A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and α-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica / The house fly, Musca domestica is one the best known and most widely distributed insects known to humans. M. domestica larvae display in anterior and middle midgut contents, a proteolytic activity with pH optimum of 3.0-3.5 and kinetical properties like cathepsin-D. Three cDNAs coding for preprocatepsin D-like proteinases (ppCAD1, ppCAD2, ppCAD3) were cloned from a M. domestica midgut cDNA library. The sequences encoding the signal peptide, propeptide and mature enzyme having all conserved catalytic and substrate binding residues found in bovine lysosomal cathepsin-D. A cladogram of sequences of insect and vertebrate cathepsin-D-like proteinases deposited on GENBANK form a large grouping divided into two monophyletic branches: one with vertebrate and the other with insect lysosomal sequences including ppCAD1. Human pepsinogen, ppCAD2, ppCAD3, and a sequence from Drosophila melanogaster are excluded indicating a nonlysosomal function for them. CAD3 should correspond to the digestive CAD found in enzyme assays because: (1) The mRNA for CAD3 is expressed (RT-PCR) only in the anterior and proximal middle midgut. (2) Recombinant pCAD3, after auto activation has a pH optimum of 2.5-3.0 that is close to the luminal pH of M. domestica midgut. (3) Immunoblots of proteins from different tissues and stained with antiserum prepared against recombinant pCAD3 were positive only for the anterior and middle midgut tissue and contents. (4) CAD3 is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior and middle midgut cells. The data support the view that on adapting to a detritivorous habit M. domestica digestive CAD (and of other Diptera Cyclorrhapha) resulted from the same archetypical gene as the intracellular cathepsin-D, paralleling what happened with vertebrates. A limited amount of data regarding DNA sequences and molecular aspects of Musca domestica species is avaliable. We proposed to generate ESTs sequences from a cDNA library constructed from larval midguts. A total of 826 randomly selected midgut derived cDNAs were sequenced and assembled based on their similarities into 323 clusters. The sequences were classified into three categories: (S) probably secretory products, (H) housekeeping products and (U) products with unknown cell localization and function. One hundred and sixty clusters (423 ESTs) encode putative secreted proteins such as lysozymes, lipases, trypsins, chymotrypsins, dipeptidases, carboxypeptidases A and α-amylases. One hundred and thirty two clusters (190 ESTs) encode housekeeping sequences associated with energy metabolism, protein syntesis, signal transduction and other cellular functions. Ninety five clusters (213 ESTs) encode proteins with no similarity with known proteins. Expression and high-throughput bioassay screening of target sequences must provide us with a better understanding of the digestive physiology of Musca domestica midgut larvae, in molecular detail. A lipolytic enzyme (LipMD) was identified from expressed sequence tags (EST) constructed from midgut larvae cDNA library. The deduced amino acid sequence is homologous to lipases and contained the three well-conserved amino acid residues, Ser183, His273, and Asp208, which form the catalytic triad of the enzyme. The cDNA fragment encoding for LipMD was cloned into a pAE vector (Ramos et al., 2004) and expressed in E. coli producing an enzyme with a molecular mass of 37.3 kDa. The recombinant LipMD was purified and was able to hydrolyse tributyrin and a broad range of substrates, from C2 to C18 p-nitrophenyl-esters and displayed an optimal pH of approximately 7.5. RT-PCR analysis in tissue homogenates (anterior, middle and posterior midguts, hemolymph, fat body and Malpighian tubules) showed that LipMD mRNA transcripts were expressed only in anterior midgut. Western-blots after SDS PAGE of proteins from different tissues and stained with anti-LipMD serum revealed that the enzyme occurs mainly in the anterior midgut lumen. LipMD is localized with immunogold labeling inside secretory vesicles and around microvilli in anterior midgut cells. LipMD is a candidate to be the digestive lipolytic enzyme found in that midgut region

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Flavio Marques Lopes.pdf: 1637206 bytes, checksum: 95899c1fbc6b76141c229cf07f0d9d1b (MD5) Previous issue date: 2008-10-23 / In this research, open ground samples (Brazilian Savannah Cerrado) proceeding from treated cultures of soy with Opera® (epoxiconazol and piraclostrobin) had been used as source of resistant microorganisms to fungicide. The sample were collected in July 2006, in three points of planted area and two depths, 0 to 20 cm, and from 80 cm to 1m, next to the state highway GO-139, in the towns of São Miguel do Passa Quatro, in a producing farm model of soy seeds, where Opera® was used since its launching in 2002. The collection point was characterized as a risk place for ecological accidents, presenting area with extensive agriculture activity, intense use of pest management, soil with good level of infiltration and storage of water, and areas of declivity. The microorganism s selection was carried through using selective solid J.E. supplemented with 0.1% of Opera® with microorganisms collected in depth of 80cm. In a previous selection, 9 microorganisms were isolated, and from these, the one that showed a better growth within the selective J.E. liquid supplemented with 0.03% of Opera® (1805) was chosen for the development of this research. The analysis for coloration of Gram-negative showed that the isolated microorganism is one bacillococcus Gram-negative with poliphormic characteristics, being sensible to all the tested antibiotics. Biochemical identification made through the method of Bactray®, presented a correlaction of 99% with the genus Klebsiella. Through molecular identification by the gene 16S rDNA, it was possible to find a correlaction of 99% of similarity with the species K.pneumoniae and K. oxytoca. The proteins released by the Klebsiella in a supplemented environment with 0.03% of Opera had been precipitated with acetone, obtaining two proteinic fractions, a soluble (FS) and the other insoluble (FI) in a 0,1 mol L-1 phosphate buffer, pH 6.0. In the soluble solution (FS), it was found an oxirredutase from the peroxidases family, which uses hydrogen peroxide as an agent and several substrates as reducing agents, presenting greater activity for pyrogallol, TMB, o-dianisidine and catechol. In a chromatogram obtained through separation by molecular exclusion in Sephadex G- 100, two peaks with peroxidasic activities had been observed. Peak 1 presented two bands in SDS-PAGE, one with39.3 kDa and another one with 24.6 kDa. In the FI, it was possible to determine the presence of one hydrolysis with capacity to break the bonds between the ester molecule, from the family of carboxylesterases esterase B. The esterase B presented activity against casein substrates (9.3 UE), BApNA (1.31 UE), pNPP (0.01), presenting 5,4% activity of inhibition after incubation with E64, 6.5% activity of inhibition after incubation with protease inhibitors cocktail containing AEBSF and 7.5% of inhibition after incubation with TLCK. The electrophoreses of FI presented two protein bands with molecular mass of approximately 61.7 kDa for superior band and 60.7 kDa for the inferior band. The enzymatic characterization using pNPP showed high activity in pH 5.0 and pH 7.0. Esterase B kept 100% of activity after 120 minutes of incubation at 60oC. The presence of ZnCl2, EDTA, MgSO4 and CuSO4 had presented an inhibition effect of 16%, 16%, 23.2% and 40.8% respectively, within the enzyme activity. Esterase B slightly presented higher activity in the presence of DMSO and acetone, and a reduction of up to 87% comparing to isopropyl alcohol (lower polarity). The vale of Km using pNPP as substratum was of 3.4 mmol L-1, with a Vmax of 0.019 UE. When the selective J.E. supplemented with 0.03% Opera was treated with Klebsiella for 120 h, it had a reduction of 43.7% in the absorbance of the compounds with a peak of 200 nm, 55.7% - 220 nm and 28.7% - 260 nm. Using released enzymes by Klebsiella for treatment of the epoxiconazol standards in the reduction of the absorbance 200, 220 and 260 nm the observed results were 99.7%, 95.7% and 99.5% respectively. Whereas for the pyraclostrobin, the observed reduction were 95.5% and 80.2% for the wave lengths 200 and 260 nm respectively / Neste trabalho amostras de solo de cerrado provenientes de culturas de soja tratadas com Opera® (epoxiconazol e piraclostrobin) foram utilizadas como fonte de microrganismos resistentes ao fungicida. A coleta foi realizada no mês de julho de 2006, em três pontos de área plantada e em duas profundidades, 0 a 20 cm e de 80 cm a 1 m, próximo à rodovia estadual GO-139, no município de São Miguel do Passa Quatro, em uma fazenda modelo produtora de sementes, em que o Opera® foi utilizado desde o seu lançamento em 2002. O ponto de coleta foi caracterizado como um local de risco a acidentes ecológicos, apresentando área com atividade agrícola extensiva, uso intenso de defensivos agrícolas, solos com boa taxa de infiltração e armazenamento de água e áreas de declividade. A seleção dos microrganismos foi feita com meio seletivo J. E. sólido - suplementado com 0,1% de Opera®, com microrganismos coletados na profundidade de 80 cm. Na primeira etapa 9 microrganismos foram isolados e, destes, o microrganismo 1805 foi o que apresentou melhor crescimento em meio seletivo J. E. líquido - suplementado com 0,03% de Opera® sendo escolhido para o desenvolvimento deste trabalho. A análise por coloração de Gram mostrou que o microrganismo isolado é um bacilococco Gram-negativo com características polimórficas, sendo sensível a todos os antibióticos testados. A identificação bioquímica pelo método de Bactray® apresentou correlação a nível de 99% com o gênero Klebsiella. Através de identificação molecular pelo gene 16S rDNA foi possível encontrar uma correlação de 99% de similaridade com as espécies K. pneumoniae e K. oxytoca. As proteínas secretadas pela Klebsiella em meio suplementado com 0,03% de Opera® foram precipitadas com acetona, obtendo duas frações protéicas, uma solúvel (FS) e outra insolúvel (FI) em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,0. Na FS foi encontrada uma oxirredutase da família das peroxidases, que utiliza o peróxido de hidrogênio como agente oxidante e vários substratos como agentes redutores, apresentando maior atividade para pirogalol, TMB, o- ianizidina e catecol. No cromatograma obtido na separação por exclusão molecular em Sephadex G-100 foram observados dois picos com atividade peroxidásica. O pico 1 apresentou duas bandas em SDS-PAGE, uma mais forte com 39,3 kDa e outra com 24,6 kDa. Na FI foi possível determinar a presença de uma hidrolase, com capacidade de degradação de ligações éster, da família das carboxilesterases esterase B. A esterase B apresentou atividade contra os substratos caseína (9,3 UE), BApNA (1,31 UE), pNPP (0,01 UE), apresentando 5,4% de inibição com E64, 6,5% de inibição após incubação com coquetel de inibidores contendo AEBSF e 7,5% de inibição após incubação com TLCK. A eletroforese da FI apresentou duas bandas de proteínas com massa molecular de aproximadamente 61,7 kDa para a banda superior e 60,7 kDa para a banda inferior. A caracterização enzimática utilizando pNPP mostrou atividade alta em pH 5,0 e em pH 7,0. A esterase B manteve 100% de atividade após 120 minutos de incubação a 60 ºC. A presença de ZnCl2 aumentou a atividade em 14,2%, FeCl3 e MnSO4 não tiveram efeito significativo sobre a atividade e os demais sais, CaCl2, EDTA, MgSO4 e CuSO4 apresentaram um efeito inibitório de 16%, 16%, 23,2% e 40,8% respectivamente, na atividade da enzima. A esterase B apresentou atividade ligeiramente mais alta na presença de DMSO e acetona, e uma redução de até 87% frente ao isopropanol (solvente com menor polaridade). O valor de Km encontrado utilizando pNPP como substrato foi de 3,4 mmol L-1, com uma Vmáx de 0,019 UE. Quando o meio seletivo J. E. suplementado com 0,03% de Opera foi tratado com a Klebsiella por 120 h, houve uma diminuição 43,7% na absorvância dos compostos com pico a 200 nm, 55,7% a 220 nm e 28,7% a 260 nm. Usando as enzimas secretadas pela Klebsiella para tratamento do padrão epoxiconazol a redução da absorvância observada em 200, 220 e 260 nm foi de 99,7%, 95,7% e 99,5% respectivamente. Para o piraclostrobin a redução observada foi de 95,5 e 80,2% nos comprimentos de onda 200 e 260 nm respectivamente

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The DNA extraction was made from 100 individual nematodes by the methods: CTAB, Phenol: Chloroform and commercial kit (PureLink® Genomic ADN Kit, Invitrogen). In the comparative analysis using the three methods the CTAB method and commercial kit obtained similar Ct values. The CTAB was the best method of extraction with less variation among the replications and showed higher linearity of the standard curve in comparison with the other methods tested. It was possible to quantify nematodes in the samples based on the intervals of the Ct values established from different numbers of nematodes (1, 10, 25, 100, 250, 500 and 750). This study demonstrated that qPCR technique is a sensitive and reliable alternative for the quantification of M. incognita that may help laboratories of diagnose and field survey. Twenty-six populations of the root-knot nematode (Meloidogyne spp.) from five locations of the state of Bahia, five from the state of Mato Grosso, four from the state of Goiás and one from the state of Minas Gerais, were characterized based on morphology of perineal cut, biochemical analysis through esterase profile and molecular analysis with specific primers. Identification of nematodes in the samples using the analysis of perineal cut, esterase profile and molecular analysis was possible, but with some variations in the perineal patterns and some atypical profiles of esterase. In the analyses of esterase profiles were found 69.23% of M. javanica with esterase profiles J3 and J2, and 30.77% of M. incognita with esterase profile I1. There was a higher occurrence of M. javanica in the areas cultivated with soybeans. Molecular analysis showed to be practical and accurate. / Nematoides causam perdas em plantas em todo o mundo, as quais podem ser traduzidas em muitos prejuízos econômicos. Os nematoides das galhas (Meloidogyne spp.) são os mais comuns e destrutivos dentro deste grupo de patógenos. Para conseguir implantar um método eficiente de manejo de fitonematoides há uma necessidade de identificação das espécies e quantificação precisa e confiável. O objetivo deste trabalho foi a otimização de um ensaio baseado em PCR em tempo real para detectar e quantificar M. incognita. Para isto diferentes métodos de extração de DNA e sua eficiência foram comparados. A extração de DNA foi feita a partir de 100 nematoides pelos métodos do CTAB, Fenol: Clorofórmio e KIT comercial (PureLink® Genomic DNA Kits, Invitrogen). Na análise comparativa destes três métodos de extração de DNA observou-se que o método CTAB e o utilizando o Kit comercial obtiveram igual eficiência, dados pelos valores próximos Ct (cycle threshold). O melhor método de extração foi considerado o CTAB, apresentando menor variação entre as diferentes amostras biológicas utilizadas como repetições e demonstrando maior linearidade na curva-padrão em comparação com os demais métodos testados. Foi possível estabelecer um parâmetro para a quantificação de nematoides nas amostras baseado em faixas de valores de Ct, estabelecidas a partir de diferentes números de indivíduos (1, 10, 25, 100, 250, 500 e 750). Este estudo demonstrou que a técnica de qPCR é uma alternativa sensível e confiável para a quantificação de M. incognita, para auxiliar laboratórios de diagnóstico e o monitoramento no campo desses nematoides. Vinte e seis populações do nematoide das galhas (Meloidogyne spp.), provenientes de cinco municípios do Estado da Bahia, cinco municípios do Estado do Mato Grosso, quatro municípios do Estado de Goiás e um município do Estado de Minas Gerais, foram caracterizados com base em: morfologia do corte perineal, análise bioquímica por meio de perfil de esterase e análise molecular com iniciadores específicos. Baseado nestes parâmetros foi possível a identificação das amostras, porém foram encontradas algumas variações nos padrões perineais e perfis atípicos nos perfis de esterase. Nas análises dos perfis de esterase foram encontradas 69,23% de M. javanica com perfis de esterase J3 e J2, e 30,77% de M. incognita com perfil de esterase I1. Verificou-se a maior ocorrência de M. javanica, nas áreas coletadas cultivadas com soja. A análise molecular se mostrou prática e precisa.

Parmi les activités catalytiques les plus intéressantes présentes dans le latex de Carica papaya on trouve l'activité lipolytique (EC 3.1.1.X). En effet les enzymes lipolytiques peuvent catalyser des réactions d’hydrolyse sur divers substrats mais également, dans des conditions thermodynamiques favorables, des réactions de synthèse. De plus, elles sont actives en présence de solvants organiques, ce qui fait de ce type d’enzymes des biocatalyseurs spécialement attractifs pour des applications industrielles. Enfin, cette activité lipolytique est associée à la matrice insoluble du latex, et constitue donc une activité immobilisée. Cependant et pour cette même raison, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'élucider la ou les séquences protéiques dans le latex responsables de cette activité lipolytique. En conséquence, cette thèse est dédiée à l'étude de l'activité lipolytique du latex de C. papaya. Pour cela, la purification partielle du latex de C. papaya a été réalisée. Ainsi, les propriétés catalytiques des fractions partiellement purifiées ont pu être déterminées pour l'hydrolyse de triglycérides, la résolution de mélanges racémique d'octyl ester de l'acide 2-bromo-phenylacétique, la synthèse de biopolymères et des lipides structurés. Parallèlement à cela, une recherche dans le génome de C. papaya des séquences codant les motifs conservés dans les protéines lipolytiques, ainsi que des essais d'expression in vivo dans les feuilles de la plante en conditions de stress a été effectuée, ce qui a permis d’isoler pour la première fois une lipase, CpLip2, exprimée in vivo chez C. papaya. Cette protéine, ainsi que 2 autres protéines déjà identifiées dans le latex de C. papaya, CpEst et CpLip1, ont été produites sous forme fonctionnelle en employant respectivement Nicothiana sp., Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris comme systèmes d'expression. Finalement, certaines des propriétés biochimiques et catalytiques de ces protéines recombinantes ont pu être déterminées / Lipolytic activity (EC 3.1.1.X) is one of the most interesting catalytic activities from Carica papaya latex. Indeed lipolytic enzymes can catalyze not only hydrolysis but also various synthesis reactions due to their activity in organic solvents, which make them especially attractive for industrial applications. Nevertheless, most of the lipolytic activity present in latex is tightly associated to the insoluble fraction of the latex and up to now it has not been possible to determine which enzymes are responsible for the lipolytic activity of C. papaya latex. This PhD work is dedicated to the study of the lipolytic activity present in Carica papaya. Partial purification of lipolytic activity from C. papaya latex was carried out to evaluate the catalytic properties of the partially purified fractions in the hydrolysis of triglycerides, the resolution of racemic mixtures of 2-bromo-phenylacetic octyl ester, biopolymers and structured lipids synthesis. Bioinformatic analysis was also realized on C. papaya genome by searching conserved motifs for lipolytic proteins. Finally, assays of in vivo transcriptomic in the leaves of stressed C. papaya allowed the isolation of a new lipase produced in vivo (CpLip2, gene 1973.2). This protein, as well as two previously identified lipolytic enzymes from C. papaya, CpEst (gen 25.180) and CpLip1 (gen 55.143) were functionally expressed using Nicotiana sp.,Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris as expression hosts, respectively. Finally, some of the biochemical and catalytic properties of these produced recombinant proteins were evaluated / Una de las actividades catalíticas más interesantes presentes en el látex de Carica papaya es la actividad lipolítica (3.1.1.X).Las enzimas lipolíticas pueden catalizar reacciones de hidrólisis sobre varios sustratos e igualmente, en condiciones termodinámicas favorables, pueden catalizar reacciones de síntesis. Adicionalmente, son activas en presencia de solventes orgánicos, por lo que son biocatalizadores atractivos para aplicaciones industriales. Sin embargo, la mayor parte de la actividad lipolítica del látex se encuentra asociada a la matriz insoluble del látex, formando un biocatalizador auto-inmovilizado.Por esta razón, hasta la fecha no ha sido posible elucidar qué enzima o enzimas son responsables de la actividad lipolítica observada en el látex de C. papaya. En consecuencia, la presente investigación está dedicada al estudio de la actividad lipolítica en Carica papaya. Para ello, se realizaron estudios de purificación parcial del látex de Carica papaya, así como la evaluación de las propiedades catalíticas de las fracciones parcialmente purificadas en la hidrólisis de triglicéridos, resolución de mezclas racémicas de octil éster del ácido 2-bromo-fenilacético y síntesis de biopolímeros y lípidos estructurados. Paralelamente, se realizó un análisis genómico mediante la búsqueda con motivos conservados que codifican para diversas proteínas lipolíticas, así como ensayos de transcriptómica para buscar la expresión in vivo de secuencias seleccionadas en las hojas de la planta, que permitieron encontrar por primera vez una expresión in vivo de una lipasa en C. papaya (CpLip2). Esta proteína y otras dos previamente identificadas en el látex de papaya (CpEst y CpLip1), fueron expresadas de forma funcional empleando respectivamente Nicotiana sp., Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris como sistemas de expresión. Finalmente algunas de las propiedades bioquímicas y catalíticas de las proteínas expresadas fueron determinadas

Nas abelhas sociais Apis mellifera a determinação de castas está relacionada à nutrição diferencial durante o desenvolvimento larval. Os indivíduos são alimentados com geléia real até o terceiro estágio larval, quando aqueles que são destinados a se tornarem operárias passam a receber uma mistura de secreções glandulares, mel e pólen. O conteúdo da dieta recebida após o terceiro estágio larval ativará respostas endócrinas diferenciais que resultarão no estímulo de vias distintas de expressão gênica que culminarão no desenvolvimento de rainhas e operárias. Vários modelos de determinação de castas foram propostos envolvendo diferentes fatores que atuam sobre o desenvolvimento de cada uma, em especial o Hormônio Juvenil (HJ), as vias de sinalização por insulina/IGF e TOR (target of rapamycin) a metilação diferencial e a proteína recentemente descoberta, royalactin, que favorecem o desenvolvimento de rainhas. Para o desenvolvimento de operárias foi sugerido estímulo de outras vias de sinalização, que possivelmente envolveria a participação dos genes ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc) e retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Utilizando diferentes abordagens avaliamos a participação destes genes no processo que culmina no desenvolvimento das castas. Através da análise de expressão gênica em larga escala utilizando microarrays, observamos a existência de genes diferencialmente expressos em rainhas e operárias, sendo a maior que parte deles apresentou expressão preferencial em operárias. Muitos destes genes, inclusive esterase do hormônio juvenil (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D) e peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2), preferencialmente expressos em operárias, estão envolvidos, segundo análises de função por Gene Ontology, em processos essenciais no desenvolvimento das castas como crescimento, reprodução, apoptose, neurogênese, degradação do hormônio juvenil, entre outros. A partir destes resultados, incluímos o gene da esterase do hormônio juvenil (jhe) em nossas análises, como um possível candidato a determinante do desenvolvimento diferencial das operárias. Além disto, foi determinado o perfil de expressão de usp, crc, RfaBp e jhe, durante o desenvolvimento de rainhas e operárias. Observamos que os maiores níveis de expressão de cada um são encontrados em fases posteriores ao período crítico de determinação de castas e que em geral, os maiores níveis de expressão são encontrados em operárias, especialmente crc, RfaBp e jhe. Para usp, os níveis são distintos em rainhas e operária apenas em pontos específicos entre o quinto estágio larval e a fase pré-pupal. Adicionalmente avaliamos a influência da diminuição, através de interferência por RNA (RNAi), dos níveis de expressão de cada um destes genes sobre os níveis dos outros genes estudados, e também sua atuação no desenvolvimento. Vimos que mesmo pequenas modificações nestes níveis inibem ou estimulam a expressão de outros genes e, em alguns casos causam alterações no desenvolvimento das abelhas. Sabendo da importância dos microRNAs (miRNAs) na regulação da expressão gênica e do desenvolvimento, avaliamos os níveis de expressão dos miRNAs preditos como reguladores de jhe. Os resultados obtidos mostraram que alguns deles, como let-7, miR-2796 e miR-263b, por apresentarem correlação negativa com os níveis do gene alvo, são realmente fortes candidatos a seus reguladores. Além disto, alterações nos níveis do gene alvo, mostraram a capacidade de alterar os níveis de expressão da maioria dos miRNAs preditos. Este resultado foi corroborado por sequenciamento em larga escala das amostras tratadas com dsjhe e controle, que apontou também outros possíveis reguladores de jhe, entre eles miR-100, miR-306 e mi-13b. Analisando os resultados obtidos de forma conjunta podemos sugerir que o desenvolvimento de operárias está sob complexa regulação que envolve a participação dos genes aqui estudados, além de outros fatores como os miRNAs. Estes genes agem de maneira coordenada, inclusive com os miRNAs, em momentos específicos do desenvolvimento atuando sobre cascatas de expressão gênica de forma a ativar ou inibir a expressão uns dos outros e também de outros genes, o que culminará no desenvolvimento diferencial de rainhas e operárias em A. mellifera. / In Apis mellifera, a eusocial bee, caste determination during larval development is regulated by differential nutrition. All female larvae are fed royal jelly until the third larval stage, when the workerdestined ones have their diet switched to a gland secretion mix, honey and pollen, Queen-destined larvae, however, are provisioned with a rich diet throughout development. Changes in diet after the third developmental stage modulate larval endocrine responses and different nutritional regimes trigger distinct patterns of gene expression. Thus, nutritional regulation of specific signaling pathways controls development of worker and queen phenotypes. Several proposed models of this process involve caste-specific regulation of hormonal and nutritional factors and/or molecular processes including Juvenile Hormone (JH), insulin/IGF and TOR (target of rapamycin) signaling pathways, differential methylation and the newly discovered protein royalactin, which facilitates queen development. Previous research has also suggested the stimulus of other factors in signaling pathways that acts towards workers development, and they possibly involves the participation of some genes like ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc), and retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Using diverse molecular approaches, we evaluate the role of these genes in caste differentiation. We used microarrays to characterize global differences in gene expression between queen and worker larvae. Functional analysis of significantly, differentially expressed genes identified fundamental biological processes including growth, reproduction, apoptosis, neurogenesis and JH degradation that are involved in caste differentiation. Based on these findings, we selected several candidate genes including juvenile hormone esterase (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D), and peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2) for investigation. Notably, these genes were preferentially upregulated in workers. In a separate experiment, we monitored expression of usp, crc, RfaBp and jhe, in queen and worker larval during stages critical to caste determination. In general, workers expressed crc, RfaBp and jhe at higher levels than queens. For usp, distinct expression levels between worker- and queen-destined larvae were observed only at specific points between the 5th larval stage and pre-pupal phase. Additionally we used RNA interference (RNAi) to monitor the impact of decreased levels of select candidate genes on larval development. We found that even small modification of gene expression levels inhibited or triggered expression of other genes, and, in some cases, caused developmental alterations. Furthermore, microRNAs (miRNAs) are also important regulators of gene expression during development and we identified miRNAs that were predicted jhe regulators and assessed their levels. Results determined that some miRNAs including let-7, miR-2796 e miR-263b were strong candidates for jhe regulation because they were significantly and negatively correlated with target gene expression levels. Furthermore, manipulation of target gene expression levels altered expression of most predicted miRNAs. These results were confirmed by deep sequencing of RNAi samples treated with double-stranded RNA for jhe gene (dsjhe) and controls (with no treatment) which also identified other candidate jhe regulators, like miR-100, miR-306 and mi-13b. Taken together, these results suggest that worker development is regulated by complex interactions that involve usp, crc, RfaBp and jhe in addition to other molecules, including miRNAs. These molecular participants coordinate development at specific time points by regulating activity of gene networks and each other, producing the differential development of workers and queens in A. mellifera.

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. / Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. / Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Nas abelhas sociais Apis mellifera a determinação de castas está relacionada à nutrição diferencial durante o desenvolvimento larval. Os indivíduos são alimentados com geléia real até o terceiro estágio larval, quando aqueles que são destinados a se tornarem operárias passam a receber uma mistura de secreções glandulares, mel e pólen. O conteúdo da dieta recebida após o terceiro estágio larval ativará respostas endócrinas diferenciais que resultarão no estímulo de vias distintas de expressão gênica que culminarão no desenvolvimento de rainhas e operárias. Vários modelos de determinação de castas foram propostos envolvendo diferentes fatores que atuam sobre o desenvolvimento de cada uma, em especial o Hormônio Juvenil (HJ), as vias de sinalização por insulina/IGF e TOR (target of rapamycin) a metilação diferencial e a proteína recentemente descoberta, royalactin, que favorecem o desenvolvimento de rainhas. Para o desenvolvimento de operárias foi sugerido estímulo de outras vias de sinalização, que possivelmente envolveria a participação dos genes ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc) e retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Utilizando diferentes abordagens avaliamos a participação destes genes no processo que culmina no desenvolvimento das castas. Através da análise de expressão gênica em larga escala utilizando microarrays, observamos a existência de genes diferencialmente expressos em rainhas e operárias, sendo a maior que parte deles apresentou expressão preferencial em operárias. Muitos destes genes, inclusive esterase do hormônio juvenil (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D) e peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2), preferencialmente expressos em operárias, estão envolvidos, segundo análises de função por Gene Ontology, em processos essenciais no desenvolvimento das castas como crescimento, reprodução, apoptose, neurogênese, degradação do hormônio juvenil, entre outros. A partir destes resultados, incluímos o gene da esterase do hormônio juvenil (jhe) em nossas análises, como um possível candidato a determinante do desenvolvimento diferencial das operárias. Além disto, foi determinado o perfil de expressão de usp, crc, RfaBp e jhe, durante o desenvolvimento de rainhas e operárias. Observamos que os maiores níveis de expressão de cada um são encontrados em fases posteriores ao período crítico de determinação de castas e que em geral, os maiores níveis de expressão são encontrados em operárias, especialmente crc, RfaBp e jhe. Para usp, os níveis são distintos em rainhas e operária apenas em pontos específicos entre o quinto estágio larval e a fase pré-pupal. Adicionalmente avaliamos a influência da diminuição, através de interferência por RNA (RNAi), dos níveis de expressão de cada um destes genes sobre os níveis dos outros genes estudados, e também sua atuação no desenvolvimento. Vimos que mesmo pequenas modificações nestes níveis inibem ou estimulam a expressão de outros genes e, em alguns casos causam alterações no desenvolvimento das abelhas. Sabendo da importância dos microRNAs (miRNAs) na regulação da expressão gênica e do desenvolvimento, avaliamos os níveis de expressão dos miRNAs preditos como reguladores de jhe. Os resultados obtidos mostraram que alguns deles, como let-7, miR-2796 e miR-263b, por apresentarem correlação negativa com os níveis do gene alvo, são realmente fortes candidatos a seus reguladores. Além disto, alterações nos níveis do gene alvo, mostraram a capacidade de alterar os níveis de expressão da maioria dos miRNAs preditos. Este resultado foi corroborado por sequenciamento em larga escala das amostras tratadas com dsjhe e controle, que apontou também outros possíveis reguladores de jhe, entre eles miR-100, miR-306 e mi-13b. Analisando os resultados obtidos de forma conjunta podemos sugerir que o desenvolvimento de operárias está sob complexa regulação que envolve a participação dos genes aqui estudados, além de outros fatores como os miRNAs. Estes genes agem de maneira coordenada, inclusive com os miRNAs, em momentos específicos do desenvolvimento atuando sobre cascatas de expressão gênica de forma a ativar ou inibir a expressão uns dos outros e também de outros genes, o que culminará no desenvolvimento diferencial de rainhas e operárias em A. mellifera. / In Apis mellifera, a eusocial bee, caste determination during larval development is regulated by differential nutrition. All female larvae are fed royal jelly until the third larval stage, when the workerdestined ones have their diet switched to a gland secretion mix, honey and pollen, Queen-destined larvae, however, are provisioned with a rich diet throughout development. Changes in diet after the third developmental stage modulate larval endocrine responses and different nutritional regimes trigger distinct patterns of gene expression. Thus, nutritional regulation of specific signaling pathways controls development of worker and queen phenotypes. Several proposed models of this process involve caste-specific regulation of hormonal and nutritional factors and/or molecular processes including Juvenile Hormone (JH), insulin/IGF and TOR (target of rapamycin) signaling pathways, differential methylation and the newly discovered protein royalactin, which facilitates queen development. Previous research has also suggested the stimulus of other factors in signaling pathways that acts towards workers development, and they possibly involves the participation of some genes like ultraspiracle (usp), cryptocephal (crc), and retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp). Using diverse molecular approaches, we evaluate the role of these genes in caste differentiation. We used microarrays to characterize global differences in gene expression between queen and worker larvae. Functional analysis of significantly, differentially expressed genes identified fundamental biological processes including growth, reproduction, apoptosis, neurogenesis and JH degradation that are involved in caste differentiation. Based on these findings, we selected several candidate genes including juvenile hormone esterase (jhe), failed axon connections (fax), activating transcription factor-3 (atf-3), cathepsin-D (cath-D), and peptidoglycan recognition protein-SC2 (pgrp-sc2) for investigation. Notably, these genes were preferentially upregulated in workers. In a separate experiment, we monitored expression of usp, crc, RfaBp and jhe, in queen and worker larval during stages critical to caste determination. In general, workers expressed crc, RfaBp and jhe at higher levels than queens. For usp, distinct expression levels between worker- and queen-destined larvae were observed only at specific points between the 5th larval stage and pre-pupal phase. Additionally we used RNA interference (RNAi) to monitor the impact of decreased levels of select candidate genes on larval development. We found that even small modification of gene expression levels inhibited or triggered expression of other genes, and, in some cases, caused developmental alterations. Furthermore, microRNAs (miRNAs) are also important regulators of gene expression during development and we identified miRNAs that were predicted jhe regulators and assessed their levels. Results determined that some miRNAs including let-7, miR-2796 e miR-263b were strong candidates for jhe regulation because they were significantly and negatively correlated with target gene expression levels. Furthermore, manipulation of target gene expression levels altered expression of most predicted miRNAs. These results were confirmed by deep sequencing of RNAi samples treated with double-stranded RNA for jhe gene (dsjhe) and controls (with no treatment) which also identified other candidate jhe regulators, like miR-100, miR-306 and mi-13b. Taken together, these results suggest that worker development is regulated by complex interactions that involve usp, crc, RfaBp and jhe in addition to other molecules, including miRNAs. These molecular participants coordinate development at specific time points by regulating activity of gene networks and each other, producing the differential development of workers and queens in A. mellifera.