A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa e progressiva que acomete o sistema neuromotor impedindo a correta funcionalidade da musculatura estriada esquelética. O objetivo deste estudo foi avaliar os músculos masseteres e temporais por meio da eletromiografia de superfície, função mastigatória e ultrassonografia de indivíduos com ELA. A força de mordida molar máxima também foi avaliada. Trinta indivíduos, com idade entre 18 e 68 anos, participaram do estudo. Estes foram distribuídos em dois Grupos: GELA - participantes com ELA, n=15 (idade média de 43,46 ± 3,67 anos) e GC: controle, participantes saudáveis, n=15 (idade média foi de 43,33 ± 3,93 anos). Foi utilizado o eletromiógrafo MyoSystem-I P84 para avaliar a atividade eletromiográfica (EMG) nas condições de repouso mandibular, protrusão, lateralidade direita e esquerda, apertamento dental em contração voluntária máxima com e sem parafilme M®. A eficiência mastigatória foi analisada por meio da integral da envoltória do sinal eletromiográfico dos ciclos mastigatórios na mastigação habitual e não habitual. Para a obtenção da espessura muscular nas condições de repouso e apertamento dental em contração voluntária máxima foi utilizado o aparelho de ultrassom SonoSite NanoMax e para a análise da força de mordida molar máxima direita e esquerda foi utilizado o dinamômetro digital Kratos. Os dados eletromiográficos, ultrassonográficos e de força de mordida molar máxima foram tabulados e submetidos à análise estatística utilizando o software SPSS versão 21.0 (teste t de student; p≤0,05). Verificou-se diferença estatística entre os Grupos ELA e Controle, na condição de repouso mandibular para os músculos masseter direito (p=0,03) e esquerdo (p=0,03); na condição de protrusão para os músculos masseter esquerdo (p=0,00) e temporais direito (p=0,00) e esquerdo (p=0,03); na condição de lateralidade esquerda para os músculos masseter direito (p=0,00), masseter esquerdo (p=0,00) e temporal esquerdo (p=0,00); e na condição de mastigação não habitual para os músculos masseter direito (p=0,00) e temporal direito (p=0,04). De acordo com os resultados obtidos, os indivíduos com ELA apresentaram alteração no padrão eletromiográfico, na função mastigatória e na força de mordida molar máxima, entretanto, o mesmo não foi observado com relação à espessura muscular. Dessa forma, concluiu-se que a doença ELA promoveu alterações funcionais na atuação do complexo sistema estomatognático, como a hiperatividade muscular e diminuição da eficiência mastigatória e da força de mordida, o que compromete muito a qualidade de vida dos indivíduos com ELA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease that affects the motor neuron system preventing the skeletal striated muscles from functioning properly. The objective of this study was to analyze the masseter and temporal muscles of individuals with ALS by surface electromyography, masticatory function, and ultrasonography. Maximal molar bite force was also evaluated. Thirty individuals, aged 18 to 68 years old, were distributed into two groups: Amyotrophic lateral sclerosis group (mean age of 43.46 ± 3.67; n=15) and Control group (mean age of 43.33 ± 3.93 years; n = 15). A MyoSystem-I P84 electromyographer was used to evaluate the muscle activity in different conditions: rest, protrusion, right laterality, left laterality, tooth clenching in maximal voluntary contraction, with and without Parafilm M®. The efficiency of the masticatory cycle was analyzed by the integral of the signal envelope EMG during habitual and non-habitual mastication. Muscle thickness analyses were performed with a SonoSite NanoMax ultrasound tool. Acquisitions were made during rest, and maximal voluntary contraction. Maximal molar bite force (right and left sides) records were taken with a digital dynamometer Kratos. The electromyographic, ultrasound and maximal molar bite data were tabulated and submitted to statistical analysis using SPSS version 21.0 (Student t-test; p≤0.05). Statistically significant differences were found between the ALS group and controls during rest for the right (p = 0.03) and left masseter muscles (p = 0.03); protrusion for the left masseter (p=0.00) and right (p=000) and left temporal (p=0.03) muscles; during left laterality for the right (p=0.00), left masseter (p=0.00) and left temporal (p=0.00); and during nonhabitual mastication for the right masseter (p=0.00) and right temporal muscles (p=0.04). Based on the results obtained, the individuals with ALS showed different patterns of muscle activity and of masticatory function. Results differed for muscle thickness. In conclusion, ASL promoted functional changes in the stomatognathic system, including muscular hyperactivity and decreased masticatory efficiency and maximal molar bite force, which can affect the quality of life for individuals with ALS.

As doenças do neurônio motor (DNM) apresentam grande variabilidade clínica e genética. A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é a forma mais comum de DNM de início tardio. Sua manifestação devastadora e incurável leva a uma profunda perda da qualidade de vida do paciente. A ELA8 é uma forma autossômica dominante de ELA familial causada por mutações no gene VAPB. A proteína VAPB está envolvida com diversos processos celulares. Nossos dados sugerem que a mutação P56S na VAPB diminui a interação dela com outras duas outras proteínas: Tubulina e GAPDH. Por terem sido previamente relacionadas a outras formas de doenças neurodegenerativas, essas proteínas são potenciais pontos-chave para desvendar a patogênese da ELA8 e de outras formas de DNM. Um número significativo de drogas testadas com sucesso em modelos animais de ELA não pôde ser transferido para os pacientes, trazendo à tona a necessidade de novos sistemas de estudo da doença. A tecnologia das iPSC torna possível a reprogramação celular para um estágio de pluripotência, permitindo a modelagem de doenças in vitro. Apresentamos um novo modelo de ELA baseado em células iPSC derivadas de pacientes com ELA8. Este modelo apresenta uma redução dos níveis de VAPB quando comparado com os controles. Contudo, não identificamos os agregados intracitoplasmáticos, característicos dos modelos de super-expressão. Mostramos pela primeira vez que células-tronco embrionárias humanas normais expressam VAPB. Adicionalmente, nossos resultados sugerem que os pacientes com ELA8 teriam uma redução dos níveis de VAPB desde o início de suas vidas e revelam a importância de modelar a ELA num background humano. Dessa forma, sugerimos a hipótese de que quantidades específicas de VAPB sejam cruciais para a viabilidade dos neurônios motores. A busca por alterações no número de cópias levou à identificação do primeiro caso de uma duplicação multi-exônica (exon10_12dup) no gene SPG4, ampliando o espectro de mutações encontradas nesse gene. Esta mutação leva à formação de um códon de parada prematuro, sugerindo que a proteína produzida não é funcional. A análise de 30 indivíduos portadores desta mutação mostrou que os homens possuem, na média, idade de início antecipada e quadro clínico mais severo. Esses dados sugerem que certas doenças neuromusculares podem ser moduladas por fatores relacionados ao background individual e ao gênero. Em suma, apoiamos a idéia de que os microtúbulos estariam envolvidos na patogênese das doenças neuromusculares, visto que tanto a VAPB quanto a Espastina interagem com estes elementos do citoesqueleto. Ainda, apresentamos um novo modelo in vitro de análise da ELA e além de justificar os estudos num background humano. / The motor neuron diseases (MND) show a huge clinical and genetic variability. Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is the most common late-onset form of MND. ALSs devastating and incurable manifestation leads to a profound loss of life quality. ALS8 is an autosomal dominant form of ALS caused by mutations in the VAPB gene. The VAPB protein is involved with many cellular processes and our data suggest that P56S mutation in this protein reduces its interaction with two other proteins: Tubulin and GAPDH. Since these proteins were previously related to other types of neurodegenerative diseases they potentially are key points to reveal the processes responsible for ALS8 and other MND. A substantial number of successful drug tests in ALS animal models could not be translated to humans, showing the need of novel ALS systems. iPSC technology made possible cellular reprogramming. The iPSC technology brings new hope in this area since it can be used to model diseases in vitro. Here we present a new ALS model based on ALS8-iPSC. Compared to control samples, this model shows a reduction of VAPB levels. However, we could not identify intracytoplasmic aggregates, which characterize overexpression models. We show for the first time that human embryonic stem cells express VAPB. Combined with results showing a VAPB reduction in ALS8 samples, it suggests that ALS8 patients present diminished protein levels since the beginning of their lives and reveal the importance of modeling ALS in a human background. The search for copy number variations has led to the identification of the first multiexonic duplication (exon10_12dup) in SPG4 gene, expanding the mutation spectrum in this gene. This mutation leads to a premature stop codon, which suggests that the expressed protein is not functional. The analysis of 30 individuals who carry the mutation showed that males have on average an earlier AAO and are more severely affected. These data suggest specific neuromuscular diseases can be modulated by factors related to individual background and gender. In sum, we support the idea that microtubules can be involved with neuromuscular disorders pathogenesis, since both VAPB and Spastin interact with these cytoskeleton components. Additionally, we present a new in vitro model to ALS analysis and we justify the studies in a human background.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa e progressiva que acomete o sistema neuromotor impedindo a correta funcionalidade da musculatura estriada esquelética. O objetivo deste estudo foi avaliar os músculos masseteres e temporais por meio da eletromiografia de superfície, função mastigatória e ultrassonografia de indivíduos com ELA. A força de mordida molar máxima também foi avaliada. Trinta indivíduos, com idade entre 18 e 68 anos, participaram do estudo. Estes foram distribuídos em dois Grupos: GELA - participantes com ELA, n=15 (idade média de 43,46 ± 3,67 anos) e GC: controle, participantes saudáveis, n=15 (idade média foi de 43,33 ± 3,93 anos). Foi utilizado o eletromiógrafo MyoSystem-I P84 para avaliar a atividade eletromiográfica (EMG) nas condições de repouso mandibular, protrusão, lateralidade direita e esquerda, apertamento dental em contração voluntária máxima com e sem parafilme M®. A eficiência mastigatória foi analisada por meio da integral da envoltória do sinal eletromiográfico dos ciclos mastigatórios na mastigação habitual e não habitual. Para a obtenção da espessura muscular nas condições de repouso e apertamento dental em contração voluntária máxima foi utilizado o aparelho de ultrassom SonoSite NanoMax e para a análise da força de mordida molar máxima direita e esquerda foi utilizado o dinamômetro digital Kratos. Os dados eletromiográficos, ultrassonográficos e de força de mordida molar máxima foram tabulados e submetidos à análise estatística utilizando o software SPSS versão 21.0 (teste t de student; p≤0,05). Verificou-se diferença estatística entre os Grupos ELA e Controle, na condição de repouso mandibular para os músculos masseter direito (p=0,03) e esquerdo (p=0,03); na condição de protrusão para os músculos masseter esquerdo (p=0,00) e temporais direito (p=0,00) e esquerdo (p=0,03); na condição de lateralidade esquerda para os músculos masseter direito (p=0,00), masseter esquerdo (p=0,00) e temporal esquerdo (p=0,00); e na condição de mastigação não habitual para os músculos masseter direito (p=0,00) e temporal direito (p=0,04). De acordo com os resultados obtidos, os indivíduos com ELA apresentaram alteração no padrão eletromiográfico, na função mastigatória e na força de mordida molar máxima, entretanto, o mesmo não foi observado com relação à espessura muscular. Dessa forma, concluiu-se que a doença ELA promoveu alterações funcionais na atuação do complexo sistema estomatognático, como a hiperatividade muscular e diminuição da eficiência mastigatória e da força de mordida, o que compromete muito a qualidade de vida dos indivíduos com ELA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease that affects the motor neuron system preventing the skeletal striated muscles from functioning properly. The objective of this study was to analyze the masseter and temporal muscles of individuals with ALS by surface electromyography, masticatory function, and ultrasonography. Maximal molar bite force was also evaluated. Thirty individuals, aged 18 to 68 years old, were distributed into two groups: Amyotrophic lateral sclerosis group (mean age of 43.46 ± 3.67; n=15) and Control group (mean age of 43.33 ± 3.93 years; n = 15). A MyoSystem-I P84 electromyographer was used to evaluate the muscle activity in different conditions: rest, protrusion, right laterality, left laterality, tooth clenching in maximal voluntary contraction, with and without Parafilm M®. The efficiency of the masticatory cycle was analyzed by the integral of the signal envelope EMG during habitual and non-habitual mastication. Muscle thickness analyses were performed with a SonoSite NanoMax ultrasound tool. Acquisitions were made during rest, and maximal voluntary contraction. Maximal molar bite force (right and left sides) records were taken with a digital dynamometer Kratos. The electromyographic, ultrasound and maximal molar bite data were tabulated and submitted to statistical analysis using SPSS version 21.0 (Student t-test; p≤0.05). Statistically significant differences were found between the ALS group and controls during rest for the right (p = 0.03) and left masseter muscles (p = 0.03); protrusion for the left masseter (p=0.00) and right (p=000) and left temporal (p=0.03) muscles; during left laterality for the right (p=0.00), left masseter (p=0.00) and left temporal (p=0.00); and during nonhabitual mastication for the right masseter (p=0.00) and right temporal muscles (p=0.04). Based on the results obtained, the individuals with ALS showed different patterns of muscle activity and of masticatory function. Results differed for muscle thickness. In conclusion, ASL promoted functional changes in the stomatognathic system, including muscular hyperactivity and decreased masticatory efficiency and maximal molar bite force, which can affect the quality of life for individuals with ALS.

Orientadora: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / Entender os mecanismos pelos quais os radicais livres e espécies oxidantes atuam em processos fisiológicos torna-se cada vez mais complexo, especialmente aqueles envolvendo metais de transição com elevada atividade redox como o cobre, ou com funções celulares como o zinco, ambos presentes na metaloenzima Cu,Zn-Superóxido Dismutase (SOD1). Muitos processos envolvendo a sua agregação e função peroxidásica deletéria ainda estão em plena discussão na literatura , mesmo após mais de 40 anos de sua descoberta e caracterização. Nesta área de pesquisa, o papel de mutações na enzima relacionado a casos familiares da doença Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) começou a ser elucidado recentemente, quando soube-se que o tipo de agregação proteica observado e a gravidade da doença apresenta relação com o tipo de mutação na SOD1. Mutações que afetam o modo de coordenação do zinco são as mais intrigantes, pois revelam uma alta patogenicidade da ELA. Sabe-se muito pouco sobre como a SOD1 estaria envolvida com casos de ELA esporádicos, mais comumente encontrados, e nossa proposta esta relacionada a alterações no sítio de ligação ao zinco na enzima, levando a agregações proteicas e formas agressivas da doença. Portanto, neste trabalho de Doutorado, foi estudada a mutação sítio dirigida T135SK136E da SOD1 em relação ao comportamento estrutural e catalítico da proteína. Estudos de Dicroísmo Circular e Ressonância Paramagnética Eletrônica mostraram que a mutação causa alterações estruturais, sem alterar, no entanto, o sítio catalítico da enzima. A proteína mutada apresentou dificuldade em alocar os metais Cobre e Zinco em seus sítios metálicos, porem, mostrou maior atividade catalítica quando comparada à SOD1 nativa. / Mechanisms involving Free-radical and oxidant species are too complexes to understand, especially those which involves high redox activity transition metals ions as copper, or those that are part of cell function, as zinc, both present at metaloenzyme Cu,Zn-Superoxide Dismutase (SOD1). It is known that many process involving SOD1 aggregation and peroxidase activity remain in literature discussion even more than 45 years from its discovery and characterization. In this research area the role of mutation on the enzyme related to cases of familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) begins to be elucidated and mutations related to zinc coordination are more intriguing because they seem to cause a more pathogenic ALS. In this way, in this PhD work we studied the site-direct mutation T135SK136E on SOD1, taking special attention to zinc site, to verify how the enzyme acts catalytic and structurally. Circular Dichroism and Electronic Paramagnetic Resonance assays have shown that the mutation causes structural alterations, without altering, however, the catalytic site of the enzyme. The mutated protein presented difficulty in allocating the copper and zinc metals in their metallic sites, but showed greater catalytic activity when compared to wild type SOD1.

Introdução: A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva, de etiologia desconhecida, que envolve os neurônios motores do córtex cerebral, do tronco encefálico e da medula espinhal. O comprometimento dos neurônios motores inferiores causa disfagia, distúrbios de fala e outros sintomas, como fraqueza muscular global e sintomas respiratórios. A dificuldade de deglutição ou disfagia pode causar complicações, como pneumonia aspirativa, má nutrição e desidratação, e afeta a qualidade de vida destes pacientes, sendo necessária a indicação de via alternativa de nutrição. Atualmente, esta indicação é dada subjetivamente pelo exame clínico e funcional realizado pela equipe multidisciplinar, de acordo com a deterioração dos parâmetros da função respiratória, do estado nutricional e de comprometimentos na deglutição. Objetivos: objetivo geral: verificar se a redução de pressão de língua pode ser indicadora de necessidade de gastrostomia (GEP) como via alternativa de nutrição em pacientes com diagnóstico de ELA. Objetivos específicos: verificar se há redução significativa nas medidas funcionais e de pressão de lábio, de língua e de bochecha entre o momento da primeira avaliação e da indicação da GEP; avaliar o tempo desde o primeiro sintoma da doença até a indicação da GEP; verificar se o tempo de indicação da GEP foi influenciado por variáveis demográficas, manifestação clínica inicial (espinhal ou bulbar), condições clínicas, medidas funcionais globais e de deglutição, com destaque para pressão de língua, de lábios e de bochechas. Métodos: Foram estudados longitudinalmente 63 pacientes, avaliados do ponto de vista fonoaudiológico com os instrumentos: escala ASHA, escala ALSFRS, avaliação funcional, medida de pressão dos órgãos fonoarticulatórios com o aparelho IOPI, encaminhamento para videoendoscopia da deglutição (VED) e capacidade vital forçada (CVF) no momento da indicação da GEP. Resultados: Os pacientes tinham faixa etária entre 28 e 79 anos (média de 58 anos de idade), com média de 7,04 anos de escolaridade, tempo médio de doença no momento da avaliação inicial de 34,96 meses, 32% manifestação clínica inicial da forma bulbar, 39,5% espinhal membros superiores e 28,5% espinhal membros inferiores, porém, na avaliação fonoaudiológica inicial, todos apresentavam alguma queixa de acometimento bulbar. Cinquenta pacientes foram encaminhados à GEP, 1 foi a óbito e 12 mantiveram dieta via oral exclusiva até o término do estudo. Medidas funcionais e de pressão de língua, lábio e bochecha apresentaram redução significativa no agravamento da ELA (p < 0,001). Dificuldades com líquido espessado: de contenção (p=0,001), de transporte (p=0,005) e de proteção de vias aéreas inferiores (p =0,003), e com a consistência pastosa: contenção na cavidade oral, (p < 0,001) observadas em avaliações clínicas fonoaudiológicas, e a idade (p =0,014) influenciam na indicação de GEP. Conclusão: A medida de pressão de língua pode, portanto, servir como um indicador adicional, objetivo e prático para o exame do prognóstico da funcionalidade da deglutição, e, em particular, da possibilidade ou não de manutenção de vias tradicionais em pacientes com diagnóstico de ELA / Introduction: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease of unknown etiology that involves motor neurons from the cerebral cortex, from the brainstem and from the spinal cord. The damage on the lower motor neurons causes dysphagia, speech disorders and other symptoms such as overall muscle weakness and respiratory symptoms. The difficulty in swallowing, or dysphasia, may cause complications such as aspiration pneumonia, malnutrition and dehydration and affects the quality of live of these patients. Thus, it is necessary to indicate and alternative form of nutrition. This indication is currently given subjectively by the clinical and functional evaluation performed by the multidisciplinary team, according to deterioration of respiratory function parameters, nutritional status and swallowing impairments. Objectives: general objective: verify if reduced tongue pressure could indicate the need for gastrostomy (PEG) as an alternative form of nutrition for patients who have been diagnosed with ALS. Specific objectives: verify if there is significant reduction on tongue, lips, and cheeks pressure as well as functional measures between the moment of the first evaluation and the indication of PEG; evaluate the time between the first symptom of the disease and the indication of PEG; verify if the time of the indication of PEG was influenced by demographic variables, initial clinical manifestation (spinal or bulbar forms), clinical conditions, global and swallowing functional measures, highlighting tongue, lips and cheeks pressure. Methods: 63 patients have been longitudinally studied. They have been assessed from the speech-language therapy point of view with the following instruments: ASHA, ALSFRS, functional evaluation, pressure measurement of the phono-articulatory organs with the IOPI, referral to videoendoscopy of swallowing and FVC at the moment of the indication of PEG. Results: The patients, whose ages ranged from 28 to 79 years old (average of 58 years old), had, on average, 7.04 years of education. They had been suffering from the disease for an average of 34.96 months at the time of the first evaluation. 32% showed initial clinical manifestation of the bulbar form, 39.5% upper limbs spinal form and 28.5% lower limbs spinal form. At the initial speech-language therapy assessment, however, all of them showed some sort of complaint regarding bulbar impairment. 50 patients were sent to PEG, 1 died and 12 continued with an oral exclusive diet until the end of this study. Tongue, lips and cheeks as well as functional measures showed significant decrease with the aggravation of ALS (p < 0,001). Difficulties with thickened liquid: with containment (p=0,001), with transport (p=0,005) and with protection of lower airways (p =0,003) and with pasty consistencies: containment in the oral cavity, (p < 0,001) observed in speech-language therapy clinical assessments, as well as age (p =0,014) have influence on the indication of PEG. Conclusion: The measure of the tongue pressure can, therefore, serve as an additional, objective and practical indicator for the evaluation of the prognosis of swallowing functionality, particularly of the possibility or not of maintenance of traditional forms in patients who have been diagnosed with ALS

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal causada pela degeneração seletiva dos neurônios motores do cérebro e medula. Dos casos familiares de ELA (fELA), 20% são causados por mutações pontuais no gene da sod1. O ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3, DHA) é um ácido graxo altamente insaturado, sendo um dos principais ácidos graxos da massa cinzenta do cérebro. Estudos têm correlacionado mutações de SOD1 com a formação de agregados que poderiam ser induzidos por ácidos graxos insaturados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos e mecanismos do DHA e de seus hidroperóxidos (DHAOOH) na agregação de SOD1 in vitro. As análises de dicroísmo circular (CD) mostraram mudanças na estrutura secundária de ambas as proteínas apo-SOD1WT e G93A promovidas pelo DHA, resultando em aumento de superfície hidrofóbica e formação de estruturas do tipo beta-amilóide, como mostrado pelos ensaios do bis- ANS e Tioflavina, respectivamente. Estas mudanças resultam na formação de agregados amorfos como observado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Espécies de alto peso molecular foram observadas nas incubações do DHA com as formas apo da SOD1 por SDS-PAGE sob condições não redutoras e também por cromatografia de exclusão por tamanho. A formação dos agregados mostrou-se dependente de resíduos de Cys na sua forma desprotonada, visto que agregados não foram observados na presença de beta-mercaptoetanol e sua formação foi inibida na presença de bloqueador de tióis e em pH ácido. Além disso, análises por cromatografia de exclusão mostraram que a agregação é dependente da insaturação e conformação cis dos ácidos graxos. Comparativamente ao DHA, os hidroperóxidos do DHA tiveram um efeito menor na agregação de SOD1, porém revelaram a propriedade de induzir a dimerização covalente de SOD1. No geral, os dados mostram que o DHA induz a agregação de SOD1, através de um processo envolvendo a exposição de superfícies hidrofóbicas, formação de pontes dissulfeto e também de possíveis cross-links envolvendo reações do tipo \"ene-tiol\". / ALS is a progressive and fatal disease caused by selective degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. Twenty percent of familial ALS (fALS) cases are caused mainly by point mutations in the sod1 gene. Docosahexaenoic acid (C22:6, n-3, DHA) is a highly unsaturated fatty acid, wich is one of the main fatty acids in the cerebral gray matter. Studies have linked SOD1 mutations to the formation of aggregates that could be induced by unsaturated fatty acids. The aim of this study was to evaluate the effect of DHA on aggregation of SOD1 fALS mutants in vitro and its mechanisms. CD analysis shows changes in the secondary structure of both apo-SOD1WT and G93A promoted by DHA resulting in an increase in the surface hydrophobicity and formation of structures such as beta amyloid, which was also confirmed by bis-ANS assay and Thioflavin, respectively. These changes enhance the interaction of SOD1 and DHA, leading to amorphous aggregates as revealed by FESEM. Incubation of DHA with apo-SOD1 forms results in high-molecular weight species as detected by SDS-PAGE analyses under non-reducing conditions and also by size exclusion chromatography. This appears to require Cys residues in their thiolate forms because high aggregates are not observed under reducing conditions and also by size exclusion chromatography or at acidic pH. Also, size-exclusion chromatography indicates that the mutant apo-SOD1 aggregation is dependent on the unsaturation and cis-conformation of fatty acids. Compared to the DHA, DHAOOH had a minor effect on SOD1 aggregation, however revealed the ability to induce covalent dimerization of SOD1. Overall, the data suggest a mechanism of DHA aggregation, by a process involving exposure to hydrophobic surfaces, formation of disulfide bonds and also for possible cross-links involving reactions such \"thiol-ene\".

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva e incurável, caracterizada pela perda seletiva dos neurônios motores (NM) superiores e inferiores com uma sobrevida média de 3 anos. As manifestações clínicas dependem da topografia e comprometimento dos NM. De causa desconhecida, descrições apontam para a participação das células gliais (astrócitos, microglia e célula de Schwann) na toxicidade neuronal. A retração precoce do axônio no músculo esquelético sugere a participação da célula de Schwann na morte neuronal retrógrada (dying back). Este estudo descreveu as alterações na expressão gênica no nervo motor extensor curto do hálux ainda funcionante dos pacientes ELA e o ramo motor do nervo acessório de sujeitos-controle (19 ELA, sendo 9 ELA espinhal e 5 ELA bulbar; 5 controles), utilizando-se plataformas expandidas de microarranjos de DNA (microarray) e análises de bioinformática (DAVID e os seus bancos de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes e o Gene Onthology Consorciun Anottation). Os resultados foram validados por PCRq e Redes de Interação de Proteínas foram geradas pelo Cytoscape. Foram encontrados 138 genes diferencialmente expressos entre esses grupos. O ribossomo e a síntese proteica foram apontados como elementos centrais no estudo em eventos relacionados tanto à neurotoxicidade quanto a protetivos. As Redes destacaram o gene EPS8 na ELA (ambas as formas, ELA bulbar e espinhal) em relação aos controles e o gene FAU na ELA bulbar em relação à ELA espinhal. Os genes e as vias apontados neste estudo deverão ser testados como alvos terapêuticos em estudos futuros envolvendo a ELA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an incurable progressive neurodegenerative disease characterized by the selective loss of upper and lower motor neurons (MN), with a median survival of 3 years. Clinical manifestations depend on onset site and involvement of the MN. Although the cause of ALS is unknown, reports point towards the participation of glial cells (astrocytes, microglia and Schwann cells) in the neuronal toxicity. The early retraction of the axonium indicates a participation of the Schwann cells in retrograde neuronal death (dying back). The current study described the abnormalities in the genic expression of the functioning extensor hallucis brevis motor neuron from ALS subjects, and the motor branch of the accessory nerve from control subjects (19 ALS, being 9 spinal and 5 bulbar types; 5 controls), through an expanded platform of DNA microarrays and bioinformatics analyses (DAVID, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, and Gene Onthology Consortium Annotation databases). The results were validated by Quantitative PCR (PCRq) and Protein-Protein interaction network generated by Cytoscape. A total of 138 differentially expressed genes were found in these groups. In this study, the ribosome and protein synthesis were pointed as central elements related both to neurotoxicity and protective events. These networks highlighted the EPS8 gene in ALS (in both types, bulbar and spinal) when correlated to controls, and the FAU gene in bulbar ALS in relation to spinal ALS. The genes and pathways identified in this study should be tested as therapeutic targets in future studies approaching ALS

Esta pesquisa se desenvolveu a partir da parceria entre o Projeto APOIAR do Laboratório de Saúde Mental e Psicologia Clinica Social do Instituto de Psicologia da USP e a ABRELA (Associação Brasileira de Esclerose Lateral Amiotrófica). O estudo refere-se à investigação e compreensão de aspectos afetivos, emocionais e de qualidade de vida dos profissionais da área de saúde, enfocando sua relação com cuidadores e pacientes portadores de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), doença degenerativa dos neurônios motores, sem prognóstico de cura, embora com a consciência mantida até a morte. Foi empregado o método clínico de pesquisa em onze profissionais, médicos, assistentes sociais, fisioterapeutas respiratórios e motor, nutricionista e terapeuta ocupacional, no setor da Neuromuscular da UNIFESP/Escola Paulista de Medicina em parceria com a ABRELA. Foram empregados como instrumentos: Entrevista Psicológica Semi Estruturada, Método de Rorschach pelo Sistema de Avaliação Aníbal Silveira (sendo alguns índices selecionados) e o Questionário de Vida de McGill. Os dados foram tratados considerando o grupo de forma geral e não de modo individualizado. Principais resultados obtidos apontam para a maturidade do grupo de profissionais, a sensibilidade da maioria à dor e ao sofrimento dos pacientes, com respostas que denotam afetividade, frustração diante da falta de cura e sucesso no tratamento. Demonstram qualidade de vida preservada, e os dados sugerem que trabalham na área que escolheram apesar das dificuldades que sentem. Sugere-se que sejam implementados programas que possam dar aos profissionais de saúde o suporte necessário para que se mantenham como o grupo estudado nessa pesquisa, em condições de dar conta do contato com pacientes com enfermidades graves e crônicas como a ELA. / The actual research was possible due to the partnership between the Project APOIAR (SUPPORT) of the Laboratory of Mental Health and Clinical Psychology of the Institute of Psychology of USP University of Sao Paulo, and ABRELA ( Brazilian Association of Amyotrophic Lateral Sclerosis ( ALS ). This study intends to investigate and better understand the Quality of Life and emotional aspects of health professionals in their relationship with ALS patients and their carers. ALS is a degenerative illness which affects motor neurons causing severe physical impediments, even tough its patients continue lucid up to their death. This illness does not have a prognosis of cure. We have applied the Clinical Method of survey and research on eleven professionals physicians, social workers, motor and respiratory physiotherapists, nutritionist and occupational therapist from de Department of neuromuscular of UNIFESP/ Federal Paulista Medical School and partnership with ABRELA. The study Instruments used were the Semi- Structured psychological Interview, the Rorschach Method ( the Evaluation System by Anibal Silveira) and the Questionnaire of Quality of Life. The collected data considered the group as a whole and not individuals. The main results point towards the maturity of the group of health professionals and their sensitivity related to the pain and suffering of patients, with answers showing affection and frustration due to impossibility of cure and success of treatment. The results show preserved Quality of Life and suggest that those health professionals work within their chosen specialty despite their difficulties.The study suggests the need of implementing programs which give health professionals the necessary support, as shown in this study, so that they can deal with their patients with serious and chronic illnesses such ALS.

Introdução: A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença degenerativa e progressiva que afeta neurônios motores da medula espinhal, tronco cerebral e/ ou córtex motor. Sua manifestação clínica é bastante variada, sua etiologia desconhecida e a progressão, fatal. Não existe ainda um tratamento curativo para a ELA, porém alguns medicamentos e a realização de fisioterapia podem auxiliar, fornecendo ao paciente uma melhor qualidade de vida. Objetivos: Testar a hipótese de que técnicas quantitativas de Ressonância Magnética (RM) são eficazes para detectar a lesão neuronal no encéfalo de pacientes com ELA no estágio inicial da doença e, verificar se existe correlação entre a lesão encefálica e a perda funcional do paciente. Dessa forma, pretende-se estabelecer um protocolo capaz de contribuir para o diagnóstico precoce da ELA. Metodologia: Quinze pacientes com diagnóstico de ELA definida ou provável (12 homens e três mulheres), com idade entre 37 e 79 anos e seus respectivos controles foram submetidos a um protocolo de avaliação por RM, que incluiu um estudo estrutural volumétrico e quantitativo do dano neuronal e mielínico por razão de sequências ponderadas em T1 e FLAIR, da Transferência de Magnetização (MT), Relaxometria, Anisotropia Fracionada (FA) e Difusão (DTI), além da Espectroscopia de prótons. Alguns dos sujeitos foram submetidos também à uma avaliação física de força muscular, de funcionalidade através da Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale Revised (ALSFRS-R), de qualidade de vida através da Amyotrophic Lateral Sclerosis Assessment Questionnaire (ALSAQ-40) e de quantificação da fadiga pela Fadigue Severity Scale (FSS). Os dados da RM dos dois grupos foram comparados através da análise de variância multi e univariada e submetidos à correção de múltiplas comparações de Bonferroni. Nas variáveis com diferença significante entre os grupos, foi estudada a validade preditiva da medida, calculando-se a área sob a curva ROC e estabelecidos os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia. Os dados das escalas foram comparados pelo teste de Mann-Whitney e correlacionados entre si e com as estruturas através da correlação de Spearman. Resultados: As várias técnicas da RM, com exceção da MT, identificaram pelo menos uma estrutura com diferença significante entre os dois grupos, totalizando 11 estruturas mais a razão dos metabólitos NAA/Cre. Os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia foram satisfatórios variando entre 0,60 e 1,00 , com destaque para o Volume do Giro Superior Frontal Direito e Giro Superior Frontal Esquerdo que apresentaram valores 1,00 , 0,93 e 0,97 , respectivamente. As escalas ALSFRS-R e ALSAQ-40 apresentaram diferença significativa entre os dois grupos, mas a FSS não apresentou. As escalas apresentaram correlação significativa entre si em quase todos os escores totais e domínios. Já a correlação das escalas com as estruturas foi significativa apenas para o Volume. Conclusões: Técnicas como DTI, FA, Relaxometria e Volume se mostraram mais eficazes no diagnóstico precoce de pacientes com ELA do que as outras. A redução de volume de substância cinzenta se correlacionou positivamente com a ALSFRS-R. Por fim, propomos um protocolo para avaliação de pacientes com ELA, que inclua imagem volumétrica de alta resolução para cálculo da Volumetria e DTI. / Introduction: Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive and degenerative disease that affects motor neurons in the spinal cord, brain stem and/ or motor cortex. Their clinical presentation is varied, its unknown etiology and fatal progression. There isnt still a curative treatment for ALS, but some medications and physical therapy can help by providing the patient a better quality of life. Objectives: To test the hypothesis that quantitative techniques of magnetic resonance imaging (MRI) are effective to detect neuronal damage in the brain of patients with ALS at the inicial stage of the disease and see if there is a correlation between brain injury and functional loss of the patient. Thus, we intend to establish a protocol can to contribute to early diagnosis of ALS. Methods: Fifteen patients with definite or probable ALS (12 men and three women) aged between 37 and 79 and their respective controls underwent an MRI evaluation protocol, including a volumetric and quantitative structural study of damage neuronal and myelin by reason of T1-weighted sequences and FLAIR , Magnetization Transfer (MT), Relaxometry, Fractional Anisotropy (FA), Diffusion (DTI) and Proton magnetic resonance spectroscopy. Some of the subjects also underwent a physical assessment of muscle strength, functionality by Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale Revised (ALSFRS-R), quality of life through the Amyotrophic Lateral Sclerosis Assessment Questionnaire (ALSAQ-40) and quantification of fatigue by Fadigue Severity Scale (FSS). The MRI data of the two groups were compared using analysis of variance multivariate and univariate and submitted to correction for multiple comparisons of Bonferroni. In the variables with significant differences between groups, we studied the predictive validity of the measure, by calculating the area under the ROC curve and set the sensitivity, specificity and accuracy. The data of the scales were compared using Mann-Whitney test and correlated with each other and with the structures by Spearman correlation. Results: The various MRI techniques, with the exception of MT, identified at least one structure with a significant difference between the two groups, a total of 11 structures over the reason for the metabolites NAA/Cre. The sensitivity, specificity and accuracy were satisfactory ranging from 0.60 to 1.00 , with emphasis on Volume of Gyros Superior Frontal Right and Gyros Superior Frontal Left that averaged 1.00 , 0.93 and 0,97 , respectively. The ALSFRS-R and ALSAQ-40 scales showed significant differences between the two groups, but the FSS did not. The scales were significantly correlated with each other in almost all domains and total scores. The correlation with the structures of the scales was significant only for the Volume. Conclusions: Techniques such as DTI, FA, Relaxometry and Volume are more effective in early diagnosis of ALS patients than others. The decrease in gray matter volume was positively correlated with the ALSFRS-R. Finally, we propose a protocol for evaluation patients with ALS, including high-resolution volumetric image to calculate the Volume and DTI.

As espécies reativas são associadas a processos toxicológicos e fisiopatológicos, agindo como importantes mediadores, por exemplo, na sinalização celular. Diversas classes de compostos têm sido utilizadas como possíveis biomarcadores de estresse redox, destacando-se os aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, capazes de alquilar biomoléculas como o DNA. Para evitar efeitos deletérios, estes aldeídos são detoxificados por glutationilação e posterior metabolização a derivados mercaptúricos. Contudo, avaliar o estado redox em sistemas biológicos ainda é tarefa bastante complexa, sendo a dificuldade em quantificar de forma prática e acurada os efeitos de sinalização e/ou dano molecular o maior problema dos estudos redox. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos acurados e sensíveis de análise de potenciais biomarcadores de estresse redox, isto é: nucleosídeos modificados, aldeídos endógenos e exógenos, glutationa e produtos de glutationilação, e avaliá-los em sistemas modelos, celular e animal, e em humanos. A avaliação dos níveis urinários de três nucleosídeos modificados por metodologia de HPLC-MS/MS desenvolvida pelo grupo em moradores da cidade de São Paulo - região com poluição atmosférica - demonstrou aumento significativo de 1,N2-propanodGuo comparado aos moradores de região não poluída. Ademais, comprova-se pela primeira vez que células deficientes em reparo de ligações cruzadas apresentam níveis basais elevados de 1,N2-propanodGuo, em duas linhagens independentes, colocando este aduto como potencial mediador de carcinogênese em pacientes portadores de Anemia de Fanconi. Utilizando cérebro de ratos SOD1G93A (modelo de Esclerose Lateral Amiotrófica - ELA), verificou-se aumento de 50% nos níveis de 1,N2-propanodGuo e de 100% nos de 1,N6-&#949;dAdo em fase sintomática, sugerindo influência do conteúdo lipídico cerebral, levando a comprometimento do metabolismo neuronal e morte celular. O perfil de aldeídos determinado em cérebro de ratos SOD1G93A demonstrou aumento de trans-hexa-2-enal e trans,trans-hexa-2,4-dienal em fase assintomática e de trans,trans-deca-2,4-dienal em fase sintomática, não sendo observada nenhuma alteração na medula. Conhecer estas variações permite direcionar estudos de modificações em biomoléculas, além de a metodologia per se corroborar com as áreas de análises lipidômicas. Técnicas distintas e o preparo de amostras refletiram nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) relatados. A técnica de espectrometria de massas mostrou-se mais precisa que a detecção eletroquímica; e a alquilação do grupo tiol minimizou interferências de matriz. Por análise de HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS, a quantificação de trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) e crotonaldeido conjugados com GSH demonstrou não haver alterações em cérebro e medula de ratos SOD1G93A. Contudo, há formação esteroespecífica dos adutos de HNE in vivo. Ressalta-se que a metodologia desenvolvida é extremamente sensível e específica e permite análise simultânea de GSH, GSSG, cisteína, cistina e dos adutos supracitados, servindo para análise de outros adutos de glutationilação de aldeídos que possam ser importantes em doenças associadas a estresse redox. / Free radicais and oxidant species are associated with toxicological and pathophysiological processes. It has been demonstrated that production of reactive oxygen species may be involved in cell signaling and regulation. Several biomarkers of redox processes have been used, including adducts formed through the reaction of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes with biomolecules such as DNA. In order to avoid these deleterious effects, aldehydes are detoxified through glutathionylation and further metabolized to mercapturic derivatives. However, assessing the redox status in biological systems is still a very complex task, and the difficulty in practical and accurate quantification of signaling effects and/or molecular damage is a major problem in redox studies. The objective of this work was to develop accurate and sensitive methods for analysis of potential biomarkers of redox stress, i.e., modified nucleosides, endogenous and exogenous aldehydes, glutathione and glutathionylation products, and their evaluation in cell, animal model and humans. Evaluation of urinary levels of 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine (1,N2-propanodGuo), 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine and 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in residents of São Paulo City - polluted region - showed a significant increase (p<0.05) in 1,N2-propanodGuo levels compared to residents of an unpolluted region by a HPLC-MS/MS methodology developed by the group. Moreover, it was proven, for the first time, that repair deficient cells have basal levels of 1,N2-propanodGuo higher than proficient cells in two independent strains, placing 1,N2-propanodGuo as a potential mediator of carcinogenesis in Fanconi Anemia patients. In an Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) animal model (SOD1G93A rat) , a 50% increase in the levels of 1,N2-propanodGuo and 100% in the 1,N6-etheno-2\'-deoxyadenosine in brain tissue in the symptomatic phase was observed, suggesting that the high brain lipid content may play a role, leading to impairment of cell metabolism and neuronal cell death. There is an increase of trans-hex-2-enal and trans,trans-hexa-2,4-dienal in asymptomatic SOD1G93A rats brain and of trans,trans-deca-2,4-dienal in symptomatic ones. However, no alteration was observed in spinal cord. Our approach contributes to a better understanding of the aldehyde status in vivo and allows us to predict biomolecule modifications. The developed methodology can contribute to lipidomic studies. The use of different techniques and sample preparation reflected in the reported levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). The mass spectrometry technique proved to be more accurate than the electrochemical one, and the use of thiol alkylating agent minimizes matrix interference. No changes were observed in the levels of the GSH conjugates of trans-4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and crotonaldehyde in brain and spinal cord of SOD1G93A rats quantified by HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS compared to controls. However, it was observed stereospecific HNE adducts formation in vivo. Note that this methodology is extremely sensitive and specific and allows simultaneous analysis of GSH, GSSG, Cys, cystine and the aforementioned adducts, serving for analysis of other aldehyde-glutathionylation adducts that may be important in pathologies associated with stress redox.