LIMA, Ticiana de Brito. Cultivo da alga marinha vermelha Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson: textura de géis aquosos e lácteos. 2012. 71 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T13:40:06Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_tblima.pdf: 3568499 bytes, checksum: d48f3a061d05e6c3a9b0df95c1bf6115 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-14T22:56:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_tblima.pdf: 3568499 bytes, checksum: d48f3a061d05e6c3a9b0df95c1bf6115 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T22:56:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_tblima.pdf: 3568499 bytes, checksum: d48f3a061d05e6c3a9b0df95c1bf6115 (MD5) Previous issue date: 2012 / The red seaweed Solieria filiformis, abundant in Ceará, biossintetiza, among other polysaccharides, phycoloide called carrageenan of great commercial importance due to its properties thickeners, stabilizers and gelling agents. In Brazil, exotic species of marine algae are being grown on a commercial scale in order to meet the demand of industrial phycoloide. The aim of this study was to analyze the texture of aqueous gels made with milk and carrageenan extracted from seaweed S. filiformis, cultivated in Ceará through sporulation natural technique, in order to establish a comparison between these gels and those prepared with commercial carrageenans (iota and kappa carrageenan). The algae were grown through sporulation natural, where monthly PVC structures (25 mm) in size 25 x 44 cm, each containing a single nylon cord (10 mm) of 23 m length were kept at depths of 1 and 2 m over a period of nine months. For extraction of carrageenan were collected at both depths seaweed samples S. filiformis backstage with higher and lower biomass, some for the rainy season (January and April) and dry (October and November). Initially, the algae were dried, crushed in electric grinder and subjected to aqueous extraction (1.5% m / v), stirring every 20 minutes in a water bath at 90 °C for 4 h. The homogenates were filtered through nylon cloth, the waste discarded. The filtrates were subjected to filtration on a vacuum funnel sintered plate, and carrageenans obtained were frozen, lyophilized and weighed. The highest yields were obtained from carrageenan seaweed collected from the scenes that have accumulated during the dry spores (35.6% - November 2M to 45.3% - October 1M), while the algae that accumulated during the rainy season had the lowest incomes (29 6% - April 1M to 33.8% - April 2M). In contrast, levels of total sugars ranged between 37.6 and 50.5% and the content of carrageenan sulfate ranged from 21.6 to 33.3% according to the levels already checked to carrageenans of the iota type. The texture of aqueous gels in the presence of CaCl2 and 0.1% milk prepared with carrageenan S. filiformis and commercial concentrations of 0.5 and 1.5%, were analyzed for firmness, adhesiveness, cohesiveness, springiness, gumminess and chewiness. All samples with carrageenan derived from S. filiformis backstage obtained values of firmness, gumminess and chewiness than those found for ι-carrageenan commercial. Backstage November had the highest values in the parameter of firmness for aqueous gels and compared to ι-carrageenan commercial dairy. Adhesiveness, elasticity and cohesiveness showed values close to those found for ι-carrageenan commercial. The results for firmness and chewiness of κ-carrageenan were superior when compared to commercial car ι-carrageenan and S. filiformis. The gels formulated with milk obtained results strongly higher than those formulated with a solution of calcium chloride 0.1% due to interactions between the proteins and the milk carrageenan. With the data obtained it can be concluded that the use of carrageenan S. filiformis derived by sporulation natural cultivation is capable of forming gels when compared to stronger ι-carrageenan commercial could generate savings through the use of lower concentrations of the carrageenan commercial, to obtain the desired firmness of a product. / A alga marinha vermelha Solieria filiformis, abundante no litoral cearense, biossintetiza, dentre outros polissacarídeos, um ficocolóide denominado carragenana de grande importância comercial devido às suas propriedades espessantes, estabilizantes e gelificantes. No Brasil, espécies exóticas de algas marinhas vêm sendo cultivadas em escala comercial com o objetivo de suprir a demanda industrial desse ficocolóide. O objetivo desse trabalho foi analisar a textura de géis aquosos e lácteos elaborados com ι-carragenana extraída da alga S. filiformis, cultivada no litoral cearense através da técnica de esporulação natural, com a finalidade de estabelecer um comparativo entre esses géis e aqueles elaborados com carragenanas comerciais (ι e κ carragenanas). As algas foram cultivadas através de esporulação natural, onde mensalmente estruturas de PVC (25 mm) de tamanho 25 x 44 cm, contendo cada uma única corda de nylon (10 mm) de 23 m de comprimento foram mantidas em profundidades de 1 e 2 m durante um período de nove meses. Para extração da ι-carragenana foram coletadas em ambas profundidades amostras da alga S. filiformis dos bastidores que apresentaram maior e menor biomassa, determinadas para a estação chuvosa (Janeiro- 26,2 Kg e Abril- 46,5 Kg) e seca (Outubro- 53,0 Kg e Novembro- 31,7 Kg). Inicialmente, as algas foram secas, trituradas em moinho elétrico e submetidas à extração aquosa (1,5% m⁄v), sob agitação a cada 20 minutos, em banho-maria a 90 ºC durante 4 h. Os homogenatos foram filtrados em tecido de nylon, os resíduos descartados. Os filtrados foram submetidos a uma filtração à vácuo em funil de placa sinterizada, e as carragenanas obtidas foram congeladas, liofilizadas e pesadas. Os maiores rendimentos de ι-carragenana obtidos foram das algas coletadas dos bastidores que acumularam esporos no período seco (35,6%- Novembro 2M a 45,3%- Outubro 1M), enquanto as algas que acumularam no período chuvoso apresentaram os menores rendimentos (29,6%- Abril 1M a 33,8%- Abril 2M). Já os teores de açúcares totais variaram entre 37,6 e 50,5% e os teores de sulfato das carragenanas variaram de 21,6 a 33,3%, de acordo com os teores já verificados para carragenanas do tipo ι. A textura dos géis aquosos na presença de CaCl2 0,1% e lácteos preparados com as ι- caragenanas de S. filiformis e caragenanas comerciais nas concentrações de 0,5 e 1,5%, foram analisados quanto a firmeza, adesividade, coesividade, elasticidade, gomosidade e mastigabilidade. Todas as amostras com ι-carragenanas de S. filiformis dos bastidores obtiveram valores de firmeza, gomosidade e mastigabilidade superiores aos encontrados para ι-carragenana comercial. Os bastidores de novembro das amostras com ι-carragenanas de S. filiformis obtiveram os maiores valores no parâmetro de firmeza para os géis aquosos e lácteos quando comparados aos géis comerciais. Adesividade, elasticidade e coesividade mostraram valores próximos aos encontrados para ι-carragenana comercial. Os resultados obtidos para firmeza e mastigabilidade da κ-carragenana foram superiores quando comparados a ι-carragenana de S. filiformis e ι-carragenana comercial. Os géis formulados com leite reconstituído obtiveram resultados de firmeza superiores aos formulados com solução de cloreto de cálcio 0,1%, devido às interações entre as proteínas do leite e a ι-carragenana. Com os dados obtidos pode-se concluir que a utilização da ι-carragenana de S. filiformis oriunda de cultivo por esporulação natural é capaz de formar géis mais firmes quando comparada a ι- carragenana comercial, podendo gerar economia através da utilização de concentrações de carragenana inferiores a comercial, para se obter a firmeza desejada para um produto.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-05-15Bitstream added on 2014-06-13T20:58:17Z : No. of bitstreams: 1 rosa_j_me_jabo.pdf: 154567 bytes, checksum: 0d2897a42007e37a9a5f314b75f0f0f0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) / Objetivou-se o ajuste de metodologia e seleção de genótipos de guandu para resistência a Macrophomina phaseolina a partir de material obtido pela Embrapa Pecuária Sudeste, e verificar o desenvolvimento micelial e esporulação do fungo em meios de cultura. O trabalho foi conduzido em casa de vegetação na UNESP/Jaboticabal no período de agosto de 2004 a dezembro de 2005. Para o ajuste de metodologia e seleção de genótipos resistentes ao fungo as sementes foram submetidas a escarificação com lixa d'água e inoculação artificial através do método de exposição das mesmas ao patógeno por diferentes períodos, que variaram de O a 72 horas. Foram avaliadas porcentagem de plantas sobreviventes e massa fresca. Já para o crescimento micelial e esporulação do fungo foi utilizado o método de sobreposição de discos de diferentes hospedeiros no meio de cultura. A escarificação das sementes contribuiu para a penetração do fungo nas mesmas o período de 24h de exposição das sementes ao fungo são suficientes para detectar diferenças no grau de resistência dos genótipos. Os genótipos mais resistentes são g167-97, g124-95, g27-94, g40-95, g154-95, g127-97 e g9m-97, e os mais suscetíveis são g48-95, g123-95, g8-95, g168-99 e g1m-95. A sobreposição de discos foliares de guandu em meio BDA e folha de papel de filtro em meio sojinha proporcionam um incremento na esporulação de M. phaseolina. / This work had the objective of determining the best schedule for artificial inoculation and select pigeon pea genotypes resistant to Macrophomina phaseolina in material obtained by Embrapa Pecuária Sudeste, and verify the mycelial growth and sporulation of the fungi in middle of culture. The work were carried in greenhouse at the UNESP/Jaboticabal, from August 2004 to December 2005. For the methodology and selection adjustment of resistant genotypes to the fungi the seeds were submitted scarified with water sandpaper and artificial inoculation the seeds were the contact method to fungi for different periods, which varied from O to 72 hours. They were evaluated percentage of surviving plants and fresh mass. For the mycelial growth and sporulation of the fungi was used the superposition of disks method of different hosts in the middle of culture. The scarified of the seeds contributed for penetration of the fungi at the seeds; the period of 24h of contact of the seeds to the fungi enough to detect differences in the resistance degree ofthe genotypes. The genotypes g167-97, g124-95, 927-94, g40-95, g154-95, g127-97 and g9m-97 were found to be the most resistant and most susceptible were g48-95, g123-95, g8-95, g168-99 and g1m-95. The treatment with superposition of the leaf disks of pigeon pea in BDA and disks of filter paper in middle of soybean extract were the treatments that provided better sporulation levei in the conditions of that experiment were half.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação σF, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor σF, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-23T12:15:14Z No. of bitstreams: 1 Priscilla Anunciada Alves Moreira.pdf: 1192520 bytes, checksum: f783ff4175972095251ac5f078d7fe19 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T12:15:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Priscilla Anunciada Alves Moreira.pdf: 1192520 bytes, checksum: f783ff4175972095251ac5f078d7fe19 (MD5) Previous issue date: 2008-08-06 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Alternaria black spot is considered one of the most common and destructive diseases of brassica, and although it may be caused by several species, Alternaria brassicicola is the predominant pathogen in both conventional and organic brassica crops in State of Pernambuco, Brazil. To assess the pathogenic variability of 120 isolates of A. brassicicola, was analyzed the virulence to brassica species, physiology aspects of the pathogen and sensitivity to fungicides. The isolates obtained from conventional and organic crops were inoculated under greenhouse conditions in 40 days old plants of broccoli, cabbage, cauliflower and Chinese cabbage and disease severity was assessed 10 days after the inoculation. Under laboratory conditions the following parameters were evaluated for all isolates: rate of growth mycelial, sporulation, and sensitivity to fungicides iprodione and tebuconazole. Based on the variables analyzed, it was found variability among isolates of A. brassicicola, but there were no significant (P>0.05) correlation among the analyzed variables, regardless of the cultivation system and the original host of each isolate. The variables were useful in distinguishing individual groups of isolated with similarity in virulence to the host, physiological characteristics and sensitivity to fungicides. The cross inoculations and the development of symptoms in brassica highlighted the absence of host specificity. All isolates weresensitive to the fungicides iprodione and tebuconazole. Based on the components of variance analysis, there was no significant effect of the cultivation system on the variables, except for disease severity on Chinese cabbage (P = 0.0391). Most of the variance results from the difference among isolates of A. brassicicola within the cropping systems and the host of origin. In the context multivariate, no effect was found regarding the host of origin of the isolates (P = 0.4993), however, there was great variability (P <0.0001) among isolates within the cropping systems and the host of origin. / A alternariose é considerada uma das doenças mais comuns e destrutivas das brássicas, e embora possa ser causada por várias espécies, Alternaria brassicicola é o agente patogênico predominante nos plantios convencionais e orgânicos de brássicas no Estado de Pernambuco, Brasil. Para avaliar a variabilidade patogênica de 120 isolados de A. brassicicola, foi analisada a virulência a espécies de brássicas, aspectos relacionados à fisiologia do patógeno e sensibilidade a fungicidas. Os isolados obtidos de cultivos convencionais e orgânicos foram inoculados em plantas de brócolis, couve-chinesa, couve-comum e couve-flor com 40 dias de idade, em casa de vegetação, onde a severidade da doença foi avaliada 10 dias após a inoculação. Em condições de laboratório, os isolados foram avaliados quanto a taxa de crescimento micelial, esporulação e sensibilidade aos fungicidas iprodione e tebuconazole. Com base nas variáveis analisadas, foi constatada a existência de variabilidade entre os isolados de A. brassicicola, mas não foram observadas correlações significativas (P=0,05) entre as variáveis avaliadas, independentemente do sistema de cultivo e do hospedeiro de origem dos isolados. As variáveis individuais foram úteis na distinção de grupos de isolados do patógeno com similaridade na virulência às hospedeiras, características fisiológicas e sensibilidade aos fungicidas. As inoculações cruzadas e o desenvolvimento de sintomas nas brássicas evidenciou a inexistência de especificidade por hospedeiro entre os isolados do patógeno. Todos os isolados foram sensíveis aos fungicidas iprodione e tebuconazole. Pela análise dos componentes de variância, não houve efeito significativo do sistema de cultivo sobre as variáveis analisadas, com exceção para severidade em couve-chinesa (P=0,0391). A maior parte da variância foi resultante da diferença entre os isolados de A. brassicicola dentro dos sistemas de cultivo e dos hospedeiros de origem. No contexto multivariado, não se constatou efeito do hospedeiro de origem dos isolados (P=0,4993), porém, houve grande variabilidade (P<0,0001) entre os isolados dentro dos sistemas de cultivo e dos hospedeiros de origem.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francy Mary Sousa.pdf: 1356959 bytes, checksum: a7db48bf3163f386db3bca96f187f815 (MD5) Previous issue date: 2010-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynespora cassiicola has been related causing damages in several crops of economic importance in Amazonas State, principally Solanaceae and Cucurbitaceae families affecting production by significative form. This study aimed to characterize C. cassiicola isolates through colony morphology, sporulation, mycelial growth and spore dimension on culture media PDA, PSA, OEA and CA. Five mm-diameter disks taken from colonies grown on PDA medium for 15 days were transferred to Petri dishes containing each medium under room temperature and continuous light. The study was installed using randomized block design in a factorial 4 x 5 x 3 (culture media x isolates x hosts) with five replications. The effects of culture media varied to isolates of same host and among different hosts. Mycelial growth was observed in CA. The most spore production was observed in PDA and PSA media. A high variation of aspect and colonies coloration was observed among same host isolates and isolates of different hosts in all culture media. Variation trough spore dimension of C. cassiicola isolates was observed in all culture media tested. / O fungo Corynespora cassiicola já foi relatado causando danos em diversas culturas de interesse comercial no Estado do Amazonas, principalmente das famílias Solanaceae e Cucurbitaceae, afetando de forma significativa a produção. Este estudo teve como objetivo caracterizar isolados de C. cassiicola quanto a morfologia das colônias, esporulação, crescimento micelial e dimensão dos conídios nos meios de cultura BDA, BSA, AvA e CA. Discos de 5mm de diâmetro retirados de colônias crescidas em meio BDA por 15 dias, foram transferidos para o centro de placas de Petri contendo os meios de cultura e mantidas à temperatura ambiente sob luz contínua. O estudo seguiu esquema fatorial 4 x 5 x 3 (meios de cultura x isolados x hospedeiros) com cinco repetições. Os efeitos dos meios de cultura variaram para isolados do mesmo hospedeiro e entre hospedeiros diferentes. Maior crescimento micelial foi observado no meio CA. A maior produção de esporos foi observada nos meios BDA e BSA. Foi verificado uma ampla variação de aspecto e coloração das colônias entre os isolados do mesmo hospedeiro e entre isolados de hospedeiros diferentes em todos os meios de cultura. Também houve variação quanto às dimensões dos conídios dos isolados de C. cassiicola em todos os meios de cultura testados.

A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

Alternaria dauci e A. solani são duas espécies de fungos fitopatogênicos reconhecidamente difíceis de esporular em meio de cultura. Isto dificulta as inoculações artificiais e, conseqüentemente, prejudica o processo de seleção de genótipos de cenoura e tomate resistentes às doenças causadas por estes fungos. Este trabalho teve o objetivo de verificar a influência de alguns fatores, aplicados na incubação, sobre o crescimento micelial e esporulação das duas espécies fúngicas. Diferentes meios de cultura (BDA, aveia e V8), temperatura (15, 20, 25, 30 e 35 &#176;C), comprimentos de onda da luz usada na incubação (amarela, azul, branca, NUV, verde e vermelha), tipos de estresse aplicado à colônia (raspagem, UV, irradiação de microondas e temperatura de 100 &#176;C) e fotoperíodos (luz / escuro, respectivamente, de 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 e 0 h / 24 h) foram testados. Após a determinação dos melhores fatores, o método desenvolvido neste trabalho foi comparado ao método tradicionalmente utilizado (BDA, 25 &#176;C, 12 h luz branca / 12 h escuro e raspagem da colônia), utilizando diversos isolados de ambas as espécies. Os resultados indicaram o meio V8-ágar e a temperatura de 25 &#176;C como os mais favoráveis ao crescimento e esporulação. Os diferentes comprimentos de onda utilizados tiveram influência marcante na esporulação, sendo o NUV o mais estimulante. Todos os tipos de estresse aplicados induziram esporulação, porém, a raspagem das colônias proporcionou os melhores resultados. O fotoperíodo 12 h luz NUV / 12 h escuro foi o que mais estimulou a esporulação. Observou-se que, de modo geral, períodos de escuro maiores que os períodos de luz aplicados após o estresse da colônia, favoreceram a esporulação. Dessa forma, o processo desenvolvido neste trabalho consistiu de incubação em meio V8-ágar, temperatura de 25 &#176;C, raspagem da colônia e fotoperíodo de 12 h luz NUV / 12 h escuro. Este procedimento mostrou-se nitidamente superior ao tradicionalmente utilizado para crescimento e esporulação de ambas as espécies. / Alternaria dauci e Alternaria solani are two phytopathogenic fungus species known for difficult sporulation in culture media. This hampers artificial inoculations and, consequently, affects the selection process of carrot and tomato genotypes resistant to the diseases caused by these fungi. This study had the objective of verifying the influence of some factors applied during incubation on mycelia growth and sporulation of the two fungus species. Different culture media (BDA, oat and V8), temperature (15, 20, 25, 30 and 35 &#176;C), light wavelengths during incubation (yellow, blue, white, NUV, green, and red), stress types applied to the colony (scratching, UV, microwave irradiation, and temperature of 100 &#176;C) and photoperiods (light / dark, respectively, of 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 h and 0 h / 24 h) were tested. Upon determination of the best factors, the method developed in this study was compared to the traditional procedure (BDA, 25 &#176;C, 12 h white / 12 h dark light and scratching of the colony), with different isolates of both species. Results indicated the V8-agar media and a temperature of 25 &#176;C as most favorable for growth and sporulation. The different wavelengths had a marked influence on sporulation and NUV was the most stimulating. All applied stress types induced sporulation, but best results were obtained with scratching of the colonies. The 12 h light / 12 h dark photoperiod stimulated sporulation most. In general, longer dark than light periods after the stress of the colony favored sporulation. The procedure developed in this study consisted of incubation in V8-agar media, a temperature of 25 &#176;C, scratching of the colony and a 12 h light / 12 h dark photoperiod. This process is clearly superior to the traditional method for growth and sporulation of both species.

Alternaria dauci e A. solani são duas espécies de fungos fitopatogênicos reconhecidamente difíceis de esporular em meio de cultura. Isto dificulta as inoculações artificiais e, conseqüentemente, prejudica o processo de seleção de genótipos de cenoura e tomate resistentes às doenças causadas por estes fungos. Este trabalho teve o objetivo de verificar a influência de alguns fatores, aplicados na incubação, sobre o crescimento micelial e esporulação das duas espécies fúngicas. Diferentes meios de cultura (BDA, aveia e V8), temperatura (15, 20, 25, 30 e 35 &#176;C), comprimentos de onda da luz usada na incubação (amarela, azul, branca, NUV, verde e vermelha), tipos de estresse aplicado à colônia (raspagem, UV, irradiação de microondas e temperatura de 100 &#176;C) e fotoperíodos (luz / escuro, respectivamente, de 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 e 0 h / 24 h) foram testados. Após a determinação dos melhores fatores, o método desenvolvido neste trabalho foi comparado ao método tradicionalmente utilizado (BDA, 25 &#176;C, 12 h luz branca / 12 h escuro e raspagem da colônia), utilizando diversos isolados de ambas as espécies. Os resultados indicaram o meio V8-ágar e a temperatura de 25 &#176;C como os mais favoráveis ao crescimento e esporulação. Os diferentes comprimentos de onda utilizados tiveram influência marcante na esporulação, sendo o NUV o mais estimulante. Todos os tipos de estresse aplicados induziram esporulação, porém, a raspagem das colônias proporcionou os melhores resultados. O fotoperíodo 12 h luz NUV / 12 h escuro foi o que mais estimulou a esporulação. Observou-se que, de modo geral, períodos de escuro maiores que os períodos de luz aplicados após o estresse da colônia, favoreceram a esporulação. Dessa forma, o processo desenvolvido neste trabalho consistiu de incubação em meio V8-ágar, temperatura de 25 &#176;C, raspagem da colônia e fotoperíodo de 12 h luz NUV / 12 h escuro. Este procedimento mostrou-se nitidamente superior ao tradicionalmente utilizado para crescimento e esporulação de ambas as espécies. / Alternaria dauci e Alternaria solani are two phytopathogenic fungus species known for difficult sporulation in culture media. This hampers artificial inoculations and, consequently, affects the selection process of carrot and tomato genotypes resistant to the diseases caused by these fungi. This study had the objective of verifying the influence of some factors applied during incubation on mycelia growth and sporulation of the two fungus species. Different culture media (BDA, oat and V8), temperature (15, 20, 25, 30 and 35 &#176;C), light wavelengths during incubation (yellow, blue, white, NUV, green, and red), stress types applied to the colony (scratching, UV, microwave irradiation, and temperature of 100 &#176;C) and photoperiods (light / dark, respectively, of 24 h / 0 h, 22 h / 2 h, 17 h / 7 h, 12 h / 12 h, 7 h / 17 h, 2 h / 22 h and 0 h / 24 h) were tested. Upon determination of the best factors, the method developed in this study was compared to the traditional procedure (BDA, 25 &#176;C, 12 h white / 12 h dark light and scratching of the colony), with different isolates of both species. Results indicated the V8-agar media and a temperature of 25 &#176;C as most favorable for growth and sporulation. The different wavelengths had a marked influence on sporulation and NUV was the most stimulating. All applied stress types induced sporulation, but best results were obtained with scratching of the colonies. The 12 h light / 12 h dark photoperiod stimulated sporulation most. In general, longer dark than light periods after the stress of the colony favored sporulation. The procedure developed in this study consisted of incubation in V8-agar media, a temperature of 25 &#176;C, scratching of the colony and a 12 h light / 12 h dark photoperiod. This process is clearly superior to the traditional method for growth and sporulation of both species.

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (&#8226;NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-&#8226;NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (&#8226;NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-&#8226; NO-cGMP signaling pathway.

A incidência e severidade da mancha de cercospora, causada por Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, aumentou significativamente em território brasileiro a partir do ano 2000, sendo hoje considerada uma das principais doenças foliares da cultura do milho. Mesmo assim, poucos estudos com este patossistema foram realizados no Brasil. Este trabalho teve por objetivo determinar meio de cultura e regime luminoso para adequada esporulação de C. zeae-maydis, estudar a reação de um grupo de 118 linhagens endogâmicas de milho quanto a resistência ao patógeno em dois ambientes distintos (Indianópolis-MG e Jardinópolis-SP), observar aspectos microscópicos da esporulação, germinação e penetração em hospedeira suscetível e avaliar diferenças morfológicas, genéticas e de agressividade entre isolados coletados na região centro-sul do país. Os resultados indicaram que a melhor esporulação do fungo foi obtida em meio V8 e suco de tomate temperado quando submetidos a fotoperíodo 12/12h (luz/escuro). Quanto a reação das linhagens à doença, foi possível verificar interação diferencial significativa entre genótipo de milho e os dois ambientes, indicando que fatores ambientais ou patogênicos, distintos entre os locais, podem ter contribuído para os discrepantes comportamentos de alguns genótipos. Também foi possível verificar elevado nível de resistência em 12 linhagens em ambos locais, demonstrando a existência de genótipos mais estáveis para resistência com possibilidade de uso em programas de melhoramento da cultura. Através da análise do padrão de restrição gerado pela digestão da região ITS-5.8S do rDNA, de 104 locos AFLP e de mensurações morfométricas dos conídios, foi possível verificar a existência de dois grupos geneticamente distintos de C. zeae-maydis em território brasileiro. Estes são relatados na literatura como grupos I e II ou espécies afins (siblings species). Estes grupos foram detectados em todos os locais de coleta do território brasileiro, com exceção de Goiás, onde o grupo I não foi observado. Quanto aos aspectos microscópicos deste patógeno, foi possível verificar que sob condições ambientais adequadas a germinação dos esporos ocorre 13 horas após o contato do esporo com a hospedeira, e a penetração, via estômato, tem início 16 horas após a inoculação. Também foi observado o fenômeno da conidiação microcíclica nos isolados brasileiros. Vinte e seis por cento daqueles pertencentes ao grupo I produziram microconídios, enquanto nenhum do grupo II apresentou esta característica. Deste modo, este é o primeiro relato da existência deste fenômeno no grupo I e ausência no grupo II. Estes estudos demonstram que a população brasileira de C. zeae-maydis se assemelha àquelas existentes nos Estados Unidos e na África, com a prevalência dos dois grupos genéticos. / The incidence and severity of cercospora leaf spot, caused by Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, increased significantly in Brazil in 2000, being considered today one of the major leaf disease of the crop. Despite this, few researches about the pathosystem come being carried in Brazil. The aims of this work were to identify the suitable culture media and light conditions for sporulation of C. zeae-maydis; to study the reaction of 118 mayze genotypes to pathogen in two different locations (Indianópolis - Minas gerais State and Jardinópolis - São Paulo State); to observe some microscopical aspects of esporulation, germination and penetration in a susceptible maize genotype; and finally to assess morphological and genetic differences among a group of isolates collected in center-south Brazil. The results showed that the better culture media for esporulation was the V8 media and tomato juice, under 12-hours photoperiod. Concerning to genotype reaction to disease, it was possible to verify significant interaction between genotypes and environment, indicanting that environmental or pathogenic factors, distinct between locations, may have influenced the reactions of some genotypes. It was possible to identify highly level of resistance in 12 lines in both places, evidencing the existence of stable genotypes that can be used in breeding programs. Analysis of restriction fragments from ITS-5.8S of rDNA, 104 AFLP loci, and conidial measurements, showed the existence of two genetically divergent groups of C. zeae-maydis in Brazil. These groups are similar to the ones reported previously reported as I and II groups or siblings species. Both groups were detected in all sampled regions, except Goiás State where no isolates from group I were detected. Concerning to microscopic traits, it was possible to verify that the brazilian isolates of this pathogen have the ability for production of microconidia. Twenty six percent of the isolates of the group I produced microconidia, while none of the group II showed this trait. Thus, this is the first report with presence of MC in the group I but absence in the group II. The results showed that Brazilian isolates are very similar to isolates from USA and Africa, occurring both genetic groups.