Objetivo: Verificar resposta após debridamento epitelial de córneas humanas. Métodos: Córneas normais foram submetidas a debridamento antes da cirurgia de enucleação. Realizou-se histologia, TUNEL, Ki67, SMA e microscopia eletrônica. Resultados: Seis córneas foram debridadas e preservadas entre ½ e 65 horas, apresentando apoptose nos ceratócitos do estroma anterior. Células estromais em proliferação foram observadas apenas no tempo de 65 horas. Miofibroblastos não foram encontrados. Uma córnea serviu de controle. Conclusões: Os eventos observados em córneas humanas após debridamento epitelial, apoptose e proliferação dos ceratócitos, foram semelhantes aos descritos em animais de experimentação / Purpose: To examine the early wound healing response to epithelial scrape in human corneas. Methods: Normal corneas had epithelial scrape prior to enucleation. Histology, TUNEL assay, Ki67, SMA and transmission electron microscopy were performed. Results: Epithelial scrape was performed in six corneas from ½ to 65 hours prior to preservation. Keratocyte apoptosis was detected in the anterior stroma in all scraped corneas. Keratocyte proliferation was detected exclusively 65 hours after scrape. No myofibroblast was detected. One cornea was not scraped (control). Conclusion: Results obtained in human corneas (keratocyte apoptosis and proliferation) were similar to animal models

Objetivo: Determinar o processo cicatricial e regenerativo da córnea em suas diferentes camadas diante do dano cirúrgico, através da Ceratectomia Fotorrefrativa (PRK) nos terços anteriores ou injúria do complexo Descemetendotélio no terço posterior. Métodos: Córneas de coelhos foram utilizadas a fim de identificar os nervos presentes, evidenciados através da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) da acetilcolinesterase (AchE) e expressos numericamente após quantificação automatizada pelo software Image-Pro. Os seguintes grupos foram incluídos nessa análise: remoção do epitélio com e sem Mitomicina (MMC) 0.02%, -9.0D PRK com e sem MMC. O dano e a regeneração dos nervos foram avaliados através da análise dos grupos após 1 dia, 1, 2, 3 e 6 meses. A morfologia e a distribuição dos nervos foram realizadas através do estudo da tubulina Beta-III, um marcador de microtúbulos presentes em neurônios. Na córnea posterior, a fim de identificar a ocorrência de apoptose após a injúria mecânica do endotélio através de uma cânula romba, cortes desse tecido foram avaliados por meio de técnicas de IHQ através do método de fragmentação do DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase (TUNEL) e microscopia de transmissão eletrônica (TEM) após 1 e 4 horas. A ocorrência de fibrose subsequente à lesão da córnea posterior foi avaliada nos grupos submetidos à Descemetorréxis ou à injúria mecânica do endotélio isolado após 1 mês. O estudo imunohistoquímico para actina de músculo liso (alfa-SMA) permitiu identificar a presença de miofibroblastos e a identificação morfológica da membrana de Descemet demonstrada através do Nidogênio-1 (Nid-1), tornando possível, portanto, a discriminação do papel das camadas posteriores no processo cicatricial da córnea. Olhos contralaterais foram incluídos como um grupo controle em todas as análises. Resultados: Na face anterior da córnea, uma menor área do complexo nervoso foi observada um dia após o PRK associado ao uso da MMC (p=0.0009) quandocomparado ao PRK sem o uso da medicação, que não se manteve após um mês (p=0.9). O PRK sem MMC demonstrou uma crescente capacidade regenerativa de seus nervos, que apresentaram valores comparáveis aos pré-operatórios após o terceiro mês. No entanto, tais fibras nervosas apresentaram uma morfologia aberrada mantida até a análise do mês seis. Na face posterior da córnea, apesar da presença de células TUNEL+ após 1 e 4 horas subsequentes ao dano mecânico do endotélio isolado, não houve a expressão de alfa-SMA no estroma posterior após um mês. A integridade estrutural da membrana de Descemet nesse grupo foi confirmada através do Nidogênio-1 (Nid-1), diferentemente do observado após o dano ao complexo Descemet-endotélio, em que houve ampla expressão de alfa-SMA identificando a presença de miofibroblastos e o consequente desenvolvimento de cicatrizes responsáveis pela perda de transparência na córnea. Conclusão: O uso do excimer laser na superfície anterior causou prejuízo à inervação da córnea. Todavia, a capacidade regenerativa das fibras nervosas foi demonstrada ao longo dos meses, apesar da persistência de uma anômala arquitetura e redistribuição dos nervos mesmo após o sexto mês. A MMC revelou uma discreta e precoce propriedade neurotóxica quando combinada ao uso do excimer laser, que não implica perda da segurança a médio/longo prazo do uso dessa droga na concentração e tempos utilizados nesse estudo. No terço posterior da córnea, a membrana de Descemet exibiu um importante papel modulador no processo de desenvolvimento de cicatrizes ou fibrose no estroma profundo. Uma vez lesada, torna constante o influxo de citocinas inflamatórias necessárias para a diferenciação e persistência do miofibroblasto. Tal processo mostrou-se análogo ao papel da membrana basal do epitélio como reguladora do processo de fibrose da córnea anterior / Purpose: To determine the wound-healing cascade and regeneration process of the cornea after surgical injury in its different layers, through Photorefractive Keratectomy (PRK) in the anterior thirds or Descemet-endothelium injury in the posterior third. Methods: Rabbit corneas were used to identify the nerves present in the central area of this tissue by the immunohistochemistry (IHQ) technique of acetylcholinesterase (AchE) and their numerical quantification by Image-Pro software. The following groups were included in this analysis: Removal of epithelium with and without Mitomycin (MMC) 0.02 %, -9.0D PRK with and without MMC. Damage and nerve regeneration were assessed by analyzing the groups after 1 day, 1, 2, 3 and 6 months. The morphology and distribution of nerves along the corneal layers was performed through tubulin beta-III study. At the posterior cornea, to distinguish the occurrence of apoptosis after the mechanical injury of the endothelium through a blunt cannula, sections of this tissue were evaluated by IHQ technique through DNA fragmentation by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase (TUNEL) and electron transmission microscopy (TEM) after 1 and 4 hours. The occurrence of cornea fibrosis subsequent to posterior corneal injury was evaluated by the group undergoing Descemet membrane surgical removal or by the endothelium mechanical injury after 1 month. The immunohistochemical study for smooth muscle actin (alpha-SMA) allowed the identification of myofibroblasts and the structural integrity of Descemet demonstrated by Nidogen-1 (Nid-1). Thus, making it possible to discriminate the role of the posterior layers during the corneal wound-healing process. Contralateral eyes were included as a control group in all analyzes. Results: At the anterior surface of the cornea, a smaller area of the nervous complex was observed one day after PRK associated with the use of MMC (p = 0.0009) when compared to PRK without the association of the drug, which was not maintained after the first month (p = 0.9). The PRK without MMC demonstrated an increasing regenerative capacity of their nerves, which presented values comparable to preoperative measurements after the third month. However, morphological differences and an aberrant distribution of innervation were persistent. At the corneal posterior surface, despite the presence of TUNEL + cells after 1 and 4 hours subsequent to the mechanical damage of the isolated endothelium, there was no alpha-SMA expression in the posterior stroma after one month. The structural integrity of Descemet\'s membrane in this group was confirmed by Nidogen-1 (Nid-1). Differently from what was observed after damage to the Descemet membrane by it surgical removal, there was a large expression of alpha-SMA identifying the myofibroblasts and the consequent development of scars responsible for the loss of corneal transparency. Conclusion: The excimer laser use on the anterior surface caused destruction to the corneal innervation. However, the regenerative capacity of nerve fibers was demonstrated over the months, despite the persistence of anomalous architecture and redistribution of the corneal nerves that persisted even after six months. MMC exhibited a moderate and early neurotoxic effect when combined with the excimer laser treatment at the concentration and time used in this study At the inferior third of the cornea, Descemet\'s membrane exhibited an important role during the modulation process of scarring or fibrosis in the deep stroma. Once damaged, a constant influx of inflammatory cytokines into the stroma was guaranteed and a differentiation and persistence of the myofibroblast occur. This process has been shown to be analogous to the role of the corneal epithelial basement membrane as a regulator of the anterior cornea fibrosis process

Odorantes são detectados por centenas de receptores olfatórios (ORs) que pertencem à superfamília dos receptores acoplados à proteína G. Estes receptores são expressos nos neurônios sensoriais olfatórios localizados na cavidade nasal. Cada neurônio sensorial olfatório expressa um único alelo de gene OR de uma grande família de genes OR. Este padrão característico da expressão de genes OR resulta na formação de um mapa olfatório espacial no bulbo olfatório, que é necessário para a discriminação de odorantes pelo sistema olfatório. Os mecanismos envolvidos nesta regulação ainda não são bem conhecidos. O DNA genômico em neurônios olfatórios é coberto com marcas repressivas de metilação de histonas, indicando que a regulação da estrutura da cromatina deve desempenhar um papel importante na regulação da expressão de genes OR. Trabalhos anteriores demonstraram que RNAs não codificadores (ncRNAs) estão envolvidos na deposição de marcas de histonas em determinados genes. No entanto, os ncRNAs expressos no epitélio olfatório ainda não são conhecidos. Neste trabalho, identificamos e catalogamos o repertório completo de ncRNAs anotados, incluindo os miRNAs, expressos no epitélio olfatório de camundongos recémnascidos e adultos. Muitos destes, apesar de já anotados como ncRNAs, ainda não foram descritos na literatura como expressos no MOE. Identificamos ao todo 1161 miRNAs e 295 lincRNAs expressos no epitélio olfatório, e pudemos verificar como os níveis de expressão destes RNAs variam durante o desenvolvimento. A partir deste repertório, selecionamos lincRNAs que são preferencialmente expressos no epitélio olfatório quando comparados a outros tecidos de camundongo. Dez destes lincRNAs foram selecionados para validação utilizando-se RT-PCR. Cinco lincRNAs foram validados e analisados quanto à sua expressão em diferentes tecidos. Nosso trabalho estabelece uma plataforma de dados que permitirá o estudo do papel desempenhado por ncRNAs no epitélio olfatório. Além disto, os nossos resultados mostram que a abordagem utilizada permite a identificação de novos lincRNAs que apresentam expressão restrita ou preferencial no epitélio olfatório, e que, portanto, devem apresentar uma função relevante para o olfato. / Odorants are detected by hundreds of odorant receptors (ORs) which belong to the superfamily of G protein-coupled receptors. These receptors are expressed in the olfactory sensory neurons of the nose. Each olfactory sensory neuron expresses one single OR gene allele from a large family of OR genes. This characteristic pattern of OR gene expression results in the formation of a spatial olfactory map in the olfactory bulb, which is required for odorant discrimination by the olfactory system. The mechanisms involved in this regulation are unknown. OR genomic DNA in olfactory neurons is covered with repressive histone methylation marks, indicating that the chromatin structure should play an important role in the regulation of OR gene expression. Previous studies suggest that noncoding RNAs (ncRNAs) are involved in the deposition of histone marks in certain genes. However, the ncRNAs expressed in the olfactory epithelium are completely unknown. In this work, we used RNA-seq to identify and catalogue the complete repertoire of ncRNAs, including miRNAs, expressed in the olfactory epithelium from newborn and adult mice. In this way, we were able to identify 1161 miRNAs and 295 lincRNAs and analyze how their levels of expression varies during development. Out of these repertoire, we selected lincRNAs that are preferentially expressed in the olfactory epithelium when compared to other mouse tissues. Ten out of these lincRNAs were selected for validation by using RTPCR, and five of them could be validated and further analyzed. Our work establishes a data platform which will enable the study of the role played by ncRNAs in the olfactory epithelium. In addition, our results show that our approach can be successfully used to identify ncRNAs that are restrictedly or preferentially expressed in the olfactory epithelium, and which therefore must be relevant for olfaction.

Métodos in vitro utilizando epitélio intestinal animal são importantes ferramentas para avaliar a permeabilidade de fármacos, propriedade que é um importante parâmetro de biodiosponibilidade. Considerando que o maior objetivo na indústria farmacêutica é desenvolver novos fármacos com boa biodisponibilidade oral, o projeto teve como objetivo padronizar o modelo de permeação com membrana de intestino de rã (Rana catesbeiana) em células de Franz, comparando seus resultados com ensaios de células Caco-2. Os fármacos modelo utilizados foram os antivirais zidovudina e aciclovir. A quantidade de fármaco permeado foi determinada por método de eletroforese capilar para o método com intestino de rã touro e por HPLC-UV para os ensaios com células Caco-2. O parâmetro de permeação foi o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) dos fármacos para ambos modelos experimentais. Para estabelecimento do protocolo experimental dos estudos de permeabilidade intestinal de rã, foi proposto um projeto fracionado 24-1 com 4 ensaios adicionais usando o software Minitab, e as variáveis foram: secção intestinal, pH da solução de Ringer e temperatura. A análise do planejamento experimental feita pela estimativa dos parâmetros da regressão obtidos através dos resultados do modelo fatorial possibilitou a determinação dos coeficientes da equação matemática que definiu a influência das variáveis sobre o coeficiente de permeabilidade aparente dos fármacos. Os efeitos das variáveis pH e temperatura interpretados conjuntamente apresentaram interferência leve, porém as variáveis fármaco e secção intestinal interpretados juntos tiveram interferência importante, mostrando maior permeação dos fármacos através da secção inicial do intestino da rã. Os resultados de Papp foram: para o metoprolol, pelo método das células Caco-2 foi de 28 x 10-6 cm/s, valor que está de acordo com demais dados de células Caco-2 na literatura e o valor obtido com células de Franz que mais se adequada a estes resultados e demais disponíveis provenientes de outras técnicas na literatura, foi de 28,1 x 10-6 cm/s, em uma das condições do planejamento estatístico utilizando segmento final da membrana epitelial da rã. No caso do aciclovir, o resultado de Papp de 0,48 x 10-6 cm/s também obtido em uma das condições envolvendo segmento intestinal final da rã foi exatamente igual a o valor 0,48 x 10 - 6 cm/s, encontrado com células Caco-2 no presente estudo e estão de acordo com outros valores disponíveis na literatura por Trapani e colaboradores, 2004 e também com células Caco-2. Para zidovudina o valor de Papp obtido em uma das condições utilizando segmento intestinal inicial da rã, de 13 x 10-6 cm/s, foi a que mais se assemelhou ao obtido pela técnica de células Caco-2, 13,6 x 10-6 cm/s, e também está de acordo com demais dados da literatura. / There are lots of different in vitro technics in the literature using animal intestinal epithelium to estimate permeability of drugs, property that is an important parameter of bioavailabity. Considering that the main objective of Pharmaceutical Companies is the development of new drugs with good oral bioavailabity, the aim of this work was to standardize the permeability of antivirals using in vitro/ex vivo method of intestinal epithelium of Rana catesbeiana in Franz cells and compare these results to those obtained from studies using Caco-2 cells. Zidovudine and Acyclovir were selected as model drugs. The amount of drug permeated will be determined by the method of capillary electrophoresis for assays using Rana Catesbeiana and HPLC-UV for studies with Caco-2 cells. The permeation parameter determined was the apparent permeability coefficient (Papp) of drugs for both experimental models. To establish the experimental protocol to studies of intestinal permeability of frog, it was proposed a fractional 24-1 design with 4 additional tests using Minitab software and the variables were: intestinal section, pH of Ringer solution and temperature. The analysis of the experimental design made by the estimate of the regression parameters obtained from the factorial model results allowed the determination of the coefficients of the mathematical equation that defines the influence of the variables on the apparent permeability coefficient of acyclovir and zidovudine. The effects of pH and temperature interpreted jointly presented a slight interference, but the variables drug and intes tinal section interpreted together had major interference, showing greater permeation of drugs through the initial section of the intestine of the frog . The results of Papp were: for metoprolol, with the method of Caco-2 cells was 28 x 10-6 cm/s, a value which is consistent with other data of Caco-2 cells provided in the literature and the condition obtained with Franz cells that are most suitable for these and other results obtained from other techniques available in the literature, was 28.1 x 10-6 cm/s, provided with the final intestinal segment using frog epithelial membrane. In the case of acyclovir, the result of Papp of 0.48 x 10-6 cm/s obtained in one condition with final frog intestinal segment was exactly equal to the value of 0.48 x 10-6 cm/s, found with Caco-2 cells in the present study and are in agreement with other values available in the literature for Trapani and colegues, 2004 and also with Caco-2 cells. The Papp value for zidovudine obtained with the initial gut segment of frog, 13 x 10-6 cm /s was which more resembled that obtained by the technique of Caco-2 cells, 13.6 x 10-6 cm/s and is also consistent with other literature data.

Os tumores odontogênicos benignos compreendem um grupo de neoplasias originárias dos tecidos dentários. Pesquisas vêm buscando identificar moléculas envolvidas nos mecanismos moleculares que regulam a remodelação da matriz extracelular (MEC) e como isto influencia no comportamento localmente invasivo presente em alguns destes tumores. A Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM conversão do fenótipo epitelial em mesenquimal) é bem caracterizada em diversos carcinomas, culminando em mestástase. MMPs são enzimas que degradam os componentes da MEC, geram moléculas bioativas, participam da TEM e o controle da remodelação da MEC dá-se pelo balanço entre elas, seus inibidores (TIMPs e RECK) e seu ativador (EMMPRIN). Assim, o objetivo deste trabalho foi delinear o perfil de expressão das MMPs (-2, -7, -9 e -14), seus inibidores (TIMPs -2, -3, -4 e RECK), seu ativador (EMMPRIN) e marcadores da TEM (Snail, Slug, N-caderina, Fibronectina, a-Actina de músculo liso e Vimentina) em Ameloblastomas (AB) e Tumores Odontogênicos Cístico Calcificantes (TOCC). Ainda, realizamos a comparação da expressão de cada molécula avaliada em cada compartimento celular (epitélio e estroma) e correlação entre as moléculas avaliadas no mesmo tumor. Utilizamos 19 casos de AB e 18 casos de TOCC (Serviço de Anatomia Patológica da FOUSP), localização das enzimas/proteínas por imunoistoquímica e analisadas nos compartimentos epitelial e estromal. Todas as proteínas/enzimas analisadas foram detectadas tanto nos AB quanto nos TOCC, sendo a maioria expressa em ambos os compartimentos. A N-caderina foi localizada apenas no epitélio dos AB e a Vimentina somente no estroma em ambos os tumores. Na comparação entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Vimentina, Snail e Slug. Na comparação entre o epitélio x estroma dos TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentina, N-caderina, Snail e Slug. Assim, entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas e TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, Vimentina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Snail e Slug. Esta é a primeira vez que a EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, Ncaderina, Snail e Slug são descritas em TOCC e TIMP-3, TIMP-4, Snail e Slug em ameloblastomas. Concluímos que estas proteínas/enzimas estão diferencialmente expressas tanto no epitélio quanto no estroma destes tumores e sugerimos que estes podem participar do comportamento localmente invasivo. / Odontogenic tumors comprise a group of benign neoplasms originating from dental tissues. Research looking for identify molecules involved in the molecular mechanisms that regulate extracellular matrix remodeling (ECM) and how this impacts on locally invasive behavior present in some of these tumors. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT - conversion of epithelial phenotype into mesenchymal phenotype) is well characterized in several carcinomas, leaving to metastasis. MMPs are enzymes that degrade ECM components, generate bioactive molecules, participating in the EMT and control ECM remodeling is given by the balance between them, their inhibitors (TIMPs and RECK) and its activator (EMMPRIN). The aim of this study was evaluate expression profile of MMPs (-2, -7, -9 and - 14), their inhibitors (TIMPs -2, -3, -4 and RECK), its activator (EMMPRIN) and EMT markers (Snail, Slug, N-cadherin, Fibronectin, -smooth muscle actin and Vimentin) in ameloblastomas (AB) and Calcifying Cystic Odontogenic Tumor (CCOT). We also compared the expression of each molecule assessed in each cellular compartment (epithelium and stroma) and correlation between molecules evaluated in the same tumor. We used 19 AB cases and 18 CCOT cases from files of Pathology Laboratory (FOUSP), localization of enzymes/proteins and analyzed by immunohistochemistry in epithelial and stromal compartments. All proteins/enzymes were detected in both AB and CCOT, mostly expressed in both compartments. N-cadherin was localized only in the epithelium of AB and Vimentin only in stromal in both tumors. Comparing \"epithelium vs stroma\" of AB, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, -smooth muscle actin, N-cadherin, Vimentin, Snail and Slug. Comparing \"epithelium vs stroma\" of CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentin, N-cadherin, Snail and Slug. Analizing epithelium vs stroma\" between AB and CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, Vimentin , -smooth muscle actin, N-cadherin, Snail and Slug. This is the first time that EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, N-cadherin, Snail and Slug are described in CCOT and TIMP-3, TIMP-4, Snail and Slug in AB. We conclude that these proteins/enzymes are differentially expressed in both epithelium and stroma of these tumors and suggest that they may participate locally invasive behavior.

O objetivo do estudo foi analisar a cápsula e o epitéilo subcapsular cristaliniano (ESC) de pacientes submetidos à capsulotomia curvilínea contínua (CCC) utilizando o corante azul de tripano (AT) a 0,1%, através de microscopia óptica (MO), da técnica TUNEL, de imunohistoquímica e de microscopia eletrônica transmissão (MET). Realizamos um estudo prospectivo, controlado e randomizado utilizando 30 amostras de cápsulas e ESC obtidos de pacientes após CCC durante cirurgia de facectomia. Essas amostras foram divididas em dois grupos (15 espécimes cada) um utilizando o AT (grupo experimental) no ato cirúrgico e o outro sem o uso do corante (grupo controle). As cápsulas e o ESC destes grupos foram fixados e processados para análises estruturais posteriores com técnicas de MO de rotina, técnica TUNEL para detecção de morte celular por apoptose, imunohistoquímica para analisar a expressão da beclina-1 (um marcador de morte celular por autofagia), além de análise ultraestrutural por meio da MET. Foram realizadas análises morfométricas das imagens de microscopia após captura e digitalização, utilizando o programa Image Pró Plus (Cybernetics®, USA). Foram encontrados resultados positivos para a expressão de morte celular por apoptose e por autofagia no grupo submetido ao uso do AT, enquanto que no grupo controle os resultados foram negativos. As análises através da MET do ESC mostraram alterações em células coradas com o AT, incluindo ruptura mitocondrial, dilatação das cisternas do retículo endoplasmático, aumento da elétrondensidade citoplasmática e nuclear, e alteração no perfil nuclear. Os resultados estatísticos obtidos pelo teste de Mann-Whitney a partir da morfometria obtida de micrografias, demonstraram diferenças morfológicas significativas entre os grupos estudados, tanto nas dimensões dos maiores eixos nucleares, quanto na relação perímetro/área do núcleo celular (p=0,03). Em relação à espessura da cápsula, do epitélio subcapsular e do conjunto dessas estruturas obtidas a partir da MO de rotina não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p= 0,1). O AT provoca no ESC toxicidade celular com sinais indicativos de morte celular. Observamos nos aspectos morfológicos e moleculares morte celular tanto pelo mecanismo de apoptose quanto de autofagia. A partir destes achados podemos sugerir que a ação do AT, talvez possa ajudar a prevenir ou reduzir a opacificação da cápsula posterior do cristalino no período pós-operatório das facectomias / The purpose of this study was to evaluate the effect of trypan blue (TB) 0.1% staining on lens epithelial cells (LECs) and capsules of patients undergoing capsulorhexis using routine optical microscopy (OM), TUNEL technique, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). In a prospective controlled and randomized study we evaluated 30 samples of capsules with LECs obtained after capsulorhexis during cataract surgery. Samples were randomly assigned to one of two groups (15 specimens each), one submitted to TB (experimental group) during the surgery and the other without the dye (control group). The capsule and the LECs of both groups were fixed and processed for later structural analysis with routine optical microscopy, immunohistochemistry for beclin-1 expression (a marker of cell death by autophagy), and the TUNEL technique to detect apoptosis, in addition to ultra-structural analysis by TEM. Morphometrical analysis were performed by using the Image Pro Plus software (Cybernetics®, USA). In the TB-stained group we have found positive results for the expression of cell death by autophagy and apoptosis while in the control group the results were negative. Analysis of LEC by TEM showed abnormalities in TB-stained cells including mitochondrial disruption, dilation of the endoplasmic reticulum cisterns, increased cytoplasmic and nuclear electron density and abnormalities in the nuclear profile. Statistical analysis using the Mann-Whitney test on morphometric data from micrographies showed significant morphologic differences between the two groups, both regarding longest nuclear axis difference and the ratio between the total nuclear perimeter and the cell area (p=0.03). No statistically significant difference was observed in capsule thickness, the LEC and the grouping of these two structures obtained from routine OM (p=0.1). Trypan blue is toxic to LECs, and cause abnormalities indicative of cell death. We observed molecular and morphologic aspects of cell death both by the mechanism of apoptosis and autophagy. Our findings lend support to the hypothesis that staining with 0.1% TB can help prevent or reduce the incidence of posterior capsule opacification following cataract surgery

Alguns estudos sugerem que as pequenas vias aéreas têm um papel importante na fisiopatologia da lesão pulmonar aguda/ síndrome do desconforto respiratório agudo (LPA/SDRA). O epitélio respiratório que reveste as vias aéreas é capaz de liberar mediadores inflamatórios e está relacionado ainda com a produção de surfactante nas vias aéreas. Até o presente momento, existem poucos estudos que avaliaram se estas funções do epitélio que reveste as pequenas vias aéreas encontram-se alteradas na SDRA. No presente estudo, nós mensuramos a expressão da proteína de surfactante (PS) A e PS-B, a expressão de citocinas inflamatórias interleucina (IL)-6 e IL-8, e um índice de apoptose do epitélio que reveste as pequenas vias aéreas de pacientes com SDRA que foram submetidos a autópsia e comparamos estes resultados com os de indivíduos controle. Foram incluídos no estudo pulmões de autópsia de 31 pacientes com SDRA (PaO2/FiO2200, 45±14 anos, 16 homens) e 11 controles (52±16 anos, 7 homens). A expressão de IL-6, IL-8, PS-A e PS-B no epitélio das pequenas vias aéreas (diâmetro2.0mm) foi verificada através de reações de imunohistoquímica e análise de imagem. O índice de apoptose epitelial das vias aéreas foi avaliado através do método de TUNEL e da expressão de FAS/FASL. Avaliou-se ainda a densidade de células inflamatórias positivas para IL-6 e IL-8 na parede das pequenas vias aéreas. As vias aéreas dos pacientes com SDRA apresentaram maior expressão epitelial de IL-8 (p=0,006) e maior densidade de células inflamatórias expressando IL-6 (p=0,004) e IL-8 (p<0,001) quando comparadas com o grupo controle. Não houve diferenças na expressão epitelial de PS-A e PS-B ou no índice de apoptose epitelial entre os grupos SDRA e controle. Nossos resultados mostram que as pequenas vias aéreas participam da inflamação pulmonar de pacientes com SDRA, caracterizada pelo aumento na expressão de interleucinas próinflamatórias tanto em células inflamatórias da parede da via aérea quanto no epitélio. Nossos resultados sugerem ainda que a apoptose não é um mecanismo importante de morte de células epiteliais das vias aéreas de pacientes com SDRA / Recent studies suggest a role for distal airway injury in the pathophysiology of human ALI/ARDS. The epithelium lining the airways modulates airway function secreting a large number of molecules such as surfactant components and inflammatory mediators. So far, there is little information on how these secretory functions of the small airways are altered in ARDS. In the present study we assessed the airway expression of surfactant protein (SP) A and SP B, the expression of inflammatory cytokines IL-6 and IL-8, and an index of airway epithelial apoptosis of patients with ARDS submitted to autopsy and compared the results with those of control subjects. We studied autopsy lungs of 31 ARDS patients (PaO2/FiO2200, 45±14 years, 16 males) and 11 controls (52±16 years, 7 males). Using immunohistochemistry and image analysis, we quantified the expression of IL-6, IL-8 and SP-A and SP-B in the epithelium of small airways (diameter2.0mm). Airway epithelial apoptosis index was obtained with the TUNEL assay and FAS/FASL expression. We also quantified the density of inflammatory cells expressing IL-6 and IL-8 within the small airway walls. ARDS airways showed an increase in the epithelial expression of IL-8 (p=0.006) and an increased density of inflammatory cells expressing IL-6 (p=0.004) and IL-8 (p<0.001) when compared to controls. There were no differences in SP-A and SP-B epithelium expression or in epithelial apoptosis index between ARDS and controls. Our results show that the distal airways are involved in ARDS lung inflammation with higher expression of pro-inflammatory interleukins in both airway epithelial and inflammatory cells. Our results also suggest that apoptosis is not a major mechanism of airway epithelial cell death in ARDS

As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos. / Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.

O presente estudo objetivou a avaliação do potencial regenerativo e trófico das CS e do fator neurotrófico PEDF sobre os neurônios da medula espinal através da cultura destas células in vitro assim como no modelo experimental da lesão medular contusa in vivo. CS foram cultivadas a partir de fragmentos de nervo ciático de ratos adultos jovens. As culturas primárias foram purificadas e utilizadas em experimentos in vitro e in vivo. Para avaliar se a cultura de CS tratadas com o PEDF proporciona o trofismo dos neurônios da medula espinal, estes foram cultivados a partir de fragmentos da medula espinal de ratos Wistar neonatos e tratados com o meio condicionado das CS (MCCS) pré-tratadas ou não com formas específicas do PEDF. A resposta trófica foi estudada através da quantificação do número de células bem como da área dos prolongamentos e dos corpos celulares dos neurônios cultivados sobreviventes no decurso temporal da cultura, utilizando-se método estereológico específico. Em outra série de experimentos, Ratos Wistar adultos foram submetidos à lesão medular contusa no 10º-11° segmento torácico pelo sistema NYU Impactor e tratados com inoculações locais de CS e do seu meio condicionado na presença ou não do PEDF. Ao término do procedimento cirúrgico, os ratos foram submetidos aos testes do comportamento BBB, CBS durante 6 semanas. Os tratamentos aplicados à cultura de neurônios da medula espinal demonstraram que o MCCS, pré-tratado ou não com diferentes formas moleculares do PEDF e os fatores por si só possuem ações tróficas e plásticas em relação aos neurônios da medula espinal. Foi observado que o MCCS exerceu um efeito de arborização e de trofismo sobre o corpo neuronal dos neurônios medulares, sendo que este efeito foi potencializado quando o MCCS foi obtido a partir de CS pré-tratadas com os fatores nPEDF ou coPEDF, e de intensidade ainda maior quando as formas puras dos fatores em questão foram adicionadas à cultura. Os animais submetidos ao trauma contuso da medula espinal que foram tratados com a inoculação das CS, pré-tratadas ou não com o nPEDF, do meio condicionado destas células e dos fatores nPEDF e coPEDF apresentaram melhor recuperação funcional em relação ao grupo controle. A partir dos dados obtidos neste trabalho pode-se dizer que as CS, seu meio condicionado e o PEDF possuem ações importantes sobre os neurônios da medula espinal, possibilitando a modulação do processo de recuperação funcional deste órgão após o trauma. / The present study aimed the assessment of the trophic and regenerative potential of the Schwann cells (SC) and of the neurotrophic factor PEDF on the spinal cord neurons by means of cultures of those cells in vitro as well as in an experimental model of a contused spinal cord lesion in vivo. SC were cultivated from sciatic nerves fragments of young adult rats. The primary cultures were purified and used in in vitro and in vivo experiments. To evaluate if the SC cultures treated with PEDF provide the trophism of the spinal cord neurons, these were cultivated from spinal cords fragments of new born rats and treated with SC conditional medium (SCCM), of cells pre-treated or not with specifics isoforms of PEDF. The trophic responses were analyzed by the quantification of the cell number, and the area of sprounting and perycaria of the survived neuronal cells in the culture time course using a specific stereological method. In another series of experiment, adults Wistar rats were submitted to a contuse spinal cord lesion in the 10º-11º thoracic level by means of the NYU Impactor and treated with local injection of SC and your CM with the presence or not of the PEDF. In the end of the surgical procedure, the rats were submitted to behaviors testes as the BBB and the CBS during the 6 follow weeks .The spinal cord neuron treatments show that the SCCM, prétreated or not with specifics molecular isoforms of PEDF and this factors by themselves demonstrated trophic and plastic actions with the spinal cord neurons. It was observed that the SCCM exerted a sprouting and trophic effect on the neuronal body of the spinal cord neurons, and that this effect was enhanced when the SCCM was achieved from SC pre-treated with PEDF, and even better when the pures forms of the PEDF was added to the culture. The animals that received the spinal cord lesion and were treated with injection of SC, pre-treated or not with nPEDF, or with the conditioned medium of those cells and the factors nPEDF or coPEDF showed a better functional recovery when compared to the control groups. The results of this study showed that the SC, your conditioned medium and the PEDF play an important role in the spinal cord neurons, allowing the modulation of the functional recovery process of this organ after the trauma.

O tratamento anti-HIV conhecido como HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy) se tornou comum por volta de 1996, e utiliza 3 ou 4 diferentes medicamentos em combinação - geralmente dois inibidores de transcriptase reversa + 1 ou 2 inibidores de protease. A introdução desse tipo de tratamento trouxe um grande impacto na morbidade e mortalidade de indivíduos infectados pelo HIV. Os inibidores de protease (PIs) são uma boa alternativa às falhas terapêuticas observadas com o uso dos inibidores de transcriptase reversa, no entanto também são associados a vários efeitos tóxicos, como desconforto abdominal, vômito, diarréia, dor de cabeça, tontura, lipodistrofia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hiperglicemia. Em função da existência de efeitos adversos e da condição do ritonavir como protótipo desse tipo de medicação, nosso objetivo é avaliar o efeito desse medicamento sobre os epitélios de revestimento e glandular relacionados à cavidade bucal, de forma a identificar a possibilidade da existência de complicações bucais relacionadas ao uso de inibidores de protease. Ratos albinos (Wistar) foram tratados com Ritonavir (10mg/Kg) por períodos de 4 e 8 semanas. Foram avaliadas as taxas séricas de triglicérides e colesterol (total, HDL, LDL, VLDL). Ao final dos períodos de tratamentos propostos, os animais foram sacrificados, e as peças utilizadas no estudo foram colhidas, (sangue, pele, língua, palatos e glândulas salivares). O sangue coletado foi imediatamente centrifugado sendo o plasma foi utilizado para avaliação das lipoproteínas. Os tecidos colhidos foram fixados, descalcificados quando necessário, processados para inclusão em parafina, cortados com 6&micro;m de espessura, montados em slides e corados com hematoxilina e eosina, para avaliação histopatológica, morfométrica e estereológica. Os dados colhidos foram apresentados em valores médios, e as diferenças analisadas por testes estatísticos adequados para a comparação entre as amostras. Nossos resultados mostram pequenas variações nas características morfológicas de epitélios de revestimento e glandulares, variações essas que poderiam deixar esses tecidos mais propensos a sofrer alterações significativas com traumas ou injúrias, comuns nos tecidos bucais. Embora observadas com pequeno grau de expressão, essas variações, parecem ser progressivas, ou seja, mais expressivas com o uso continuado do medicamento. Mais estudos devem ser realizados, principalmente voltados para avaliações histoquímicas, bioquímicas e moleculares, no entanto nosso estudo é um alerta inicial para a avaliação dos tecidos bucais de pacientes que utilizam inibidores de protease. / HAART had a dramatic impact on the HIV infection, however, protease inhibitor exhibit significant drug-drug interactions, and side effects. There are only few data on effects of protease inhibitors on oral tissues. We propose to observe experimental effects of ritonavir on oral epithelial tissues, covering and glandular. Wistar rats received Ritonavir twice a week for 4-8 weeks. Controls received no treatment. At the time for sacrifice, plasma were collected for evaluation of triglycerides, total cholesterol, HDL, LDL and VLDL. Were also collected skin, tongue, palate and glandular tissues Lipoproteins were evaluated and histological examination of skin, mucosal epithelium on tongue, palate and salivar submandibular glandula were made under light microscope. Morphometric methods (cariometry and stereology) were used. Data were statistically analysed by Kruskal Wallis test for multiple samples, since our data were considered not-normal. P[U] 0.05 were considered statistically significant. Our results show that protease inhibitor may be associated with small alterations in epithelial tissues, significant mostly when on longer times using the medication. The complete significance of this data has to be better understood, and other studies has to be done to define these points.