Recentemente, uma quantidade significativa de dados de sequência (tanto genômicas como transcritômicas) para Echinococcus spp. foi publicado, facilitando a análise de genes expressos durante um estágio especifico ou envolvidos no desenvolvimento do parasito. Para realizar uma análise adequada de quantificação da expressão gênica, o uso de genes de referência validados é fortemente recomendado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e validar genes de referência para permitir a normalização confiável da expressão gênica de determinados genes de interesse em Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) (G1) e Echinococcus ortleppi durante o desenvolvimento inicial da forma pré-adulta do parasito. Protoescólices não tratados (PS) e protoescólices tratados com pepsina (PSP) do metacestódeo de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi foram usados para extração de RNA total e análise da expressão gênica. A estabilidade na expressão gênica de onze genes candidatos (TUB, NDUFV2, RPL13, TBP, CYP, RNApol sub2, EF-1α, βACT, GAPDH, ETIF4 e ERK) foi avaliada usando os programas geNorm, NormFinder e RefFinder. Nossos dados de RT-qPCR mostraram uma alta correlação com dados recentemente publicados de RNA-seq. Em relação à estabilidade na expressão, EF-1α e TBP foram os genes mais estáveis para ambas as espécies. Entretanto, βACT (gene comumente utilizado como normalizador), GAPDH e ETIF4 (previamente identificados como genes housekeeping) não tiveram um comportamento estável em nossas condições de ensaio. Desta maneira, propomos o uso de EF-1α como gene de referência para estúdios que envolvam análises de expressão gênica no inicio do desenvolvimento da forma pré-adulta de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi. Para demonstrar sua aplicabilidade, EF-1α foi usado como gene normalizador na quantificação relativa de transcritos para genes que codificam as proteínas ribossômicas L10, L14, e S15, e para as subunidades do antígeno B de E. granulosus. O mesmo gene de referência EF-1α poderia ser usado em estudos com outras espécies de Echinococcus sensu lato. Este é o primeiro relato que valida genes de referência adequados para a classe Cestoda, phyllum Platyhelminthes, portanto fornecendo uma base para futuras validações em espécies de cestódeos epidemiologicamente importantes, como aquelas do gênero Taenia.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2015-07-17T20:13:43Z No. of bitstreams: 1 SILVA JUNIOR, Joaquim Custódio.pdf: 4910459 bytes, checksum: 7746a181edeca5d3d7a1104ec6e7fc66 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-17T20:13:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SILVA JUNIOR, Joaquim Custódio.pdf: 4910459 bytes, checksum: 7746a181edeca5d3d7a1104ec6e7fc66 (MD5) / FAPESB – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia. / Introdução: A despeito de bom prognóstico na maioria dos casos, o manejo do câncer diferenciado de tireoide (CDT) ainda carece de avanços em situações de doença mais agressiva. O uso crescente da Biologia Molecular na Oncologia vem ganhando força como ferramenta útil no manejo de diversos tipos de câncer. Além da abordagem tradicional de busca de mutações relacionadas a tipos específicos de câncer, o estudo de características epigenéticas emerge como uma nova modalidade de análise e predição do comportamento dos tumores. HOPX é um gene homeobox com função de supressão tumoral, cuja hipermetilação e consequente redução de expressão gênica foi estudada em diversos tipos de câncer (pulmão, esôfago, estômago, pâncreas, cólon e útero). Em câncer colorretal, gástrico, pulmonar e de esôfago, a redução de expressão gênica de HOPX confere fenótipo mais agressivo e piora do prognóstico. HOPX possui papel controlador de diversas onco-proteínas (Cyr61, EMP1, EphA2, c-Fos, c-Jun, EGR1 e GLUT-3) e interage com fatores de transcrição tais como HDAC2/GATA4, SRF e EPC1. Objetivos: Analisar o perfil de expressão do gene homeobox HOPX em amostras de CDT, comparando com o tecido não-tumoral adjacente e com tecidos benignos, e buscar associação com aspectos clínico-patológicos. Metodologia: Estudo prospectivo envolvendo 32 pacientes submetidos à tireoidectomia total, dos quais 26 tiveram confirmação de diagnóstico de CDT e 6 com tumores benignos. Realizada dissecção de amostra de tecido tumoral (T) e tecido não-tumoral (NT) adjacente ao tumor. Extração de RNA das amostras pelo método Trizol® e conversão em cDNA. Análise de expressão gênica através da reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando aparelho 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems® ). O gene S8 foi utilizado como controle interno para normalização da expressão. Dados clínicos e patológicos foram obtidos através de entrevista com os pacientes e revisão de prontuários eletrônicos. Para cálculo da expressão gênica foi empregado o método ∆∆cT. A comparação da expressão gênica entre tecidos NT e T foi realizada utilizando testes de Wilcoxon. Para comparar os grupos benigno e maligno foi utilizado o teste ANOVA. As análises considerando os aspectos clínico-patológicos foram realizadas com o teste do Qui-Quadrado e o teste de Kruskal-Wallis. Resultados: A expressão de HOPX demonstrou marcada redução em amostras de CDT, quando comparado a neoplasias benignas de tireoide (p = 0,024). Verificou-se significativa redução (65,6%) da expressão gênica de HOPX nas amostras T quando comparadas com as NT (3,49 ± 8,3 vs. 10,14 ± 27,8) (p = 0,009). Em pacientes com CDT sem tireoidite associada, a redução da expressão de HOPX esteve associada a estádios mais iniciais de neoplasia (I e II, classificação TNM), em comparação com estádios mais avançados (III e IV) (p = 0,021). Redução de expressão de HOPX também esteve associada com idade menor que 45 anos (p = 0,048). Conclusão: Este é o primeiro estudo da literatura que evidencia redução da expressão de HOPX em câncer de tireoide, tanto em comparação com tecidos benignos, quanto comparado a tecido não-tumoral. Por outro lado, os achados de associação com estádios mais precoces e pacientes mais jovens sugerem uma possível especificidade dos mecanismos de controle da expressão gênica de HOPX em CDT, mediante influências microambientais e genéticas ainda não identificadas. Estudos adicionais permitirão confirmar estes achados em maior tamanho amostral, bem como definir o papel de HOPX como marcador de prognóstico clínico e risco de recorrência tumoral em câncer de tireoide. / Background: Despite good prognosis in majority of cases, differentiated thyroid cancer (DTC) management still lacks advances in more aggressive disease. Growing use of Molecular Biology in Oncology has emerged as useful tool in management of several types of cancer. In addition to the traditional approach of search tissue-specific related mutations, the study of epigenetic pattern constitutes a new way to analysis and prediction of tumor’s behavior. HOPX is a homeobox gene with tumor-suppressing function, whose hypermethylation and consequent reduction of gene expression was studied in several cancer types (lung, esophagus, stomach, pancreas, colorectal and uterus). In colorectal, gastric, lung and esophageal cancer, reduction of HOPX gene expression gives more aggressive phenotype and worse prognosis. HOPX acts controlling various oncoproteins (like Cyr61, EMP1, EphA2, c-Fos, c-Jun, EGR1 and GLUT-3) and interacts with transcription factors such as HDAC2/GATA4, SRF and EPC1. Objectives: Analysis of HOPX gene expression profile in DTC samples, comparing with the adjacent non-tumor tissue and benign thyroid samples, and looking for association with clinical-pathologic features. Methods: Prospective study enrolling 32 patients who undergone thyroidectomy, of which 26 has confirmed DTC diagnosis and 6 with benign tumors. Held sample dissection of tumor tissue (T) and nontumor tissue (NT) adjacent to the tumor. RNA extraction from samples with Trizol® method, and then converted in cDNA. Gene expression analysis with real time PCR method, using 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems® ). S8 ribosomal gene was used as housekeeping to normalize expression. Clinical and pathological data was obtained interviewing patients and reviewing electronic medical records. ∆∆cT method was used to calculate gene expression. Gene expression. comparison between T and NT tissues was done with Wilcoxon’s test. ANOVA test was used to compare malign and benign tumors. Clinicalpathologic features analysis were done with qui-square test and Kruskal-Wallis’s test. Results: HOPX expression markedly reduced in DTC samples, when compared to benign thyroid tissues (p = 0.024). There was a significant reduction (65.6%) of HOPX gene expression in tumor samples compared to non-tumoral (3.49 ± 8.3 vs. 10.14 ± 27.8) (p = 0.009). In DTC patients without thyroiditis, HOPX reduced expression was associated with earlier tumor stages (I and II, TNM staging system) compared with advanced stages (III and IV) (p = 0.021). HOPX reduced expression was also associated with age below 45 years (p = 0.048). Conclusion: This is the first study that evidences HOPX reduced expression in thyroid cancer, compared with benign thyroid tumors and non-tumoral tissues. However, finding of association with earlier stages and lower age suggests specific mechanisms controlling HOPX gene expression in DTC, mediated by microenvironmental and genetic influences, yet not identified. Additional studies may confirm these findings in larger samples, and establish the utility of HOPX use as prognostic and tumor recurrence marker in thyroid cancer.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340680.pdf: 2547462 bytes, checksum: 4b518d80ad6cd59a59c91662e04721ab (MD5) Previous issue date: 2016 / Os nanomateriais estão sendo amplamente utilizados em nosso cotidiano, com diferentes finalidades. A nanopartículas de prata (NPAg) é conhecida por suas propriedades antimicrobianas e é uma das mais comuns em produtos de consumo, tais como tecidos utilizados em roupas para prática de esportes, produtos médicos, produtos para bebês e muitos outros. O uso generalizado de NPAg pode aumentar sua liberação para ambientes naturais e às estações de tratamento de águas residuárias, onde podemos encontrar bactérias do ciclo do nitrogênio. Entre elas são bactérias oxidadoras de amônio (BOA), que são consideradas extremamente sensíveis às mudanças no ambiente. Como as NPAgs afetam a atividade dessas bactérias, importantes agentes reguladores do nitrogênio na natureza, este trabalho visa avaliar sua inibição em processo em batelada e em processo contínuo perante uma cultura pura de Nitrosomonas europaea e também uma cultura enriquecida em BOA, utilizando nanopartícula comercial. Para isso foram feitos testes inibição em batelada e em contínuo, de tempo de exposição, testes cinéticos, de microscopia e expressão gênica, expondo a bactéria à NPAg e Ag+. Os ensaios com cultura pura, nas concentrações de 0,075 mgAgNO3. L-1 (íon de prata), 0,075, 0,25, 0,50 e 0,75 mgAg_NPAg.L-1. Os resultados indicaram que as NPAg apresentam toxicidade elevada sobre a N. europaea, reduzido a velocidade de oxidação de amônia de 80,95 mgNO2-.L-1.d-1 para 46,43 mgNO2-.L-1.d-1 quando exposto à 0,75 mgAg_NPAg.L-1 (inibição foi de 42%). A concentração necessária para inibir a atividade em 50% (KI50) foi de 0,85 mgAg_NPAg.L-1. Íons de prata geraram 100% de inibição da cultura. A expressão gênica corroborou com esses resultados, indicando que existem outros caminhos metabólicos sendo utilizados pela bactéria na presença desse tóxico, podendo haver formação de N2O, gás do efeito estufa. A cultura mista também apresentou maior suscetibilidade ao Ag+ do que à NPAg, sendo que a concentração necessária para inibir 50% da atividade foi de 0,36 mgAgNO3.L-1 e 10,75 mgAg_NPAg.L-1, quase 30 vezes maior. Através de imagens produzidas MEV foi possível observar que a NPAg age sobre a membrana celular, causando ruptura da mesma em elevadas concentrações. Já o íon não apresentou danos relevantes à superfície da bactéria, agindo internamente. A comunidade nitritante perdeu atividade após a exposição contínua à 4,35 mgAg_NPAg.L-1, indicando que o acúmulo de amônia, devido a redução da atividade bacteriana com consequente esgotamento do sistema estudado. Por fim, um teste de tempo de exposição indicou que a toxicidade da NPAg é exclusivamente dependente da dose aplicada, sendo independente do tempo de exposição.<br> / Abstract: Nanomaterials are being widely used in our daily lives, with different purposes. Silver nanoparticle (NPAg) is known by its antimicrobial properties and is one of the most common in consumer products, such as sports cloths, medical products, baby products and many others. The widespread use of NPAg can increase its release to natural environments and to wastewater treatment plants (WWTP), where we can find bacteria from the Nitrogen cycle. Among them are ammonia oxidizing bacteria (AOB), that are considered extremely sensitive to environment changes. NPAg can affect the activity from this group of bacteria, and disrupt the nitrogen cycle. Therefore, this works objective was to evaluate the inhibition caused by NPAg during batch and continuous experiments towards a pure culture of Nitrosomonas europaea and also to a enriched culture AOB, using a commercial silver nanoparticles. Several tests were performed, such as: batch assays and continuous tests, dose and contact time batches, among other tests in order to try to understand the mechanism behind this inhibition. Pure culture batches were exposed to 0.075 AgNO3.L-1 (silver ion), 0.075, 0.25, 0.50 e 0.75 mgAg_NPAg.L-1. Nitrite production rate, fluorescence microscopy analysis and molecular biological methods were used to verify the toxic effect of those concentrations of silver. Results pointed out that NPAg cause inhibition of N. europaea, reducing ammonia oxidation rate from 80.95 mgNO2-L-1.d-1 ,in control, to 46.43 mgNO2-.L-1.d-1 when exposed to 0.75 mgAg_NPAg.L-1 (42% of inhibition). NPAg concentration needed to reduce bacterial activity in 50% (KI50) was 0.85 mgAg_NPAg.L-1. Silver ions caused 100% of inhibition. Gene expression corroborates with these results, indicating that there are other metabolic pathways being used by the bacteria in the presence of this toxic compound, with possible formation of N2O, a greenhouse gas. The mixed culture also showed higher susceptibility to silver ion than NPAg. Wherein the KI50 was 0.36 mgAgNO3.L-1 and 10.75 mgAg_NPAg.L-1, almost 30 times higher. SEM images showed how NPAg generates pints and breakage of cell membrane in when exposed to high concentrations of NPAg. However, Ag+ did not cause damage the surface of the bacteria, acting internally. The nitrifying community lost activity after continuous exposure to 4.35 mgAg_NPAg.L-1, ammonia accumulated, generating being toxic to the culture. Finally, a contact time test shown that the inhibition caused by NPAg is exclusively dependent of the dose and independent of the exposure time.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-07T03:11:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343951.pdf: 2276017 bytes, checksum: 73222d91ce2239bad67a45177bcd46ac (MD5) Previous issue date: 2016 / Os estudos dos mecanismos moleculares do desenvolvimento em crustáceos são importantes para entender a diversidade morfológica deste grupo. No entanto, poucos estudos foram realizados, se consideramos a diversidade deste grupo. Dentre os camarões de água doce, Macrobrachium olfersii surge como um modelo potencial para estudos de desenvolvimento e de toxicidade. Porém, os mecanismos moleculares durante o desenvolvimento ainda não foram descritos, pois poucas sequências são conhecidas nesta espécie. Neste contexto, o presente estudo teve os seguintes objetivos: 1) identificar transcritos com a finalidade de gerar um banco de sequências e contribuir no entendimento dos mecanismos moleculares nesta espécie; 2) identificar transcritos de genes relacionados ao desenvolvimento, em especial os genes Hox e genes de segmentação; 3) e analisar os níveis de seus transcritos durante o desenvolvimento embrionário de M. olfersii. Uma montagem de novo a partir de 25,6 milhões de reads e análise transcriptômica de pool de embriões (E4-E8) proporcionou 99.751 unigenes. Do total, 20,95% foram similares às sequências do banco de dados GenBank. Uma diversidade de transcritos foi classificada por ontologia gênica (21.845 unigenes) e em 129 vias (6.866 unigenes) do KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Os transcritos de genes codificados pelo DNA mitocondrial (22 tRNA, 2 rRNA e 13 genes codificantes de proteínas) também foram identificados. Na análise do transcriptôma utilizando ontologia gênica, 2.142 unigenes foram classificadas na categoria de processos do desenvolvimento e 553 unigenes na subcategoria do desenvolvimento embrionário, cujas sequências foram mais similares aos artrópodes Zootermopsis nevadensis e Limulus polyphemus. Além disso, os transcritos de genes do padrão ântero-posterior, do padrão dorso-ventral, de vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento (TGF-ß, Wnt, Notch, MAPK, Hedgehog, Jak-STAT, VEGF) e dos receptores nucleares induzíveis por ecdiesteróides foram identificados. Através da PCR com iniciadores degenerados foram identificados transcritos dos genes Hox (Lab, Dfd, Antp, Ubx, AbdA, AbdB), genes de segmentação (Eve e Wg) e da família Wnt (Wnt2, Wnt4, Wnt5, Wnt7, Wnt11). Estes resultados indicam que os mecanismos moleculares em M. olfersii podem ser similares a outros crustáceos estudados. Além disso, parálogos dos genes En (En1 e En2) e Eve (Eve1 e Eve2) foram identificados, sendo que os de Eve foram pela primeira vez identificados em crustáceos. Ainda, isoformas de En (En1a e En1b) e de 4 genes Hox (Dfd1a e Dfd1b, Scr1a e Scr1b, Ubx1a e Ubx1b, AbdA-1a e AbdA-1b) foram identificados provavelmente resultantes de splicing alternativo. Para analisar os níveis de transcritos de genes Hox e de segmentação no desenvolvimento, primeiramente foi avaliada a estabilidade de 6 genes de referência utilizando programas computacionais e qPCR. A expressão dos genes Rpl8 e Rps6 foi mais estável durante o desenvolvimento e nos tecidos de animais adultos, respectivamente. Enquanto que, a expressão dos genes Gapdh e Ef-1a foi menos estável no desenvolvimento. Os genes Rpl8 ou Rps6 e suas combinações são mais indicados para serem utilizados como genes de referência, na análise durante o desenvolvimento, por RT-qPCR. Da análise dos níveis de transcritos de genes relacionados ao desenvolvimento, os transcritos de 3 genes Hox (Lab, Dfd e Ftz) diminuíram com o avanço do desenvolvimento, enquanto que os transcritos de 6 genes Hox (Pb, Scr, Antp, Ubx, AbdA e AbdB) aumentaram com o avanço do desenvolvimento, o que estaria relacionado com a função da identidade dos segmentos da cabeça, tórax e abdome. Os genes En1, En2 e Eve2 estariam relacionados com a segmentação, aumentando seus transcritos com a formação de novos segmentos do corpo durante o desenvolvimento. Enquanto que, os transcritos do gene Eve1 diminuíram, o que estaria relacionado com uma função em estágios mais inicias. No entanto, En e Eve também poderiam participar na neurogênese similar a outros artrópodes estudados. Os genes Wg e Hh funcionariam como genes de polaridade segmentar mantendo seus níveis de transcritos similares com o avanço do desenvolvimento. Os níveis de transcritos do gene Dll foi similar entre os estágios e estaria envolvido na formação dos apêndices durante o desenvolvimento como acontece em outros crustáceos. Assim, o presente estudo contribuiu com a primeira identificação em larga escala de transcritos presentes em embriões de M. olfersii, em especial os transcritos de 9 genes Hox e de outros genes relacionados ao desenvolvimento. Além disso, proporciona informação da avaliação de genes de referência para análises de qPCR nesta espécie, que permitirá resultados mais precisos para entender os mecanismos moleculares durante o desenvolvimento embrionário. Da mesma forma, a identificação destas sequências em M. olfersii contribuirá para futuros estudos em diferentes linhas de pesquisa e poderá ainda servir como referência para identificar genes em outros camarões de água doce. <br> / Abstract : Studies of the molecular mechanisms of development in crustaceans are important to understand the morphological diversity of this group. However, few studies have been conducted if we consider the diversity of this group. Among the freshwater prawns, Macrobrachium olfersii emerges as a potential model for development and toxicity studies. However, the molecular mechanisms during development were not described because few sequences are known in this species. In this context, this study had the following objectives: 1) to identify transcripts in order to generate a sequence data bank and contribute to the understanding of the molecular mechanisms in this species, 2) to identify transcripts of gene related to the development, in particular Hox genes and segmentation gene, and 3) analyze the levels of their transcripts during embryonic development of M. olfersii. De novo assembly from 25.6 million reads and transcriptomic analysis of embryos pool (E4-E8) provided 99.751 unigenes. Of the total, 20.95% were similar to sequences of GenBank database. A diversity of transcripts were classified by gene ontology (21.845 unigenes) and 129 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathways (6.866 unigenes). The transcripts of genes encoded by mitochondrial DNA (22 tRNA, 2 rRNA and 13 protein-coding genes) were also identified. In the transcriptome analysis using gene ontology, 2,142 unigenes were assigned to the development processes category and 553 unigenes in embryonic development subcategory, whose sequences were more similar to the Zootermopsis nevadensis e Limulus polyphemus arthropods. Furthermore, transcripts of anterior-posterior pattern genes, of dorsal-ventral pattern genes and signaling pathways involved in the development (TGF-ß, Wnt, Notch, MAPK, hedgehog, Jak-STAT VEGF) and ecdysteroid-inducible nuclear receptors were identified. Moreover, by PCR with degenerate primers were identified transcripts of Hox genes (Lab Dfd, Antp, Ubx, AbdA, AbdB), segmentation genes (Eve and Wg) and Wnt family (Wnt2, Wnt4, Wnt5, Wnt7, Wnt11). These results indicate that the molecular mechanisms in M. olfersii could be similar to other crustaceans studied. Moreover, paralogs of genes En (En1 and En2) and Eve (Eve1 and Eve2) were identified, and the Eve paralogs were first identified in crustaceans. In addition, isoforms of En (En1a and En1b) and of 4 Hox genes (Dfd1a and Dfd1b, Scr1a and Scr1b, Ubx1a and Ubx1b, AbdA-1a and AbdA-1b) were identified probably resulting from alternative splicing. To analyze transcript levels of Hox genes and segmentation genes in development, it was first evaluated the expression stability of reference genes using computer programs and qPCR. Expression of Rpl8 and Rps6 genes was more stable embryonic development and in the adult animal tissues, respectively, whereas the expression of Gapdh and Ef-1a genes was less stable in development. Rpl8 and Rps6 genes or its combinations are most appropriate for use as reference gene for RT-qPCR analysis in development. In the analysis of transcript levels of genes related to the development, the transcripts of 3 Hox genes (Lab, Dfd and Ftz) decreased and the transcripts 6 Hox genes (Pb, Scr, Antp, Ubx, AbdA and AbdB) increased its expression with the progress of the development, which is related to its function in the identity of the segments of the head, thorax and abdomen. The genes En1, En2 and Eve2 would be related to the segmentation, increasing its transcripts with formation of new segments of the body during the development. Whereas the transcripts of Eve1 gene decreased that would be related to a function in most early stages. However, En and Eve could also participate in neurogenesis similar to other arthropods studied. The Wg and Hh gene would function as segment polarity genes, maintaining similar their transcript levels with the progress of development. The transcript levels of gene Dll was very similar between the stages and would be involved in the formation of appendages during development as in other crustaceans studied. Thus, this study contributed with the first large-scale identification of transcripts in M. olfersii embryos, in particular transcripts of 9 Hox genes and other genes related to development. It also provides information of the reference genes evaluation for qPCR analysis in this species, allowing more accurate results to understand the molecular mechanisms during embryonic development. In addition, the identification of these sequences in M. olfersii will contribute in future studies in different lines of research and could serve as a reference to identify genes in other freshwater prawns.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-07T03:14:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343972.pdf: 2649254 bytes, checksum: fd64b01fedb1c00ade7f63f898892b65 (MD5) Previous issue date: 2016 / Proteínas relacionadas ao fibrinogênio (FREPs) compreendem uma grande família gênica envolvidas no reconhecimento microbiano e atuam em muitas funções biológicas nos animais vertebrados e invertebrados. Pesquisas em banco de dados de sequências não anotadas (EST) apresentaram uma sequência homóloga de FREP-like de L. vannamei denominada no presente estudo como LvFrep. A sequência obtida possui um domínio conservado relacionado com o fibrinogênio (FReD) e apresenta similaridade com as proteínas FREP-like de outros invertebrados e ficolinas de crustáceos. A expressão de LvFrep mostrou-se majoritária nos hemócitos circulantes e foi constitutivamente expresso nos hemócitos de camarões apenas em resposta a uma infecção por Vibrio harveyi, mas não para o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV). Além disso, níveis transcricionais de LvFrep foram detectados no início do desenvolvimento, desde os ovos fertilizados, sugerindo que este gene relacionado a imunidade possa participar nas defesas antimicrobianas durante o desenvolvimento do camarão.<br> / Abstract : Fibrinogen-related proteins (FREPs) comprise a large family of microbial recognition proteins involved in many biological functions in both vertebrate and invertebrate animals. By taking advantage of publicly accessible databases, we have identified a FREP-like homolog in the most cultivated penaeid shrimp, Litopenaeus vannamei (LvFrep). The obtained sequence showed a conserved fibrinogen-related domain (FReD) and displayed significant similarities to FREP-like proteins from other invertebrates and to ficolins from crustaceans. The expression of LvFrep appeared to be limited to circulating hemocytes. Interestingly, LvFrep gene expression was induced in shrimp hemocytes only in response to a Vibrio infection but not to the White spot syndrome virus (WSSV). Moreover, LvFrep transcript levels were detected early in fertilized eggs, suggesting the participation of this immune-related gene in the antimicrobial defenses during shrimp development.

Os leiomiomas são neoplasias benignas comuns do sistema reprodutivo feminino e são encontrados em até 50% das mulheres em idade reprodutiva. As causas e os mecanismos de desenvolvimento desse tumor não estão bem estabelecidos; eventuais descontroles nos percursos apoptóticos e influências dos hormônios esteróides ovarianos devem estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi examinar a expressão do gene e da proteína das isoformas A e B do receptor de progesterona, de p53 e de p21 em miométrio e leiomioma uterino. Foram obtidas amostras de 14 pacientes em idade reprodutiva que se submeteram à histerectomia abdominal por leiomiomatose. Os tecidos foram submetidos à extração de mRNA com o uso de Trizol®, para análise da expressão gênica pela técnica de RT-PCR, e à extração de proteínas, para análise de expressão proteica pela técnica de Western Blot. Não foram observadas diferenças nos níveis de expressão de mRNA para PRAB, PRB e nos níveis proteicos dos PRs entre o miométrio e o leiomioma uterino. Não houve correlação entre a fase do ciclo menstrual e os receptores de progesterona. A relação entre as isoformas (PRA:PRB) não foi diferente entre os tecidos e mostrou uma forte correlação entre ambos (r=0,767, P=0,004). As análises da expressão gênica e proteica mostraram aumento nos níveis de mRNA e de proteína de p53 no leiomioma comparado ao miométrio (P=0,030 e P=0,002, respectivamente). O mesmo aumento foi observado nos níveis de mRNA de p21 (P=0,016) e nos níveis proteicos de p21 (P=0,026) nas amostras de leiomioma uterino. As expressões gênica e proteica inalteradas dos PRs são características das doenças benignas, como a leiomiomatose; alterações da relação PRA:PRB são observadas em neoplasias malignas. Já o aumento significativo observado nos níveis de mRNA e de proteína de p53 e p21 em leiomiomas indica uma possível participação destes genes no desenvolvimento desse tumor podendo estar relacionado à estabilização funcional e detenção de possíveis danos, evitando a transformação carcinogênica. / Leiomyomas are common benign neoplasms of the female reproductive system and they are found in up to 50% of women of reproductive age. The causes and mechanisms of the development of this tumor are not well established. Occasional lack of control in apoptotic pathways and influences of ovarian steroid hormones must be involved. The aim of this study was to examine the expression of gene and protein progesterone receptor isoforms A and B, p53 and p21 in uterine leiomyoma and myometrium. Samples of 14 reproductive-age patients, submitted to abdominal hysterectomy due to leiomyomatosis, were obtained. The tissues were submitted to mRNA extraction using Trizol® for gene expression analysis through the RT-PCR technique, and protein extraction for protein expression analysis was developed through the Western blot technique. There were not significant differences in levels of mRNA expression for PRAB, PRB and PRs protein between the myometrium and uterine leiomyoma. It was not found any correlation between the menstrual cycle phase and progesterone receptors. The relationship between the isoforms (PRA: PRB) was not different in the tissues and it was observed a strong correlation (r = 0.767, P = 0.004) between them. The analysis of gene and protein expression showed an increase in levels of mRNA and p53 protein in leiomyoma when compared to myometrium (P = 0.030 and P = 0.002). The same increase was observed in the p21 mRNA levels (P = 0.016) and in the p21 protein levels (P = 0.026) in the samples of uterine leiomyoma. The unchanged gene and protein expressions of PRs are characteristic of benign diseases such as leiomyomatosis, and alterations in PRA: PRB relationship are observed in malignant neoplasms. However, the significant increase observed in the levels of mRNA and p53 and p21 protein in leiomyomas indicates a possible participation of those genes in the development of that tumor, which can be related to functional stabilization and retention of possible damage, avoiding the carcinogenic transformation.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:50Z : No. of bitstreams: 1 000856041_20160224.pdf: 369728 bytes, checksum: 9a361cff02824a96220d774796576075 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-24T11:27:51Z: 000856041_20160224.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-24T11:28:35Z : No. of bitstreams: 1 000856041.pdf: 2405364 bytes, checksum: 33e00067b3833e32f474101ba15a417f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As associações de mutualismo afetam a vida de todos os organismos vivos. Um modelo biológico muito útil para estudos sobre o mutualismo são as formigas da tribo Attini, cuja nutrição depende da associação com fungos basidiomicetos. Estes fungos produzem despolimerases que degradam a matéria vegetal, gerando açúcares simples que são essenciais para a sobrevivência das formigas. Estudos bioquímicos sugerem que pode haver vias metabólicas mutualistas, iniciando com passos catalisados por enzimas fúngicas e terminando com passos catalisados por enzimas das formigas. Estudos genômicos indicam que as formigas podem não ser capazes de sintetizar alguns aminoácidos, que seriam supridos pelos fungos. Estudos em microbiologia sugerem que as formigas utilizam antibióticos microbianos para proteção contra eventuais entomopatógenos. Desta forma, caracteriza-se uma dependência nutricional e de metabólitos microbianos pelas formigas. Para avaliar a extensão desta dependência, na presente dissertação de mestrado nós anotamos o transcriptoma da formiga Attini Atta sexdens rubropilosa em busca das vias metabólicas com elementos mais expressos. Foram avaliadas a presença e expressão de genes a partir de dados de transcriptômica de nova... / Mutualistic associations affect all living organisms. A useful biological model for studies of mutualism are Attini ants, whose nutrition depends on the association with basidiomycete fungi. These fungi produce depolymerases that act on degrading plant material, producing simple sugars that are essential for the survival of ants. Biochemical studies suggest that may be metabolic pathways, starting with steps catalyzed by fungal enzymes and ending with steps catalyzed by enzymes of the ants. Genomic studies indicate that the ants may not be able to synthesize some amino acids that would be supplied by the fungi, thus characterizing nutritional mutualistic dependence. To assess the extent of this metabolic dependence, in this thesis we aimed to annotate the transcriptome of Attine ant Atta sexdens rubropilosa in search of metabolic pathways. The presence and expression of genes from transcriptomics data of next generation sequencing were evaluated

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:53:56Z : No. of bitstreams: 1 porto_mp_me_botib.pdf: 2132236 bytes, checksum: b1dd297e7ebc3769eafbc4dbcaa5705a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Devido a propriedades terapêuticas, várias plantas e seus constituintes químicos vêm sendo muitas vezes utilizados como o primeiro recurso para o tratamento de diversas doenças. Nesse contexto, compostos isolados de plantas têm sido alvos de inúmeros estudos que avaliam, além da atividade, seus possíveis mecanismos de ação. Dentre os compostos com potencial quimioprotetor, o citral e o eugenol merecem atenção devido suas estruturas químicas de monoterpeno e de composto fenólico, respectivamente, e por seus potenciais anti-inflamatório, antiparasitário e antioxidante. Considerando que mutação no DNA pode ser a primeira etapa de várias doenças, e que lesões induzidas nessa molécula podem ser prevenidas ou moduladas por compostos naturais, este estudo objetivou avaliar, pelo teste do cometa, o potencial genotóxico do citral (25, 50 e 100 Tg/mL) e do eugenol (0,31, 0,62, 1,24 e 2,48 Tg/mL), após diferentes tempos de tratamento (6, 10, 24 e 30 h) e, também, seus possíveis efeitos moduladores sobre danos induzidos no DNA pela doxorrubicina (DOX), em diferentes protocolos de tratamento (pré, pós e simultaneamente à DOX) e momentos de análise (12, 24 e 36 h), em macrófagos peritoneais de camundongos. Além disso, foi avaliado o potencial toxicogenômico do citral e do eugenol por meio da modulação da expressão dos genes NF-kB1, COX-2 e TNF-α (relacionados a processos inflamatórios) em macrófagos ativados ou não por lipopolissacarideo de bactéria (LPS). Os resultados mostraram que ambos os compostos apresentaram potencial genotóxico. No caso do citral, a genotoxicidade foi observada para as duas maiores concentrações, mas apenas no tempo de 6h; para o eugenol, o aumento de danos no DNA foi detectado para todas as concentrações, em pelo menos um momento de análise. Com relação ao potencial... / Because of the therapeutic properties, several plants and their chemical constituents have been used for treatment of various diseases. Therefore, isolated compounds from plants have been targets of numerous studies that evaluate their activity and mechanisms of action. Among compounds with chemopreventive potential, citral and eugenol have gain attention because of their chemical structures, monoterpene and phenol,respectively, and for their anti-inflammatory, antioxidant and antiparasitic potentials. Since DNA mutation is the first step for some diseases, and since the lesions induced in this molecule can be prevented or modulated by natural compounds, aim of the present study was first to evaluate the genotoxic potential of citral (25, 50 and 100 Tg/mL) and eugenol (0.31, 0.62, 1.24 and 2.48 Tg/mL) at different times after exposure (6, 10, 24 and 30 h), and then, their ability to modulate DNA damage induced by doxorubicin (DOX) at different treatment protocols (pre, post and simultaneous with DOX) and times (12, 24 and 36 h) in mice peritoneal macrophages. In addition, the toxicogenomic potential of citral and eugenol by modulating the expression of NF-KB1, COX-2 and TNF-α (related to inflammatory processes) genes in macrophages activated or not by bacterial lipopolysaccharide (LPS) was also investigated. The results showed that both compounds have genotoxic potential. In the case of citral, genotoxicity was observed for the two major concentrations, but only 6h after the exposure. For eugenol, increased DNA damage was detected for all concentrations, in at least one moment of analysis. Related to the antigenotoxicity, both citral and eugenol presented protective effects at different concentrations and treatment protocols, and the more effective activities were detected at simultaneous and pre-treatment... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-12Bitstream added on 2015-05-14T16:59:24Z : No. of bitstreams: 1 000819494.pdf: 730304 bytes, checksum: c24a03c0d2e555a0ddbac4bad206675a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Durante o processo de germinação da semente várias enzimas estão presentes em reações metabólicas importantes durante a respiração, como por exemplo, malato desidrogenase e álcool desidrogenase. Além disso, para que a germinação aconteça, são necessárias a expansão e a posterior divisão das células do embrião, nesses processos estão envolvidos os genes actina e ciclina, respectivamente. São importantes ainda, os mecanismos de proteção das sementes contra estresses abióticos durante a germinação, dentre eles podem ser citadas a presença de proteínas de choque térmico, relacionadas com a tolerância à dessecação e de enzimas como a glutationa-S-transferase, consideradas antioxidantes. Objetivou-se com este estudo avaliar o perfil de expressão de genes associados com a respiração, citoesqueleto, ciclo celular e estresse no embrião de sementes de Solanum lycocarpum durante a germinação. As sementes de lobeira foram avaliadas com relação a sua qualidade fisiológica, determinando-se: porcentagem de germinação, índice de velocidade de germinação, tempo médio de germinação, frequência de germinação. Além disso, determinou-se uma curva de embebição. O RNA do embrião das sementes foi extraído aos 1, 5, 10 e 15 dias de embebição em água seguido da síntese de cDNA. A expressão gênica foi realizada usando-se a técnica de PCR em tempo real. Os genes estudados no embrião foram malato desidrogenase (MDH), álcool desidrogenase (ADH2), actina (ACT7), ciclina (CDC2), proteína de choque térmico (HSPS17.6), glutationa-S-transferase (GST). A partir dos resultados obtidos conclui-se que, durante o processo de germinação de sementes de lobeira, existe variação no perfil de expressão de ... / During the process of seed germination various enzymes are present in important metabolic reactions during respiration, such as malate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase. In addition, for germination to take place, is necessary expansion and subsequent division of the cells of the embryo, which requires the involved of the genes cyclin and actin, respectively. Mechanisms associated with seed protection against abiotic stresses during germination, among which may be mentioned is the presence of heat shock proteins related to desiccation tolerance and enzymes such as glutathione-S-transferase, considered as antioxidant. The aim of this study was to evaluate the expression profile of genes associated with respiration, cytoskeleton, cell cycle and stress in the embryo of seeds of Solanum lycocarpum during germination. Lobeira seeds were evaluated with respect to their physiological quality, determining: germination percentage, speed of germination, means germination time, frequency of germination and was also given a curve of soaking. The RNA from the embryo of the seeds was extracted at 1, 5, 10 and 15 days of imbibitions in water, followed by cDNAS synthesis The gene expression was carried out using the technique of real time PCR. The genes studied in the embryo were malate dehydrogenase (MDH), alcohol dehydrogenase (ADH2) and actin (ACT7), cyclin (CDK2), heat shock protein (HSPS17.6), glutathione-S-transferase (GST). From the results obtained we concluded that, during the process of germination of lobeira, there is variation in the expression of genes associated with respiratory, stress protection and expansion and cell division

O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.