Les biofilms en industries agroalimentaires (IAA) représentent un problème récurrent aux conséquences économiques et de sécurité sanitaire. Le développement de surfaces photoactives aux propriétés antibactériennes pourrait faciliter leur élimination. Une solution serait de déposer une couche mince de dioxyde de titane (TiO2) sur des matériaux rencontrés dans les IAA. Les objectifs de cette thèse ont donc été d’optimiser des couches minces de TiO2 aux propriétés antibactériennes et d’étudier les mécanismes impliqués dans la photocatalyse. Les dépôts sont réalisés par pulvérisation cathodique radiofréquence dans différentes conditions (température, PO2, durée), d’abord sur substrat de verre puis sur acier inoxydable 316La caractérisation des couches minces par microscopie à balayage, diffraction des rayons X, a montré des différences dues au changement de substrat. Les différentes optimisations ont conduit à l’obtention de couches minces possédant une activité photocatalytique et des propriétés antibactériennes sur des souches représentatives de la flore retrouvée dans les IAA de la filière « viande » : L. monocytogenes, Y. enterocolitica et P. fragi. Des diminutions de la population bactérienne entre 1,5Log et 3Log ont été observées. La production d’espèces réactives de l’oxygène (H2O2, ¿OH, O2-¿) a été étudiée par des méthodes spectrocolorimétriques. L’H2O2 à la surface de la couche mince serait converti en ¿OH. L’étude des mécanismes de réponse de L. monocytogenes face à la photocatalyse des couches minces a été initiée par une approche transcriptomique, en suivant l’exp / Biofilms in food industries represent a recurrent problem with economic and health safety implications. The development of photoactive surfaces with antibacterial properties could facilitate their elimination. One solution would be to deposit a thin layer of titanium dioxide (TiO2) on conventional materials used in food plants. The objectives of this thesis were the optimization of thin films of TiO2 with antibacterial properties and to study the mechanisms involved in photocatalysis. Deposits were made by radio-frequency sputtering under different conditions (temperature, oxygen partial pressure, duration), first on a glass substrate and then on 316 stainless steel. Characterization of thin layers by scanning microscopy, diffraction of X-ray, showed differences due to substrate changeTiO2 thin layers obtained either on glass or stainless steel showed photocatalytic and antibacterial properties on representative strains of the flora found in the meat industry: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica and Pseudomonas fragi. Decreases in the bacterial population between 1.5Log and 3Log were observed. The production of reactive oxygen species (ROS) was studied by spectrocolorimetric methods. It seems that H2O2 on the surface is converted in another ROS, ¿OH. Finally, the study of the bacterial response mechanisms to photocatalysis, especially for L. monocytogenes, was initiated by a transcriptomic approach by following the expression of genes involved in the response to oxidative stress. However, the method used requires an optimization in order to be used for the bac

APOBEC3A (Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like editing complex 3 A) appartient à la famille des cytidines désaminases, qui clivent les cytidines en uraciles. APOBEC3G (le modèle de la famille) est un facteur de restriction du VIH : son incorporation dans la particule virale lui permet de désaminer le génome viral néoformé, entrainant hypermutations et dégradation de l’ADN viral. A3A, au contraire, n’est pas incorporée dans la particule virale : la protéine, exprimée spécifiquement dans les cellules myéloïdes de façon inoffensive pour la cellule, agit de la même façon qu’A3G en s’attaquant au virus dès son entrée dans la cellule.Physiologiquement, dans les cellules non-myéloïdes, les APOBEC3 désaminent l’ADN cellulaire simple brin, dont les uraciles sont retirés par UNG2. Les sites abasiques sont clivés par la machinerie de réparation de l’ADN, conduisant parfois à des cassures double-brin et à la mort de la cellule.L’objectif de la thèse était de comprendre cette différence de comportement selon le type cellulaire. Pour cela, des lignées cellulaires inductibles pour A3A ont été créées en cellules HeLa et U937 (monocytaire). Les données obtenues indiquent qu’A3A, partiellement nucléaire, édite l’ADN des cellules en division, conduisant à des dommages à l’ADN, à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et à la mort des cellules. Les cellules différenciées ne présentent pas ce type de dommages, et cela s’explique par une localisation différente de la protéine. Ces résultats permettent de faire pour la première fois le lien entre dommages à l’ADN induits par un membre de la famille des A3 et production de ROS, et donc à l’induction d’une activation immunitaire. Cette activation pourrait avoir des implications dans l’infection ainsi que dans les processus tumorigéniques. / APOBEC3A (Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like editing complex 3 A) belongs to a family of cytidine deaminases that can edit cytidines to uraciles. APOBEC3G (model protein for the family) is a restriction factor for HIV: since it’s incorporated in the viral particle, it can deaminate the newly formed viral genome leading to hypermutation and viral DNA degradation.A3A is not incorporated in the viral particle: this protein is specifically expressed in myeloid cells where it is harmless for the cell and edits the DNA of the incoming viral particle in the same way than A3G.Physiologically, in non-myeloid cells, APOBEC3s deaminate single strand cellular DNA and the resulting uraciles are cut out by UNG2. These abasic sites are cleaved by the DNA repair machinery and can generate double strand breaks that will result in cell death.The objective of the thesis was to understand this difference of behaviour between different cell types. For that purpose, A3A-inducible cell lines were created in HeLa and U937 (monocytic) cells. The results obtained indicate that partially nuclear A3A edits the genomic DNA of cycling cells, leading to DNA damage, to the production of reactive oxygen species (ROS) and to cell death. Differentiated cells do not present this type of damage and that phenotype can be explained by a different localization of the protein.These results link for the first time DNA damage induced by a member of the A3 proteins family to ROS production and to induction of an immune activation. This activation could have implications in infection as well as in tumorigenic processes.

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) évolue généralement vers le développement d’une hépatite C chronique, fréquemment associée à des perturbations métaboliques, (insulinorésistance et stéatose), et de la structure hépatique (fibrose et cirrhose), favorisant le développement d’un hépatocarcinome. Le stress oxydant semble étroitement lié à la progression de ces pathologies, notamment l’insulino-résistance. Or, les mécanismes moléculaires par lesquels le VHC module le stress oxydant restent confus, ainsi que l’effet réciproque du stress oxydant sur la réplication virale. Jusqu’à récemment, la modulation de ce stress a été étudiée in vitro dans des modèles non réplicatifs du VHC ou dans des modèles d’expression ectopiques des protéines virales. Peu d’études ont encore tenté de caractériser l’effet d’une infection complète et productive dans les cellules cibles naturelles du VHC, les hépatocytes. Mes travaux de recherche ont donc consisté à étudier la modulation de la balance redox cellulaire dans un modèle d’infection complet de type HCVcc, et dans les cellules hépatocytaires Huh7.5. Cette étude a permis de caractériser le stress oxydant dans ce modèle, mais surtout d’identifier un antioxydant à activité pro-virale, la glutathion peroxydase 4 (GPx4). En effet, nous avons observé une stimulation viro-induite de l’expression et de l’activité de GPx4, seule enzyme capable de détoxifier les lipides membranaires oxydés. L’expression de cette enzyme semble nécessaire à la réplication ainsi qu’à l’infectivité virale. Son importance pour le VHC résiderait dans son activité catalytique permettant de maintenir l’intégrité des lipides cellulaires nécessaire au cycle viral / Chronic infection with Hepatitis C virus (HCV) is frequently associated with metabolic disturbances (insulin-resistance and steatosis) as well as with changes to hepatic structure (fibrosis and cirrhosis) that favor hepatocellular carcinogenesis. Insulin resistance is in particular linked to oxidative stress, which is thought to play a key role in driving disease progression. However, molecular mechanisms by which HCV regulates oxidative stress are still unclear and reciprocally, the effect of oxidative stress on viral life cycle is not well understood. Until recently, induction of oxidative stress by HCV has mainly been investigated in non replicative in vitro models or in cell systems expressing viral proteins alone. Few studies have yet investigated oxidative stress in the context of productive HCV infection. My work consisted of studying the modulation of the cellular redox system using the HCVcc infection model, based on a replicative HCV isolate and the hepatoma cell line Huh7.5. This work provided a broad characterization of how HCV induces and prevents oxidative stress and identified glutathion peroxidase 4 (GPx4) as a pro-viral antioxydant enzyme. Indeed, we observed an HCVinduced upregulation of expression and activity of GPx4. We also demonstrated that GPx4 expression is required for viral replication and infectivity. As GPx4 possesses a particular catalytic activity, which is the detoxification of oxidized membrane lipids, we investigated the impact of the accumulation of oxidized lipids on HCV replication. These studies showed that GPx4 is an important host factor for HCV life cycle by maintaining membrane lipid integrity in an oxidative cellular environment

Le métabolisme oxydatif joue un rôle important dans l’hématopoïèse normale et leucémique. L’homéostasie des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est un élément crucial qui repose sur une balance finement régulée entre leur élimination et leur production. A ce niveau, des études ont montrés une différence entre cellules souches leucémique (CSL) présentant un faible niveau de ROS et cellules différenciées leucoblastiques présentant un plus fort niveau de ROS. Dans cette étude nous avons montré que les NADPH oxydases sont des producteurs majeurs de ROS des cellules de leucémies aiguës myéloïdes. Les cellules leucoblastiques, quelque soit le stade de différenciation présentent une activité NADPH oxydase constitutive qui contribue à leur niveau de ROS élevé et favorise leur prolifération en accélérant le cycle cellulaire. A l’inverse, les analyses réalisées sur des CSL grâce à des modèles murins de leucémies primaires induites par les oncogènes Hoxa9 et Meis1 suggèrent qu’il existerait une plus faible activité oxydase dans les cellules souches leucémiques. / Oxydative metabolism play a key role in normal and leukemic hematopoiesis. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis is a crucial point which is the result of a finely regulated balance between elimination and production. Recent studies establishe a difference in ROS level between leukemic stem cells (LSC, ROSlow) and differentiated leucoblasts (higher level). In our study we have shown that NADPH oxidases are major ROS producers in acute myeloid leukemic cells. Leukoblasts, wathever their differentition stage, have a constitutive NADPH oxydase activity that contributes to the ROS level and promotes the proliferation by accelerating the cell cycle. Conversly, the analyses of LSCs performed by using murins primary leukemia induced by Hoxa9 and Meis1 oncogens suggest a potential lower NADPH oxidase activity in LSCs.

Dans le monde, 350 000 leucémies sont diagnostiquées chaque année. La rechute reste un problème majeur des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) et le métabolisme oxydatif pourrait jouer un rôle essentiel dans la réponse au traitement. Un faible niveau des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est associé à des propriétés des cellules souches leucémiques et la quiescence alors qu’un niveau plus élevé caractérise les leucoblastes proliférants. L’homéostasie des ROS repose sur un équilibre entre les systèmes oxydants et antioxydants. Les antioxydants sont bien documentés dans les LAM alors que les connaissances sur l’activité oxydante sont encore limitées. Dans ce travail nous avons choisi d’étudier les sept complexes NADPH oxydases (NOX) dans 25 lignées issues de LAM humaines et des LAM primaires. L’analyse des ARNm et des protéines montre des profils d’expression variables entre les lignées avec une expression plus forte des sous-unités du complexe NOX2 dans les lignées correspondant à des stades de différenciation myéloïde plus avancés. L’activité enzymatique des NOX est cependant équivalente entre les lignées. Deux inhibiteurs, DPI et VAS3947, ont été utilisés pour connaître la contribution des NOX à la production des ROS cellulaires. Alors qu’ils ont inhibé l’activité, ils ont aussi généré un stress oxydatif majeur conduisant à une diminution de la prolifération cellulaire et une forte apoptose, le DPI en augmentant les ROS mitochondriaux et VAS3047 les ROS cytoplasmiques. Afin de connaitre les sous-unités impliquées et de mieux comprendre les mécanismes, les sous-unités NOX2 et p22phox ont été inhibée par ARN interférence. Celle-ci n’ont pas affecté la prolifération mais ont montré des effets compensatoires. Nos data montrent qu’inhiber les NOX pourrait s’avérer une stratégie thérapeutique en augmentant le stress oxydatif dans les cellules leucémiques. / 350,000 leukaemia are diagnosed each year worldwide. In acute myeloid leukaemia (AML), relapse remains a major problem and the oxidative metabolism might play a crucial role in the therapeutic response. Low level of reactive oxygen species (ROS) is associated with properties of leukemic stem cells and quiescence whereas higher level promotes leukoblasts proliferation. ROS homeostasis relies on a tightly regulated balance between the oxidant and antioxidant systems. Although the antioxidant system is extensively studied in AML, the oxidant system remains poorly documented. In this work we aimed to study the seven NADPH oxidases (NOX) complexes in 25 AML human cell lines and primary samples. NOX transcriptional and protein profiles are variable with a higher expression of NOX2 in cell lines belonging to mature differentiation stages. An equivalent level of enzymatic activity was observed across all the cell lines. To reveal the contribution of NOX to global ROS production in the cells, two NOX inhibitors, DPI and VAS3947, were then used. Although both inhibitors efficiently blocked NOX activity they unexpectedly triggered strong oxidative stress leading to reduced cell proliferation and strong apoptosis, DPI by increasing mitochondrial ROS while VAS3947 by increasing cytoplasmic ROS production. To highlight which of the subunits were involved and to understand the mechanisms, NOX2 and p22phox subunits were inhibited using shRNA strategy. These did not affect cell proliferation but revealed a compensation effect. Our data suggest that NOX inhibition might be potential therapeutic strategy by increasing oxidative stress in leukemic cells.

La bactérie hyperthermophile Thermotoga maritima a été cultivée dans un fermenteur dans lequel la concentration en O2 a été rigoureusement contrôlée. A 80°C et pH 7, il a été démontré que T. maritima pouvait survivre à des expositons de durées variables à l’O2 et qu’elle était capable de le consommer. La vitesse spécifique de consommation de l’O2 a été estimée à 73.6 µmoles O2.min-1.g protéines-1 lors d’une courte exposition à l’O2 (30 min). De longues expositions à l’O2 (20 h) nous ont permis de démontrer que la présence d’O2 ralentissait la croissance de T. maritima et conduisait à un shift du métabolisme vers la production de lactate aux dépens de l’acétate et à un arrêt de production d’H2. Dans ces conditions, il a été constaté que 73% du glucose était consommé selon un métabolisme partiellement oxydatif faisant intervenir simultanément les deux voies Embden-Meyerhof et Entner-Doudoroff de la glycolyse. En l’occurrence, l’oxydation incomplète du glucose est corrélée à la réduction de l’O2 en eau. Les études transcriptomiques ont montré que cette réduction de l’O2 résultait d’une cascade de réactions intermédiaires faisant intervenir des enzymes de type peroxydases [activation de l’expression des enzymes Ahp (alkyl hydroperoxyde réductase), Bcp1 et Bcp2 (thiol peroxydase thioredoxin-dépendante)] qui acheminent les électrons libérés via les radicaux libres. D’autres enzymes comme la rubréryhtrine et la neelarédoxine interviendraient pour détoxiquer les espèces réactives d’O2. Les électrons libérés seraient au final utilisés pour réduire l’O2 en H2O par l’enzyme FprA, dont l’expression varie en fonction du potentiel redox du milieu de culture. Ce schéma est proposé comme un des éléments essentiels du dispositif enzymatique permettant la consommation de l’O2 et la protection des cellules contre les effets des espèces réactives de l’oxygène chez T. maritima. / Batch cultures of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima were performed in a bioreactor where O2 concentrations in the gas phase were strictly controlled. At 80°C and pH 7, we demonstrated that T. maritima survived despite being exposed to oxygen at different times and that it consumed it. O2 uptake rate was estimated at 73.6 µmoles O2 min-1g proteins-1 during a short exposure to O2 (30 minutes). A long time exposure of T. maritima cultures to oxygen (20h) led to a drastic reduction in growth, together with a shift in glucose metabolism towards lactate instead of acetate production and a stop in H2 production. Under these conditions, it has been observed that 73% of glucose was partially oxidised by using both Embden-Meyerhof and Entner-Doudoroff glycolytic payhways. Uncomplete oxidation of glucose is correlated to a reduction of O2 to H2O. Transcription analyses revealed that this reductive process of O2 involved enzymes like peroxidases [activation of alkyl hydroperoxide reductase (ahp), bcp1 and thioredoxin-dependent thiol peroxidase (bcp 2)]. Moreover, genes encoding reactive oxygen species (ROS)-scavenging systems (neelaredoxin and rubrerythrin), were found to be upregulated during oxygen exposure. The oxygen reductase FprA, which expression was shown to depend on the redox level of the culture medium, is proposed as a primary consumer of O2. All these enzymes are essential for T. maritima to consume O2 consumption and to fight against the toxic effects of ROS in cells.

Les déficits héréditaires de la synthèse de l’hème sont à l’origine de pathologies métaboliques appelées porphyries. La plus sévère est une porphyrie hépatique, la porphyrie aiguë intermittente (PAI). Des liens métaboliques étroits existent entre la synthèse de l’hème et la mitochondrie. L’objectif de ce travail était d’étudier l’impact de la crise aiguë de PAI sur le fonctionnement énergétique mitochondrial. Nous avons montré, dans un modèle murin déficitaire en hydroxymethylbilane synthase (HMBS) mimant biologiquement la crise de PAI, un dysfonctionnement énergétique mitochondrial. L’activité des complexes de la chaîne respiratoire, la respiration mitochondriale et l’activité des enzymes du cycle de Krebs se sont en effet révélées altérées dans ce modèle, tant à l’état basal qu'après induction par le phénobarbital, et ceci dans le foie, le muscle squelettique et le cerveau. Afin d'évaluer les effets d'un excès de précurseurs métaboliques de l'hème, nous analysons, dans un modèle cellulaire, l'effet de l’administration d’acide delta-aminolévulinique (ALA). Cela provoque une altération, dose-dépendante, de la fonction énergétique mitochondriale et une surproduction des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Nos résultats suggèrent un impact profond de la crise de PAI sur la fonction mitochondriale in vivo et in vitro, ce qui pourrait expliquer certaines anomalies métaboliques et cliniques de la maladie. / Hereditary porphyrias are a group of metabolic disorders of the haem biosynthesis pathway, the most severe and important porphyria is the Acute Intermittent Porphyria (AIP). Several metabolic links exist between haem biosynthesis and mitochondria, which is an organelle specialized in energy production. The aim of this work was to examine the impact of the acute attack of AIP on the mitochondrial energetic function. We have shown in a mice model of AIP, with deficiency in the hydroxymethylbilane synthase (HMBS), a mitochondrial metabolic dyfunction, an important alteration in the mitochondrial respiratory complexes activity, and those of Krebs cycle. This deficiency concerned the mice at basal state and after induction by phenobarbital in different tissus (liver, skeletal muscle and brain). In vitro, the administration of delta-aminolevulinic acid, a precursor of haem accumulating in AIP caused a dose-dependent impairment of mitochondrial function with an overproduction of reactive oxygen species (ROS). Our results suggest that acute attack of AIP alters the mitochondrial function in vivo and in vitro. This new data allows to better understand the pathophysiology and the clinical expression of this disease.

L’expression ‘programmation périnatale’ est employée pour décrire les effets à long terme d’un environnement gestationel néfaste observés chez la progéniture. Ce concept est aujourd’hui bien reconnu. Notre laboratoire a déjà démontré l’impact de l’hyperglycémie maternelle sur le développement rénal des embryons à l’aide des souris HoxB7-GFP transgéniques (Tg) et qui se traduit par une augmentation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et une néphrogenèse perturbée. Les rejetons affectés présentent ainsi des reins plus petits et possédant un nombre inférieur de néphrons à la naissance, et développent une hypertension et des dommages rénaux à l’âge adulte (20 semaines). Dans la première étude, nous avons tenté de réduire la production excessive de ROS dans les reins en développement par la surexpression de la catalase (CAT). Pour ce faire, nous avons croisé les souris CAT-Tg qui surexpriment la CAT dans les cellules des tubules proximaux rénaux (RPTCs) aux souris HoxB7-GFP-Tg afin de générer les souris HoxB7/CAT-GFP-Tg. Nous espérons observer la normalisation du nombre de néphrons et la prévention de l’hypertension et des dommages rénaux observés chez la progéniture issue d’un environnement gestational hyperglycémique. Nous avons observé que la surexpression de CAT dans les RPTCs permet de normaliser la dysmorphogenèse rénale présente chez les embryons de mères diabétiques. À l’âge adulte, la surexpression de CAT dans les RPTCs permet également de réduire la génération des ROS et l’hypertension, tout en améliorant la morphologie et la fonction rénale. Afin de définir les mécanismes impliqués dans ce processus, nous avons étudié le rôle potentiel de Nrf2 (‘nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2) related factor-2’; un facteur de transcription des gènes antioxidants) et HO-1 (hème oxygénase-1’; une enzyme antioxidante). À la fois Nrf2 et HO-1 sont de forts antioxidants et ont été rapportés comme protecteurs pour le rein. Nous avons observé une surexpression des gènes et protéines Nrf2 et HO-1, en plus d’une translocation nucléaire accrue de Nrf2, dans les RPTCs de la progéniture des mères diabétiques, indiquant que chez les souris surexprimant CAT, Nrf2 et HO-1 sont tous deux bien activés et fonctionnels. En conclusion, nos études suggèrent que la surexpression de CAT dans les RPTCs permet de prévenir la programmation de l’hypertension et les dommages rénaux observés à l’âge adulte chez la progéniture issue de mères diabétiques, en partie suite à l’activation du système de défense Nrf2-HO-1 dans leurs reins. Il a déjà été démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) intrarénal induit l’hypertension en augmentant la constriction des artérioles et la réabsorption du sodium par les tubules rénaux. Une activation du récepteur AT1R et de ses voies de signalisation induit également les dommages rénaux observés dans plusieurs pathologies. Dans le cadre de mon second article, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel l’angiotensine (Agt) intrarénale induit l’hypertension et des dommages rénaux en réduisant l’expression de l’aquaporine 1 (AQP1, le canal pour l’eau le plus important dans les RPTCs). Des souris transgéniques surexprimant l’Agt de rat (rAgt-Tg) dans leurs RPTCs et des clones stables de cellules immortalisées de tubule proximal de rein de rat (IRPTCs) surexprimant le rAgt (pRSV/rAgt-IRPTC) ont été étudiés. Lorsque comparés aux souris non-transgéniques, les souris rAgt-Tg développent de l’hypertension et des dommages rénaux. Ces changements sont atténués par le traitement avec une double inhibition du RAS (losartan et perindopril). L’expression des protéines AQP1 et HO-1 est réduite dans les RPTCs, tandis que Nrf2 et le transporteur sodique NHE3 sont augmentés, à la fois in vivo et in vitro. Ces changements sont renversés par la double inhibition du RAS chez les animaux expérimentaux. Même si les niveaux de Nrf2 sont élevés, une accumulation cytosolique causée par une augmentation de l’export nucléaire induit par GSK3β se produit et ne parvient donc pas à induire l’expression des gènes en aval comme HO-1, ni à réduire l’expression de l’AQP1. En conclusion, nos résultats suggèrent qu’une déficience en Nrf2 nucléaire mène à une diminution de l’expression de HO-1 et une régulation négative de l’AQP1, jouant un role dans l’hypertension et les dommages rénaux induits par l’Agt intrarénal. L’hypertension et les dommages rénaux sont des maladies très hétérogènes et multifactorielles qui impliquent l’interaction de diverses molécules et voies de signalisations, et sont influencées par plusieurs facteurs environnementaux tels la diète ou la programmation périnatale. Tous ces différents facteurs contribuent à la progression de l’hypertension et des dommages rénaux, rendant les stratégies de traitement d’autant plus complexes. Dans notre étude, nous avons évalué le développement de l’hypertension dans deux circonstances : l’hypertension de la progéniture programmée par le diabète maternel et l’hypertension induite par l’activation du RAS intrarénal. Nous avons démontré que la génération des ROS dans les reins constitue un facteur majeur commun dans nos deux modèles d’hypertension chez la souris. De plus, le gène/facteur de transcription antioxydant Nrf2, sensible aux ROS, joue un rôle important dans le processus. Grâce à une meilleure compréhension des diverses voies qui mènent à la progression de l’hypertension, nous espérons qu’il sera possible de développer de meilleurs traitements pour faire face à l’hypertension. / The term ‘perinatal programming’ is used to describe the phenomenon that maternal adverse environment during pregnancies which have profound influences to their offspring later in life. And this concept is well accepted. Previously, we successfully created an in vivo murine model and demonstrated that maternal diabetes constitutes an adverse in utero environment that may fundamentally impair nephrogenesis and subsequently program of the offspring to develop hypertension and kidney injury in adulthood. It appears that enhanced reactive oxygen species (ROS) generation, activation of the nuclear factor-kappa B (NF-kB), intrarenal renin- angiotensin system (RAS) and p53 pathways were involved in the underlying mechanisms. In our first study, we investigated whether overexpression of catalase (CAT) in renal proximal tubular cells (RPTCs) could prevent the perinatal programming of hypertension and kidney injury in male offspring of diabetic dams and examined the potential underlying mechanisms both in vivo and in vitro. Our data demonstrate that CAT overexpression in RPTCs exert a direct effect on nephrogenesis in utero and ameliorate maternal diabetes- induced dysnephrogenesis. And further consequently, CAT overexpression in RPTCs preventing maternal diabetes-induced perinatal programming, mediated at least in part, via the nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2) related factor-2 (Nrf2)- heme oxygenase (HO)- 1 defense system. Intrarenal RAS activation has attracted more attention in recent years due to studies have been reported that activation of the intrarenal RAS can elicit hypertension and kidney injury independently from the systemic RAS. Previously, we established a murine model (Agt-Tg) that specifically overexpress rat angiotensinogen (Agt) in their RPTCs and develops hypertension and nephropathy. Aquaporin 1 (AQP1) is the major water channel within renal RPTCs, but whether it has a regulatory role in the development of hypertension and nephropathy remains elusive. Our second study aimed to examine the regulation of AQP1 expression in an intrarenal RAS-induced hypertension and kidney injury, focusing on underlying molecular mechanisms. We believe that both our in vivo and in vitro studies identified a novel mechanism(s) in which Agt overexpression in RPTCs enhances cytosolic accumulation of Nrf2 via the phosphorylation of pGSK3β Y216. Consequently, less intranuclear Nrf2 is available to trigger HO-1 expression as a defense mechanism and subsequently diminishes AQP1 expression in RPTCs. In conclusion, our data suggest that Agt mediated-downregulation of AQP1 and Nrf2 signaling may play an important role in intrarenal RAS-induced hypertension and kidney injury. Hypertension and kidney injury is a heterogeneous and multifactorial disease that involves the interaction of various molecules/pathways and the influence of environmental factors, for instance, diet and perinatal programming. Such diverse causes contribute to the progression of hypertension and kidney disease, making the strategy of treatment even more complex. In our present study, we evaluated the development of hypertension under two circumstances: maternal diabetes-programmed hypertension in offspring and intrarenal RAS activation-induced hypertension. We found that ROS generation in the kidneys is a major and common factor in both hypertensive mice model. Also, the ROS-sensitive antioxidant gene/transcription factor – Nrf2, plays an important role in the process. By understanding the pathways that lead to hypertension progression, we can hopefully develop more effective treatments to cope with the disease.

La peau, organe le plus étendu du corps humain, réalise une barrière entre l’environnement et le milieu interne préservant ainsi l’homéostasie. De nombreuses fonctions sont assurées par le tégument telles une modulation des échanges thermiques, une barrière physique, chimique et immunitaire contre l’entrée des composés et microorganismes exogènes mais également contre la perte des substances du milieu interne. L’altération de la surface cutanée et donc de ses fonctions, engendre un processus complexe de réparation qui vise à restaurer le système. Lors de ce travail de thèse des outils biophysiques ont été expérimentés dans un premier temps afin de renseigner sur la qualité de la fonction barrière, et donc sur la qualité de la cicatrisation cutanée. La première approche consistait à quantifier la qualité de la barrière cutanée par mesure de la perte insensible en eau. Cette approche s’est révélée fructueuse et a été proposée comme standard interne dans les études de perméation cutanée ex vivo afin de permettre une comparaison plus aisée des résultats expérimentaux issus de différentes préparations de peau. Dans un second temps la mesure des paramètres du micro relief cutané a été confrontée aux résultats des mesures concomitantes des paramètres biophysiques classiques (perte insensible en eau et hydratation cutanée) afin de mettre en évidence une possible corrélation entre qualité de la fonction barrière cutanée et topologie de surface. Les résultats des deux méthodes d’investigation sont effectivement bien corrélés dans le cas d’une altération physique de la surface cutanée, suggérant les mesures des paramètres du micro relief cutané comme une méthode originale de quantification de la réépithélialisation cutanée. Une approche plus fondamentale a également été éprouvée afin d’appréhender les mesures de « pertes insensibles en oxygène » comme une mesure innovante de la qualité de la fonction barrière cutanée. Cette première approche a permis de mettre en évidence, une orientation préférentielle significative du flux d’oxygène à travers la peau.La deuxième partie de ce travail de thèse a consisté à développer une nouvelle formulation pro cicatrisante et de tester son potentiel thérapeutique in vitro. Initialement basée sur l’administration d’oxygène afin de lutter contre l’hypoxie qui accompagne souvent les lésions cutanées, cette ligne d’étude a rapidement été écartée au profit du développement d’une formulation pour l’établissement d’un stress oxydant améliorant les processus de cicatrisation. Cette théorie du stress oxydant comme promoteur de la cicatrisation découle d’observations récentes qui démontrent un retard de cicatrisation en l’absence d’un stress oxydant in vivo, et une stimulation spécifique des cellules in vitro. Les formulations développées à ce dessein ont été testées sur des cultures de kératinocytes in vitro afin d’étudier leurs effets sur la réépithélialisation : l’une des dernières étapes de la cicatrisation. / Skin, the largest organ of the human body, confers protection from the environment through several barrier functions which provide physical, immune and chemical defenses. Skin provides protection to microorganisms, exogenous compounds, shocks, radiations, temperature and out flowing of solutes or water from the body. Without an efficient system to restore skin structures and functions, skin wounding may be deleterious. Over the course of this Ph.D. work, varied biophysical parameters have been experienced as tools to investigate the cutaneous wound healing quality. Measurement of transepidermal water loss (TEWL) to quantify the barrier function quality of the skin has been successfully assessed. It has been proposed as an internal standard of skin integrity facilitating direct comparison of data issued from different skin samples. In an in vivo approach, skin micro-relief parameters have been set against TEWL and hydration values after a physical or chemical damage onto the skin. Interestingly micro-relief parameters and biophysical measurements were closely related after tape-stripping, suggesting topographical parameters as an original method to quantify skin reepithelialization. A more fundamental assay was performed suggesting oxygen flux as a new tool to investigate skin barrier quality. From our results a “transepidermal oxygen loss” development seems to be compromised but surprisingly, we pointed out a preferential oxygen delivery course through the skin from endogenous reservoir. Besides the improvement of these tools for wound healing assessment, an innovative formulation to promote skin wound healing has been developed. The challenge of this new preparation is to generate reactive oxygen species, namely hydrogen peroxide, at sub-cytotoxic levels. Indeed recent studies pointed out that down regulation of hydrogen peroxide production in vivo delayed wound healing; furthermore, in vitro stimulation of fibroblasts or keratinocytes with hydrogen peroxide induced expression of healing promoting factors. The developed formulation was therefore assayed on keratinocytes’ in vitro culture in order to evaluate their efficacy on réépithélialisation, ending wound closure. Interestingly one of the developed formulation stimulated significantly keratinocytes migration, through a mechanism which do not imply TGF-1 expression, suggesting a potential benefit in wound réépithélialisation.

L'eczéma allergique de contact (EAC) est une pathologie inflammatoire cutanée de plus en plus fréquente. Il s’agit d’une sensibilisation vis-à-vis de substances chimiques, appelées haptènes, qui sont en contact répété avec la peau. A l’heure actuelle, le pouvoir sensibilisant d’une molécule est évalué principalement grâce à des modèles animaux. Cependant, dans un contexte européen exigeant le développement de méthodes alternatives, la compréhension et la reproduction in vitro des mécanismes de l’EAC permettent le développement de nouvelles stratégies. Le but de ce travail, réalisé sur des cellules dendritiques (DCs) et la lignée humaine U937, est de mettre en évidence les événements précoces de la signalisation intracellulaire à l’origine de l’activation des DCs induite par des allergènes, et notamment par le composé mercurique thimerosal. Les résultats obtenus démontrent que l’induction d’un stress oxydant par les allergènes est un mécanisme induit précocement. L’utilisation d’antioxydants montre que ce mécanisme participe de manière directe à l’initiation du processus d’activation des DCs (expression du CD86 et sécrétion d’IL-8) et de l’apoptose. Le stress oxydant, caractérisé par une production d’ERO associée à une chute du potentiel membranaire mitochondrial et une déplétion en glutathion intracellulaire, est un acteur majeur de la signalisation induite par les allergènes et notamment dans la réponse induite par le thimerosal et le DNCB. Plus particulièrement, ce travail démontre le rôle des groupements thiols dans l’initiation de la transduction du signal aboutissant à l’activation des DCs. Par ailleurs, une signalisation calcique, dépendante du stress oxydant, a également été mise en évidence en réponse aux allergènes. Ces résultats mettent en valeur l’importance de l’étude de la réactivité des allergènes vis-à-vis des groupements thiols et de la nécessité de tenir compte du potentiel oxydant (rédox) des haptènes ainsi que du métabolisme cellulaire dans la mise en place de modèles prédictifs in vitro. / Allergic Contact Dermatitis (ACD) resulting from skin sensitization is a frequent inflammatory skin disease linked to the use of chemicals, called haptens. At this time, the sensitizing potential of a new chemical is evaluated on animal models. However, new European legislation requires alternative methods for skin sensitization. In this context, a better knowledge of ACD and the capacity to reproduce in vitro its mechanisms lead to the development of new alternative methods. The aim of this study performed with human dendritic cells (DCs) and the human cell line U937 was to determine the early events involved in dendritic cell activation induced by contact sensitizers and especially by the mercury compound thimerosal. Data show that oxidative stress induced by sensitizers is an early signaling event leading to DC activation (expression of CD86 and IL-8 release) and to apoptosis. Using antioxidants, our data show that oxidative stress, characterized by ROS production in correlation with the depletion of the mitochondrial membrane potential and of intracellular glutathione, is a key player in signal transduction induced by sensitizers, especially in the response of DCs towards thimerosal and DNCB. More specifically, these studies demonstrate that thiol groups play a direct role in the initiating events leading to DC activation. In addition, calcium influx was detected in DCs exposed to sensitizers, in correlation with oxidative stress. These data highlight the great interest in the development of a hapten-protein binding assay based on thiol groups and the necessity to better understand the redox status of chemicals as well as cell metabolism for predicting skin sensitization.