Os projetos para estudo de genomas ou genes expressos partem de uma etapa de seqüenciamento no qual são gerados em laboratório dados brutos, ou seja, seqüências de DNA sem significado biológico. Estas seqüências de DNA possuem códigos responsáveis pela produção de RNAs e proteínas. O grande desafio dos pesquisadores consiste em analisar essas seqüências e obter informações biologicamente relevantes. Durante esta análise diversos programas de computador, além de um grande volume de dados armazenados em fontes de dados biológicas, são utilizados. Assim sendo, o presente trabalho prop6s a elaboração de um sistema computacional que permite a análise de dados sobre biologia molecular e facilite a instanciação do software dependendo do ambiente de trabalho e tipo de projeto de análise. Para este sistema foi dado o nome de Sistema de Gerenciamento de Análise de Dados por Bioinformática - SGADBio. O trabalho apresenta o desenvolvimento do sistema baseado em metodologias de Engenharia de Software, além dos módulos e funções disponíveis. Seqüências oriundas de um projeto de ESTs do fungo dermatófito Trichophyton rubrum, geradas em um laboratório de biologia molecular, foram submetidas ao sistema para análise. Os resultados são expressivos, demonstrando que o sistema é adequado e capaz de adaptar se a projetos envolvendo seqüenciamento / Projects involving the study of genomes and expressed genes typically initiate with the raw data generated by laboratory sequencing of DNA, devoid of any biological meaning. However, such sequences contain the codes for the production of RNAs and proteins. One of the great challenges faced by researchers is the analysis of such sequences in order to obtain biologically meaningful information. Several computer programs and auxiliary databases are used for that purpose. The present work reports on the development of a computational system capable of supporting biology data analysis and it can be instantiated in order to suit specific working environments and analyses projects. This system has been called Management and Data Analysis System for Applications in Bioinformatics- SGADBio. This work presents the development of the system based on Software Engineering methodologies, as well as the involved modules and functionalities. Sequences from an EST project involving the dermatophyte fungus Trichophyton rubrum, generated in a molecular biology laboratory, were submitted to the system for analysis. The results are expressive, corroborating the versatility of the system for adaptation to sequencing projects

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-23Bitstream added on 2014-08-13T18:01:30Z : No. of bitstreams: 1 000746997.pdf: 3302808 bytes, checksum: 58184a6b45dcee98ec20085fe1a0b6a9 (MD5) / Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é uma bactéria fitopatogênica causadora do cancro cítrico. Genes que codificam proteínas relacionadas à tolerância a cobre foram identificados no genoma de Xac (copA e copB) e estudos de caracterização molecular e bioquímica vem sendo realizados pelo nosso grupo. Compostos a base cobre são usados no controle de doenças bacterianas em plantas e a eficácia desse processo tem sido reduzida pelo aparecimento de linhagens resistentes a cobre. Inicialmente, linhagens de Xac isoladas em diferentes estados foram avaliadas em relação ao crescimento na presença de cobre e os resultados mostraram que as linhagens isoladas no sul do país possuem uma maior tolerância ao metal. Entretanto, análises de Southern Blot mostraram que algumas destas linhagens apresentaram um perfil de organização genômica das ORFs envolvidas na homeostase de cobre semelhante ao da linhagem controle. Os genes cromossomais copA e copB em Xac estão organizados em um operon cuja transcrição foi previamente mostrada ser induzida e específica ao cobre. A ORF XAC3629, objeto de estudo no presente trabalho, está localizada upstream ao operon copAB e codifica uma proteína homóloga a CopL de X. axonopodis pv. vesicatoria. Análises de expressão gênica mostraram que o transcrito da ORF também foi induzido por cobre e que a inativação da ORF pela inserção de um transposon levou a não expressão do operon copAB, sugerindo que a ORF controla a expressão do operon. Além disso, a linhagem mutante XAC3629 / Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a plant pathogen that causes citrus canker. Genes encoding proteins related to tolerance to copper have been identified in the genome of Xac (copA and copB) and studies of molecular and biochemical characterization has been performed by our group. Copper-based compounds are used in the control of bacterial diseases in plants and the effectiveness of this process has been limited by the appearance of strains resistant to copper. Initially, Xac strains isolated in different States of the country were evaluated for growth in the presence of copper. The results showed that the strains isolated in the South have the higher tolerance to the metal. However, Southern blot analysis showed that some strains exhibited an identical profile in the genomic organization of ORFs involved in copper homeostasis when compared to the control strain (Xac, strain 306). The chromosomal genes copA and copB in Xac are organized in an operon whose transcription was previously shown to be induced and specific to copper. The ORF XAC3629, object of study in this work, is located upstream to copAB operon and encodes a protein homologous to CopL of X. axonopodis pv. vesicatoria. Gene expression analysis showed that the transcript of the ORF was also induced by copper and inactivation of the ORF by insertion of a transposon led to no expression of the operon copAB, suggesting that the ORF controls the expression of the operon. Furthermore, the XAC3629

Orientador : Prof. Dr. Ricardo Lehtonen Rodrigues de Souza / Co-orientadora : Profª Drª Lupe Furtado Alle / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/02/2013 / Inclui referências / Área de concentração : Genética / Resumo: Alterações na estrutura e na expressão de alguns genes são eventos comuns na formação e progressão de diversos tumores e possuem relevância na busca por marcadores de neoplasia ou ainda para a classificação e caracterização molecular de tumores. Existem na literatura alguns relatos de que as regiões onde estão localizados os genes ACHE e EPHB4 (7q22) e os genes BCHE e MME (3q26) apresentam amplificações e deleções em diversos tipos de câncer. Além disso, os produtos desses genes têm sido descritos com alterações no nível de expressão nessa doença. Com o objetivo de verificar se esses genes estão sofrendo alterações no número de cópias, analisamos 32 amostras de DNA do tumor e do sangue periférico de pacientes de câncer de mama, usando a técnica de qPCR e quantificando pelo método da curva padrão. Os genes ACHE e EPHB4 apresentaram uma tendência a estar amplificado (62,5% vs. 37,5%; p . 0,1; e 53,13% vs. 46,88%; p . 0,5; respectivamente) e os genes BCHE e MME uma tendência a estarem deletados (56,25% vs. 43,75% em ambos; p . 0,5). Essas alterações obtidas nos conjuntos de genes localizados proximamente (ACHE-EPHB4 e BCHE-MME) mostraram correlação (rs 0.5948; p = 0.0004; rs = 0.3581; p = 0.0478 respectivamente), indicando uma concordância na alteração da estrutura dessas regiões cromossômicas . Adicionalmente avaliamos a expressão relativa desses genes em 45 amostras de carcinoma mamário e em 8 amostras de tecido normal. Essa análise foi feita por RT-qPCR utilizando o método do Ct comparativo (2-..Ct). Observou-se que a expressão dos genes BCHE e MME encontra-se baixa em quase todas as amostras tumorais (95,6%), no entanto, os genes ACHE e EPHB4 não apresentam diferença no número de amostras com maior e menor expressão em tumores. A média de expressão de BCHE e MME é significativamente maior no tecido normal do que no tumoral (Z = -3,702; p < 0,001 e Z = -4,120; p < 0,001, respectivamente). Para os genes ACHE e EPHB4 essa diferença não é observada (Z = -0,870; p = 0,385 e Z = -0,025; p = 0,98, respectivamente). Correlacionou-se as alterações no número de cópias com os níveis de expressão relativa e verificou-se que não existe relação direta entre esses dois fatores para os genes estudados. Também não foi encontrado nenhuma relação dessas alterações com os parâmetros histopatológicos de cada paciente. Como conclusão, nota-se que não há uma relação causal direta dessa alteração do número de cópias com o desenvolvimento do tumor, podendo ser esta uma consequência do processo neoplásico, e que de alguma forma torna-se vantajoso para a progressão da doença. Além disso, pode-se observar também que o perfil de baixa expressão dos genes BCHE e MME é um comportamento característico desses genes no tecido tumoral, e por não ter relação direta com a tendência à deleção, propõe-se que possa ser regulada por algum outro fator, provavelmente algum evento epigenético. Já o perfil de expressão semelhante dos genes ACHE e EPHB4 nos dois tecidos nos permite sugerir que o padrão de expressão obtido para esses genes pode ser um evento comum na mama, parecendo não ser influenciado pelo processo de carcinogênese. Palavras-chave: alteração do número de cópias, expressão gênica relativa, câncer de mama, região 7q22, região 3q26. / Abstract: Changes in the structure and expression of some genes are common events in the formation and progression of several tumors and have relevance in the search for neoplasia markers or for the molecular characterization and classification of tumors. The regions where the ACHE and EPHB4 (7q22) and BCHE e MME (3q26) genes are mapping has been reported suffering amplifications and deletions in several types of cancer. And the products of these genes are described as showing changes in the level of expression in this disease. Aiming to verify whether these genes are undergoing copy number variation, we analyzed 32 samples of DNA from tumor and peripheral blood of breast cancer patients, using the qPCR technique and quantify by standard curve method. The ACHE and EPHB4 genes tended to be amplified (62,5% vs. 37,5%; p . 0,1; e 53,13% vs. 46,88%; p . 0,5; respectively) and BCHE and MME genes a tendency to be deleted (56,25% vs. 43,75% both; p . 0,5). Sets of genes close (ACHE-EPHB4 and BCHE-MME) showed that their variations are correlated (rs 0.5948; p = 0.0004; s = 0.3581; p = 0.0478 respectively). Further, assess the relative expression of these genes in 45 breast carcinoma samples and 8 of normal tissue. This analysis was performed by RT-qPCR using the comparative Ct method (2-..Ct). The expression of BCHE and MME genes is lower in almost every tumor samples (95,6%) and the ACHE and EPHB4 genes have no difference to the amount of overexpression and lowexpression samples in this tissue. The mean expression of BCHE and MME is significantly higher in normal tissue than (Z = -3,702; p < 0,001 e Z = -4,120; p < 0,001, respectively). To the ACHE and EPHB4 genes this difference does not exist (Z = -0,870; p = 0,385 e Z = -0,025; p = 0,98, respectively). Correlated the copy number variation to relative expression levels, however find that there is no direct relationship between these two factors for the genes studied. Found no relation of these alterations with histopathological parameters of each patient. It is possible to suggest that the low expression profile of BCHE and MME genes is a characteristic behavior in tumor tissue and having failed to direct relation with the tendency to deletion, it is proposed that this differential expression may be regulated by some other factor probably epigenetic. The same expression profile of the ACHE and EPHB4 genes in both tissues, as well as the fact that the amount of transcript overexpressed and lowexpressed be equal in breast carcinoma, allows us suggest that the expression pattern obtained for these genes may be a common event in breast, seems not to be influenced by the process of carcinogenesis Keywords: copy number variation, relative gene expression, breast cancer, 7q22 region, 3q26 region.

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Franklin Behlau / Banca: Maria Teresa Marques Novo Mansur / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Celso Eduardo Benedetti / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é uma bactéria fitopatogênica causadora do cancro cítrico. Genes que codificam proteínas relacionadas à tolerância a cobre foram identificados no genoma de Xac (copA e copB) e estudos de caracterização molecular e bioquímica vem sendo realizados pelo nosso grupo. Compostos a base cobre são usados no controle de doenças bacterianas em plantas e a eficácia desse processo tem sido reduzida pelo aparecimento de linhagens resistentes a cobre. Inicialmente, linhagens de Xac isoladas em diferentes estados foram avaliadas em relação ao crescimento na presença de cobre e os resultados mostraram que as linhagens isoladas no sul do país possuem uma maior tolerância ao metal. Entretanto, análises de Southern Blot mostraram que algumas destas linhagens apresentaram um perfil de organização genômica das ORFs envolvidas na homeostase de cobre semelhante ao da linhagem controle. Os genes cromossomais copA e copB em Xac estão organizados em um operon cuja transcrição foi previamente mostrada ser induzida e específica ao cobre. A ORF XAC3629, objeto de estudo no presente trabalho, está localizada upstream ao operon copAB e codifica uma proteína homóloga a CopL de X. axonopodis pv. vesicatoria. Análises de expressão gênica mostraram que o transcrito da ORF também foi induzido por cobre e que a inativação da ORF pela inserção de um transposon levou a não expressão do operon copAB, sugerindo que a ORF controla a expressão do operon. Além disso, a linhagem mutante XAC3629::Tn foi incapaz de crescer na presença de cobre, mesmo em baixas concentrações. Uma linhagem de Xac, a qual expressa o produto da ORF fusionado à proteína TAP foi construída e tal linhagem mostrou que a proteína pode não ser sintetizada in vivo em Xac, sugerindo que a sequência nucleotídica que contém a ORF muito provavelmente atua como uma sequência regulatória. Visando compreender os mecanismos moleculares... / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a plant pathogen that causes citrus canker. Genes encoding proteins related to tolerance to copper have been identified in the genome of Xac (copA and copB) and studies of molecular and biochemical characterization has been performed by our group. Copper-based compounds are used in the control of bacterial diseases in plants and the effectiveness of this process has been limited by the appearance of strains resistant to copper. Initially, Xac strains isolated in different States of the country were evaluated for growth in the presence of copper. The results showed that the strains isolated in the South have the higher tolerance to the metal. However, Southern blot analysis showed that some strains exhibited an identical profile in the genomic organization of ORFs involved in copper homeostasis when compared to the control strain (Xac, strain 306). The chromosomal genes copA and copB in Xac are organized in an operon whose transcription was previously shown to be induced and specific to copper. The ORF XAC3629, object of study in this work, is located upstream to copAB operon and encodes a protein homologous to CopL of X. axonopodis pv. vesicatoria. Gene expression analysis showed that the transcript of the ORF was also induced by copper and inactivation of the ORF by insertion of a transposon led to no expression of the operon copAB, suggesting that the ORF controls the expression of the operon. Furthermore, the XAC3629::Tn mutant was unable to grow in the presence of copper, even at low concentrations. A Xac strain, which expresses the ORF product fused to the protein TAP was constructed and the results showed that the XAC3629 protein may not be synthesized in vivo in Xac, suggesting that the nucleotide sequence containing the ORF is likely a regulatory sequence. To understand the molecular mechanisms involved in the regulation of tolerance to copper, fragments of the 5'- flanking region of... / Doutor

Orientador: Ivan de Godoy Maia / Resumo: Laccases are p-diphenol-O2-oxidoreductases encoded by multigene families widely distributed throughout the plant kingdom. They exhibit important roles in the oxidation of monolignols during lignin biosynthesis and are reported to be functionally involved in plant development, tolerance and response to stress. Apart from plants, laccases can be also found in bacteria, fungi and insects. Here, a genome-wide survey of the eucalyptus genome revealed the presence of 88 putative laccases genes. However, after meticulous analyzes using different approaches, the redundant sequences were discarded and 54 laccases genes (referred as EgLAC) were retrieved. These genes were phylogenetically distributed in six different subgroups. Based on RNA-Seq data, distinct organ/tissue expression patterns of the identified EgLAC genes were ascertained. The vast majority showed organ/tissue-enriched expression, while certain genes exhibited no detectable expression. RT-qPCR analyzes confirmed the organ/tissue expression patterns of a representative set of genes such as, for example, the rootspecific expression of EgLAC52 and the root and leaf preferential expressions of genes EgLAC4 and EgLAC32. Further expression profiling of selected EgLAC genes in response to oxidative and osmotic stresses revealed differences in their relative expression, with some genes being stress-induced. These results suggest that certain laccases might be implicated in abiotic stress responses. / Mestre

Os leiomiomas são neoplasias benignas comuns do sistema reprodutivo feminino e são encontrados em até 50% das mulheres em idade reprodutiva. As causas e os mecanismos de desenvolvimento desse tumor não estão bem estabelecidos; eventuais descontroles nos percursos apoptóticos e influências dos hormônios esteróides ovarianos devem estar envolvidos. O objetivo deste trabalho foi examinar a expressão do gene e da proteína das isoformas A e B do receptor de progesterona, de p53 e de p21 em miométrio e leiomioma uterino. Foram obtidas amostras de 14 pacientes em idade reprodutiva que se submeteram à histerectomia abdominal por leiomiomatose. Os tecidos foram submetidos à extração de mRNA com o uso de Trizol®, para análise da expressão gênica pela técnica de RT-PCR, e à extração de proteínas, para análise de expressão proteica pela técnica de Western Blot. Não foram observadas diferenças nos níveis de expressão de mRNA para PRAB, PRB e nos níveis proteicos dos PRs entre o miométrio e o leiomioma uterino. Não houve correlação entre a fase do ciclo menstrual e os receptores de progesterona. A relação entre as isoformas (PRA:PRB) não foi diferente entre os tecidos e mostrou uma forte correlação entre ambos (r=0,767, P=0,004). As análises da expressão gênica e proteica mostraram aumento nos níveis de mRNA e de proteína de p53 no leiomioma comparado ao miométrio (P=0,030 e P=0,002, respectivamente). O mesmo aumento foi observado nos níveis de mRNA de p21 (P=0,016) e nos níveis proteicos de p21 (P=0,026) nas amostras de leiomioma uterino. As expressões gênica e proteica inalteradas dos PRs são características das doenças benignas, como a leiomiomatose; alterações da relação PRA:PRB são observadas em neoplasias malignas. Já o aumento significativo observado nos níveis de mRNA e de proteína de p53 e p21 em leiomiomas indica uma possível participação destes genes no desenvolvimento desse tumor podendo estar relacionado à estabilização funcional e detenção de possíveis danos, evitando a transformação carcinogênica. / Leiomyomas are common benign neoplasms of the female reproductive system and they are found in up to 50% of women of reproductive age. The causes and mechanisms of the development of this tumor are not well established. Occasional lack of control in apoptotic pathways and influences of ovarian steroid hormones must be involved. The aim of this study was to examine the expression of gene and protein progesterone receptor isoforms A and B, p53 and p21 in uterine leiomyoma and myometrium. Samples of 14 reproductive-age patients, submitted to abdominal hysterectomy due to leiomyomatosis, were obtained. The tissues were submitted to mRNA extraction using Trizol® for gene expression analysis through the RT-PCR technique, and protein extraction for protein expression analysis was developed through the Western blot technique. There were not significant differences in levels of mRNA expression for PRAB, PRB and PRs protein between the myometrium and uterine leiomyoma. It was not found any correlation between the menstrual cycle phase and progesterone receptors. The relationship between the isoforms (PRA: PRB) was not different in the tissues and it was observed a strong correlation (r = 0.767, P = 0.004) between them. The analysis of gene and protein expression showed an increase in levels of mRNA and p53 protein in leiomyoma when compared to myometrium (P = 0.030 and P = 0.002). The same increase was observed in the p21 mRNA levels (P = 0.016) and in the p21 protein levels (P = 0.026) in the samples of uterine leiomyoma. The unchanged gene and protein expressions of PRs are characteristic of benign diseases such as leiomyomatosis, and alterations in PRA: PRB relationship are observed in malignant neoplasms. However, the significant increase observed in the levels of mRNA and p53 and p21 protein in leiomyomas indicates a possible participation of those genes in the development of that tumor, which can be related to functional stabilization and retention of possible damage, avoiding the carcinogenic transformation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-22T20:53:14Z No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-23T22:54:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T22:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) Previous issue date: 2008-11 / Embriões produzidos por hiperestimulação hormonal são usados como controle in vivo na maioria das publicações relacionadas à expressão gênica. Entretanto, ainda não se sabe se esses embriões são os controles mais apropriados a serem utilizados em estudos de perfil da expressão gênica. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi comparar a expressão dos genes candidatos relacionados ao desenvolvimento embrionário bovino: GRB-10, IGF-II, IGF-IIR, MnSOD, GPX-4, CATALASE, BAX, e INTERFERON-τ, entre embriões produzidos in vivo através de superovulação (SOV), através de Produção in vitro (PIV) e in vivo produzidos por ovulação natural, sem nenhuma estimulação hormonal (OVN). A comparação foi realizada através da técnica de RT-PCR usando β-ACTIN e GAPDH como os controles constitutivos. Quando a expressão individual dos genes foi analisada, GRB-10 foi menos expresso em embriões OVN do que em SOV (P = 0,04) e PIV (P = 0,01), no entanto, nenhuma diferença foi encontrada entre os outros genes. Genes relacionados à resposta ao estresse foram agrupados e comparados entre os diferentes tipos de embriões. A soma da expressão dos genes MnSOD, GPX-4, CATALASE tende (P = 0,10) a ser maior em embriões PIV do que em OVN. A expressão de todos os genes estudados foi também somadas para cada tratamento, e a expressão gênica geral foi menor em embriões OVN quando comparados com embriões de SOV(P = 0,06) ou de PIV(P = 0,04). Nenhuma diferença foi observada entre os embriões SOV e PIV(P = 0,70). Finalmente, os genes foram agrupados de acordo com suas funções, relacionadas ao desenvolvimento embrionário (GRB-10, IGF-II e IGF-IIR), a resposta ao estresse (MnSOD, xiv GPX-4 e CATALASE) e a qualidade embrionária (BAX, INTERFERON-τ). A análise de correlação foi realizada e mostrou um comportamento distinto nos embriões de OVN quando comparados com os de SOV (r = -0,9429) e com os de PIV (r = - 0,8833) para os genes GRB-10, IGF-II e IGF-IIR. No entanto, o comportamento desses genes foi similar para os embriões de SOV e de PIV (r = 0.9890). Concluímos que a estimulação hormonal ovariana afeta os embriões através da alteração de sua expressão gênica. Portanto, se os embriões de SOV tiverem que ser usados como contrôle em estudos de expressão gênica, os dados deverão ser analisados com cautela. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Embryos produced by hormonal hyperstimulation are used as “in vivo” control in the majority of publications related to gene expression. However, if those are the most appropriated control for gene expression profile studies it is not known. Thus, the objective of this study was to compare the expression of GRB-10, IGF-II, IGF-IIR, MnSOD, GPX-4, CATALASE, BAX, and Interferon-τ genes among embryos produced in vivo by hormonal hyperstimulation (SOV), by in vitro fertilization (IVF) or in vivo without any hormonal stimulus (NOV). Comparison was performed using a semi-quantitative RT-PCR using β-Actin and GAPDH as constitutive controls. When the individual gene expression was analyzed, GRB-10 was less expressed in NOV than SOV (P = 0.04) and IVF (P = 0.01) embryos, whereas no differences were found for the other genes. Then, genes related to stress response were grouped and compared among the types of embryos. The sum of expression of MnSOD, GPX-4, CATALASE genes tended (P = 0.10) to be greater in IVF than NOV embryos. The expression of all studied genes were also added together for each treatment, the “overall” gene expression was lower in the NOV embryos when compared with SOV (P = 0.06) or IVF (P = 0.04). No difference was observed between the SOV and IVF embryos (P = 0.70). Finally, genes were grouped according to their function as being related to embryo development (GRB-10, IGF-II, IGF-IIR), stress response (MnSOD, GPX4, CATALASE) and embryo quality (BAX, INTERFERONτ). A correlation analysis was performed and showed a distinct behavior for NOV embryos when compared with SOV (r = -0.9429) or IVF (r = -0.8833) for GRB-10, IGF-II and IGF-IIR genes. However, the behavior of xvi xvii those genes was similar for SOV and IVF embryos (r = 0.9890). We conclude that ovarian hormonal stimulation affects embryos by altering their gene expression. Therefore, if SOV embryos have to be used as experimental control for gene expression studies, data should be analyzed with caution.

Resumo não disponível

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:55:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia do Sul (MEST) / Governo da província de Gyeonggi da Coreia do Sul / Instituto Coreano de Informação Científica e Tecnológica (KISTI) / Crescentes evidências mostram que a organização espacial da transcrição é um fator epigenético importante na regulação gênica em eucariotos. Em células de mamíferos, os genes são transcritos em estruturas nucleares discretas conhecidas como fábricas de transcrição, e genes com funções relacionadas e co-regulados compartilham as mesmas fábricas de transcrição. Plasmodium falciparum apresenta um padrão de expressão gênica bastante complexo durante o ciclo eritrocítico, contrastando paradoxalmente com o baixo número de putativos fatores de transcrição codificados pelo seu genoma. Por outro lado, mecanismos epigenéticos são importantes na regulação gênica neste parasita. Nesta tese, investigamos a organização da transcrição em P. falciparum visando determinar se a organização nuclear está relacionada com a expressão/regulação gênica ao longo do desenvolvimento do parasita. Com este objetivo, marcamos transcritos nascentes com BrUTP em formas eritrocíticas de P. falciparum. Assim como em mamíferos, a transcrição no parasita também está organizada em focos nucleoplásmicos discretos, chamados fábricas de transcrição. Análises automatizadas de imagens em 3D mostram que o número e a intensidade das fábricas de transcrição variam durante o ciclo eritrocítico, estando correlacionados com o número de genes expressos em cada estágio, mas não com o volume nuclear. O baixo número de fábricas indica que os genes ativos compartilham as fábricas enquanto estão sendo transcritos. Surpreendentemente, as fábricas são espacilamente redistribuídas durante o desenvolvimento de anéis para trofozoítas, com a periferia nuclear sendo a zona de transcrição favorita nos anéis, enquanto nos trofozoítas as fábricas estão igualmente distribuídas por todo o nucleoplasma. Também observamos que a transcrição por RNA polimerase I ocorre principalmente nas áreas centrais dos núcleos em trofozoítas, sugerindo que os componentes nucleolares podem ser dispersos devido à entrada na fase S. Assim como nos eucariotos superiores, as fábricas de transcrição em P. falciparum também se localizam em áreas nucleares com baixa densidade de cromatina. Análises de imunofluorescência combinando incorporação de BrUTP com marcadores nucleares mostram que as fábricas de transcrição formam um compartimento exclusivo, diferente do compartimento de silenciamento definido por PfSir2A ou do compartimento de cromatina ativa definido por H4ac ou H3K79me3. Para estudar a organização espacial da cromatina e entender como os genes co-regulados interagem com as fábricas de transcrição, decidimos realizar ensaios de hibridização fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Durante a realização de ensaios de FISH seguindo protocolos publicados, observamos uma grande variação na morfologia nuclear dos parasitas, o que nos moveu a otimizar esta técnica. Utilizando análises automatizadas de imagens, mostramos que os parasitas desidratados por secagem ao ar e fixados por curtos períodos de tempo à temperatura ambiente apresentam uma variação intra-populacional maior em relação à forma e ao volume nucleares após o ensaio de FISH, assim como valores de volume quase duas vezes maiores, do que núcleos de parasitas fixados em suspensão por longos períodos de tempo e em baixas temperaturas. Também observamos que a fixação em suspensão leva a uma melhor conservação da estrutura nuclear, e índices de colocalização mais altos para duas sondas de repetições adjacentes das extremidades cromossômicas, Rep20 e telômeros. Em resumo, nossos resultados mostram que o tipo de protocolo de fixação utilizado antes da realização do desenvolvimento de FISH é um fator crucial para a conservação apropriada da arquitetura nuclear. / Growing evidence points that transcription spatial organization is an important epigenetic factor for eukaryotes gene regulation. In mammalian cells, genes are transcribed in discrete nuclear structures known as transcription factories, and developmentally co-regulated, functionally related genes have been shown to share factories. Plasmodium falciparum shows a remarkably complex pattern of gene expression during the erythrocytic cycle, paradoxically contrasting with the low number of putative transcription factors encoded by its genome. However, epigenetic mechanisms are important for gene regulation in this parasite. In this thesis, we investigated transcription organization of P. falciparum in order to determine if nuclear architecture is related with developmentally regulated gene expression. To this aim, we have labeled nascent transcrips with BrUTP in P. falciparum erythrocytic forms. Transcription in organized in discrete nuceloplasmic foci, the transcription factories. Automated 3D analysis of confocal images shows the number and intensity of transcription factories change during the erythrocytic cycle, correlating with the number of genes expressed at each stage but not with the nuclear volume. The low number of factories indicates that active genes share factories while being transcribed. Unexpectedly, factories spatially redistribute from ring to trophozoites, being the nuclear periphery the preferential transcription zone in rings while in trophozoites factories are equally distributed throughout the nucleoplasm. We also observed that RNApolymerase I transcription occurs mostly at central nuclear areas in trophozoites, suggesting that nucleolar components may be dispersed upon S phase transition. Like in higher eukaryotes, in P. falciparum transcription factories occur on nuclear areas with low chromatin density. Immunofluorescence analysis of P. falciparum nuclear markers combined with BrUTP incorporation show that transcription factories are a novel and exclusive nuclear compartment, different from the silent compartment defined by PfSir2A or the active chromatin compartment defined by H4ac and H3K79me3. In order to study the spatial organization of chromatin, and how co-regulated, functionally related genes interact with transcription factories, we decided to perform fluorescence in situ hybridization (FISH). While performing FISH with published protocols, we observed great variation in the parasite nuclear morphology, prompting us to optimize this technique. Using automated image analysis, we show that parasites dehydrated by air-drying and fixed for short periods at room temperature present after FISH higher intra-population variation of nuclear shape and volume, as well as almost two-times higher relative volume values, than parasite nuclei fixed in suspension for long periods at low temperatures. We also observe that longer fixation in suspension leads to improved conservation of the nuclear structure, with chromosome end clusters preferentially locating at the nuclear periphery, and higher colocalization indexes for two adjacent chromosome end probes, Rep20 and telomere. Overall, our results show that the type of fixation protocol applied prior to FISH is crucial for the conservation of nuclear architecture. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura. Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1. Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon. Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de 55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína durante a infecção. Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional, dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum. O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento. Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro que os isolados apresentam em camundongos B10.A. / Paracoccidioides brasiliensis is the dimorphic fungus responsible for paracoccidioidomycosis in man, who is infected by inhalation of conidia. The cellular differentiation of P. brasiliensis from mycelium (M) to yeast (Y) in the lungs is essential for infection to occur. J-domain (DnaJ) proteins, of the Hsp40 family, are essential cofactors of their cognate Hsp70 chaperones, besides acting as independent chaperones. In the present study, we have cloned and sequenced the heat shock gene PbMDJ1, which encodes an Mdj1 homologue that is a mitocondrial DnaJ in yeasts. The gene sequence consists of an ORF of 1719bp interrupted by three introns and translates 551 amino acid residues. PbMdj1 is organized in modules consisting of a J domain, followed by a glycine/phenylalanine-rich segment and four CXXCXGXG (zinc finger) domains. The C-terminal is not conserved. We expressed a His-tagged N-terminal region of PbMdj1 and used the recombinant protein to immunize rabbits to obtain anti-PbMdj1r serum. Immune-localization was performed using confocal and electron microscopy, and also flow cytometry. We demonstrated the presence of PbMdj1 not only in the mitochondria, where it is apparently sorted, but also in the cell wall of P. brasiliensis. Labeling was abundant throughout the cell wall and especially in the budding regions; however, anti-PbMdj1r did not affect fungal growth in the concentrations tested in vitro, possibly due to the poor access of the antibodies to their target in growing cells. Labeled mitochondria stood preferentially close to the plasma membrane and gold particles were detected in the thin space between them, towards the cell surface. The anti-rPbMdj1 antibodies used in the reactions specifically recognized a single 55 kDa mitochondrial and cell wall (alkaline β-mercaptoethanol extract) component, compatible with the predicted size of the protein devoid of its matrix peptidetargeting signal. This is the first time a DnaJ member has been observed on the cell surface, where its function is speculative. In the present work we show that Mdj1 and the mitochondrial proteinase Lon homologues are heat shock proteins in the P. brasiliensis and that their gene organization is conserved among thermodimorphic fungi and Aspergillus, where the genes are adjacent and have a common 5´region. We mapped and validaded transcription elements in the 5´-shared intergenic (ML) region of MDJ1/LON from P. brasiliensis using both DNAse I protection footprinting and mobility shift assays. Three of them were similar to canonical and nonconventional heat shock elements and one is a putative AP-1 binding domain (ARE), related to oxidative stress. Similar motifs were detected in the correspondent locus of B. dermatitidis and H. capsulatum. Our studies compared P. brasiliensis Pb18 with genetically distinct Pb3, where the ML region is polymorphic outside mapped motifs. In these isolates, different numbers of elements were detected and the pattern of mRNA accumulation of the genes was distinct during phase transition. In Pb18, PbMDJ1 was preferentially expressed in the yeast phase. This is the first study of transcription elements in P. brasiliensis that might help to understand regulation of stress-related genes involved in fungal adaptation to the host. / BV UNIFESP: Teses e dissertações