A sinalização da resposta Imune Inata exerce um papel fundamental na eliminação de patógenos bem como no recrutamento de progenitoras para recuperação de tecidos nervosos lesionados. Nossos estudos iniciais que buscavam a compreensão desta participação da atividade inflamatória na neurorregeneração e degenerção do OE constataram que a administração tópica de lipopolissacarídeo (LPS) gera perda de seus neurônios olfatórios (OSNs), enquanto que camundongos deficientes do gene Myd88 apresentam uma taxa de reposição neuronal pós-lesão mais elevada que a de selvagens e o uso consecutivo de DEX retarda a neurorregeneração olfatória em curto prazo. Prosseguimos agora no esclarecimento destes resultados em três vertentes: A primeira busca descrever as respostas do OE de animais selvagens e trangênicos Tlr4-/-, Myd88-/-, Ticam1-/-, Il1r1-/-, Casp1-/-/Casp4-/- e Casp1-/-/Casp4-/-/Casp4tg a estímulos inflamatórios provenientes de infusões intranasais de ligantes e citocinas recombinantes envolvidas na sinalização dos TLRs. Isto através de análises histológicas por marcação nuclear e análise da espessura e alterações anatômicas do OE, e da expressão de IL1b e Nf&#954bia por hibridização in situ (ISH), ou ainda pela contagem de suas células TUNEL-positivas pós-tratamento. Neste estudo propomos ainda um modelo de lesão para estudos de neurorregenereração através da análise por imunofluorescência (IF) de OSNs em função do tempo após uma infusão intranasal (IN) de LPS. A segunda analisa por microarranjos de oligonucleotídeos (microarray) as alterações de expressão gênicas associadas à ausência do gene Myd88 no OE pós-lesão seguida de análises histológicas de sua regeneração em camundongos com deleções em genes selecionados. Por fim o terceiro estudo investiga a degeneração e a neurorregeneração do OE sob o efeito do uso tópico consecutivo de DEX. O corticoide é co-aplicado topicamente com um insulto inflamatório para avaliar o seu efeito preventivo e consecutivamente por três dias em dois modelos de lesão para avaliar sua interferência na neurorregeneração 14 dias após o tratamento. Foram realizadas IF para quantificação dos volumes neuronais, espessura do OE, proliferação celular, síntese proteica e morte celular por TUNEL. O uso tópico de LPS promove a degeneração do OE via TLR4 a partir de regiões com expressão de Il1b e Nf&#954bia e número de células TUNEL elevada. Este efeito é via MyD88-dependente sem a participação da TRIF-dependente. O gene Myd88 é tão crucial nesta degeneração do epitélio quanto na gerada por rmIL-1β e rmTNFα. Sua ausência não promove citoproteção contra o gás NO. Possivelmente, CASP1 e IL-1R estejam também envolvidos. O modelo de lesão imunológica para estudos de neurorregeneração é rápido e eficaz. A ausência do gene Myd88 acompanha uma redução na expressão da enzima degradadora de insulina (IDE) no OE pós-lesão. Camundongos que não a expressam apresentam uma reposição celular do epitélio mais rápida. A co-IN de DEX com LPS impede a degeneração do OE. 10µl deste corticoide a 40ng/µl administrada por IN não é tóxica a este epitélio, porém seu uso consecutivo em curto prazo promove aberrações anatômicas nos modelos de lesão imunológica, além de interferir na sua dinâmica de reposição neural, elevação da taxa de síntese proteica e proliferação celular, sem alterar a diferenciação, após lesão induzida por metimazol. / The innate immune response signaling plays a key role in the elimination of pathogens and in the recruitment of new cells to recover the injured nervous tissues. Our preliminary studies on the roles of the inflammatory activity in OE degeneration and neuroregeneration process showed that the topical administration of lipopolysaccharide (LPS) generates the loss of olfactory sensorial neurons (OSNs), Myd88 gene-deficient mice exhibit a higher neuronal replacement rate after injury than wild-type mice, and that the consecutive use of DEX provokes retarding olfactory neuroregeneration over the short term. We seek now to clarify these results in three ways: The first describes the OE response in wild-type animals Tlr4-/-, Myd88-/-, Ticam1-/-, Il1r1-/-, Casp1-/-/Casp4-/- and Casp1-/-/Casp4-/-/Casp4tg animals to inflammation through the intranasal infusion (IN) of ligands and cytokines associated with Toll-Like Receptors (TLR) signaling. This was acomplished through histological analysis of the thickness and anatomical changes in DAPI stained OE, Il1b and Nfκbia expression analysis by in situ hybridization (ISH), and TUNEL-positive cells counting after treatment. In this study we propose an inflammatory lesion for neuroregeneration studies using immunofluorescence (IF) analysis of the OE in function of time after the intranasal infusion of LPS. The second part analyzes the Myd88 gene loss in the OE gene expression of after a lesion using microarray. This is followed by the histological analysis of regeneration using IF in transgenic mice with the deletion of specific genes (microarray versus literature review). Finally, the third study evaluates the OE degeneration and neuroregeneration under the influence of consecutive topical use of the DEX. The corticosteroid is co-administered with the inflammatory stimulus in order to evaluate its protective effect and consecutively for three days in two models of lesion to assess their influence on neuroregeneration 14 days after treatment. The IF analysis was performed in order to quantify the neuronal volumes, the thickness of the OE, cell proliferation, protein synthesis (by incorporation the identification of puromycin) and cell death by TUNEL. The topical use of LPS promotes the degeneration of OE by TLR4 from sites that feature an overexpression of Il1b and Nfκbia and a high number of TUNEL-positive cells. This effect is MyD88-dependent. The Myd88 gene is as crucial in this degeneration of the epithelium as in those generated by rmIL-1β and rmTNFα. Their absence does not promote cytoprotection against the cytotoxic gas nitric oxide (NO). It is possiby that CASP1 and IL-1R are also involved. The immunologic lesion model for neuroregeneration studies is fast and effective. The absence of Myd88 gene reduces the expression of insulin-degrading enzyme (IDE) in the post-lesion OE. Mice without this enzyme show a rapid cellular restoration in the epithelium. The Co-IN of DEX with LPS prevents the degeneration EO. The doses adopted by us are nontoxic; however its short-term consecutive use promotes anatomical aberrations in the immunological lesion model, and interferes with the dynamics of neural replacement by impairing both the rate of protein synthesis and proliferation of the epithelium without halting their differentiation.

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

A combustão do diesel (DEP) é a principal fonte de partículas ultrafinas (PUFs) relacionadas à poluição causada pelo tráfego. Indivíduos com doenças respiratórias crônicas estão propensos a exacerbações durante a exposição à poluição ambiente. Este estudo avaliou os efeitos de exposição subcrônica a uma baixa dose de partículas de combustão de diesel (DEP). 90 camundongos machos BALB/c foram divididos em 3 grupos: (a) Controle: instilação nasal de solução salina (n = 30); (b) DEP15: 15?g de DEP/10?l de solução salina (n = 30); e (c) DEP30: 30?g de DEP/10?l de solução salina (n = 30) durante cinco dias por semana, por 30 e 60 dias. Os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio (50mg/kg ip) e sacrificados por exanguinação. A contagem de células inflamatórias e as concentrações de interleucinas (IL) -4, -10, -13 e -17 no lavado broncoalveolar (LBA) foram avaliadas por ensaio imunoenzimático (Elisa). mRNA da MUC5ac foi avaliado por PCR em tempo real. A análise histológica do septo nasal e bronquíolos foi realizada para avaliar: (a) a espessura do epitélio brônquico e nasal, (b) o conteúdo de muco neutro e ácido na mucosa nasal. Nossos resultados mostraram que a instilação de DEP30 após 30 dias aumentou o número de células inflamatórias totais em relação ao controle (p=0,033). Ao comparar os resultados de DEP30 com o grupo Controle após 60 dias observamos os seguintes aumentos: (a) na expressão de MUC5AC nos pulmões (p = 0,016), no conteúdo de muco ácido no septo nasal (p = 0,017), nas células inflamatórias totais no LBA (p<0,001), no número de macrófagos no LBA (p=0,035) e na espessura do epitélio nasal (p=0,042). Nossos dados sugerem que dose baixa de DEP induz inflamação do trato respiratório com padrão tempo-dependente. / Diesel exhaust is the major source of ultrafine particles (UFPs) in trafficrelated pollution. Subjects with chronic respiratory diseases have great risk of exacerbations during exposure to air pollution. This study evaluated the effects of sub-chronic exposure to a low dose of diesel exhaust particles (DEPs). Ninety male BALB/c mice were divided into 3 groups: (a) Control: nasal saline instillation (n=30); (b) DEP15: nasal instillation of 15?g of DEP/10?l of saline (n=30); and (c) DEP30: nasal instillation of 30?g of DEP/10?l of saline (n=30). Nasal instillations were performed five-days a week, during 30 e 60 days. Animals were anesthetized with pentobarbital sodium (50mg/kg i.p), and sacrificed by exsanguination. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed to assess inflammatory cell count and concetrations of interleukin (IL)-4, -10, -13 and -17 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The RNAm MUC5ac gene expression was evaluated by real-time PCR. Histological analysis in nasal septum and bronchioles assessed: (a) bronchial and nasal epithelium thickness (b) acidic and neutral nasal mucous content. Our results showed that the instillation of DEP30 after 30 days increased the number of total inflammatory cells, as compared to the Control group (p = 0.033). The results of DEP30 after 60 days showed increases in: (a) the expression of MUC5AC in the lungs (p = 0.016); (b) acidic mucus production in the nasal septum (p = 0.017); (c) total inflammatory cells in the BAL fluid (p <0.001); (d) the number of macrophages in BALF (p = 0.035); and (d) nasal epithelium thickness (p = 0.042), as compared with control after 60 days. Our data suggest that a low dose of DEP induces inflammation of the respiratory tract in a time- dependent manner.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eliasnaimkassis_tese.pdf: 1206838 bytes, checksum: 890b2f6915170e129c35065467aeb0f2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-11 / The ingestion of alcohol by a mother during lactation changes the composition of the milk, resulting in the origin of ethanol and acetaldehyde in the milk, and turns more severe the effects of the ethanol in infant rats. Objective: This work aimed to study the effects of ethanol at the palatine bone and palatine epithelium of young infants in 21 days of postnatal life, administered to the experimental rats during lactation. Materials and Methods: The experimental rats received ethanol at 20% in the drinking fountain ad libitum during those 21 day of nursing. Another group of animals received an amount of water similar to that group without ethanol. The infant rats were put to death with an extra dose of anesthesia in their 21 days of life. Their heads were separated from their body, put in 85mls of a 80% alcohol solution, 10 ml of formalin and 5ml of acetic acid, the palate area was cut in serial sections by frontal plans, in the same level were the molar are located, the cuts were about 6 micrometers and were treated with hematoxylin-eosin. The nuclear parameters of the palate epithelium, the cytoplasmatic volume and cellular, the relation nucleon/cytoplasm, numerical density and superficial, the thickness of the epithelium were all estimate. The average body weight of the infant rats in the ethanol group was 20,20 g and the other group average weight was 34,86gr. Histologically, the palate epithelium was thinner and it had more numbers of smaller cells with a bigger nucleon. The palate bone had more delicate and less trabeculo calcificated, and smaller osteocyte. Conclusion: In this experiment, the ethanol induced a epithelial hypotrophy condition and palate bone more delicate and less calcificated, showing a direct affect in the cells and trabeculo palate and also the poor development of the intoxicated infant rats. / A ingestão materna de etanol durante a lactação altera a composição do leite, resulta no aparecimento do etanol e acetaldeído no leite, e exacerba os efeitos do etanol nos filhotes da rata. Objetivo: Este trabalho teve o objetivo de estudar os efeitos do etanol, ao epitélio palatino e osso palatino de filhotes lactantes em 21 dias de vida pós-natal, administrados nas ratas-mães durante a lactação. Materiais e Métodos: Para tal, foram utilizadas ratas que receberam etanol a 20% no bebedouro ad libitum durante os 21 dias de lactação. Os animais controles receberam um volume similar de água sem álcool. Os filhotes foram sacrificados com sobre dosagem anestésica no 21º dia. As cabeças foram separadas, fixadas em solução fixadora de álcool 80%- 85ml, formalina- 10 ml e ácido acético- 5ml, a região palatina foi seccionada seriadamente em planos frontais, ao nível dos molares, e os cortes de 6 micrometros foram tratados com hematoxilina-eosina . Os parâmetros nucleares do epitélio palatino foram estimados, assim como os volumes citoplasmáticos e celulares, relação núcleo/citoplasma, densidades numérica e superficial, e espessura epitelial. O peso corporal médio do filhote foi de 34,86 g no grupo controle e 20,20 g no tratado. Histologicamente, o epitélio palatino mostrou-se mais adelgaçado, constituído de células abundantes e menores com núcleos maiores. O osso palatino mostrou trabéculas mais delicadas e menos calcificadas e com osteócitos de menor tamanho. Conclusões: Neste experimento, o etanol, induziu no quadro de hipotrofia epitelial e osso palatino mais delicado e pouco calcificado, indicando uma ação direta nas células e trabéculas do palato, além de retardar o desenvolvimento de filhotes intoxicados.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-11-14T17:53:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AvaliacaoAtividadeGonadal.pdf: 3734747 bytes, checksum: c8292253197827b92c34de2888dee135 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-11-19T16:25:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AvaliacaoAtividadeGonadal.pdf: 3734747 bytes, checksum: c8292253197827b92c34de2888dee135 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-19T16:25:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AvaliacaoAtividadeGonadal.pdf: 3734747 bytes, checksum: c8292253197827b92c34de2888dee135 (MD5) Previous issue date: 2006 / Fêmeas e machos adultos de P. squamosissimus (Pisces, Teleostei, Sciaenidae) foram coletados mensalmente no Rio Pará, que banha a ilha do Capim (PA) (S 010 34. 971`; W 0480 52.932`), durante o período de fevereiro de 2004 a fevereiro de 2005, correspondendo ao total de 234 espécimes. As gônadas foram coletadas, fixadas e processadas de acordo com os métodos usuais utilizados para processamento em parafina e análise em microscopia de luz. A espécie em estudo é uma das principais fontes de proteína animal para a população local, sendo capturada de forma intensa e ininterrupta ao longo do ano. Com base em informações dos pescadores locais, essa captura parece estar determinando uma aparente diminuição quantitativa e qualitativa em seus estoques locais. A espécie apresenta desova parcelada e o desenvolvimento gonadal foi caracterizado nos estádios de repouso, maturação, maduro e esvaziado ou semi-esvaziado. Gônadas maduras foram encontradas nos meses de dezembro, janeiro e julho. A análise de correlação entre o estádio gonadal maduro e a variação temporal da relação gonadossomática (ΔRGS) indica também a ocorrência de desova nos respectivos meses. Não obstante, as informações obtidas da correlação entre a ΔRGS e a média de oócitos maduros e percentual de espermatozóides por túbulo seminífero, respectivamente, também indicaram haver desova nos respectivos meses, sendo que aparentemente a espécie apresenta uma desova mais intensa ou desova principal entre os meses de dezembro e janeiro (inverno), e outra desova menos intensa ou secundária no mês de julho (verão). Com base no método da morfologia tubular, foram determinados oito estádios do ciclo do epitélio seminífero (CES), sendo que no estádio 1 os túbulos seminíferos são compostos por espermatogônias primárias e cistos de spermatogônias secundárias; o estádio 2 é composto por espermatogônias primárias e secundárias e cistos de espermatócitos; estádio 3 é caracterizado por espermatogônias primárias, secundárias, cistos de espermatócitos e de espermátides jovens ou recém-formadas; estádio 4 com túbulos seminíferos caracterizados pela presença de espermatogônias primárias e secundárias, espermatócitos e por cistos de espermátides jovens e tardias; estádio 5 apresenta todas as células anteriores e é marcado pelo surgimento de espermatozóides no lúmen tubular; estádio 6 tem como características a diminuição dos cistos de células germinativas e considerável aumento do número de espermatozóides no lúmen tubular; os túbulos seminíferos no estádio 7 contêm poucos cistos de células germinativas e se inicia o esvaziamento da massa de espermatozóides do lúmen tubular; estádio 8 é o último do CES e é caracterizado pela aparente desorganização dos cistos remanescentes de células germinativas no túbulo seminífero. / Male and female adults of P. squamosissimus (Pisces, Teleostei, Sciaenidae) were collected monthly in the Para River that surrounds Capim insland, state of Para (S 010 34. 971` ; W 0480 52.932`), during the month of february 2004 to february 2005, having 234 specimes. The gonads were collected, mounted and processed in accordance with the standard methods of paraffin and analysis using a light microscope. The species under analysis is one of the principal sources of animal protein for the local population, fishing being uninterrupted and intensive throughout the year based on information given by local fisherman, the collection process appears to be determined by an apparent qualiquantitative reduction in local stock. The species represents spawn divisions, the gonad development was characterized in state of repose, maturation, mature and empty or half-empty. Mature gonads were found on the months of december, january and july. Correlation analysis between the maturing state of gonads, seasonal variations in relation to gonadosomatic indexes (GSI) and also the occurrence of spawn in the respective months. Nevertheless, the information obtained in correlation to GSI and mature oocyte mediums and between spermatozoa percentages by seminiferous tubule, respectively, also indicate spawning in the respective months, and apparently that the species represents a more intensive spawning period or a primary spawning period between the months of december and january, and a second or less intensive spawning period in the months of july. Based on the tubular morphology method, eight of the seminiferous epithelium cycle stages (SEC) were determined, stage 1 being seminiferous tubule that are comprised of primary spermatogonia and cysts of the secondary spermatogonia; stage 2 is comprised of primary and seconday spermatogonia and spermatocytes cysts; stage 3 is characterized by primary and secondary spermatogonias, spermatocyte cysts and young spermatids; stage 4 with seminiferous tubule characterized by presence of spermatogonias primary and secondary, spermatocyte and by presence of young and later spermatids cysts; stage 5 represents all of the previously mentioned cells and is highlighted by presence of spermatozoa in the tubule lumen; stage 6 is characterized by reduction of cysts of germinative cells and a considerable increase in number of spermatozoa in the tubular lumen; stage 7 is characterized by seminiferous tubule that contain few cysts of germinative cells and is marked by the begining of a mass emptying of spermatozoa of the tubule lume; stage 8 is the last of the SEC and is characterized by the apparent disorganization of the remaining germinative cellular cysts in the seminiferous tubule.

Alguns estudos sugerem que as pequenas vias aéreas têm um papel importante na fisiopatologia da lesão pulmonar aguda/ síndrome do desconforto respiratório agudo (LPA/SDRA). O epitélio respiratório que reveste as vias aéreas é capaz de liberar mediadores inflamatórios e está relacionado ainda com a produção de surfactante nas vias aéreas. Até o presente momento, existem poucos estudos que avaliaram se estas funções do epitélio que reveste as pequenas vias aéreas encontram-se alteradas na SDRA. No presente estudo, nós mensuramos a expressão da proteína de surfactante (PS) A e PS-B, a expressão de citocinas inflamatórias interleucina (IL)-6 e IL-8, e um índice de apoptose do epitélio que reveste as pequenas vias aéreas de pacientes com SDRA que foram submetidos a autópsia e comparamos estes resultados com os de indivíduos controle. Foram incluídos no estudo pulmões de autópsia de 31 pacientes com SDRA (PaO2/FiO2200, 45±14 anos, 16 homens) e 11 controles (52±16 anos, 7 homens). A expressão de IL-6, IL-8, PS-A e PS-B no epitélio das pequenas vias aéreas (diâmetro2.0mm) foi verificada através de reações de imunohistoquímica e análise de imagem. O índice de apoptose epitelial das vias aéreas foi avaliado através do método de TUNEL e da expressão de FAS/FASL. Avaliou-se ainda a densidade de células inflamatórias positivas para IL-6 e IL-8 na parede das pequenas vias aéreas. As vias aéreas dos pacientes com SDRA apresentaram maior expressão epitelial de IL-8 (p=0,006) e maior densidade de células inflamatórias expressando IL-6 (p=0,004) e IL-8 (p<0,001) quando comparadas com o grupo controle. Não houve diferenças na expressão epitelial de PS-A e PS-B ou no índice de apoptose epitelial entre os grupos SDRA e controle. Nossos resultados mostram que as pequenas vias aéreas participam da inflamação pulmonar de pacientes com SDRA, caracterizada pelo aumento na expressão de interleucinas próinflamatórias tanto em células inflamatórias da parede da via aérea quanto no epitélio. Nossos resultados sugerem ainda que a apoptose não é um mecanismo importante de morte de células epiteliais das vias aéreas de pacientes com SDRA / Recent studies suggest a role for distal airway injury in the pathophysiology of human ALI/ARDS. The epithelium lining the airways modulates airway function secreting a large number of molecules such as surfactant components and inflammatory mediators. So far, there is little information on how these secretory functions of the small airways are altered in ARDS. In the present study we assessed the airway expression of surfactant protein (SP) A and SP B, the expression of inflammatory cytokines IL-6 and IL-8, and an index of airway epithelial apoptosis of patients with ARDS submitted to autopsy and compared the results with those of control subjects. We studied autopsy lungs of 31 ARDS patients (PaO2/FiO2200, 45±14 years, 16 males) and 11 controls (52±16 years, 7 males). Using immunohistochemistry and image analysis, we quantified the expression of IL-6, IL-8 and SP-A and SP-B in the epithelium of small airways (diameter2.0mm). Airway epithelial apoptosis index was obtained with the TUNEL assay and FAS/FASL expression. We also quantified the density of inflammatory cells expressing IL-6 and IL-8 within the small airway walls. ARDS airways showed an increase in the epithelial expression of IL-8 (p=0.006) and an increased density of inflammatory cells expressing IL-6 (p=0.004) and IL-8 (p<0.001) when compared to controls. There were no differences in SP-A and SP-B epithelium expression or in epithelial apoptosis index between ARDS and controls. Our results show that the distal airways are involved in ARDS lung inflammation with higher expression of pro-inflammatory interleukins in both airway epithelial and inflammatory cells. Our results also suggest that apoptosis is not a major mechanism of airway epithelial cell death in ARDS

Os tumores odontogênicos benignos compreendem um grupo de neoplasias originárias dos tecidos dentários. Pesquisas vêm buscando identificar moléculas envolvidas nos mecanismos moleculares que regulam a remodelação da matriz extracelular (MEC) e como isto influencia no comportamento localmente invasivo presente em alguns destes tumores. A Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM conversão do fenótipo epitelial em mesenquimal) é bem caracterizada em diversos carcinomas, culminando em mestástase. MMPs são enzimas que degradam os componentes da MEC, geram moléculas bioativas, participam da TEM e o controle da remodelação da MEC dá-se pelo balanço entre elas, seus inibidores (TIMPs e RECK) e seu ativador (EMMPRIN). Assim, o objetivo deste trabalho foi delinear o perfil de expressão das MMPs (-2, -7, -9 e -14), seus inibidores (TIMPs -2, -3, -4 e RECK), seu ativador (EMMPRIN) e marcadores da TEM (Snail, Slug, N-caderina, Fibronectina, a-Actina de músculo liso e Vimentina) em Ameloblastomas (AB) e Tumores Odontogênicos Cístico Calcificantes (TOCC). Ainda, realizamos a comparação da expressão de cada molécula avaliada em cada compartimento celular (epitélio e estroma) e correlação entre as moléculas avaliadas no mesmo tumor. Utilizamos 19 casos de AB e 18 casos de TOCC (Serviço de Anatomia Patológica da FOUSP), localização das enzimas/proteínas por imunoistoquímica e analisadas nos compartimentos epitelial e estromal. Todas as proteínas/enzimas analisadas foram detectadas tanto nos AB quanto nos TOCC, sendo a maioria expressa em ambos os compartimentos. A N-caderina foi localizada apenas no epitélio dos AB e a Vimentina somente no estroma em ambos os tumores. Na comparação entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Vimentina, Snail e Slug. Na comparação entre o epitélio x estroma dos TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentina, N-caderina, Snail e Slug. Assim, entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas e TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, Vimentina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Snail e Slug. Esta é a primeira vez que a EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, Ncaderina, Snail e Slug são descritas em TOCC e TIMP-3, TIMP-4, Snail e Slug em ameloblastomas. Concluímos que estas proteínas/enzimas estão diferencialmente expressas tanto no epitélio quanto no estroma destes tumores e sugerimos que estes podem participar do comportamento localmente invasivo. / Odontogenic tumors comprise a group of benign neoplasms originating from dental tissues. Research looking for identify molecules involved in the molecular mechanisms that regulate extracellular matrix remodeling (ECM) and how this impacts on locally invasive behavior present in some of these tumors. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT - conversion of epithelial phenotype into mesenchymal phenotype) is well characterized in several carcinomas, leaving to metastasis. MMPs are enzymes that degrade ECM components, generate bioactive molecules, participating in the EMT and control ECM remodeling is given by the balance between them, their inhibitors (TIMPs and RECK) and its activator (EMMPRIN). The aim of this study was evaluate expression profile of MMPs (-2, -7, -9 and - 14), their inhibitors (TIMPs -2, -3, -4 and RECK), its activator (EMMPRIN) and EMT markers (Snail, Slug, N-cadherin, Fibronectin, -smooth muscle actin and Vimentin) in ameloblastomas (AB) and Calcifying Cystic Odontogenic Tumor (CCOT). We also compared the expression of each molecule assessed in each cellular compartment (epithelium and stroma) and correlation between molecules evaluated in the same tumor. We used 19 AB cases and 18 CCOT cases from files of Pathology Laboratory (FOUSP), localization of enzymes/proteins and analyzed by immunohistochemistry in epithelial and stromal compartments. All proteins/enzymes were detected in both AB and CCOT, mostly expressed in both compartments. N-cadherin was localized only in the epithelium of AB and Vimentin only in stromal in both tumors. Comparing \"epithelium vs stroma\" of AB, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, -smooth muscle actin, N-cadherin, Vimentin, Snail and Slug. Comparing \"epithelium vs stroma\" of CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentin, N-cadherin, Snail and Slug. Analizing epithelium vs stroma\" between AB and CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, Vimentin , -smooth muscle actin, N-cadherin, Snail and Slug. This is the first time that EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, N-cadherin, Snail and Slug are described in CCOT and TIMP-3, TIMP-4, Snail and Slug in AB. We conclude that these proteins/enzymes are differentially expressed in both epithelium and stroma of these tumors and suggest that they may participate locally invasive behavior.

Submitted by CAMILA LEONEL DA SILVA null (camilaleonels_1@hotmail.com) on 2016-05-02T19:33:26Z No. of bitstreams: 1 TESE - Camila Leonel da Silva.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T19:19:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_cl_dr_sjrp.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T19:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_cl_dr_sjrp.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) Previous issue date: 2016-04-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A transição epitélio-mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual as células cancerosas a partir de tumores primários passam por uma conversão fenotípica para invadir e migrar, gerar metástases em tecidos ou órgãos distantes. Este processo pode ser induzido por fatores de crescimento, tais como Fator de Crescimento Transformante beta (TGF-β) e sua alta expressão tem sido implicada na angiogênese tumoral, na migração e invasão celular em muitos tipos de tumores. A expressão de ROCK-1 está associada com a malignidade dos tumores, enquanto a inibição desta molécula resulta em uma supressão significativa de metástases tumorais. A metformina, um fármaco utilizado no tratamento da diabetes, demonstrou inicialmente inibir a EMT e impedir o fenótipo mesenquimal pela repressão transcricional de pontos chave da regulação da EMT (ZEB1, TWIST1, SNAIL2, TGF-β) em células de câncer de mama. Os objetivos foram avaliar a expressão gênica e proteica de marcadores relacionados a metástase, em um estudo in vitro e in vivo, em linhagens de câncer de mama, após o tratamento com metformina, além do silenciamento gênico do TGF-β1 para inibição da transição epitélio-mesenquimal. Foi realizado a transfecção da linhagem celular metastática de tumor mamário canino CF41 de forma estável após a construção de um pequeno RNA de interferência para desenvolver derivados clonais que expressam níveis reduzidos de TGF-β1 (células TGF-β1sh). Este foi subsequentemente combinado com o tratamento com metformina, para analisar os efeitos sobre a migração de células, assim como a expressão dos marcadores de EMT E-caderina e N-caderina, quantificados através de imunofluorescência e do qRT-PCR. As linhagens mamárias humanas MCF-7 (não-metastática) e MDA-MB-231 (metastática) foram tratadas com metformina e inibidor Y27632, após a indução da EMT por TGF-β1 para examinar os efeitos sobre a migração destas células, bem como a expressão proteica dos marcadores ROCK-1, vimentina, E-caderina, CD44 e CD24 por imunocitoquímica. Em um estudo in vivo, as células não modificadas CF41 ou que expressam TGF-β1 shRNA foram injetadas na região inguinal de camundongos fêmea nude atímicos tratados com metformina. Os camundongos foram eutanasiados após o tratamento e os pulmões foram recolhidos para avaliação do número de metástases. As regiões metastáticas foram subsequentemente avaliadas pela expressão de N-caderina, E-caderina, vimentina e claudina-7 através da imuno-histoquímica. Foi possível avaliar que a taxa de migração e invasão foi menor em células TGF-β1sh, em comparação com as células parentais CF41 e esta inibição foi significativa quando combinado com o tratamento com metformina. As análises in vitro demonstraram que o tratamento com metformina reduziu a expressão de N-caderina e aumentou a expressão de E-caderina nas células CF41 e TGF-β1sh. Os resultados demonstram também que após a indução do TGF-β1 nas linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 houve menor expressão das proteínas ROCK-1, vimentina, CD44 e CD24 em ambas as linhagens após tratamento com metformina e Y27632. Nas células MDA-MB-231 a expressão de E-caderina foi maior em todos os grupos de tratamento. O tratamento da linhagems MDA-MB-231 com metformina e Y27632 reduziu significativamente a invasão destas células. O estudo in vivo demonstrou que o tratamento com metformina reduziu o número de metástases pulmonares em animais portadores de tumores induzidos com as células TGF-β1sh. Houve diminuição da expressão de marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina, e aumento da expressão de marcadores epiteliais E-caderina e claudina-7 nas metástases pulmonares. Assim, concluimos que este estudo confirma os benefícios do silenciamento do TGF-β1, além do tratamento com metformina e Y27632 como potenciais agentes terapêuticos em tumores de mama, bloqueando o processo de EMT e seu potencial metastático. / Epithelial mesenchymal transition (EMT) is the process by which cancer cells from primary tumors pass through a phenotypic conversion to invade and migrate, generating metastases in organs or tissues distant. This process can be induced by growth factors such as transforming growth factor beta (TGF-β) and its overexpression has been implicated in tumor angiogenesis, cell migration and invasion in many cancers. ROCK-1 expression is associated with the malignant character of tumors, while inhibiting this molecule results in a significant suppression of tumor metastasis. Metformin, a drug use for the treatment of diabetes, was previously shown to inhibit EMT by suppressing expression of key transcription factors in breast cancer cells. The aims were to evaluate the gene expression and protein expression of related markers metastasis, in a study in vitro and in vivo in breast cancer cell lines after treatment with metformin in addition to the gene silencing of TGF-β1 for inhibiting epithelial-mesenquimal transition. These aims were contemplated performing transfected of canine metastatic mammary tumor cell line CF41 with small interfering RNA constructs to develop clonal derivatives expressing reduced levels of TGF-β1 (TGF-β1sh cells). This was subsequently combined with metformin treatment, to look at effects on cell migration, as well as the expression of the EMT markers E-cadherin and N-cadherin, which were quantified by immunofluorescence and qRT-PCR. MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines were treated with metformin and Y27632, after induction of EMT by TGF-β1, to examine the effects on cell migration as well as the protein expression of the ROCK-1 markers, vimentin, E-cadherin, CD44 and CD24 by immunocitochemistry. In an in vivo study, unmodified or TGF-β1 shRNA-expressing CF41 cells were injected in the inguinal region of nude athymic female mice that were treated with metformin. Mice were sacrificed after treatment and the lungs were collected to assess the number of metastases. Metastatic nodules were subsequently assessed for, N-cadherin, E-cadherin, vimentin and claudin-7 expression via immunohistochemistry. With the obtained results it was possible to assess the migration and invasion rate was lower in TGF-β1sh cells as compared to parental CF41 cells and this inhibition was significant when combined with metformin treatment. In vitro analyses demonstrated that metformin treatment reduced n-cadherin expression and increased E-cadherin expression in both CF41 and TGF-β1sh cells. After TGF-β1 induction in MDA-MB231 and MCF-7 cell lines, there was a lower protein expression of ROCK-1, vimentin, CD44 and CD24 in both cell lines after treatment with metformin and Y27632. In MDA-MB-231 cells, E-cadherin expression was increased in all treatment groups. Treatment of MDA-MB-231 cell line with metformin and Y27632 significantly reduced the invasion of these cells. In vivo studies demonstrated that metformin treatment reduced the number of lung metastases in animals bearing TGF-β1sh tumors. This paralleled a decreased expression of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin, and increased expression of epithelial markers E-cadherin and claudin-7 in lung metastases.This study confirms the benefits of TGF-β1 silencing in addition to metformin and Y27632 as potential therapeutic agents in mammary tumors, by blocking EMT process and metastatic potential. / FAPESP: 2012/09778-1

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1681295 bytes, checksum: 41cbc7f4bb36b7a1d7c8d9f98b41a88f (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The coati (Nasua nasua) belonging the order Carnivora and the family Procyonidae, does not configure the List of species in Brazilian fauna threatened of extinction from the Ministry of the Environment. On the contrary, its unstoppable population growth near urban areas has been causing economic, environmental and sanitary problems. The detailed study about reproductive characteristics of this species proves to be an important tool in reproductive biotechnologies application concerning to conservation as well as to its population control. The objectives on this work were to describe the stages of the seminiferous epithelium combining the techniques of tubular morphology method and acrossomic system method, besides determining the total duration of seminiferous epithelium cycle (SEC) with the incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU). In this experiment six captive adult male animals were used. All six animals were used in the description of the stages, but only two were used in the measurement of SEC duration. The total duration of the seminiferous epithelium cycle in this species was calculated in 8,13 days and, as long as it takes approximately 4,5 cycles so that the whole spermatogenic process is complete, about 36,58 days are spent in the production of spermatozoa from a spermatogonia. / O quati (Nasua nasua) pertencente a ordem Carnívora e a família Procyonidae, não configura a Lista das Espécies da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção do Ministério do Meio Ambiente (MMA). Pelo contrário, seu desenfreado crescimento populacional próximo à áreas urbanas, vem causando transtornos de ordem econômica, ambiental e sanitária. O estudo detalhado acerca das características reprodutivas desta espécie é uma potencial ferramenta na aplicação de biotécnicas reprodutivas voltadas a programas tanto de conservação quanto para seu controle populacional em locais onde atuam sinantropicamente. Os objetivos deste estudo foram descrever os estádios do ciclo do epitélio seminífero associando as primícias do método da morfologia tubular com o método do sistema acrossômico, além de calcular a duração total do ciclo do epitélio seminífero (CES) com incorporação da bromodeoxiuridina (BrdU). Foram utilizados seis animais machos adultos provenientes de cativeiro. Todos os animais foram utilizados na descrição dos estádios, mas somente dois destes para o cálculo da duração do CES. A duração total do ciclo do epitélio seminífero foi calculada em 8,13 dias e com aproximadamente 4,5 ciclos do epitélio seminífero são necessários para que todo o processo espermatogênico seja completado, cerca de 36,58 dias são despendidos na produção de espermatozóides a partir de uma espermatogônia.

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.