Métodos in vitro utilizando epitélio intestinal animal são importantes ferramentas para avaliar a permeabilidade de fármacos, propriedade que é um importante parâmetro de biodiosponibilidade. Considerando que o maior objetivo na indústria farmacêutica é desenvolver novos fármacos com boa biodisponibilidade oral, o projeto teve como objetivo padronizar o modelo de permeação com membrana de intestino de rã (Rana catesbeiana) em células de Franz, comparando seus resultados com ensaios de células Caco-2. Os fármacos modelo utilizados foram os antivirais zidovudina e aciclovir. A quantidade de fármaco permeado foi determinada por método de eletroforese capilar para o método com intestino de rã touro e por HPLC-UV para os ensaios com células Caco-2. O parâmetro de permeação foi o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) dos fármacos para ambos modelos experimentais. Para estabelecimento do protocolo experimental dos estudos de permeabilidade intestinal de rã, foi proposto um projeto fracionado 24-1 com 4 ensaios adicionais usando o software Minitab, e as variáveis foram: secção intestinal, pH da solução de Ringer e temperatura. A análise do planejamento experimental feita pela estimativa dos parâmetros da regressão obtidos através dos resultados do modelo fatorial possibilitou a determinação dos coeficientes da equação matemática que definiu a influência das variáveis sobre o coeficiente de permeabilidade aparente dos fármacos. Os efeitos das variáveis pH e temperatura interpretados conjuntamente apresentaram interferência leve, porém as variáveis fármaco e secção intestinal interpretados juntos tiveram interferência importante, mostrando maior permeação dos fármacos através da secção inicial do intestino da rã. Os resultados de Papp foram: para o metoprolol, pelo método das células Caco-2 foi de 28 x 10-6 cm/s, valor que está de acordo com demais dados de células Caco-2 na literatura e o valor obtido com células de Franz que mais se adequada a estes resultados e demais disponíveis provenientes de outras técnicas na literatura, foi de 28,1 x 10-6 cm/s, em uma das condições do planejamento estatístico utilizando segmento final da membrana epitelial da rã. No caso do aciclovir, o resultado de Papp de 0,48 x 10-6 cm/s também obtido em uma das condições envolvendo segmento intestinal final da rã foi exatamente igual a o valor 0,48 x 10 - 6 cm/s, encontrado com células Caco-2 no presente estudo e estão de acordo com outros valores disponíveis na literatura por Trapani e colaboradores, 2004 e também com células Caco-2. Para zidovudina o valor de Papp obtido em uma das condições utilizando segmento intestinal inicial da rã, de 13 x 10-6 cm/s, foi a que mais se assemelhou ao obtido pela técnica de células Caco-2, 13,6 x 10-6 cm/s, e também está de acordo com demais dados da literatura. / There are lots of different in vitro technics in the literature using animal intestinal epithelium to estimate permeability of drugs, property that is an important parameter of bioavailabity. Considering that the main objective of Pharmaceutical Companies is the development of new drugs with good oral bioavailabity, the aim of this work was to standardize the permeability of antivirals using in vitro/ex vivo method of intestinal epithelium of Rana catesbeiana in Franz cells and compare these results to those obtained from studies using Caco-2 cells. Zidovudine and Acyclovir were selected as model drugs. The amount of drug permeated will be determined by the method of capillary electrophoresis for assays using Rana Catesbeiana and HPLC-UV for studies with Caco-2 cells. The permeation parameter determined was the apparent permeability coefficient (Papp) of drugs for both experimental models. To establish the experimental protocol to studies of intestinal permeability of frog, it was proposed a fractional 24-1 design with 4 additional tests using Minitab software and the variables were: intestinal section, pH of Ringer solution and temperature. The analysis of the experimental design made by the estimate of the regression parameters obtained from the factorial model results allowed the determination of the coefficients of the mathematical equation that defines the influence of the variables on the apparent permeability coefficient of acyclovir and zidovudine. The effects of pH and temperature interpreted jointly presented a slight interference, but the variables drug and intes tinal section interpreted together had major interference, showing greater permeation of drugs through the initial section of the intestine of the frog . The results of Papp were: for metoprolol, with the method of Caco-2 cells was 28 x 10-6 cm/s, a value which is consistent with other data of Caco-2 cells provided in the literature and the condition obtained with Franz cells that are most suitable for these and other results obtained from other techniques available in the literature, was 28.1 x 10-6 cm/s, provided with the final intestinal segment using frog epithelial membrane. In the case of acyclovir, the result of Papp of 0.48 x 10-6 cm/s obtained in one condition with final frog intestinal segment was exactly equal to the value of 0.48 x 10-6 cm/s, found with Caco-2 cells in the present study and are in agreement with other values available in the literature for Trapani and colegues, 2004 and also with Caco-2 cells. The Papp value for zidovudine obtained with the initial gut segment of frog, 13 x 10-6 cm /s was which more resembled that obtained by the technique of Caco-2 cells, 13.6 x 10-6 cm/s and is also consistent with other literature data.

A combustão do diesel (DEP) é a principal fonte de partículas ultrafinas (PUFs) relacionadas à poluição causada pelo tráfego. Indivíduos com doenças respiratórias crônicas estão propensos a exacerbações durante a exposição à poluição ambiente. Este estudo avaliou os efeitos de exposição subcrônica a uma baixa dose de partículas de combustão de diesel (DEP). 90 camundongos machos BALB/c foram divididos em 3 grupos: (a) Controle: instilação nasal de solução salina (n = 30); (b) DEP15: 15?g de DEP/10?l de solução salina (n = 30); e (c) DEP30: 30?g de DEP/10?l de solução salina (n = 30) durante cinco dias por semana, por 30 e 60 dias. Os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio (50mg/kg ip) e sacrificados por exanguinação. A contagem de células inflamatórias e as concentrações de interleucinas (IL) -4, -10, -13 e -17 no lavado broncoalveolar (LBA) foram avaliadas por ensaio imunoenzimático (Elisa). mRNA da MUC5ac foi avaliado por PCR em tempo real. A análise histológica do septo nasal e bronquíolos foi realizada para avaliar: (a) a espessura do epitélio brônquico e nasal, (b) o conteúdo de muco neutro e ácido na mucosa nasal. Nossos resultados mostraram que a instilação de DEP30 após 30 dias aumentou o número de células inflamatórias totais em relação ao controle (p=0,033). Ao comparar os resultados de DEP30 com o grupo Controle após 60 dias observamos os seguintes aumentos: (a) na expressão de MUC5AC nos pulmões (p = 0,016), no conteúdo de muco ácido no septo nasal (p = 0,017), nas células inflamatórias totais no LBA (p<0,001), no número de macrófagos no LBA (p=0,035) e na espessura do epitélio nasal (p=0,042). Nossos dados sugerem que dose baixa de DEP induz inflamação do trato respiratório com padrão tempo-dependente. / Diesel exhaust is the major source of ultrafine particles (UFPs) in trafficrelated pollution. Subjects with chronic respiratory diseases have great risk of exacerbations during exposure to air pollution. This study evaluated the effects of sub-chronic exposure to a low dose of diesel exhaust particles (DEPs). Ninety male BALB/c mice were divided into 3 groups: (a) Control: nasal saline instillation (n=30); (b) DEP15: nasal instillation of 15?g of DEP/10?l of saline (n=30); and (c) DEP30: nasal instillation of 30?g of DEP/10?l of saline (n=30). Nasal instillations were performed five-days a week, during 30 e 60 days. Animals were anesthetized with pentobarbital sodium (50mg/kg i.p), and sacrificed by exsanguination. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed to assess inflammatory cell count and concetrations of interleukin (IL)-4, -10, -13 and -17 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The RNAm MUC5ac gene expression was evaluated by real-time PCR. Histological analysis in nasal septum and bronchioles assessed: (a) bronchial and nasal epithelium thickness (b) acidic and neutral nasal mucous content. Our results showed that the instillation of DEP30 after 30 days increased the number of total inflammatory cells, as compared to the Control group (p = 0.033). The results of DEP30 after 60 days showed increases in: (a) the expression of MUC5AC in the lungs (p = 0.016); (b) acidic mucus production in the nasal septum (p = 0.017); (c) total inflammatory cells in the BAL fluid (p <0.001); (d) the number of macrophages in BALF (p = 0.035); and (d) nasal epithelium thickness (p = 0.042), as compared with control after 60 days. Our data suggest that a low dose of DEP induces inflammation of the respiratory tract in a time- dependent manner.

O presente estudo objetivou a avaliação do potencial regenerativo e trófico das CS e do fator neurotrófico PEDF sobre os neurônios da medula espinal através da cultura destas células in vitro assim como no modelo experimental da lesão medular contusa in vivo. CS foram cultivadas a partir de fragmentos de nervo ciático de ratos adultos jovens. As culturas primárias foram purificadas e utilizadas em experimentos in vitro e in vivo. Para avaliar se a cultura de CS tratadas com o PEDF proporciona o trofismo dos neurônios da medula espinal, estes foram cultivados a partir de fragmentos da medula espinal de ratos Wistar neonatos e tratados com o meio condicionado das CS (MCCS) pré-tratadas ou não com formas específicas do PEDF. A resposta trófica foi estudada através da quantificação do número de células bem como da área dos prolongamentos e dos corpos celulares dos neurônios cultivados sobreviventes no decurso temporal da cultura, utilizando-se método estereológico específico. Em outra série de experimentos, Ratos Wistar adultos foram submetidos à lesão medular contusa no 10º-11° segmento torácico pelo sistema NYU Impactor e tratados com inoculações locais de CS e do seu meio condicionado na presença ou não do PEDF. Ao término do procedimento cirúrgico, os ratos foram submetidos aos testes do comportamento BBB, CBS durante 6 semanas. Os tratamentos aplicados à cultura de neurônios da medula espinal demonstraram que o MCCS, pré-tratado ou não com diferentes formas moleculares do PEDF e os fatores por si só possuem ações tróficas e plásticas em relação aos neurônios da medula espinal. Foi observado que o MCCS exerceu um efeito de arborização e de trofismo sobre o corpo neuronal dos neurônios medulares, sendo que este efeito foi potencializado quando o MCCS foi obtido a partir de CS pré-tratadas com os fatores nPEDF ou coPEDF, e de intensidade ainda maior quando as formas puras dos fatores em questão foram adicionadas à cultura. Os animais submetidos ao trauma contuso da medula espinal que foram tratados com a inoculação das CS, pré-tratadas ou não com o nPEDF, do meio condicionado destas células e dos fatores nPEDF e coPEDF apresentaram melhor recuperação funcional em relação ao grupo controle. A partir dos dados obtidos neste trabalho pode-se dizer que as CS, seu meio condicionado e o PEDF possuem ações importantes sobre os neurônios da medula espinal, possibilitando a modulação do processo de recuperação funcional deste órgão após o trauma. / The present study aimed the assessment of the trophic and regenerative potential of the Schwann cells (SC) and of the neurotrophic factor PEDF on the spinal cord neurons by means of cultures of those cells in vitro as well as in an experimental model of a contused spinal cord lesion in vivo. SC were cultivated from sciatic nerves fragments of young adult rats. The primary cultures were purified and used in in vitro and in vivo experiments. To evaluate if the SC cultures treated with PEDF provide the trophism of the spinal cord neurons, these were cultivated from spinal cords fragments of new born rats and treated with SC conditional medium (SCCM), of cells pre-treated or not with specifics isoforms of PEDF. The trophic responses were analyzed by the quantification of the cell number, and the area of sprounting and perycaria of the survived neuronal cells in the culture time course using a specific stereological method. In another series of experiment, adults Wistar rats were submitted to a contuse spinal cord lesion in the 10º-11º thoracic level by means of the NYU Impactor and treated with local injection of SC and your CM with the presence or not of the PEDF. In the end of the surgical procedure, the rats were submitted to behaviors testes as the BBB and the CBS during the 6 follow weeks .The spinal cord neuron treatments show that the SCCM, prétreated or not with specifics molecular isoforms of PEDF and this factors by themselves demonstrated trophic and plastic actions with the spinal cord neurons. It was observed that the SCCM exerted a sprouting and trophic effect on the neuronal body of the spinal cord neurons, and that this effect was enhanced when the SCCM was achieved from SC pre-treated with PEDF, and even better when the pures forms of the PEDF was added to the culture. The animals that received the spinal cord lesion and were treated with injection of SC, pre-treated or not with nPEDF, or with the conditioned medium of those cells and the factors nPEDF or coPEDF showed a better functional recovery when compared to the control groups. The results of this study showed that the SC, your conditioned medium and the PEDF play an important role in the spinal cord neurons, allowing the modulation of the functional recovery process of this organ after the trauma.

O objetivo do estudo foi analisar a cápsula e o epitéilo subcapsular cristaliniano (ESC) de pacientes submetidos à capsulotomia curvilínea contínua (CCC) utilizando o corante azul de tripano (AT) a 0,1%, através de microscopia óptica (MO), da técnica TUNEL, de imunohistoquímica e de microscopia eletrônica transmissão (MET). Realizamos um estudo prospectivo, controlado e randomizado utilizando 30 amostras de cápsulas e ESC obtidos de pacientes após CCC durante cirurgia de facectomia. Essas amostras foram divididas em dois grupos (15 espécimes cada) um utilizando o AT (grupo experimental) no ato cirúrgico e o outro sem o uso do corante (grupo controle). As cápsulas e o ESC destes grupos foram fixados e processados para análises estruturais posteriores com técnicas de MO de rotina, técnica TUNEL para detecção de morte celular por apoptose, imunohistoquímica para analisar a expressão da beclina-1 (um marcador de morte celular por autofagia), além de análise ultraestrutural por meio da MET. Foram realizadas análises morfométricas das imagens de microscopia após captura e digitalização, utilizando o programa Image Pró Plus (Cybernetics®, USA). Foram encontrados resultados positivos para a expressão de morte celular por apoptose e por autofagia no grupo submetido ao uso do AT, enquanto que no grupo controle os resultados foram negativos. As análises através da MET do ESC mostraram alterações em células coradas com o AT, incluindo ruptura mitocondrial, dilatação das cisternas do retículo endoplasmático, aumento da elétrondensidade citoplasmática e nuclear, e alteração no perfil nuclear. Os resultados estatísticos obtidos pelo teste de Mann-Whitney a partir da morfometria obtida de micrografias, demonstraram diferenças morfológicas significativas entre os grupos estudados, tanto nas dimensões dos maiores eixos nucleares, quanto na relação perímetro/área do núcleo celular (p=0,03). Em relação à espessura da cápsula, do epitélio subcapsular e do conjunto dessas estruturas obtidas a partir da MO de rotina não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p= 0,1). O AT provoca no ESC toxicidade celular com sinais indicativos de morte celular. Observamos nos aspectos morfológicos e moleculares morte celular tanto pelo mecanismo de apoptose quanto de autofagia. A partir destes achados podemos sugerir que a ação do AT, talvez possa ajudar a prevenir ou reduzir a opacificação da cápsula posterior do cristalino no período pós-operatório das facectomias / The purpose of this study was to evaluate the effect of trypan blue (TB) 0.1% staining on lens epithelial cells (LECs) and capsules of patients undergoing capsulorhexis using routine optical microscopy (OM), TUNEL technique, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). In a prospective controlled and randomized study we evaluated 30 samples of capsules with LECs obtained after capsulorhexis during cataract surgery. Samples were randomly assigned to one of two groups (15 specimens each), one submitted to TB (experimental group) during the surgery and the other without the dye (control group). The capsule and the LECs of both groups were fixed and processed for later structural analysis with routine optical microscopy, immunohistochemistry for beclin-1 expression (a marker of cell death by autophagy), and the TUNEL technique to detect apoptosis, in addition to ultra-structural analysis by TEM. Morphometrical analysis were performed by using the Image Pro Plus software (Cybernetics®, USA). In the TB-stained group we have found positive results for the expression of cell death by autophagy and apoptosis while in the control group the results were negative. Analysis of LEC by TEM showed abnormalities in TB-stained cells including mitochondrial disruption, dilation of the endoplasmic reticulum cisterns, increased cytoplasmic and nuclear electron density and abnormalities in the nuclear profile. Statistical analysis using the Mann-Whitney test on morphometric data from micrographies showed significant morphologic differences between the two groups, both regarding longest nuclear axis difference and the ratio between the total nuclear perimeter and the cell area (p=0.03). No statistically significant difference was observed in capsule thickness, the LEC and the grouping of these two structures obtained from routine OM (p=0.1). Trypan blue is toxic to LECs, and cause abnormalities indicative of cell death. We observed molecular and morphologic aspects of cell death both by the mechanism of apoptosis and autophagy. Our findings lend support to the hypothesis that staining with 0.1% TB can help prevent or reduce the incidence of posterior capsule opacification following cataract surgery

O tratamento anti-HIV conhecido como HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy) se tornou comum por volta de 1996, e utiliza 3 ou 4 diferentes medicamentos em combinação - geralmente dois inibidores de transcriptase reversa + 1 ou 2 inibidores de protease. A introdução desse tipo de tratamento trouxe um grande impacto na morbidade e mortalidade de indivíduos infectados pelo HIV. Os inibidores de protease (PIs) são uma boa alternativa às falhas terapêuticas observadas com o uso dos inibidores de transcriptase reversa, no entanto também são associados a vários efeitos tóxicos, como desconforto abdominal, vômito, diarréia, dor de cabeça, tontura, lipodistrofia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hiperglicemia. Em função da existência de efeitos adversos e da condição do ritonavir como protótipo desse tipo de medicação, nosso objetivo é avaliar o efeito desse medicamento sobre os epitélios de revestimento e glandular relacionados à cavidade bucal, de forma a identificar a possibilidade da existência de complicações bucais relacionadas ao uso de inibidores de protease. Ratos albinos (Wistar) foram tratados com Ritonavir (10mg/Kg) por períodos de 4 e 8 semanas. Foram avaliadas as taxas séricas de triglicérides e colesterol (total, HDL, LDL, VLDL). Ao final dos períodos de tratamentos propostos, os animais foram sacrificados, e as peças utilizadas no estudo foram colhidas, (sangue, pele, língua, palatos e glândulas salivares). O sangue coletado foi imediatamente centrifugado sendo o plasma foi utilizado para avaliação das lipoproteínas. Os tecidos colhidos foram fixados, descalcificados quando necessário, processados para inclusão em parafina, cortados com 6&micro;m de espessura, montados em slides e corados com hematoxilina e eosina, para avaliação histopatológica, morfométrica e estereológica. Os dados colhidos foram apresentados em valores médios, e as diferenças analisadas por testes estatísticos adequados para a comparação entre as amostras. Nossos resultados mostram pequenas variações nas características morfológicas de epitélios de revestimento e glandulares, variações essas que poderiam deixar esses tecidos mais propensos a sofrer alterações significativas com traumas ou injúrias, comuns nos tecidos bucais. Embora observadas com pequeno grau de expressão, essas variações, parecem ser progressivas, ou seja, mais expressivas com o uso continuado do medicamento. Mais estudos devem ser realizados, principalmente voltados para avaliações histoquímicas, bioquímicas e moleculares, no entanto nosso estudo é um alerta inicial para a avaliação dos tecidos bucais de pacientes que utilizam inibidores de protease. / HAART had a dramatic impact on the HIV infection, however, protease inhibitor exhibit significant drug-drug interactions, and side effects. There are only few data on effects of protease inhibitors on oral tissues. We propose to observe experimental effects of ritonavir on oral epithelial tissues, covering and glandular. Wistar rats received Ritonavir twice a week for 4-8 weeks. Controls received no treatment. At the time for sacrifice, plasma were collected for evaluation of triglycerides, total cholesterol, HDL, LDL and VLDL. Were also collected skin, tongue, palate and glandular tissues Lipoproteins were evaluated and histological examination of skin, mucosal epithelium on tongue, palate and salivar submandibular glandula were made under light microscope. Morphometric methods (cariometry and stereology) were used. Data were statistically analysed by Kruskal Wallis test for multiple samples, since our data were considered not-normal. P[U] 0.05 were considered statistically significant. Our results show that protease inhibitor may be associated with small alterations in epithelial tissues, significant mostly when on longer times using the medication. The complete significance of this data has to be better understood, and other studies has to be done to define these points.

As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos. / Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.

O objetivo foi evidenciar a presença do espaço intercelular dilatado do epitélio esofágico após a infusão de ácido clorídrico (HCl) à 0,1N comparando com a infusão de soro fisiológico (SF) em pacientes sem sintomas típicos da DRGE com mucosa esofágica normal e compará-los com os de sintomas típicos e esofagite erosiva. Foram entrevistados e realizaram o exame de endoscopia digestiva alta 60 pacientes destes, 29 foram incluídos no estudo sendo 18 com esôfago normal (9 foram infundidos SF e 9 HCl) e 11 com esofagite erosiva (6 foram infundidos SF e 5 HCl) e foram realizados 4 biópsias da mucosa esofágica (2 antes e 2 depois das infusões). Não foi encontrado diferença estatisticamente significante no espaço intercelular da mucosa esofágica dos pacientes com e sem esofagite erosiva com ácido clorídrico ou soro fisiológico não sendo um marcador da DRGE / The purpose was to prove the presence of extended intercellular space of the esophagic epithelium after chloridric acid infusion (HCI) to 0,1N comparing to the physiologic serum infusion (PS) in patients without typical symptoms of DGER with normal esophagic mucous membrane and compare them to ones with typical symptoms and erosive esophagitis. 60 patients were interviewed and took the high digestive endoscopy; 29 were included in the research, among them 18 with normal esophagus (9 were infused PS, and 9 HCI) and 11 with erosive esophagitis (6 were infused PS and 5 HCI); 4 biopsies of esophagic mucous membrane were made (2 before and 2 after infusions). It was not found any statistically meaningful difference in intercellular space of esophagic mucous membrane in patients with or without erosive esophagitis with chloridric acid or physiologic serum, and thus it is not a DGER

A asma ocupacional é a forma mais comum de doença pulmonar relacionada ao trabalho e vários dos casos reportados estão correlacionados à exposição de proteases. A serino protease subtilisina foi bastante utilizada na década de 60 e foi a principal responsável pela alta incidência de asma na indústria de detergente. Este projeto visou a desenvolver um modelo murino de inflamação alérgica pulmonar à subtilisina e caracterizar os mecanismos principais envolvidos nessa resposta. A sensibilização e desafio com subtilisina induziu doença alérgica pulmonar, verificada pela eosinofilia às vias aéreas, produção de muco, IgE total, hiper reatividade brônquica e produção de citocinas tipo II no pulmão. Estas respostas foram dependentes da atividade enzimática da subtilisina, PAR-2, receptor de IL-33 ST2, IL-1R e da sinalização via MyD88. Em conjunto, nossos resultados estabelecem um novo modelo experimental de asma ocupacional induzida por subtilisina e fornece os principais mecanismos moleculares responsáveis pela inflamação alérgica. / Occupational asthma is the most common form of pulmonary disease related to work. Most of occupational asthma cases reported are strictly correlated with proteases exposure. Serine protease subtilisin was widely used in the detergent industry during the 60s, which resulted in increased incidence of occupational asthma. We aimed to develop and characterize a murine model of occupational asthma using subtilisin as allergen. Briefly, sensitization and challenge with subtilisin triggered lung allergic inflammation, as accessed by eosinophilic influx to the airways, mucus production, and increased levels of type II cytokines. Subtilisin induced total IgE and airway hyperactivity. Allergic responses to subtilisin were dependent on its serine protease activity, protease-activated receptor (PAR)-2, IL-33 receptor ST2, IL-1R, and Myd88 signaling. Together, these data establish a new murine model of occupational asthma induced by subtilisin and provide the main molecular mechanisms responsible for allergic inflammation.

Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP. / Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.

Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP. / Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.