Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes-Pires_MariaElisa_M.pdf: 587163 bytes, checksum: da754de9ce10b146c6cb1043d6b01555 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O LPS é capaz de ativar diferentes células, incluindo plaquetas, causando a liberação de mediadores inflamatórios como o óxido nítrico, interleucinas e espécies reativas de oxigênio (ROS). Vários trabalhos têm sido publicados sobre os efeitos do LPS sobre a reatividade plaquetária, mas os resultados ainda são conflitantes e os mecanismos envolvidos nas cascatas de sinalização desencadeada pelo LPS permanecem indefinidos. Portanto, utilizamos plaquetas isoladas de ratos tratados com LPS para investigar o papel das ROS na modulação da agregação plaquetária. Os ratos foram injetados com LPS (1 mg / kg, i.p.) e após, 2 a 72 h depois, a agregação plaquetária foi avaliada. As espécies reativas de oxigênio foram determinadas através da sonda 2', 7'-dichlorofluorescein diacetato (DCFH-DA). A agregação plaquetária induzida por ADP foi, tempo-dependente, reduzida 4 a 72 h após a injeção LPS, e este efeito inibitório foi aumentado quando plaquetas foram incubadas com PEG-SOD, PEG-catalase ou N-acetilcisteína (NAC). O tratamento de ratos com NAC (150 mg / kg i.p., 30 minutos após a injeção LPS) impediu a inibição da agregação plaquetária. A incubação de plaquetas de animais controle com LPS (100 e 300 µg/ml, 2 h) in vitro não afetou a produção de ROS. Nas plaquetas de ratos tratados com LPS, ativadas com ADP, a produção de ROS foi significativamente maior comparado com os ratos controle. Este aumento da produção de ROS foi significativamente reduzido quando as plaquetas foram incubadas in vitro com o inibidor da NADPH-oxidase (DPI). O tratamento de ratos com NAC impediu o aumento da produção de ROS pelo LPS. Como conclusão, a produção sistêmica de ROS em resposta ao tratamento in vivo de LPS desempenha um importante papel modulatório na agregação plaquetária. / Abstract: LPS activates different cells, including platelets, causing the release of inflammatory mediators like nitric oxide, interleukins and reactive oxygen species (ROS). It has been published several reports about the effects of LPS on platelet reactivity but the results are still conflicting and the mechanisms underlying the LPS signaling pathway remains unclear. Therefore, we have used platelets isolated from LPS-treated rats to investigate the role of ROS in modulating the platelet aggregation. Rats were injected with LPS (1 mg/kg, i.p.), and at 2 to 72 h thereafter, platelet aggregation was evaluated. Reactive-oxygen species was determined 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA). ADP-induced platelet aggregation was time-dependently reduced at 4 to 72 h after LPS injection, and this inhibitory effect was augmented when platelets were incubated with PEG-SOD, PEG-catalase or N-acetylcysteine (NAC). Treatment of rats with NAC (150 mg/kg i.p., 30 min after LPS injection) prevented the inhibition of platelet aggregation. Incubation of control platelets with LPS (100 and 300 µg/ml, 2 h) in vitro did not affect the ROS production. In ADP-activated platelets of LPS-treated rats, ROS production was significantly higher compared with control rats. This increased ROS production was significantly reduced when platelets were incubated in vitro with the NADPH-oxidase inhibitor (DPI). Treatment of rats with NAC prevented the increased ROS production by LPS. In conclusion, systemic or in situ ROS production in response to in vivo LPS treatment plays an important modulatory role on platelet aggregation. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_GleitonGoncalvesde_M.pdf: 1152962 bytes, checksum: a8d0dcf959a775fc045c37b503428c2d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, uma enfermidade que ainda não possui uma cura efetiva. O tratamento é apenas sintomático, e até os dias atuais ainda é um problema de saúde pública. As drogas disponíveis contra a doença têm apenas atividade parcial sobre o protozoário, devido à baixa especificidade e à grande heterogeneidade das cepas; e, além disso, são tóxicas ao hospedeiro. O objetivo desse trabalho foi analisar os efeitos do ibuprofeno contra o T. cruzi, com o intuito de verificar a possibilidade desta substância se tornar uma alternativa para o tratamento da doença. Utilizamos nesse estudo, duas cepas com diferentes resistências ao estresse oxidativo, cepas Y e Tulahuen 2. Através das análise dos dados de proliferação celular após 48 h de tratamento, determinou-se a IC50 para ambas as cepas, sendo 611 ± 22 µM de ibuprofeno para Tulahuen 2 e 879 ± 14 µM para Y. Com relação ao potencia de membrana mitocondrial, concentração de tióis totais e consumo de oxigênio, não houve alterações significativas quando as células foram tratadas com essa concentração por até 72h. O tratamento com ibuprofeno promoveu um aumento significativo na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em ambas as cepas, sendo este mais pronunciado na Y nos tempos de 24 e 48 h. A produção de NADPH pela via das pentoses também foi avaliada verificando-se que no tempo de 24h não há diferença significativa entre as células tratadas e seus respectivos controles em ambas as cepas. Entretanto, nos tempos de 48 e 72 h esta diferença da atividade enzimática é significativa. Os resultados indicam que o ibuprofeno inicialmente não altera as funções mitocondriais e que o seu mecanismo de indução de morte deve estar relacionado a produção de EROs. / Abstract: Trypanosoma cruzi is the ethiologic agent of Chagas' disease, a disease that remains without an effective cure. Treatment is just symptomatic, and until the present days it is a public health problem. The available drugs have only partial activity on the protozoan, due its low specificity, as well as, the great heterogeneity of strains; and, besides that, they are toxic to the host. The purpose of this work was to analyse ibuprofen effect on T. cruzi, in order to verify if this drug could be used as a treatment for the disease. We studied two strains with different resistance to the oxidative stress, Y e Tulahuen 2 strains. After 48h of treatment, the IC50 values were determined, 611 ± 22 µM for Tulahuen 2 and 879 ± 14 µM for the Y strain. Regarding the mitochondrial membrane potential, total thiols concentration and oxygen consumption, no significant differences were observed up to 72h of treatment. Ibuprofen treatment promoted a significant increase on reactive oxygen species formation (ROS) in both strains. The increase in ROS formation was higher after 24 and 48h of treatment. NADPH production by the pentose phosphate pathway was also determined. After 24h of treatment no significant differences were observed in both strains. However after 48 and 72h of treatment the difference was significant. The results indicate that ibuprofen treatment initially does not alter mitochondrial functions. And that its mechanism of action appears to be related to ROS formation. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Nadja Cristhina de Souza Pinto, Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T01:38:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_RuteAlvesPereirae_D.pdf: 10770990 bytes, checksum: 08f31895722a5f60be02fcde15d3ea05 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Xeroderma Pigmentosum (XP) é uma doença rara, autossômica recessiva, caracterizada por fotossensibilidade, mudanças pigmentares, envelhecimento precoce da pele e incidência elevada de neoplasias de pele. XP é causada por mutações em, pelo menos oito genes, que caracterizam sete diferentes grupos de complementação genética (XP-A a XP-G) e um tipo variante (XP-V). Mutações em cada em dos genes envolvidos resultam em diferentes graus de severidade da doença, principalmente quanto ao comprometimento neurológico. Pacientes XP-C apresentam mutações no gene Xpc, que resultam, geralmente, em proteínas truncadas e instáveis. XPC é uma proteína envolvida na via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) e sua função é reconhecer a lesão na fita de DNA e dar início ao reparo. Recentemente, a participação indireta de XPC no reparo por excisão de bases (BER) foi sugerida, através de sua interação física e funcional com a DNA glicosilase OGG1. Uma vez que OGG1 é essencial para a remoção de purinas oxidadas do DNA mitocondrial, nós hipotetizamos que o DNAmt, e consequentemente a função mitocondrial, estariam comprometidas em células deficientes em XPC. Desta forma, este trabalho se propôs a investigar alterações bioenergéticas mitocondrias em células obtidas de pacientes XP-C. Nossos resultados revelaram que linhagens celulares XP-C apresentavam menor função mitocondrial, apesar de não apresentarem alterações no número de cópias de DNAmt. O consumo de oxigênio pelo complexo I estava significativamente diminuído em células XP-C quando comparado à células controle, enquanto que o consumo de O2 via os complexos II, III e IV foi maior em células XP-C. A capacidade de captar cálcio também se mostrou alterada nas células XP-C, uma vez que essa célula era incapaz de captar e reter concentrações fisiológicas desse íon. A produção de espécies reativas de oxigênio foi significativamente maior em células XP-C comparadas a células controle. Em acordo, a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e glutationa peroxidase foi menor em células XP-C, indicando um desbalanço redox nessas células. A análise da expressão de genes relacionados à biogênese mitocondrial revelou que um regulador transcricional fundamental, o coativador PGC1?, estava significativamente reduzido em células XP-C transformadas e primárias. Resultados de Western blotting e imunofluorescência revelaram que as alterações bioenergéticas e genômicas observadas em células XP-C eram via sinalização e não por efeito direto, uma vez que nas condições experimentais utilizadas neste trabalho, XPC não está presente na mitocôndria. Nossos resultados demonstram, pela primeira vez, que a proteína XPC exerce um papel indireto na manutenção da integridade funcional da mitocôndria, provavelmente através de seu papel no controle da expressão de genes envolvidos na biogênese mitocondrial / Abstract: Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare autosomal recessive disorder characterized by photosensitivity, pigmentary changes, premature skin aging and increased incidence of skin cancer. XP is caused by mutations in at least eight genes, which characterize seven different genetic complementation groups (XP-A to XP-G) and variant type (XP-V). Mutations in each gene result in varying degrees of severity, mostly regarding the presence or not of neurodegeneration. XP-C is caused by mutations in the Xpc gene, resulting, mostly, in a truncated and unstable protein. The XPC protein is involved in the nucleotide excision repair pathway (NER), where it functions as a damage recognition factor. Recently, a role for XPC in the base excision repair (BER) pathway has been proposed, through its physical and fucntional interaction with the DNA glycosylase OGG1. Since OGG1 has a major function in repairing oxidized purines in the mitochondrial DNA (mtDNA), we hypothesized that XPC played a role in maitaining mtDNA integrity, and consequently, mitochondrial function. Thus, this study proposes to investigate mitocondrial function in XP-C cell. Our results showed that XP-C cells had less mitochondrial function, although without changes in mtDNA copy number. Oxygen consumption through complex I was lower in XP-C cells compared to control cells, while respiration through complexes II, III and IV was higher in XP-C cells. Calcium uptake and retention by mitochondria was also decreased in XP-C cells, as these cells were unable to retain even physiological spikes in calcium concentration. Reactive oxygen species production was significantly higher in XPC cells compared to controls. In agreement to that, the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase and glutathione peroxidase was significatly decreased in XP-C cells, indicating that these cells are under a severe redox signaling inbalance. The analysis of the expression of genes related to mitochondrial biogenesis revealed that the key transcriptional regulator PGC1? was significantly lower in both transformed and primary XP-C cells. The results of Western blotting and imunofluorescence revealed that the bioenergetic impairment observed in XP-C cells is likely the result of changes in expression and signaling pathwyas, since, under the experimental conditions used here, XPC is not present in mitochondria. Our results indicate, for the first time, that XPC plays an important role in mitochondrial maintenace, likely via its role in transcription regulation of mitochondrial biogenesis / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T03:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peloso_EduardodeFigueiredo_D.pdf: 2969065 bytes, checksum: 6920a8df71d5ab432dce07d0beb2e5eb (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas para a qual não há vacina e os tratamentos disponíveis têm eficácia limitada, sendo agravada pela heterogeneidade das cepas do parasita. Na busca por novos alvos terapêuticos, destaca-se o sistema antioxidante do parasita. As proteínas desse sistema como as triparedoxinas peroxidases citosólica e mitocondrial e as superóxido dismutases A e B (TcCPx, TcMPx, SODA e SODB, respectivamente) são fundamentais para a sobrevivência do parasita. Neste sentido, analisou-se o envolvimento da TcCPx e TcMPx na bioenergética mitocondrial de T. cruzi que superexpressavam estas enzimas (CPx e MPx, respectivamente) e também em células controle (pTEX), bem como a expressão dessas enzimas e das SODA e SODB, a liberação de H2O2 e a produção de O2 .- ao longo da curva de proliferação nas cepas Tulahuen 2 e Y. Paralelamente, foi verificado o nível de expressão da TcCPx e TcMPx na forma tripomastigota de cultura sob incubação com H2O2, tanto intracelularmente quanto no meio de incubação e a expressão dessas enzimas comparada com a da forma epimastigota. Em relação à CPx e MPx, foi possível observar que na CPx há um aumento na expressão da TcMPx, e a mesma correlação para a MPx foi observada. Diferenças na liberação de H2O2 entre CPx e MPx foram detectadas apenas quando a cadeia respiratória mitocondrial foi inibida. A MPx teve maiores taxas de consumo de oxigênio do que a pTEX e CPx, entretanto em todas as células, o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ATP foram similares. Em relação às cepas Tulahuen 2 e Y, diferenças foram observadas em relação à liberação de H2O2 e produção de O2.- não somente entre as cepas, mas também ao longo da curva de proliferação. Todas as enzimas estudadas nessas cepas variaram sua expressão em função do tempo em cultura. Contudo, na cepa Y, o nível de expressão de todas as enzimas foi menor do que da Tulahuen 2, exceto para a SODA. Em relação à forma tripomastigota, tanto a TcCPx quanto a TcMPx tiveram padrões de expressão similares, com um aumento em baixas concentrações (10?M) seguido por uma redução até concentrações maiores de H2O2. No sobrenadante do meio de incubação a TcMPx não foi detectada, contudo a TcCPx foi e em níveis que aumentaram concomitantemente com a redução da sua expressão no compartimento intracellular. Adicionalmente, o nível de expressão de ambas peroxiredoxinas foi maior na forma tripomastigota em relação à epimastigota. Devido a um leve desacoplamento observado nas MPx, a presença ou indução de um transportador na membrana mitocondrial é sugerido quando a TcMPx é expressa em maiores níveis. Além disso, houve uma modulação das enzimas antioxidantes ao longo da curva de proliferação e entre as diferentes cepas, formas do parasita e tratamento com H2O2. Dada a importância das espécies reativas de oxigênio na sinalização redox do parasita, a expressão diferencial das enzimas antioxidantes nos diferentes parâmetros analisados sugere que as mesmas desempenham diversos papéis na sobrevivência, proliferação e diferenciação do parasita / Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, which has no vaccine and the available treatments have limited efficacy that is aggravated by the heterogeneity of parasite strains. In the search for new therapeutic targets, the antioxidant system of the parasite has attracted attention. The proteins of this system such as the cytosolic and mitochondrial tryparedoxin peroxidases and superoxide dismutases A and B (TcCPx, TcMPx, SODA and SODB, respectively) are essential for parasite survival. In this sense, analysis of the involvement of TcCPx and TcMPx in the mitochondrial bioenergetics in T. cruzi overexpressing these enzymes (CPx and MPx, respectively) and also in control cells (pTEX) as well as the expression of these enzymes and SODA and SODB, H2O2 release and O2 .- production along the growth curve in two strains Tulahuen 2 and Y were performed. In parallel, the expression level of TcCPx and TcMPx was determined in tissue culture-derived trypomastigotes under incubation with H2O2, both intracellularly and in the incubation medium and the expression of these enzymes compared to the epimastigote form. Regarding CPx and MPx, it was observed that in CPx the expression of TcMPx was increased, and the same correlation was observed for MPx. Differences in H2O2 release between CPx and MPx were detected only when the mitochondrial respiratory chain was inhibited. MPx had higher oxygen consumption rates than pTEX and CPx, however in all cells, the mitochondrial membrane potential and ATP levels were similar. Regarding Tulahuen 2 and Y strains, differences were observed in relation to H2O2 release and O2.- production not only between strains but also along the growth curve. All the enzymes studied in these strains varied their expression in function of time in culture. However, in the Y strain, the expression level of all enzymes was lower than Tulahuen 2, except for SODA. Regarding trypomastigotes, not only TcCPx but also TcMPx had similar expression patterns, with an increasing in lower concentrations (10?M) followed by a reduction till higher H2O2 concentrations. In the supernatant of the incubation medium TcMPx was not detected, but TcCPx was detected and its levels increased concomitantly with the reduction in its expression in the intracellular compartment. Additionally, the level of expression of both peroxiredoxinas was higher in trypomastigote compared to epimastigote. Because of the mild uncoupling observed in MPx, the presence or induction of a carrier in the mitochondrial membrane is suggested when the TcMPx is expressed at higher levels. In addition, there was a modulation of the antioxidant enzymes along the growth curve and between different strains, forms of the parasite and treatment with H2O2. Given the importance of reactive oxygen species in parasite redox signaling, the differential expression of the antioxidant enzymes in the different parameters analyzed suggests that they play different roles in the survival, proliferation and differentiation of the parasite / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:52Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10947.pdf: 1984469 bytes, checksum: 2cce63c3d607e63adb499e8742f10eed (MD5) / O envelhecimento é um processo multi-fatorial associado a déficits funcionais, sendo que o cérebro é um dos órgãos com maior susceptibilidade a doenças crônico-degenerativas. Dentre essas, as doenças de Alzheimer e de Parkinson apresentam maior prevalência na população global e levam à incapacitação severa do indivíduo. Assim, o entendimento dos mecanismos dessas doenças que estão relacionados com o envelhecimento é importante para a busca de alternativas de tratamento. Há evidências de que, em doenças neurodegenerativas, ocorrem alterações na homeostase do cálcio (Ca2+), o que pode contribuir para a morte celular por apoptose. No presente trabalho, buscamos investigar fenômenos envolvidos com a tríade Ca2+ -mitocondria- EROs (espécies reativas do oxigênio) (TOESCU, 2005) e a apoptose em corpo estriado de ratos no envelhecimento. Foram avaliadas a sinalização intracelular dinâmica (em tempo real) e estática (biologia molecular), a morfologia celular e ultraestrutural, a morfometria e bioenergética. Utilizando fatias cerebrais de ratos, observamos que os anmais senescentes apresentaram um aumento de Ca2+ citosólico maior que os animais jovens, após a estimulação glutamatérgica. Em seguida, utilizamos antagonistas parciais das duas classes de receptores, os metabotrópicos do grupo I e os ionotrópicos (NMDAR), para estudar os componentes desse aumento de Ca2+. Avaliamos também o aumento de Ca2+ citosólico mediado por agentes que mobilizam esse íon do retículo endoplasmático e da mitocôndria, mostrando que esses estoques de Ca2+ podem estar aumentados no envelhecimento. As medidas do ∆ψm basal mostraram que hei urna diminuição deste parâmetro no envelhecimento, sendo estas alterações condizentes com a inibição mais acentuada do complexo I da cadeia transportadora de elétrons e do aumento na produção de EROs. As alterações funcionais não implicaram em mudanças ultraestruturais da mitocôndria. Foram investigados a expressão gênica e o conteúdo proteíco de Bax e Bcl-2, mostrando um aumento da expressão de bax e uma redução de proteínas Bcl-2, o que pode ter uma relação com o aumento de apoptose encontrado no estriado dos animais senescentes. Desse modo, os resultados indicam que, no envelhecimento, existem alterações no controle intracelular de sinalização de Ca2+ e na bioenergética, que podem contribuir para o aumento de apoptose. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Fernanda Ramos Gadelha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T13:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MarianaPinheiro_D.pdf: 41725038 bytes, checksum: ed76a74896573daa3ea8087e075ca302 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que reconhecem glicoconjugados de superfície celular. Neste trabalho, nós investigamos se a lectina de sementes de Cratylia mollis (Cramoll 1,4) tem efeitos tóxicos em Trypanosoma cruzi. Cramoll 1,4 reconheceu glicoconjugados presentes na superfície celular dos parasitas, levando a aglutinação de epimastigotas e tripomastigotas, de uma maneira dose dependente (1-50 µg/ml). Além disso, Cramoll 1,4 diminuiu a proliferação de epimastigotas; 93% de inibição foi obtida com 50 µg/ml. A incubação de células (1.25 x 108 /ml) na presença de Cramoll 1,4 (50 |ig/ml) e Ca2+ (10µM) por 1 h induziu permeabilização de membrana plasmática seguida por influxo de Ca2+ e cúmulo de Ca2+ mitocondrial, resultado que se assemelha ao efeito clássico da digitonina. Cramoll 1,4 estimulou (cinco vezes) a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) mitocondrial, diminuiu de maneira significativa o potencial elétrico de membrana mitocondrial (??m) e prejudicou a fosforilação de ADP. A geração de EROs induzida por Cramoll 1,4 foi diminuída de forma significativa por EGTA. A permeabilização de membrana plasmática por digitonina (20 µM) em meio contendo Ca2+ também estimulou a geração de EROs mitocondrial, mas numa proporção menor que Cramoll 1,4. A velocidade de respiração desacoplada em epimastigotas não foi afetada pelo tratamento com Cramoll 1,4 + Ca2+ mas a respiração de repouso induzida por oligomicina foi 65% maior nas células tratadas do que nos controles. Experimentos usando frações mitocondriais de T. cruzi (MTc) mostraram que, em contraste com a digitonina, a lectina diminuiu de forma significativa o ??m por um mecanismo sensível a EGTA. Em concordância com os resultados da permeabilização de membrana plasmática e prejuízo da fosforilação oxidativa pela lectina, experimentos de microscopia de fluorescência usando iodeto de propídeo revelaram que Cramoll 1,4 induziu morte de epimastigotas por necrose. Experimentos feitos com mitocôndrias isoladas de fígado de rato (MFR) mostraram que Cramoll 1,4 induziu transição de permeabilidade mitocondrial, dependente de Ca2+, com aumento na produção de EROs. Em contraste ao que foi observado em MFR, o efeito de Cramoll 1,4 em MTc é insensível a ciclosporina A, um inibidor clássico do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. Nós mostramos que a toxicidade de Cramoll 1,4 em epimastigotas parece resultar de uma ação conjunta nas membranas plasmática e mitocondrial do parasita, sobrecarga de Ca2+ mitocondrial e produção de EROs / Abstract: Lectins are proteins or glycoproteins that recognize cell surface glycoconjugates. In this work, we investigated whether Cratylia mollis seed lectin (Cramoll 1,4) has toxic effects on Trypanosoma cruzi. Cramoll 1,4 recognized glycoconjugates present on the cell surfaces of parasites, leading to agglutination of both epimastigotes and trypomastigotes in a dose-dependent manner (1-50 µg/ml). In additional, Cramoll 1,4 decreased epimastigote proliferation; 93% inhibition was attained at 50 µg/ml. Incubation of cells (1.25 x 108 /ml) in the presence of 50 µg/ml Cramoll 1,4 and 10 Ca2+ for 1 h induced plasma membrane permeabilization followed by Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ accumulation, a result that resembles the classical effect of digitonin. Cramoll 1,4 stimulated (five-fold) mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, significantly decreased the electrical mitochondrial membrane potential (??m) and impaired ADP phosphorylation. ROS generation induced by Cramoll 1,4 was significantly diminished by EGTA. Plasma membrane permeabilization by 20 digitonin in a Ca2+ -containing medium also stimulated mitochondrial ROS generation but at a lower rate than Cramoll 1,4. The rate of uncoupled respiration in epimastigotes was not affected by Cramoll 1,4 plus Ca2+ treatment, but oligomycin-induced resting respiration was 65% higher in treated cells than in controls. Experiments using T. cruzi mitochondrial fractions (MTc) showed that, in contrast to digitonin, the lectin significantly decreased ??m by a mechanism sensitive to EGTA. In agreement with the results showing plasma membrane permeabilization and impairment of oxidative phosphorylation by the lectin, fluorescence microscopy experiments using propidium iodide revealed that Cramoll 1,4 induced epimastigote death by necrosis. Experiments performed with rat liver mitochondria (RLM) showed that Cramoll 1,4 induced Ca2+-dependent mitochondrial permeability transition increasing the ROS production. In contrast to RLM, the Cramoll 1,4 effect in MTc is insensitive to cyclosporin A, a classic inhibitor of mitochondrial permeability transition pore. We showed that Cramoll 1,4 toxicity to T. cruzi epimastigotes seems to result from a concerted action on the parasite's plasma and mitochondrial membranes, mitochondrial Ca2+ overload and ROS production / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T13:49:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Casarin_AndreLuiz_M.pdf: 791279 bytes, checksum: d5ae52b9c458a272700ec00ce544fce3 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A sepse é um problema grave enfrentado em hospitais e por isso é importante mais estudos que possam esclarecer melhor a sua fisiopatologia. Alguns estudos indicam que as plaquetas podem ter um papel importante nesta condição, já que a gravidade da sepse relaciona-se positivamente com o estado de ativação destes elementos. O LPS é uma substância bastante utilizada no estudo da sepse, uma vez que mimetiza vários efeitos observados neste quadro como a grande produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs). Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar as ações do tratamento de ratos com LPS na adesão plaquetária, bem como o envolvimento de EROs e ERNs na modulação deste(s) efeito(s). Para tanto, ratos foram injetados com LPS (1 mg/kg, i.p.) e após 2h a 48h a adesão plaquetária foi avaliada. As plaquetas aderidas aos poços foram quantificadas através da determinação da atividade da fosfatase ácida. Para investigar o papel do NO e de EROs no(s) efeito(s) do LPS na adesão plaquetária, foram realizados co-tratamentos de ratos com o inibidor da óxido sintase L-NAME ou com antioxidante N-acetilcisteína (NAC), bem como a incubação de plaquetas in vitro com o sequestrador de O2- PEG-SOD. Os níveis de GMPc em plaquetas foram determinados por radioimunoensaio. O tratamento de ratos com LPS aumentou a adesão de plaquetas não-ativadas ao fibrinogênio e diminuiu a adesão de plaquetas ativadas por trombina. O tratamento crônico dos ratos com L-NAME (20 mg/kg/dia) por 7 dias antes da injeção com LPS reduziu o aumento da adesão de plaquetas não-ativadas, mas não afetou a adesão de plaquetas ativadas. Os níveis de GMPc em plaquetas de ratos tratados com LPS foram semelhantes aos observados em animais tratados com salina. Os níveis intraplaquetários de GMPc em plaquetas não-ativadas de grupo controle ou no que recebeu o LPS foram reduzidos pelo tratamento crônico do animais com L-NAME. Entretanto, em plaquetas ativadas, o tratamento dos animais com L-NAME reduziu os níveis de GMPc somente no grupo tratado com LPS em 6h. A incubação de plaquetas não-ativadas com PEG-SOD (30 U/ml) reduziu o aumento da adesão de plaquetas de ratos tratados com LPS para níveis semelhantes aos do grupo controle, mas não modificou a adesão de plaquetas ativadas, seja a dos animais controle ou dos injetados com LPS. O tratamento de ratos com NAC (150 mg/kg, i.p.) 30 min após a injeção com LPS impediu o aumento da adesão de plaquetas não-ativadas de ratos injetados com LPS e reduziu o efeito inibitório do LPS na adesão de plaquetas ativadas por trombina. Em conclusão, o tratamento de ratos com LPS apresenta um efeito ambíguo na adesão plaquetária, já que aumenta a adesão de plaquetas não ativadas e reduz a adesão de plaquetas ativadas por trombina. O óxido nítrico (NO) modula o efeito estimulatório do LPS na adesão de plaquetas não ativadas através de mecanismos independentes de GMPc, mas não participa do efeito inibitório do LPS na adesão de plaquetas ativadas. Por outro lado, a geração sistêmica de EROs em ratos tratados com LPS modula a adesão de plaquetas não ativadas ou ativadas por trombina. / Abstract: Platelets are known as hemostatic regulators, but multiple studies have shown that platelets are important in inflammatory reactions including sepsis. Lipopolysaccharide (LPS) is a component of the outer membrane of Gram negative bacteria and has a pivotal role in inducing Gram negative sepsis. LPS triggers the production of various substances including nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) that are involved in the organ failure and death. Therefore, we investigate the role of NO and ROS in modulating the platelet adhesion of LPS-treated rats using the model of platelet adhesion to fibrinogen-coated plates. Wistar rats were injected with LPS (1 mg/kg, i.p.) and 2 to 48h thereafter the platelet adhesion was evaluated. Microtiter plates were coated with fibrinogen, and rat washed platelet suspension (6 x 10(6) platelets) was added to each well. Adherent platelets were quantified through measurement of acid phosphatase activity. Treatment of rats with LPS significantly increased spontaneous platelet adhesion to fibrinogen-coated plates when compared to the control rats. In contrast, in thrombin-stimulated platelets LPS reduced platelet adhesion at 6 to 48h. Chronic treatment of rats with the nitric oxide sinthase inhibitor L-NAME (20 mg/kg/day) for 7 days before injection with LPS reduced the increase of non-activated platelet adhesion, whereas in thrombin-activated cells no differences were found. The cGMP levels in non-activated platelets of control or LPS-treated rats were reduced by chronic treatment of animals with L-NAME. However, the levels of cGMP in thrombin-activated platelets were reduced by L-NAME only in platelets 6h after LPS-treatment. The incubation of non-activated platelets with the O2- scavenger PEG-SOD reversed the stimulatory effect of LPS on spontaneous adhesion, but did not affected the stimulated-platelet adhesion of non-treated or LPS-treated groups. Moreover, the treatment of rats with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC, 150 mg/kg, i.p.) 30 min after LPS injection prevented the increase of non-activated platelet adhesion as well as significantly reduced the inhibitory effect of LPS on thrombin-stimulated adhesion. Our findings suggest that NO modulates the stimulatory effect of LPS on non-activated platelet adhesion through GMPc-independent mechanisms, but it does not take part on the inhibitory effect of LPS on thrombin-activated platelet adhesion. In addition, the systemic generation of ROS in the LPS-treated rats plays an important role in both non-activated and thrombin-activated platelet adhesion. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Marlene Aparecida Schiavinato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T08:26:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PinzonTorres_JavierAlberto_D.pdf: 1532904 bytes, checksum: 9f5bb662cffba52fd08c58de00484c25 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As grandes quantidades de poluentes gasosos que as áreas urbano-industriais emitem contribuem para a degradação de ecossistemas com subseqüentes declínios na vegetação. A fotossíntese é um dos primeiros processos alterados pela ação destes poluentes e o dióxido de enxofre (SO₂), por ser um dos poluentes aéreos mais freqüentes e nocivos, afeta drasticamente a atividade fotossintética e causa graves injúrias nos tecidos foliares. O SO₂ difunde-se tão prontamente quanto o CO₂ para o interior da folha através dos estômatos e, na fase aquosa da câmara subestomática, se solubiliza formando bisulfito e sulfito, que são espécies iônicas de ação oxidante altamente agressiva para a célula. O sulfito, se não for rapidamente oxidado para sulfato em presença da luz, compete com o CO₂ tornando-se um inibidor da fixação fotossintética, enquanto que o bisulfito pode reagir com aldeídos e cetonas, formando hidroxisulfonatos, que são inibidores de várias enzimas. Durante a oxidação aeróbica dos sulfitos e bisulfitos há aumento da concentração de radicais livres que, se não forem exauridos rapidamente por enzimas de destoxificação, podem causar peroxidação dos ácidos graxos insaturados, ruptura dos lipídeos hidroperóxidos e co-oxidação das clorofilas nos cloroplastos. A resistência da planta à ação tóxica do SO₂ sugere vários mecanismos, dentre as quais se destacam: a redução da absorção de SO₂ por meio do fechamento estomático; a oxidação do sulfito a sulfato com posterior armazenamento do sulfato no vacúolo e incorporação ao metabolismo normal sob forma orgânica; e a eliminação pelo sistema antioxidante das peroxidases e da superóxido dismutase. Se um excesso de enxofre é absorvido e a concentração de tióis aumenta, o enxofre poderá ser acumulado na forma de glutationa, que é um tripeptídeo com uniões sulfídricas, ou os excessos de grupos sulfídricos e sulfitos poderiam ser convertidos em sulfetos ou perdidos na forma de ácido sulfídrico, por meio de trocas gasosas, retirando enxofre do metabolismo da planta. O objetivo do trabalho foi estudar os mecanismos imediatos de defesa e recuperação da taxa fotossintética em plantas de Centrolobium tomentosum sob condições de estresse induzido por SO₂, antes que algum tipo de injúria foliar ou fitotoxicidade, como clorose ou necrose foliar, se tornassem visíveis. Para isto, uma câmara de indução foi especialmente construída, de modo a permitir coletar amostras foliares in vivo, enquanto o estresse estava acontecendo. Dentro da câmara de indução foi colocada uma espécie nativa, Centrolobium tomentosum, que havia sido mantida até então sob condições ambientais naturais, na casa de vegetação do Departamento de Fisiologia Vegetal (Unicamp). Os ensaios com SO₂ foram realizados na câmara de indução, em sistema fechado, e esta foi mantida em uma câmara de crescimento, sob condições controladas de luz, temperatura e umidade. Plantas de C. tomentosum entre oito meses e um ano de idade foram submetidas a diferentes concentrações de SO₂ com a finalidade de determinar a concentração mínima de SO₂ capaz de induzir, na taxa fotossintética, a sucessão das fases características de uma dinâmica de estresse. Foram utilizadas cinco plantas diferentes por cada concentração de SO₂ aplicada e registrou-se a taxa fotossintética utilizando um Sistema Portátil de Análise de Gases por Infravermelho (IRGA). Nas mesmas folhas foram analisados antioxidantes do tipo não enzimático (pigmentos fotossintéticos e ácido ascórbico) e antioxidantes do tipo enzimático (superóxido dismutase e glutationa redutase). Foi determinado que a concentração mínima para induzir a dinâmica de estresse em plantas de C. tomentosum foi de 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³, que equivale a uma concentração muito alta com relação às concentrações máximas recomendadas pelas organizações governamentais para o controle de poluição de ar. A sucessão de fases na taxa fotossintética foram as seguintes: - Taxa fotossintética antes da aplicação do SO&#8322: nesta fase, a taxa fotossintética registrou uma média de 4,4 μmol CO&#8322 m­­­­­ֿ² s­­­­­ֿ¹. Foram tomadas amostras foliares, cujas análises corresponderam ao controle. - Fase de alarme: iniciada imediatamente após a aplicação de 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³ e caracterizada por uma queda abrupta na taxa fotossintética de 92%. Posteriormente, veio o estresse propriamente dito, com registros muito baixos na taxa fotossintética. - Fase de restituição: na qual se observou a recuperação paulatina da taxa fotossintética. Fase de resistência: na qual, após 9 h da exposição ao SO₂, a taxa fotossintética registrou recuperação de 50%. Após 24 h do ensaio ter sido iniciado, a taxa fotossintética registrou os valores iniciais correspondentes ao controle, ou seja, uma recuperação completa. Em todas as fases, com exceção da fase de restituição, foram tomadas amostras foliares. Não foram observados sintomas de clorose ou necrose nas folhas de C. tomentosum após a exposição ao SO₂ e as análises químicas dos pigmentos fotossintéticos corroboram esta observação. Porém, nas fases de estresse e de recuperação completa, os teores de carotenóides aumentaram com relação ao controle. O incremento do ácido ascórbico teve a mesma tendência do que o dos carotenóides nas fases de estresse e de recuperação completa. A atividade da superóxido dismutase aumentou significativamente na fase de estresse, enquanto que a atividade da glutationa redutase aumentou significativamente na fase de recuperação completa. A dinâmica de estresse e o mecanismo imediato de destoxificação em plantas de C. tomentosum submetidas a 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³ sugerem que efetivamente houve um estresse oxidativo, que foi superado da seguinte maneira: na fase de alarme, o sulfito reagiu com a ribulose bisfosfato antes que fosse foto-oxidado para sulfato. Isto explica a inibição da carboxilação, com a queda abrupta da taxa fotossintética. Os oxi-radicais livres citotóxicos gerados nos cloroplastos, como conseqüência da foto-oxidação dos sulfitos, foram exauridos rapidamente pelo aumento, na fase de estresse, dos carotenóides e do ácido ascórbico e pelo aumento da atividade da superóxido dismutase. Porém, o enxofre proveniente do SO₂ não foi imediatamente acumulado na forma de glutationa. Isso somente ocorreu quando a planta recuperou completamente a taxa fotossintética. Desta maneira, verificou-se que C. tomentosum é uma espécie resistente que poderia ser utilizada em espaços onde as emissões de SO₂ são altas, como nas indústrias químicas, petroquímicas, siderúrgicas e de fertilizantes, dentre outras. / Abstract: Large quantities of gaseous pollutants emited by urban-industrial areas emit contribute to the degradation of ecosystems with subsequent declines in vegetation. The photosynthesis is one of the first processes altered by the action of these pollutants and sulphur dioxide (SO₂), as one of the most common and harmful air pollutants, drastically affect the photosynthetic activity and cause serious injuries in the leaf tissue. The SO₂ diffuses itself as promptly as the CO₂ into the leaf through the stomata, and in the aqueous phase of the substomatal cavity it solubilizes forming bisulphite and sulphite, which are ionic species of highly aggressive oxidant action to the cell. Sulphites, if it is not quickly oxidized to sulphate in the presence of light, it competes with CO₂ becoming an inhibitor of photosynthetic fixation, while the bisulphite can react with aldehydes and ketones, forming hidroxisulphonates, which are inhibitors of several enzymes. During the aerobics oxidation of sulphites and bisulphites there are increase in the concentration of free radicals that cause peroxidation of unsaturated fatty acids, lipid hydroperoxides and disruption of co-oxidation of chlorophylls in chloroplasts, if not quickly eliminated by enzymes of detoxification. The resistance of the plant to the toxic action of SO₂ suggests several mechanisms, among which stand out: the reduction of SO₂ absorption through the stomatal closure, the oxidation of sulphite to sulphate with the subsequent storage of sulphate inside the vacuole and the incorporation in the normal metabolism in organic way, and the scavenging by antioxidant system of peroxidases and superoxide dismutase. If an excess of sulphur is absorbed and the concentration of thiols increase, the sulphur may be accumulated in the form of glutathione, which is a tripeptide with sulphidric bindings, or the excesses of sulphidric groups and sulphites could be converted into sulfides or lost in the form of sulphidric acid, through gas exchange, removing the sulphur from the metabolism of the plant. The objective was to study the mechanisms of immediate protection and recovery of the photosynthetic rate in plants of Centrolobium tomentosum under conditions of stress induced by SO₂, before some kind of leaf injury or phytotoxicity, like chlorosis or leaf necrosis, became visible. For this, an induction chamber has specially been constructed to allow collect of leaf samples in vivo, while the stress was happening. Inside the induction chamber it was put a native species, Centrolobium tomentosum, which had been kept under natural environmental conditions at a greenhouse of the Department of Plant Physiology (UNICAMP). The tests were conducted with SO₂ in the chamber of induction, in a closed system, and this was maintained in a growth chamber, under controlled light, temperature and humidity conditions. Plants of C. tomentosum between eight months and one year old were submited to different concentrations of SO₂ in order to determine the lowest concentration of SO₂ capable to induce, in the photosynthetic rate, the succession of phases that are characteristics of a dynamics of stress. There were used five different plants for each concentration of SO₂ applied, and the photosynthetic rate was recorded using a Portable System for Analysis of gases by Infrared (IRGA). In the same leaves, non-enzymatic antioxidants (photosynthetic pigments and ascorbic acid) and enzymatic antioxidant (superoxide dismutase and glutathione reductase) were analysed. It was determined that the lowest concentration to induce the dynamics of stress in plants of C. tomentosum was 258,07 g SO₂ m­­­ֿ³, which represents a very high concentration regarding the maximum concentrations recommended by governmental organizations to the air pollution control. The succession of phases in the photosynthetic rate was as follows: - Photosynthetic rate before the implementation of SO₂: at this stage, the photosynthetic rate recorded an average of 4.4 μmol CO₂ m­­­ֿ² sֿ¹. Leaf samples were taken, whose analyses correponded to the control. - Phase of alarm: it has begun immediately after the injection of 258,07 g SO₂ m­ֿ³ characterized by the sharp fall in the photosynthetic rate of 92%. Then the stress itself begun, with very low records in photosynthetic rate. - Phase of restitution: in which there was observed the gradual recovery of the photosynthetic rate. - Phase of resistance: in which, after 9 hours of exposure to SO₂, the photosynthetic rate recorded recovery of 50%. After 24 hours of the beginning of the assay, the photosynthetic rate recorded the initial value corresponding to the control, that is, a complete recovery. In all stages, except in the stage of restitution, leaf samples were taken. There were no symptoms of chlorosis or necrosis in the leaves of C. tomentosum after exposure to SO₂ and chemical analysis of photosynthetic pigments corroborate to this observation. However, in stages of stress and complete recovery, the levels of carotenoids increased in relation to the control. The increase of ascorbic acid had the same trend of that of carotenoids in stages of stress and complete recovery. The activity of superoxide dismutase increased significantly in the stage of stress, while the activity of glutathione reductase increased significantly during the complete recovery. The dynamics of stress and the immediate mechanism of detoxification in plants of C. tomentosum submitted to 258,07 g SO₂ m­­­­­ֿ³ suggest that effectively there was actually an oxidative stress, which was overcame in the following way: during the alarm, the sulfite reacted with ribulose bisphosphate before the photo-oxidation to sulphate. This explains the inhibition of carboxylation, with a sharp decrease in the photosynthetic rate. The citotoxic free radicals generated in the chloroplasts, as a result of the photo-oxidation of sulphites, were quickly scavenged by the increase, in the phase of stress, of carotenoids and ascorbic acid and the increasing activity of superoxide dismutase. However, the sulphur from SO₂ has not been immediately accumulated in the form of glutathione. It only occurred when the plant recovered completely the photosynthetic rate. Thus, it was found that C. tomentosum is a resistant species that could be used in areas where SO₂ emissions are high, as in the chemical, petrochemical, steel and fertilizers factories, among others. / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T19:38:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_CamilaBononide_D.pdf: 2554249 bytes, checksum: c6b3764fee73b2d53da308d36c53522b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Anemia falciforme (AF) é um distúrbio na síntese de hemoglobina causada por uma mutação pontual que leva a produção de uma hemoglobina anormal, HbS. Em locais com baixa concentração de O2, a HbS se polimeriza resultando em uma série de alterações que podem culminar em processos vaso-oclusivos, a principal causa de dor e mortalidade entre os pacientes falciformes. A AF é uma doença inflamatória crônica caracterizada por níveis de citocinas alterados, além de um elevado número de leucócitos e lesões nas células endoteliais. Os leucócitos apresentam um papel importante na AF uma vez que, seu recrutamento pode levar a um bloqueio do fluxo sanguíneo da microvasculatura, já que são células grandes, pouco deformáveis e que aderem facilmente ao endotélio ativado, além de interagirem com eritrócitos circulantes. As estratégias terapêuticas utilizadas e desenvolvidas para o tratamento da doença baseiam-se em 3 pontos principais: 1) diminuir a concentração intracelular de HbS como, por exemplo, aumento da HbF; 2) reduzir processos inflamatórios e o estresse oxidativo; 3) inibir a adesão celular e consequentemente, reduzir a vaso-oclusão (VO). A Hidroxiuréia (HU) é um agente quimioterápico que vem sendo utilizada com sucesso no tratamento da AF. Essa droga é capaz de elevar a HbF e também de reduzir o número de células brancas. Entretanto, além dos efeitos adversos provocados por ela, nem todos os pacientes respondem à terapia. Assim, faz-se necessária uma melhor compreensão da fisiopatologia da AF, incluindo o papel dos leucócitos e os mecanismos envolvidos no processo de VO, para o desenvolvimento de terapias alternativas. Neste estudo, tivemos como objetivos principais 1) verificar a ação de fatores presentes no soro de pacientes com AF quanto à modulação do número de neutrófilos e à geração de estresse oxidativo; 2) melhor compreensão do papel dos neutrófilos na iniciação e propagação de processos inflamatórios e consequentemente a participação dessas células no processo de VO. Dados indicaram que fatores presentes no soro de pacientes com AF são capazes de alterar a apoptose de neutrófilos e também iniciar a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), possivelmente pela ativação da enzima NADPH presente nestas células. Adicionalmente, resultados obtidos com um modelo de camundongo transgênico falciforme indicaram que a ativação da via dependente de GMPc pode ser uma abordagem interessante para a inibição da adesão de neutrófilos à parede vascular sob condições inflamatórias. Além disso, os dados mostram que o uso de drogas que amplificam os efeitos da HU poderiam ser úteis na prevenção da VO / Abstract: Sickle Cell Disease (SCD) is a disorder of hemoglobin synthesis, caused by a point mutation, and resulting in the production of abnormal sickle hemoglobin, HbS. The consequence of low oxygen levels is HbS polymerization, which is responsible for the vaso-occlusive phenomenon that is the hallmark of the disease. SCD is a chronic inflammatory disease characterized by alterations in cytokine levels and an increase in leukocytes number and endothelial cell injury. Leukocytes play an important role in SCD since their recruitment to the microvasculature, consequent adhesion to the vessel wall, and interactions with other cells may interrupt the blood flow and culminate in vaso-occlusion. Therapeutic strategies for SCD treatment are based on three points: 1) reduction of intracellular HbS concentration, for example, by increasing the erythrocytic HbF concentration; 2) reduction of inflammatory processes and oxidative stress; 3) inhibition of cellular adhesion and, as a consequence, a reduction in vaso-occlusion. HU is a chemotherapeutic drug used for SCD treatment. This drug is able to increase HbF concentrations and reduce white blood cells counts, although it has some adverse effects and some patients do not respond to this therapy. Thus, it is necessary to fully understand the mechanisms that contribute to the vaso-occlusive process, including the role of the leukocytes in this phenomenon. The goals of this study are: 1) To check the influence of factors present in SCD serum on mechanisms that may affect the neutrophil count and oxidative stress generation; 2) understand the role of neutrophils in the initiation and propagation of vascular inflammation and vaso-occlusion. Date indicate that factors present in the SCD serum are able to alter neutrophil apoptosis and induce reactive oxygen species (ROS) generation, possibly by the activation of the NADPH enzyme expressed in these cells. Additionally, results obtained from a SCD inflammatory mouse model indicate that an activation of the cGMP - dependent pathway can inhibit neutrophil adhesion to the vascular endothelium cells after inflammatory induction and that drugs that amplify the effects of HU may represent a potential new therapy for SCD treatment / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Neura Bragagnolo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RendonMamani_MeryYovana_D.pdf: 1061749 bytes, checksum: e4d872dcfdb5e597973a5b13542d1e51 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Mudanças na bebida e na cor dos grãos durante o armazenamento do café cru levam à perda do valor no mercado devido, provavelmente, a processos oxidativos nos lipídios. Durante a oxidação dos lipídios há formação de compostos muito reativos, os quais podem reagir com proteínas, ácidos clorogênicos e outros compostos presentes no grão cru. O objetivo do presente trabalho foi avaliar em café natural (CN) e café cereja descascado (CD) da cultivar IPR 98 as alterações nos lipídios, proteínas, ácido 5-cafeoilquínico, viabilidade da semente e na estrutura celular do grão, além das mudanças sensoriais na bebida e na cor do grão, verificando se a perda da qualidade sensorial durante a estocagem por 15 meses está relacionada com processos oxidativos. As modificações nos lipídios foram avaliadas pelo acompanhamento do processo oxidativo mediante análises de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS) e no teor de ácidos graxos livres. A fração de ácidos graxos livres foi analisada por cromatografia gasosa após a extração com éter metil-t-butílico e fracionamento por cromatografia de permeação em gel. A oxidação de proteínas foi medida pelo método espectrofotométrico empregando dinitrofenilidrazina para a formação de osazonas. O teor do ácido 5-cafeolquínico foi medido utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos. A avaliação da viabilidade da semente foi realizada mediante imersão em sal de tetrazólio, e a análise da estrutura celular foi realizada por microscopia eletrônica de transmissão. As mudanças sensoriais avaliadas foram a qualidade global da bebida, a intensidade do sabor café descansado na bebida e a medida da cor nos grãos. No final da estocagem foi observado nos cafés CN e CD aumento do teor de ácidos graxos livres, do valor de TBARS e do número de grupos carbonilas nas proteínas, assim como diminuição do teor de ácido 5-cafeoilquínico e perda total da viabilidade da semente. A qualidade global da bebida aumentou até o nono mês da estocagem para o café CD e diminuiu nos meses seguintes, enquanto que para o café CN aumentou, mantendo-se até o final da estocagem. A intensidade do sabor café descansado aumentou durante todo o tempo da estocagem. Essas mudanças foram acompanhadas pelo branqueamento dos grãos de café. A microscopia revelou mudanças na estrutura celular durante a estocagem. A presença de grupos carbonilas e os valores de TBARS encontrados no inicio da estocagem, além de trabalhos na literatura que relatam o desenvolvimento de estresse oxidativo durante a secagem, levaram a realizar um novo estudo analisando o comportamento de algumas enzimas antioxidantes durante a secagem de outra amostra de café (cultivar Mundo Novo), processado como café natural e café cereja descascado. Nestas amostras foram quantificadas as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD), guaiacol-peroxidase (GOPX) e glutationa redutase (GR), além da quantificação simultânea de peróxido de hidrogênio. Durante a secagem foi observada maior atividade enzimática no café cereja descascado em comparação com o natural, e maior concentração de peróxido de hidrogênio no café natural do que no café cereja descascado. Considerando os resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que as mudanças sensoriais observadas durante a estocagem são em parte decorrentes de processos oxidativos não enzimáticos, os quais podem ter sido iniciados durante a secagem do grão / Abstract: Changes in beverage and coffee beans color during storage lead to loss of commercial value probably due to the oxidative processes in lipids. Oxidation of lipids lead to formation of reactive compounds which can react with proteins, chlorogenic acids and other compounds present in raw coffee beans. The present study was initiated to determine the relationship between changes in lipids, proteins, 5-caffeoylquinic acid and sensory characteristics; in addition it was evaluated the viability of the beans and the cell structure of the coffee beans processed as natural coffee and pulped natural coffee during the storage for 15 months. Lipid oxidation was evaluated as thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) and free fatty acids. Lipids were extrated with tertiary butyl methyl ether, fractionated by gel permeation chromatography and the fraction of free fatty acids analysed by gas chromatography. The protein carbonyl groups were quantified by following the dinitrophenylhydrazine coupling method. The 5-cafeoylquinic acid content was performed using high performance liquid chromatography. The viability of coffee beans was estimated by tetrazolium chloride test and the cellular structure was examined by transmission electron microscopy. The cup quality and rested coffee flavor using an intensity scale were used for the coffee beverage evaluation . The color was expressed in L*, a* and b*. After 15 months of storage the free fatty acids content, the TBARS values and the number of carbonyl groups increased, while the 5-cafeoilquinic acid content decreased and the coffee bean viability was lost. The cup quality increased until the ninth month of storage and declined in subsequent months to pulped natural coffee while the cup quality to natural coffee not declined during the storage. The rested coffee flavor increased during storage, these changes were accompanied by bleaching of the coffee beans. The transmission electron microscopy revealed changes in the cell structure during the storage. The number of carbonyl groups and TBARS values at the beginning of the storage and the literature reporting the possibility of oxidation stress during the drying of the coffee beans led to a new study aiming to analyze the behavior of some antioxidant enzymes in other coffee sample processed as natural coffee and pulped natural coffee during the drying. The activity of superoxide dismutase (SOD), guaicol-peroxidase (GOPX) and glutathione redutase (GR) as well as hydrogen peroxide content were evaluated. Pulped natural coffee showed more enzyme activities and lower hydrogen peroxide concentration than natural coffee. The results suggested that the sensory changes occurrence during the coffee storage are at least partly due to non enzymatic oxidative process initiated during drying of coffee bean / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos