Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:39Z : No. of bitstreams: 1 000837967_20170212.pdf: 232550 bytes, checksum: a1094395aeb571a1e335ad7f2c585852 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-02-17T11:23:26Z: 000837967_20170212.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-02-17T11:24:29Z : No. of bitstreams: 1 000837967.pdf: 3734694 bytes, checksum: 58e85e2f06e28ba5f8c69ee9e98eefee (MD5) / O clone metagenômico B5pl37 (inserto de 23 Kb) foi obtido por meio de uma prospecção por PCR para o conjunto gênico de Policetídeos Sintases tipo II (PKSII) em uma biblioteca cosmidial de amostra de solo de bosque de eucaliptos (S.E.). As PKSII são responsáveis pela produção de inúmeras moléculas bioativas, dentre os quais se destacam os antibióticos policetídicos. Parte da sequência do inserto (cobertura de 27-43%) apresentou similaridade de 77-78% com bactérias da família Streptomycetaceae (ferramenta BlastN, Genbank). Além da PKS II, a anotação gênica permitiu identificar genes relacionados à degradação de compostos lignocelulósicos importantes para a produção de combustíveis de segunda geração (2G): uma β- glicosidase, uma celulase e uma Multicopper oxidase (MCO). Considerando a importância industrial destes genes, este trabalho teve como objetivo a caracterização in silico e in vitro/vivo dos mesmos. As análises in silico auxiliaram a identificar a arquitetura do sítio ativo (modelo de estrutura proteica obtida por homologia) e famílias enzimáticas (com base em agrupamentos fenéticos com sequências de enzimas de atividade conhecida). Quanto às análises in vitro/vivo, foram realizados experimentos de expressão em vetor pET28a em Escherichia coli para as enzimas celulase (linhagens de E.coli BL21; C41 e Artics) e β-glicosidase (E.coli BL21), enquanto o gene MCO foi submetido à síntese in vitro para um estudo posterior. Foi feita a caracterização cinética da β-glicosidase (melhor rendimento na expressão e purificação), que obteve os parâmetros catalíticos: Vmax de 0,79 μM/min; km de 0,46 mM.. Os respectivos valores de temperatura e pH ótimos para a enzima foram 37°C e pH7-7,5; e a enzima foi capaz de manter uma atividade acima de 80% para uma faixa de pH 6,5-8,0 e temperatura 35- 40°C. Com relação à PKSII, foram iniciados os processos preparatórios para a... / The Clone metagenomic B5pl37 (insert of 23kb length) was obtained by a PCR prospect for gene set Polyketide Synthases type II (PKSII) in a library cosmidial eucalyptus grove soil sample (SE). The PKSII are responsible for producing many bioactive molecules, among which the antibiotics were noticeable. Part of the sequence of the insert (27-43% coverage) showed similarity of 77-78% with bacteria Streptomycetaceae family (BLASTN tool, Genbank). In PKS II gene annotation was possible to identify genes related to the degradation of lignocellulosic important compounds for the production of second generation biofuel (2G): A β-glucosidase, a cellulose and a Multicopper oxidase (MCO). Considering the industrial importance of these genes, this study aimed to characterize in silico and in vitro /in vivo thereof. The in silico analyzes helped identify the architecture of the active site (protein structure obtained by homology) and enzyme families (based on phenetic groups with sequences of known enzyme activity). The in vitro / vivo experiments were performed in pET28a expression vector in Escherichia coli for cellulase (E. coli strains BL21; Artics and C41) and β-glucosidase (E. coli BL21), while the gene MCO in vitro synthesis for a subsequent study it was submitted. We had done the kinetic characterization of β- glucosidase (best performance in the expression and purification), which obtained the catalytic parameters: Vmax 0.79 uM / min; km from 0.46 mM. The respective temperature and the pH optimum for the enzyme was 37 ° C and pH7-7,5; and the enzyme was able to maintain an activity above 80% at a pH of 6.5-8.0 and temperature range 35-40 ° C. With respect to PKSII, the preparatory processes have been started to insert the expression in the same host specialized for expression of Streptomyces coelicolor antibiotic M1152 (courtesy of Juan P. Gomez-Escribano, John Innes Centre, Norwich, UK). Cosmidial exchange vector was carried out ...

Orientador: Maria Luiza Cotrim Sartor de Oliveira / Resumo: O Diuron (3-(3,4-Diclorofenil)-1,1-dimetilureia), herbicida derivado da ureia, induziu tumores uroteliais na bexiga de ratos Wistar após dois anos de exposição à alta concentração (2500ppm). Estudos sucessivos de nosso laboratório sugeriram que a concentração intermediária de 500ppm na ração poderia ser citotóxica e potencialmente cancerígena ao urotélio de ratos. A proposta deste estudo foi avaliar as alterações uroteliais induzidas pela exposição subcrônica e crônica (20 e 84 semanas, respectivamente) ao diuron na concentração de 500ppm. Cento e trinta e dois ratos Wistar machos foram distribuídos em grupos controle ou diuron e avaliados após 20 ou 84 semanas de exposição. Os rins e as bexigas foram processados para análise histológica, as bexigas para análise de microscopia eletrônica de varredura e para avaliação da expressão dos genes Gpc3, Ugt1a6, Nfe2l2, Tgfb1 e Gstm1 por RT-PCR quantitativo em tempo real. Apenas após 84 semanas de exposição, a incidência de hiperplasia simples foi significativamente maior na bexiga urinária (10/18) e na pelve renal (23/25) nos animais expostos ao diuron quando comparado aos do grupo controle (2/22 e 9/30, respectivamente). Em ambos os períodos de exposição, o diuron induziu diminuição de expressão do gene Gpc3, envolvido na proliferação celular, e aumento de expressão do gene Ugt1a6, relacionado com o metabolismo de xenobióticos. A expressão do gene Nfe2l2, relacionado ao estresse oxidativo, aumentou apenas no período de 20 semanas. N... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Os caracteres produtivos são normalmente influenciados por muitos fatores, sendo difícil determinar todos os locos envolvidos em um fenótipo específico. Por isso, a seleção animal tem se baseado principalmente em uma estimativa direta ou indireta do fenótipo. A leptina é um importante regulador do metabolismo energético, da adiposidade e da reprodução. E por desempenhar diferentes funções, pode ser considerado um bom gene candidato para o estudo de associações entre marcadores moleculares e a eficiência reprodutiva ou ganho de peso. Em várias espécies, têm sido descritos diversos polimorfismos no gene da leptina, influenciando o ganho de peso, a reprodução, e outras características produtivas. Em bovinos, o STR IDVGA51 e o SNP LEPSau3A1, foram descritos por afetarem a performance reprodutiva, os alelos IDVGA51*181 e LEPSau3A1*2 estando associados a um aumento no intervalo entre partos de 79 e 81 dias, respectivamente, e os STRs BMS1074 e BM1500 afetam o ganho de peso, em vacas, no pós-parto: os alelos BMS1074*151 e BM1500*135 reduzindo e aumentando, respectivamente, o ganho de peso diário. Para confirmar o efeito ou não destes alelos na expressão do gene da leptina, este trabalho comparou os níveis de mRNA de leptina em animais portadores e não portadores dos alelos IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 e BM1500*135, com os objetivos de: 1. Verificar as distribuições genotípicas e alélicas dos marcadores IDVGA51, BMS1074, BM1500 e LEPSau3A1, em uma amostra de 137 bovinos da raça Brangus-Ibagé, provenientes da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA-Pecuária Sul, Bagé-RS). 2. Identificar, no rebanho, animais portadores e não portadores dos alelos IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 ou BM1500*135, previamente descritos como associados à eficiência reprodutiva e ganho de peso. 3. Avaliar os animais, criados em campo nativo, com pastagem natural, quanto à sua condição corporal. 4. Realizar procedimento cirúrgico, para obtenção de amostras de tecido adiposo subcutâneo e omental. 5. Dosar os níveis de mRNA de leptina nos adipócitos destes dois tecidos, através do método quantitativo em tempo real (Real-Time RT-PCR), comparando a expressão do gene LEP entre indivíduos portadores e não portadores dos alelos de predisposição a ganho de peso e desempenho reprodutivo. / Production characters are usually determined by multifactorial factors being difficult to determine all the individual loci involved in a specific phenotype. Therefore, animal selection had been so far applied based mainly on phenotype direct and indirect estimates. Leptin is an important regulator of energy metabolism, adiposity and reproduction. Due to these different roles it could be considered a good candidate gene for the study of association between molecular markers and reproductive efficiency or weight gain. Several polymorphisms at the leptin gene have been described as influencing weight gain, reproduction, and other productive traits in different species. In cattle, IDVGA51 STR and LEPSau3A1 SNP had been described as affecting reproductive performance, the alleles IDVGA51*181 and LEPSau3A1*2 increasing calving interval by about 79 and 81 days, respectively, and BMS1074 and BM1500 STRs seem to be related to weight gain, in postpartum cows, the alleles BMS1074*151 and BM1500*135 reducing and increasing, respectively, the daily weight gain. In order to confirm or not their effect on leptin gene expression, this paper compares the leptin mRNA levels on carriers and non-carriers animals of the IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 and BM1500*135 alleles, with the objectives: 1. To verify genotype and allele frequencies of IDVGA51, BMS1074, BM1500 STRs e LEPSau3A1 SNP in a sample of 137 Brangus- Ibagé cows from the Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA-Pecuária Sul, Bagé-RS). 2. To identify in this herd carriers and non carriers of IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 or BM1500*135 alleles, previously described as associated to reproduction or weight gain. 3. To evaluate the body score conditions of the animals managed on native pasture in an extensive livestock system. 4. To perform surgery in these animals to obtain adipose omental and subcutaneous tissues. 5. To evaluate adipocyte mRNA levels of these two tissues, through Real-Time RT-PCR, comparing the values between animals with and without these alleles.

Resumo não disponível

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O arroz é o alimento base para metade da população mundial. Entretanto, é uma fonte pobre em micronutrientes essenciais como Fe e Zn, que são removidos durante o processamento do grão para produção de alimento. Por essa razão, populações cujas dietas baseiam-se principalmente em arroz estão sujeitas à deficiência de Fe e Zn, que são as deficiências nutricionais mais comuns no mundo, afetando mais de dois bilhões de pessoas. Uma vez que as folhas-bandeira são uma das fontes de remobilização de metais para os grãos em desenvolvimento, a identificação dos mecanismos moleculares que contribuem no processo de transporte de metais das folhas-bandeira para os grãos pode ser útil em programas de biofortificação. Dessa forma, utilizamos duas abordagens diferentes para estudar esta questão. Primeiro, realizamos uma análise por hibridização subtrativa supressora (SSH) em folhas-bandeira de duas cultivares de arroz e isolamos 78 sequências induzidas no estágio de enchimento do grão (R5) em relação ao estágio de emergência da panícula (R3). A expressão diferencial de alguns genes selecionados (entre eles do fator de transcrição OsNAC5) foi confirmada por PCR quantitativo. Mostramos que a expressão de OsNAC5 é ativada em processos de senescência natural (envelhecimento) e induzida (escuro, aplicação de ABA, alta salinidade, frio e deficiência de Fe) e sua expressão não é afetada na presença de 6- benzilaminopurina (um inibidor de senescência) em condição de senescência induzida por escuro. A indução da expressão de OsNAC5 sob alta salinidade é abolida por nicotinamida, um inibidor dos efeitos do ABA. Este resultado e a presença de elementos cis-atuantes na região promotora do gene OsNAC5 sugere uma regulação dependente de ABA. Utilizando quatro diferentes cultivares de arroz, mostramos que a indução de OsNAC5 é maior e antecipada em folhas-bandeira e panículas de plantas da cultivar IR75862, que possui as maiores concentrações de Fe, Zn e proteínas nas sementes. Dessa forma, sugerimos que OsNAC5 é um fator de transcrição do tipo NAC dependente de ABA e associado à senescência, e sua função pode estar relacionada à remobilização de Fe, Zn e aminoácidos dos tecidos verdes para os grãos. Posteriormente, analisamos a expressão de 25 genes de arroz relacionados à homeostase de metais em folhas-bandeira de oito cultivares de arroz (com níveis contrastantes de Fe e Zn nos grãos) durante os estágios de emergência da panícula (R3) e enchimento do grão (R5). Nove destes genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 e OsNAC5) apresentaram correlação significativa entre os níveis de expressão em folhas-bandeira e as concentrações de Fe e Zn nas sementes. Assim, nosso estudo forneceu uma pequena lista de possíveis genes-alvo para manipulação da concentração de Fe e Zn em grãos de arroz. / Rice is the staple food for half of the world population. However, it is a poor source of essential micronutrients such as Fe and Zn, most of which are lost during grain processing for food production. For this reason, populations with monotonous diets consisting mainly of rice are especially prone to Fe and Zn deficiency, which are the most common and widespread nutritional disorders in the world, affecting more than 2 billion people. Since flag leaves are one of the sources of remobilized metals for developing seeds, the identification of the molecular players that might contribute to the process of metal transport from flag leaves to the seeds may be useful for biofortification purposes. In this way, we used two different appraches to address this issue. First, we conducted suppression subtractive hybridization (SSH) analysis in flag leaves of two rice cultivars and isolated 78 sequences up-regulated in flag leaves at the grain filling stage (R5) relative to the panicle exertion stage (R3). Differential expression of selected genes (including the OsNAC5 transcription factor) was confirmed by quantitative RT-PCR. We showed that OsNAC5 expression is up-regulated by natural (aging) and induced senescence processes (dark, ABA application, high salinity, cold and Fedeficiency) and its expression is not affected in the presence of 6-benzylaminopurine (a senescence inhibitor) under dark-induced senescence. Salt induction of OsNAC5 expression is abolished by nicotinamide, an inhibitor of ABA effects. This result and the presence of cis-acting elements in the promoter region of the OsNAC5 gene suggest an ABA-dependent regulation. Using four different rice cultivars, we showed that OsNAC5 up-regulation is higher and earlier in flag leaves and panicles of IR75862 plants, which have higher seed concentrations of Fe, Zn and protein. We suggest that OsNAC5 is a novel senescenceassociated ABA-dependent NAC transcription factor and its function could be related to Fe, Zn and amino acids remobilization from green tissues to seeds. We also analyzed the expression of 25 metal-related genes from rice in flag leaves of eight rice cultivars (showing contrasting levels of seed Fe and Zn) during panicle emergence (R3) and grain filling stage (R5). The expression level of nine of these genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 and OsNAC5) in flag leaves exhibited significant correlations with Fe and/or Zn concentrations in the seeds. In this way, our study has provided a short list of putative target genes to manipulate Fe and Zn concentrations in rice grains.

A endometriose é caracterizada pela presença de tecido endometrial localizado fora da cavidade uterina como peritônio, ovários e septo reto-vaginal e sua prevalência gira em torno de 6% a 10%. Mulheres com endometriose podem ser assintomáticas ou apresentar queixas de dismenorréia, dispareunia, dor pélvica crônica e/ou infertilidade. Em relação à patogênese, a teoria da menstruação retrógrada é bem aceita, embora alterações na biologia molecular do endométrio pareçam ser fundamentais para o desenvolvimento dos implantes endometrióticos. Evidências indicam que a endometriose está associada com aumento das concentrações de citoquinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento e de angiogênese no fluido peritoneal (FP). Entre as citoquinas, a leptina é uma proteína derivada do gene da obesidade (Ob) que, além de ações no balanço energético, ingestão alimentar e controle do peso corporal também apresenta atividades imunorregulatórias e angiogênicas. A interleucina-6 (IL-6) é uma glicoproteína secretada por diversos tipos de células, incluindo macrófagos peritoneais e células estromais endometriais. A IL-6 é um marcador da resposta inflamatória de fase aguda e tem diversas atividades biológicas como indução da expressão do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), crescimento e diferenciação de linfócitos B e ativação de linfócitos T. Estas citoquinas podem ter um papel na endometriose através das suas propriedades inflamatórias e angiogênicas. No presente estudo, avaliamos a razão leptina/IMC e os níveis de IL-6 no soro e FP, bem como a expressão gênica da leptina e da forma longa do seu receptor (OB-RL) no endométrio tópico e ectópico de 30 mulheres com endometriose e 19 controles com pelve normal à laparoscopia. A razão leptina/IMC no soro foi significativamente maior no grupo com endometriose em relação às controles normais 0.61 (0.41 – 0.95) e 0.41 (0.22 – 0.71) P<0.05, respectivamente. A expressão gênica da leptina e do OB-RL foi significativamente maior no endométrio ectópico do que no endométrio tópico de pacientes com diferentes estágios da endometriose e controles. Uma correlação positiva entre níveis de RNAm da leptina e do OB-RL foi observada no endométrio ectópico e tópico das pacientes com endometriose e no endométrio tópico das controles. A imuno-histoquímica do OB-RL foi mais intensa nas células estromais e epiteliais do endométrio tópico das pacientes e controles com maiores níveis de leptina no FP. Os níveis de IL-6 no FP foram significativamente maiores no grupo com endometriose do que no controle e também nas pacientes com endometriose III e IV em comparação a I e II e controles. Houve uma correlação positiva e significativa entre os níveis de IL-6 no FP e o escore de gravidade da endometriose da American Society of Reproductive Medicine-revised (ASRM-r). Concluindo, nossos resultados sugerem que a razão leptina/IMC está associada com a presença da endometriose, o uso desta razão na prática clínica para predizer a presença de endometriose necessita ainda confirmação. Concentrações mais elevadas de leptina e OB-RL no endométrio ectópico sugerem uma modulação positiva entre a leptina e seu receptor ativo com um papel da leptina no desenvolvimento dos implantes endometrióticos. Finalmente, nosso estudo sugere que a IL-6 esteja associada com a presença da endometriose pélvica e sua gravidade. Estudos avaliando a expressão gênica e protéica da IL-6 no endométrio tópico e ectópico são necessários para melhor elucidar o papel desta citoquina na patogênese da endometriose. / Endometriosis is characterized by the presence of endometrial tissue, localized out of the uterine cavity, like peritoneum, ovaries, and rectum-vaginal septum, with a prevalence of about 6% to 10%. Women with endometriosis may be asymptomatic or present dysmenorrhea, dyspareunia, chronic pelvic pain and/or infertility. Concerning its pathogenesis, while the retrograde menses theory is well accepted, disruption on endometrial molecular mechanisms seems to be critical to development of endometrial ectopic implants. Evidences support that endometriosis is associated with abnormal levels of proinflammatory cytokines, growth and angiogenic factors on peritoneal fluid (PF). Leptin is an adipocyte derived protein and Ob-gene product. Besides the well established functions in energetic balance, food intake and body weight controls, leptin also presents imunoregulatory and angiogenic activities. Interleukin-6 (IL-6) is a glycoprotein secreted by several cell types, including peritoneal macrophages and endometrial stromal cells. IL-6 is a marker of the acute-phase inflammatory response and has several biologic activities including the induction of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, growth and differentiation of B lymphocytes and activation of T lymphocytes. These cytokines may play a role in endometriosis through its inflammatory and angiogenic proprieties. In the present study, we assessed leptin/BMI ratio and IL-6 levels in serum and peritoneal fluid (PF) and evaluated the gene expression of leptin and its long form receptor (OB-RL) in eutopic and ectopic endometrium of 30 women with endometriosis and 19 controls with normal pelvis at laparoscopy. Serum leptin/BMI ratio was significantly increased in endometriosis in comparison with controls [0.61 (0.41 – 0.95); 0.41 (0.22 – 0.71) P<0.05]. Leptin and OB-RL gene expression was significantly higher in ectopic endometrium than in eutopic endometrium of patients with different stages of endometriosis and controls. A positive correlation between leptin mRNA and OB-RL mRNA expression was observed in ectopic and eutopic endometrium in patients and in eutopic endometrium in controls. OB-RL immunostaining was more intense in stromal and epithelial cells of eutopic endometrium in patients and controls with higher PF leptin levels. IL-6 levels in the PF were found to be significantly higher in endometriosis group than in controls. In addition, IL6 levels in PF were significantly higher in patients with endometriosis III and IV in comparison to I and II and normal pelvis controls. There was a positive and significant correlation between IL-6 levels in PF and endometriosis ASRM-r score of severity. In conclusion, our data suggest that serum leptin/BMI ratio is associated with the presence of endometriosis, although the clinical use of leptin/BMI ratio to predict endometriosis presence still needs confirmation. Moreover, the increased expression of leptin and OB-RL in ectopic endometrium suggests a modulatory interaction between leptin and its active receptor and a role of leptin in the development of endometrial implants. In addition, our study suggests that IL-6 may be associated with the presence of pelvic endometriosis and its gravity. Further studies evaluating IL-6 gene and protein expression in topic and ectopic endometrium are needed to better elucidate the role of this cytokine on the pathogenesis of endometriosis.

O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

No presente trabalho está descrita a análise de experimentos de microarranjos de DNA realizados pelos pesquisadores do Projeto GENOLYPTUS em conjunto com a empresa NimbleGen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), assim como a validação dos resultados gerados por essa análise, com a finalidade de encontrar genes diferencialmente expressos entre folhas e xilema de E. grandis para futuro estudo. O processo de análise dos microarranjos de DNA envolveu a busca por um software com programas estatísticos adequados ao estudo de grande quantidade de dados com mínima probabilidade de erro. A comprovação dos resultados gerados pelo software escolhido foi realizada com o uso da técnica da reação em cadeia da DNA-polimerase quantitativa (em tempo real) precedida de transcrição reversa (qRT-PCR). Alguns dos genes mais diferencialmente expressos foram selecionados para esta etapa, juntamente com alguns genes com expressão não tão alta. Os genes mais expressos nas folhas que foram escolhidos codificam para; (i) uma proteína semelhante à metalotioneína do tipo 3 (MT-3); (ii) uma glicolato-oxidase; (iii) uma catalase; (iv) uma fosforribulocinase precursora de cloroplasto (PRK); (v) um fator de transcrição MYB do tipo MYB142 e, (vi) uma proteína tipo “dedo-de-zinco”. Os genes mais expressos no xilema escolhidos foram os que codificam (i e ii) duas proteínas expressas em Arabidopsis thaliana; (iii) uma proteína hipotética expressa em Nicotiana benthamiana; (iv) uma descarboxilase de UDPglicuronato do tipo 2, (v) uma quitinase do tipo ELP; (vi) uma celulosesintase tipo 3; (vii) um fator de transcrição MYB; (viii) uma cafeoil-CoA-3- O-metiltransferase (CCoAOMT) e; (ix) uma proteína rica em prolina híbrida do tipo 2 (HyPRP2). Os resultados das qRT-PCRs demonstraram que o experimento de microarranjo e seus resultados foram consistentes e válidos, embora os primeiros tenham demonstrado valores de expressão freqüentemente mais altos. Acreditamos que tanto a análise dos microarranjos de DNA quanto a equivalência das amostras (duplicatas) biológicas estudadas foram totalmente sustentadas pelos resultados da qRT-PCR, pois foram robustas o suficiente para estimar um grande número de genes simultaneamente e indicar aqueles mais importantes como candidatos para futuras análises. / In the present work it is described the analysis of DNA microarray experiments developed by GENOLYPTUS researchers together with Nimblegen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), as well as the validation of the generated results with the aim to find differentially expressed genes between leaves and xylem tissue of E. grandis for further study. The DNA microarray analysis process comprised the search for software containing statistical programs satisfactory for studying an enormous amount of data with a very low false discovery rate. The confirmation of the generated data by the chosen software was made with the use of quantitative (real-time) reverse-transcription followed by polymerase chain reaction (qRT-PCR). Some of the most differentially expressed genes were selected for this step, along with some genes with average expression. Leaf chosen genes were those that codify (i) a metallothionein-like protein type 3 (MT-3), (ii) a glycolate oxidase, (iii) a catalase, (iv) a precursor phosphoribulokinase (PRK) from chloroplast, (v) a MYB transcription factor (MYB142), and (vi) a CONSTANS-LIKE 16 zincfinger protein. Xylem chosen genes were those codifying (i and ii) two expressed proteins from Arabidopsis thaliana, (iii) a hypothetic protein expressed in Nicotiana benthamiana, (iv) a putative UDP-glucuronate decarboxylase type 2, (v) a chitinase type ELP (ectopic deposition of lignin in pith), (vi) a cellulose synthase type 3, (vii) a MYB transcription factor, (viii) a caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT), and (ix) a hybrid proline-rich protein type 2 (HyPRP2). Our qRT-PCR results proved the full consistency and validation of the microarray experiments, although the relative expression ratios of the first were often higher. We believe that our microarray analysis as well as the equivalence of biological samples (duplicates) were fully supported by the qRT-PCR findings since they were robust enough to evaluate a massive number of genes and able to point out important candidate genes.