendo considerado um problema de saúde pública. Frente a esses dados é imprescindível o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento desses tumores e a busca de tratamentos menos invasivos. A mifepristona (RU 486), um modulador seletivo dos receptores de progesterona e glicocorticoides, é capaz de diminuir o tamanho dos tumores e amenizar os sintomas associados. Objetivos: verificar se (1) nos tecidos de leiomiomas uterinos e miométrio, os mecanismos epigenéticos como a metilação global do DNA e a acetilação de histonas estão alterados (2) se em cultura primária de leiomioma uterino e miométrio o tratamento com estradiol e progesterona é capaz de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B, assim como a atividade das enzimas histona acetiltransferase e desacetilase, e (3) se a mifepristona (RU 486) é capaz de modular diretamente a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B após tratamento com os hormônios estradiol e progesterona. Métodos: para análise de metilação global do DNA e acetilação de histonas foram utilizadas 25 amostras teciduais para cada grupo de leiomioma uterino e miométrio oriundos de pacientes submetidas à histerectomia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A metilação global do DNA e a atividade da enzima histona acetiltransferase foram dosadas pelo método de ELISA e a enzima histona desacetilase por detecção fluorimétrica. Para verificar o efeito dos hormônios sexuais ovarianos e o efeito da mifepristona (RU 486) sobre a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B foram realizadas 7 culturas primárias de leiomiomas uterinos e miométrio. Resultados: (1) Foram observadas hipermetilação (P = 0,022) e hipoacetilação (P = 0,04) em leiomiomas uterinos quando comparado ao miométrio. Não houve diferença estatística entre estes tecidos em relação à atividade da histona acetiltransferase. (2) Houve aumento da expressão gênica do receptor de progesterona total em cultura primária de leiomioma uterino quando tratado com estradiol (P = 0,028) e o receptor de progesterona B teve sua expressão aumentada quando tratado com estradiol, progesterona e estradiol + progesterona (P = 0,001). (3) O tratamento com mifepristona (RU 486) na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B em células de leiomiomas uterinos e miométrio. A atividade da enzima histona desacetilase foi maior nas células de leiomioma uterino quando tratadas com estradiol (P = 0,034) e estradiol + progesterona + RU 486 (P = 0,001) quando comparado às células de miométrio, já a atividade da enzima histona acetiltransferase não foi detectada, devido a sua baixa quantidade. Conclusão: Nesse estudo foi observado uma hipermetilação e hipoacetilação nos tecidos de leiomiomas uterinos. Esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos podem estar contribuindo para a diminuição transcricional de genes relacionados ao funcionamento normal do miométrio e, com isso, colaborando para o crescimento desses tumores. Além disso, nossos resultados sugerem que estradiol e progesterona são capazes de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B e o medicamento RU 486 na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir diretamente a expressão desses receptores. / Introduction: Uterine leiomyoma, also known as fibroids, is a smooth muscle cell tumor, and is clinically apparent in up to 50% of reproductive-age women. Clinical symptoms include abnormal uterine bleeding and pelvic pain. Estrogen has been considered a primary growth promoter of uterine leiomyoma, however clinical and biochemical evidence has suggested that progesterone plays a critical role in the development of these tumors. Furthermore, epigenetic modifications may be involved with etiology of theses tumors, through DNA methylation and histone acetylation. In the United States, 240.000 hysterectomies/year are performed to treat uterine leiomyomas which is being considered to be a public public health problem. The understanding of molecular mechanisms involved in the development of uterine leiomyoma may provide not only opportunities for a diagnostic, but also generation of novel therapeutic approaches. The mifepristone (RU 486), a synthetic steroid that has affinity for progesterone and glucocorticoid receptors has been reported to induce regression of uterine leiomyoma and reduce the symptoms. Objective: verify if (1) DNA global methylation and histone acetylation patterns are altered in uterine leiomioma tissue compared with myometrium; (2) the treatment with estradiol and progesterone are able to modulated de gene expression of total and B progesterone receptors and histone acetylation patterns in primary culture of uterine leiomyoma cells and myometrium as well as (3) the mifepristone (RU 486) are able to modulate the gene expression of total and B progesterone receptors after the treatment with ovarian steroids hormones. Methods: DNA global methylation and histone acetylation patterns were analyzed in 25 tissue samples from uterine leiomioma and myometrium. The DNA global methylation and the activity of histone acetyltransferase were performed using ELISA method. In order to evaluate histone deacetylase activity fluorimetric detection was used. To verify the effect of estradiol and progesterone on total and B progesterone receptors gene expression, as well as the influence of RU486 on this parameters, seven cultured cells from uterine leiomyoma and myometrium cells were performed. Results: (1) Hypermethylation (p = 0.022) and hypoacetylation (p = 0.04) in uterine leiomioma tissues compared with myometrium were observed. There was no statistic difference between these tissues in histone acetyltransferase activity. (2) We observed increased gene expression of total progesterone receptor in culture cells of uterine leiomyoma when treated with estradiol (p = 0.028). There was an increase of B progesterone receptor mRNA when treated with hormones, estradiol and progesterone (p = 0.001). The treatment with RU 486 was not able to modulate progesterone receptors. The histone desacetilase activity was elevated in uterine leiomyoma cells when treated with estradiol (p = 0.034) and estradiol + progesterone + RU 486 (p = 0.001). The histone acetyltransferase activity was barely detectable. Conclusion: In our study we found hypermethylation and hypoacetylation in uterine leiomyoma tissues suggesting that this process may lead to a decreased transcriptional activity of important genes associated with normal myometrium function contributing to the development of these tumors. Furthermore, our results suggest that ovarian steroids hormones increase progesterone receptors expression, being mifepristone (RU 486) at dose of 10-6M unable to decrease total and B progesterone receptors in uterine leiomyoma cells.

O peptídeo liberador de gastrina (GRP) age como potente mitógeno em tecidos neoplásicos pela ativação do seu receptor (GRPR), que é super expresso em estágios avançados de neuroblastoma humano. GRPR knockdown ou antagonistas de GRPR mostraram inibir o crescimento de neuroblastoma. Investigou-se, em condições experimentais, que os antagonistas de GRPR podem promover, em vez de inibir o crescimento de células de neuroblastoma. O antagonista do GRPR, RC-3095 em 0,1 nM inibiu, enquanto a concentração de 100 nM estimulou a proliferação de células de neuroblastoma murino Neuro2a, in vitro. Os efeitos proliferativos de RC -3095 no crescimento celular foram impedidos pelo inibidor de deacetilase de histona (HDI), butirato sódico (NAB). Estes resultados fornecem a primeira evidência de que um antagonista do GRPR pode estimular o crescimento de células cancerosas, e sugerem que o GRPR pode interagir com os mecanismos epigenéticos na regulação do crescimento de células do neuroblastoma.

O desenvolvimento e a progressão do câncer bucal envolvem processos complexos de múltiplas etapas levando a modificações fenotípicas nas células epiteliais, aumento da proliferação e invasão dos tecidos subjacentes. Diversos fatores vem sendo associados à carcinogênese, dentre eles os mecanismos epigenéticos como a acetilação de histonas, que promovem mudanças na expressão de genes independente de mutações. O objetivo do presente estudo observacional transversal foi analisar a relação entre acetilação da histona 3 (acetil Histona H3) com proliferação celular e transição epitélio-mesênquima na mucosa bucal normal (MBN), leucoplasias bucais (LB) e carcinomas espinocelulares (CEC) de boca, bem como correlacioná-los com dados clínico-demográficos, graduação histopatológica e o comportamento das lesões. Foram analisados 10 casos de mucosa bucal normal (MBN), 20 casos de LB e 75 casos de CEC de boca. Todos os casos foram submetidas a análise imunoistoquímica utilizando anticorpos anti-acetil Histona H3, Ki67, vimentina e TGF-β1. A imunomarcação da acetil histona H3 foi significativamente menor nos casos de CEC quando comparados a LB (p=0.03). Não foi encontrado diferença entre os casos de MBN e LB. Paralelamente, foi observado um aumento estatisticamente significativo na proliferação durante o processo de carcinogênese (p<0.00) e o mesmo foi observado quando avaliados os marcadores da transição epitélio-mesênquima, vimentina (p=0.03) e TGF-β1 (p<0.00). A análise da associação dos marcadores com fatores clínicos-demográficos não mostrou diferença significativa. Entretanto, maior média de acetil histona H3 foi associada ao bom prognóstico (p=0.01) e também, foi observado uma tendência de uma melhor taxa de sobrevida (p=0.06). Conclui-se que os CEC de boca são hipoacetilados, exibem maior perfil proliferativo e de transição epitélio-mesênquima. Além disso, a acetil histona H3 pode ser considerada um marcador prognostico nestas lesões. / The development and progression of oral cancer involve multi-step processes leading phenotypic changes in epithelial cells, proliferation increase and invasion of adjacent tissue. Several factors have been associated with carcinogenesis, including epigenetic mechanisms such as histone acetylation, which promote changes in the expression independent of gene mutations. The aim of the present study was to analyze the association of acetylation of histone 3 (acetyl-histone H3) with cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in oral leukoplakia (OL) and oral squamous cell carcinoma (OSCC) and correlate them with data clinic-demographic, histopathological grading and the behavior of these lesions. We analyzed 10 cases of normal oral mucosa (NOM), 20 cases of OL and 75 cases of OSCC. All samples were submitted to immunohistochemical analysis using anti-acetyl histone H3, Ki67, vimentin and TGF-β1. Acetyl-histone H3 labeling was significantly lower in cases of OSCC compared to LB (p=0.03). It was not found difference between NOM and OL. In parallel, the proliferation analysis revealed a gradual increase on Ki67 labeling (p<0.00) during oral carcinogenesis with highest value detected in OSCC Also, an increase on EMT markers, vimentin (p=0.03) and TGF-β1 (p<0.00) were noted. A higher mean acetyl-histone H3 was associated with good prognosis (p= 0.01) and similarly a tendency to improved survival rate was observed (p=0.06). As conclusion, OSCC are hypoacetylated, exhibit higher proliferative profile and epithelial-mesenchymal transition characteristics. Furthermore, acetyl histone H3 can be considered a prognostic marker in OSCC.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / A epigenética estuda mecanismos reguladores da atividade e herança gênica que independem de modificações na seqüência de nucleotídeos do DNA. Os principais eventos epigenéticos são: metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas. miRNAs correspondem a moléculas de RNAs bem pequenas que se associam a mRNA alvos promovendo a desestabilização ou degradação dos mesmos. É estimado que mais de 30% de todos os mRNAs sejam regulados por miRNAs. Desta forma, os miRNAs representam componentes essenciais em diversos processos biológicos, tais como proliferação celular, apoptose e resposta ao estresse. Tanto alterações nos mecanismos epigenéticos quanto modificações no perfil de expressão de miRNAs pode modificar a expressão dos componentes do ciclo celular. Alguns estudos sugerem que o câncer é uma doença do ciclo celular. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a contribuição dos componentes do ciclo celular na gênese do melanoma e seus possíveis reguladores. Para tal, foi utilizado um modelo murino de gênese do melanoma, no qual várias linhagens celulares foram obtidas após submeter melanócitos melan-a a ciclos sequenciais de bloqueio de ancoragem. Alterações significativas foram identificadas na expressão dos componentes do ciclo celular, p53, p21, ciclina D1 e Cdk4 durante o processo de transformação maligna dos melanócitos. Foi verificada perda da expressão da p53 ao mesmo tempo em que foi observado aumento na expressão de p21 na linhagem de melanoma agressivo. Observaram-se também alterações na expressão de Dnmt1 durante a gênese do melanoma. Ensaios de imunoprecipitação de proteínas mostraram que p53 interage com Dnmt1 somente nos melanócitos melan-a. Vinte e cinco miRNAs foram encontrados diferencialmente expressos ao longo do processo de transformação de melanócitos e os miRNAs 138, 340 5p, 678 e 330 foram reconhecidos como possíveis reguladores de p53, ciclina D1 e Cdk4 e p21, respectivamente. Estes dados sugerem a contribuição da maquinaria epigenética e dos miRNAs na regulação do ciclo celular e demonstram a importância do equilíbrio destas vias para manutenção do um fenótipo celular. Alterações nos componentes do ciclo celular estão envolvidas com transformação maligna de melanócitos melan-a e os eventos epigenética podem contribuir com estas alterações. Os alvos terapêuticos que visam os componentes da maquinaria epigenética podem representar úteis intervenções contra o câncer. Além disso, a proteína p53 interage com um dos principais componentes das máquinas epigenética, Dnmt1, indicando que p53 pode regular essa enzima e contribuir para a manutenção do padrão de metilação do DNA. Os miRNAs identificados também representam moléculas envolvidas na gênese do melanoma e, por isso, são fortes candidatos no desenvolvimento de novas terapias. / Epigenetic studies regulatory mechanisms of the activity and inheritance in gene expression that is independent of modifications in the nucleotide sequence. The main epigenetic events are: DNA methylation and histone pos-translational modifications. miRNAs are non-coding RNAs that bind to mRNA targets and disturb their stability and/or translation, thus acting in the post-transcriptional regulation. It is estimated that over 30% of mRNAs are regulated by miRNAs and therefore these molecules are considered essential in the processing of many biological responses, such as cell proliferation, apoptosis and stress responsiveness. Changes in the epigenetic machinery like modifications in miRNA expression profile can modify the expression of cell cycle components. Some studies suggest that cancer is also a disease of cell cycle. In this regard the aim of the present study was identify the contribution of cell cycle components in melanoma genesis and their possible regulators. For that it was used a murine model of melanoma genesis in which several cell lineages were obtained after submitting melan-a melanocytes to sequential cycles of anchorage blockade. Significant alterations were identified in expression of the cell cycle components, p53, p21, cyclin D1 and cdk4 along melanocyte malignant transformation. It was observed loss of p53 expression in the same time that was observed an increase in expression of p21 in the aggressive melanoma lineages. It was also observed alterations in the expression of dnmt1 during the genesis of melanoma. Protein immunoprecipitation assays showed that p53 interact with dnmt1 only in melan-a melanocytes. Twenty five miRNAs were found differentially expressed along the process of malignant transformation and the miRNAs 138, 340-5p, 678 and 330 were recognized as possible regulators of p53, cyclin D1, Cdk4 and p21, respectively. These data show the contribution of epigenetic and miRNA machinery in the regulation of cell cycle and the importance of the equilibrium of these pathways in maintenance of cell phenotype. Cell cycle components imbalance are involved in malignant transformation of melan-a melanocytes and epigenetic machinery might contribute to these alterations. The therapeutic targets that focus on epigenetic machinery could be useful interventions against cancer. Besides that, the p53 protein interacts with one of the major components of the epigenetic machinery, dnmt1. This indicates that the components of cell cycle may regulate this enzyme and contribute for the maintenance of DNA methylation pattern. The miRNAs identified also represent strong candidates in the contribution of melanoma genesis. They may be useful as therapeutic targets on interventions against cancer. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: Leiomiomas uterinos ou miomas são tumores benignos que se desenvolvem no miométrio e acometem cerca de 50% da população feminina. Têm como principais sintomas, sangramento excessivo e dor pélvica inespecífica. Convencionalmente o estrogênio é considerado o responsável pelo início da proliferação tumoral, mas recentes evidências clínicas e bioquímicas sugerem que a progesterona apresenta um papel importante no desenvolvimento desses tumores. Além disso, mecanismos epigenéticos parecem estar envolvidos na etiologia dos leiomiomas uterinos, como a metilação de DNA e acetilação de histonas. Somente nos EUA são realizadas 240 mil histerectomias/ano para tratar essa doença sendo considerado um problema de saúde pública. Frente a esses dados é imprescindível o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento desses tumores e a busca de tratamentos menos invasivos. A mifepristona (RU 486), um modulador seletivo dos receptores de progesterona e glicocorticoides, é capaz de diminuir o tamanho dos tumores e amenizar os sintomas associados. Objetivos: verificar se (1) nos tecidos de leiomiomas uterinos e miométrio, os mecanismos epigenéticos como a metilação global do DNA e a acetilação de histonas estão alterados (2) se em cultura primária de leiomioma uterino e miométrio o tratamento com estradiol e progesterona é capaz de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B, assim como a atividade das enzimas histona acetiltransferase e desacetilase, e (3) se a mifepristona (RU 486) é capaz de modular diretamente a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B após tratamento com os hormônios estradiol e progesterona. Métodos: para análise de metilação global do DNA e acetilação de histonas foram utilizadas 25 amostras teciduais para cada grupo de leiomioma uterino e miométrio oriundos de pacientes submetidas à histerectomia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A metilação global do DNA e a atividade da enzima histona acetiltransferase foram dosadas pelo método de ELISA e a enzima histona desacetilase por detecção fluorimétrica. Para verificar o efeito dos hormônios sexuais ovarianos e o efeito da mifepristona (RU 486) sobre a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B foram realizadas 7 culturas primárias de leiomiomas uterinos e miométrio. Resultados: (1) Foram observadas hipermetilação (P = 0,022) e hipoacetilação (P = 0,04) em leiomiomas uterinos quando comparado ao miométrio. Não houve diferença estatística entre estes tecidos em relação à atividade da histona acetiltransferase. (2) Houve aumento da expressão gênica do receptor de progesterona total em cultura primária de leiomioma uterino quando tratado com estradiol (P = 0,028) e o receptor de progesterona B teve sua expressão aumentada quando tratado com estradiol, progesterona e estradiol + progesterona (P = 0,001). (3) O tratamento com mifepristona (RU 486) na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B em células de leiomiomas uterinos e miométrio. A atividade da enzima histona desacetilase foi maior nas células de leiomioma uterino quando tratadas com estradiol (P = 0,034) e estradiol + progesterona + RU 486 (P = 0,001) quando comparado às células de miométrio, já a atividade da enzima histona acetiltransferase não foi detectada, devido a sua baixa quantidade. Conclusão: Nesse estudo foi observado uma hipermetilação e hipoacetilação nos tecidos de leiomiomas uterinos. Esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos podem estar contribuindo para a diminuição transcricional de genes relacionados ao funcionamento normal do miométrio e, com isso, colaborando para o crescimento desses tumores. Além disso, nossos resultados sugerem que estradiol e progesterona são capazes de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B e o medicamento RU 486 na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir diretamente a expressão desses receptores. / Introduction: Uterine leiomyoma, also known as fibroids, is a smooth muscle cell tumor, and is clinically apparent in up to 50% of reproductive-age women. Clinical symptoms include abnormal uterine bleeding and pelvic pain. Estrogen has been considered a primary growth promoter of uterine leiomyoma, however clinical and biochemical evidence has suggested that progesterone plays a critical role in the development of these tumors. Furthermore, epigenetic modifications may be involved with etiology of theses tumors, through DNA methylation and histone acetylation. In the United States, 240.000 hysterectomies/year are performed to treat uterine leiomyomas which is being considered to be a public public health problem. The understanding of molecular mechanisms involved in the development of uterine leiomyoma may provide not only opportunities for a diagnostic, but also generation of novel therapeutic approaches. The mifepristone (RU 486), a synthetic steroid that has affinity for progesterone and glucocorticoid receptors has been reported to induce regression of uterine leiomyoma and reduce the symptoms. Objective: verify if (1) DNA global methylation and histone acetylation patterns are altered in uterine leiomioma tissue compared with myometrium; (2) the treatment with estradiol and progesterone are able to modulated de gene expression of total and B progesterone receptors and histone acetylation patterns in primary culture of uterine leiomyoma cells and myometrium as well as (3) the mifepristone (RU 486) are able to modulate the gene expression of total and B progesterone receptors after the treatment with ovarian steroids hormones. Methods: DNA global methylation and histone acetylation patterns were analyzed in 25 tissue samples from uterine leiomioma and myometrium. The DNA global methylation and the activity of histone acetyltransferase were performed using ELISA method. In order to evaluate histone deacetylase activity fluorimetric detection was used. To verify the effect of estradiol and progesterone on total and B progesterone receptors gene expression, as well as the influence of RU486 on this parameters, seven cultured cells from uterine leiomyoma and myometrium cells were performed. Results: (1) Hypermethylation (p = 0.022) and hypoacetylation (p = 0.04) in uterine leiomioma tissues compared with myometrium were observed. There was no statistic difference between these tissues in histone acetyltransferase activity. (2) We observed increased gene expression of total progesterone receptor in culture cells of uterine leiomyoma when treated with estradiol (p = 0.028). There was an increase of B progesterone receptor mRNA when treated with hormones, estradiol and progesterone (p = 0.001). The treatment with RU 486 was not able to modulate progesterone receptors. The histone desacetilase activity was elevated in uterine leiomyoma cells when treated with estradiol (p = 0.034) and estradiol + progesterone + RU 486 (p = 0.001). The histone acetyltransferase activity was barely detectable. Conclusion: In our study we found hypermethylation and hypoacetylation in uterine leiomyoma tissues suggesting that this process may lead to a decreased transcriptional activity of important genes associated with normal myometrium function contributing to the development of these tumors. Furthermore, our results suggest that ovarian steroids hormones increase progesterone receptors expression, being mifepristone (RU 486) at dose of 10-6M unable to decrease total and B progesterone receptors in uterine leiomyoma cells.

O peptídeo liberador de gastrina (GRP) age como potente mitógeno em tecidos neoplásicos pela ativação do seu receptor (GRPR), que é super expresso em estágios avançados de neuroblastoma humano. GRPR knockdown ou antagonistas de GRPR mostraram inibir o crescimento de neuroblastoma. Investigou-se, em condições experimentais, que os antagonistas de GRPR podem promover, em vez de inibir o crescimento de células de neuroblastoma. O antagonista do GRPR, RC-3095 em 0,1 nM inibiu, enquanto a concentração de 100 nM estimulou a proliferação de células de neuroblastoma murino Neuro2a, in vitro. Os efeitos proliferativos de RC -3095 no crescimento celular foram impedidos pelo inibidor de deacetilase de histona (HDI), butirato sódico (NAB). Estes resultados fornecem a primeira evidência de que um antagonista do GRPR pode estimular o crescimento de células cancerosas, e sugerem que o GRPR pode interagir com os mecanismos epigenéticos na regulação do crescimento de células do neuroblastoma.

Introdução: Leiomiomas uterinos ou miomas são tumores benignos que se desenvolvem no miométrio e acometem cerca de 50% da população feminina. Têm como principais sintomas, sangramento excessivo e dor pélvica inespecífica. Convencionalmente o estrogênio é considerado o responsável pelo início da proliferação tumoral, mas recentes evidências clínicas e bioquímicas sugerem que a progesterona apresenta um papel importante no desenvolvimento desses tumores. Além disso, mecanismos epigenéticos parecem estar envolvidos na etiologia dos leiomiomas uterinos, como a metilação de DNA e acetilação de histonas. Somente nos EUA são realizadas 240 mil histerectomias/ano para tratar essa doença sendo considerado um problema de saúde pública. Frente a esses dados é imprescindível o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento desses tumores e a busca de tratamentos menos invasivos. A mifepristona (RU 486), um modulador seletivo dos receptores de progesterona e glicocorticoides, é capaz de diminuir o tamanho dos tumores e amenizar os sintomas associados. Objetivos: verificar se (1) nos tecidos de leiomiomas uterinos e miométrio, os mecanismos epigenéticos como a metilação global do DNA e a acetilação de histonas estão alterados (2) se em cultura primária de leiomioma uterino e miométrio o tratamento com estradiol e progesterona é capaz de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B, assim como a atividade das enzimas histona acetiltransferase e desacetilase, e (3) se a mifepristona (RU 486) é capaz de modular diretamente a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B após tratamento com os hormônios estradiol e progesterona. Métodos: para análise de metilação global do DNA e acetilação de histonas foram utilizadas 25 amostras teciduais para cada grupo de leiomioma uterino e miométrio oriundos de pacientes submetidas à histerectomia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A metilação global do DNA e a atividade da enzima histona acetiltransferase foram dosadas pelo método de ELISA e a enzima histona desacetilase por detecção fluorimétrica. Para verificar o efeito dos hormônios sexuais ovarianos e o efeito da mifepristona (RU 486) sobre a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B foram realizadas 7 culturas primárias de leiomiomas uterinos e miométrio. Resultados: (1) Foram observadas hipermetilação (P = 0,022) e hipoacetilação (P = 0,04) em leiomiomas uterinos quando comparado ao miométrio. Não houve diferença estatística entre estes tecidos em relação à atividade da histona acetiltransferase. (2) Houve aumento da expressão gênica do receptor de progesterona total em cultura primária de leiomioma uterino quando tratado com estradiol (P = 0,028) e o receptor de progesterona B teve sua expressão aumentada quando tratado com estradiol, progesterona e estradiol + progesterona (P = 0,001). (3) O tratamento com mifepristona (RU 486) na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B em células de leiomiomas uterinos e miométrio. A atividade da enzima histona desacetilase foi maior nas células de leiomioma uterino quando tratadas com estradiol (P = 0,034) e estradiol + progesterona + RU 486 (P = 0,001) quando comparado às células de miométrio, já a atividade da enzima histona acetiltransferase não foi detectada, devido a sua baixa quantidade. Conclusão: Nesse estudo foi observado uma hipermetilação e hipoacetilação nos tecidos de leiomiomas uterinos. Esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos podem estar contribuindo para a diminuição transcricional de genes relacionados ao funcionamento normal do miométrio e, com isso, colaborando para o crescimento desses tumores. Além disso, nossos resultados sugerem que estradiol e progesterona são capazes de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B e o medicamento RU 486 na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir diretamente a expressão desses receptores. / Introduction: Uterine leiomyoma, also known as fibroids, is a smooth muscle cell tumor, and is clinically apparent in up to 50% of reproductive-age women. Clinical symptoms include abnormal uterine bleeding and pelvic pain. Estrogen has been considered a primary growth promoter of uterine leiomyoma, however clinical and biochemical evidence has suggested that progesterone plays a critical role in the development of these tumors. Furthermore, epigenetic modifications may be involved with etiology of theses tumors, through DNA methylation and histone acetylation. In the United States, 240.000 hysterectomies/year are performed to treat uterine leiomyomas which is being considered to be a public public health problem. The understanding of molecular mechanisms involved in the development of uterine leiomyoma may provide not only opportunities for a diagnostic, but also generation of novel therapeutic approaches. The mifepristone (RU 486), a synthetic steroid that has affinity for progesterone and glucocorticoid receptors has been reported to induce regression of uterine leiomyoma and reduce the symptoms. Objective: verify if (1) DNA global methylation and histone acetylation patterns are altered in uterine leiomioma tissue compared with myometrium; (2) the treatment with estradiol and progesterone are able to modulated de gene expression of total and B progesterone receptors and histone acetylation patterns in primary culture of uterine leiomyoma cells and myometrium as well as (3) the mifepristone (RU 486) are able to modulate the gene expression of total and B progesterone receptors after the treatment with ovarian steroids hormones. Methods: DNA global methylation and histone acetylation patterns were analyzed in 25 tissue samples from uterine leiomioma and myometrium. The DNA global methylation and the activity of histone acetyltransferase were performed using ELISA method. In order to evaluate histone deacetylase activity fluorimetric detection was used. To verify the effect of estradiol and progesterone on total and B progesterone receptors gene expression, as well as the influence of RU486 on this parameters, seven cultured cells from uterine leiomyoma and myometrium cells were performed. Results: (1) Hypermethylation (p = 0.022) and hypoacetylation (p = 0.04) in uterine leiomioma tissues compared with myometrium were observed. There was no statistic difference between these tissues in histone acetyltransferase activity. (2) We observed increased gene expression of total progesterone receptor in culture cells of uterine leiomyoma when treated with estradiol (p = 0.028). There was an increase of B progesterone receptor mRNA when treated with hormones, estradiol and progesterone (p = 0.001). The treatment with RU 486 was not able to modulate progesterone receptors. The histone desacetilase activity was elevated in uterine leiomyoma cells when treated with estradiol (p = 0.034) and estradiol + progesterone + RU 486 (p = 0.001). The histone acetyltransferase activity was barely detectable. Conclusion: In our study we found hypermethylation and hypoacetylation in uterine leiomyoma tissues suggesting that this process may lead to a decreased transcriptional activity of important genes associated with normal myometrium function contributing to the development of these tumors. Furthermore, our results suggest that ovarian steroids hormones increase progesterone receptors expression, being mifepristone (RU 486) at dose of 10-6M unable to decrease total and B progesterone receptors in uterine leiomyoma cells.