O controle de Listeria monocytogenes (Lm) nas plantas processadoras de alimentos é uma tarefa difícil, devido à sua capacidade em formar biofilmes e se adaptar às condições adversas do ambiente. A sobrevivência a altas concentrações de cloreto de sódio, além da multiplicação em temperaturas de refrigeração são outras duas importantes características de isolados de Lm, incluindo os dois sorotipos mais prevalentes da espécie (4b e 1/2a). Os objetivos deste estudo foram avaliar o comportamento de multiplicação, da expressão gênica global e da virulência dos dois principais sorotipos de Lm em ambientes de estresse encontrados por esses micro-organismos na indústria de alimentos. Para tanto, 22 cepas de Lm - 12 isoladas de casos clínicos (seis cepas sorotipo 4b e seis sorotipo 1/2a) e 10 isoladas de alimentos (seis sorotipo 4b e quatro sorotipo 1/2a) - além de uma cepa de Listeria monocytogenes Scott A e outra de Listeria innocua, foram inoculadas em caldo BHI com atividade de água (aw) 0,94 (11% NaCl) e incubadas a 4°C, 10°C e 25°C durante 73, 42 e 15 dias, respectivamente. A 4°C, a maior parte das cepas, tanto clínicas como de origem alimentar, conseguiu se manter viável ou ainda se multiplicar e aumentar até 2 log UFC/ml a partir da população inicial. Já a 10°C, a maioria das cepas conseguiu se multiplicar, porém diferenças significativas (p < 0,05) na duração da fase lag entre as cepas dos sorotipos 1/2a e 4b, independentemente da origem das mesmas, foram observadas (lag1/2a > lag4b). Diferenças estatísticas também foram observadas no que diz respeito às cepas de Lm sorotipo 4b, quando incubadas a 25°C em meio de cultura BHI com aw 0,94, apresentando maiores taxa de multiplicação e concentração populacional máxima (p < 0,05) em comparação às cepas de Lm sorotipo 1/2a submetidas às mesmas condições. Já com relação ao potencial de virulência das cepas, não foram detectadas diferenças estatísticas entre os sorotipos com relação a sua capacidade hemolítica, entretanto, a capacidade de invasão das cepas sorotipo 4b em células Caco-2 foi maior (p < 0,05) em comparação ao sorotipo 1/2a. Além disso, análises comparativas pré e pós-estresse osmótico confirmaram o aumento no potencial de invasão (p < 0,05) tanto das cepas sorotipo 1/2a, quanto 4b após o contato com elevadas concentrações de sal. O papel dos reguladores de transcrição Sigma B e PrfA na sobrevivência de Listeria monocytogenes, sob condição de estresse osmótico, também foi avaliado. Ensaios de microarray com cepas das linhagens I e II demonstraram maiores níveis de transcrição para 173 e 68 genes, respectivamente, na cepa selvagem quando comparada à cepa mutante &#916sigB, incluindo genes relacionados à virulência (internalinas), sobrevivência a condições de estresse e metabolismo. Os resultados obtidos confirmam a habilidade de cepas de Lm se manterem viáveis ou mesmo se multiplicarem em baixas temperaturas, bem como em ambientes com elevada pressão osmótica, independentemente do sorotipo ou origem, enfatizando a necessidade de tomada de medidas efetivas de controle desse patógeno pela indústria de alimentos uma vez que cepas de Lm podem, além de sobreviver às condições adversas, ter seu potencial de virulência aumentado. Os dados obtidos também indicam a necessidade de mais estudos de avaliação comportamental e viabilidade de Lm em ambientes com concentração de sal modificada, uma vez que a discussão sobre a diminuição nos teores de sal em alimentos vem ganhando importância mundialmente. / The control of Listeria monocytogenes (Lm) in food processing plants is difficult due to its ability to form biofilms and adapt to adverse environmental conditions. The survival at high concentrations of sodium chloride and growing at low temperatures are two other important features of Lm isolates, including the two most prevalent serotypes (1/2a and 4b). The objectives of this study were to evaluate the growing behavior, global gene expression profile and virulence potential of the two main serotypes of Lm under osmotic stress environments encountered by these microorganisms in the food industry. 22 Lm strains - 12 isolated from clinical cases (six strains serotype 4b and six serotype 1/2a) and 10 isolated from food (six serotype 4b and four serotype 1/2a) - plus one L. monocytogenes Scott A and one Listeria innocua were inoculated into BHI broth with water activity (aw) 0.94 (11% NaCl) and were incubated at 4°C, 10°C and 25°C during 73, 42 and 15 days respectively. At 4°C, the majority of strains both clinical and food were able to remain viable and to grow (up to 2 log CFU/ml). At 10°C, most strains could grow but significant differences (p < 0.05) on the lag phase duration between the serotypes 1/2a and 4b strains, regardless their origin, were observed (lag1/2a > lag4b). Statistical differences were also observed related to Lm serotype 4b strains when grown in BHI with aw 0.94 at 25°C, that showed higher maximum growth rate and final density (p < 0.05) compared to Lm serotype 1/2a strains. Regarding the virulence potential, there were no statistical differences among serotypes with respect to its hemolytic activity, however, the invasiveness of serotype 4b strains in Caco-2 cells was higher (p <0.05) than serotype 1/2a. Furthermore, comparative analyzes before and after osmotic stress confirmed the increased potential for invasion (p < 0.05) in both serotypes (1/2a and 4b) after being submitted to high salt concentrations. The role of transcription regulators sigma B and PrfA in L. monocytogenes survival under osmotic stress condition was also evaluated. Microarray assay using lineage I and II strains showed increased transcription levels in 173 and 68 genes, respectively, when comparing the wild type strains to the mutant &#916sigB strain. This included genes related to virulence (internalina), survival under stress conditions and metabolic genes. The results confirm the ability of Lm strains in remain viable or even grow at low temperatures and in high osmotic pressure environments, regardless of serotype or origin. They also emphasize the need for effective measures to control this pathogen by food industry since it is possible that Lm strains survive under adverse conditions and also increase its virulence potential. The data also indicate the need for additional studies regarding the behavior of Lm in environments with modified sodium chloride concentration since the discussion about salt levels in foods is increasing worldwide.

Terminado o sequenciamento do genoma humano, as atenções se voltaram para a determinação do conjunto completo de transcritos humanos. Diversos trabalhos sugerem que enquanto apenas uma pequena fração de mRNAs codificantes para proteína não é conhecida, existe um grande número de RNAs não-codificantes (ncRNAs) ainda não caracterizados. Nesse contexto, o presente trabalho visou explorar as informações de expressão gênica contidas em ESTs para identificar e caracterizar novos transcritos humanos. A busca genômica por membros de famílias gênicas relacionadas com câncer levou a identificação de novas pequenas GTPases, destacando uma subfamília que deve apresentar função supressora tumoral em próstata. Uma classe de ncRNAs longos, sem splicing, expressos antisenso a partir de regiões intrônicas foi descrita utilizando plataformas de microarrays, construídas pelo grupo, enriquecidas com seqüências sem anotação. O perfil de expressão de 23 ncRNAs intrônicos estava significativamente correlacionado com o grau de diferenciação de tumores de próstata (Gleason Score), e pode ser utilizado como candidato a marcador molecular de prognóstico. Um total de 39 ncRNAs intrônicos responderam à estimulação por andrógeno, apontando para um mecanismo regulatório da expressão intrônica por sinais fisiológicos hormonais. A biogênese da expressão intrônica parece ser complexa, pois uma fração não é transcrita pela RNA Polimerase II. A transcrição intrônica estava correlacionada com uso de exons em células tratadas com andrógeno. Assinaturas de expressão intrônica conservadas em tecidos humanos e de camundongos, e interações de transcritos intrônicos com proteínas regulatórias foram observadas. Este trabalho contribui com novas e originais evidências que dão apoio ao papel postulado para esses ncRNAs no controle fino do programa transcricional humano. / With the completion of the human genome sequence, attention has shifted towards determining the complete set of human transcripts. Multiple lines of evidence suggest that while only a small fraction of protein-coding mRNAs remains to be described, there is a huge amount of uncharacterized non-coding RNAs (ncRNAs). In this context, the present work sought to explore the gene expression information provided by ESTs to identify and characterize new human transcripts. A genomic-wide search for cancer related gene family members identified novel small GTPase genes, and highlighted an uncharacterized subfamily that may have a tumor suppressor role in prostate cancer. A class of long unspliced ncRNAs, expressed antisense from introns of protein-coding genes was described using custom-designed microarray platforms enriched with unannotated sequences. The expression profile of 23 intronic ncRNAs was significantly correlated to the degree of prostate tumor differentiation (Gleason Score), and could be used as a candidate prognostic molecular maker. A total of 39 intronic ncRNAs were responsive to androgen stimulation, poiting to a mechanism of intronic expression regulation by physiological hormone signals. Intronic ncRNA biogenesis seems to be complex, since a fraction of them is not transcribed by RNA Polymerase II. Intronic transcription was correlated to exon usage in androgen treated cells. Tissue expression signatures of intronic transcription were conserved in human and mouse, and intronic transcripts were found to interact with regulatory proteins. This work provides new and original contributions that support the postulated role of ncRNAs in the fine tunning of the human transcriptional program.

Implantes de titânio têm sido extensivamente utilizados na Ortopedia e na Odontologia, principalmente como substitutos de elementos dentários ausentes. O titânio é um implante metálico de escolha devido à sua alta biocompatibilidade e resistência à corrosão, e também porque não provoca reações imunológicas, ao mesmo tempo em que promove a osseointegração. A biocompatibilidade do implante depende da resposta celular em contato com a sua superfície; sendo assim, mudanças nesta superfície podem provocar impactos benéficos na osseointegração através de alterações nas interações com as células presentes no local do implante, como, por exemplo, células osteoblásticas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a resposta celular de células osteoblásticas humanas provenientes da crista óssea alveolar em contato com diferentes superfícies de titânio: controle (polido), nanotextura, nano+submicrotextura e microtextura rugosa. Os ensaios bioquímicos realizados foram: proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total e atividade de fosfatase alcalina, além da detecção e quantificação de nódulos mineralizados, com a utilização do teste estatístico não paramétrico de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney com p&le;0,05. Também foi realizada a avaliação da modulação gênica nas células em contato com as diferentes superfícies de titânio por meio do método de oligo microarray, utilizando lâminas Agilent formato 4x44 K e análise de microRNAs utilizando lâminas Agilent 8x15 K. A fim de identificar alterações na expressão gênica foi utilizado o programa GeneSpring GX. A expressão gênica foi validada pela reação de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Observamos um pico na proliferação celular aos 10 dias de cultura e um aumento gradual da viabilidade celular ao longo do tempo. Entre as superfícies tratadas observou-se maior quantidade de proteína total na nanotextura em relação à nano+submicrotextura aos 10 dias de cultura (p&le;0,05) e um aumento progressivo da atividade de fosfatase alcalina, com maior atividade na nanotextura em relação à nano+submicrotextura aos 14 dias de cultura (p&le;0,05). Não houve diferença qualitativa na formação dos nódulos mineralizados, apesar de a microtextura rugosa apresentar maior quantidade de cálcio que a nanotextura (p&le;0,05). Os resultados encontrados evidenciaram expressão diferenciada de 716 mRNAs (fold change&ge;2,0 e p&le;0,05) e 32 microRNAs (fold change&ge;1,5 e p&le;0,01) com funções associadas ao processo de osteogênese, principalmente mineralização, adesão celular, apoptose, proliferação e diferenciação celular. Os resultados sugerem que, diante do protocolo utilizado neste trabalho, o tratamento químico realizado na superfície do titânio provoca variações no metabolismo de células osteoblásticas tanto em nível celular como de expressão gênica / Titanium implants have been extensively used in orthopedics and dentistry, mainly as a replacement for missing teeth. Titanium is the metal implant of choice due to its high biocompatibility and corrosion resistance, as well as absence of immune response, while promoting osseointegration. The biocompatibility of the material depends on cellular response in contact with the surface; therefore, changes on this surface can have beneficial impacts on osseointegration through changes in interactions with cells at the implant site, such as osteoblastic cells. The objective of this study was to characterize the cellular response of osteoblastic cells from human alveolar crest in contact with different titanium surfaces: control (polished), nanotextured, nano+submicrotextured and rough microtexture. The performed biochemical assays included cell proliferation and viability, total protein content and alkaline phosphatase activity, in addition to the detection and quantification of mineralized nodules, using the non-parametric statistical tests of Kruskal-Wallis and Mann-Whitney (p&le;0,05). Osteoblastic gene modulation was evaluated by means of an oligo microarray method using Agilent format 4 x 44 K slides and Agilent 8x15 K slides for microRNAs analysis. In order to identify changes in gene expression, it was used the GeneSpring GX program. Gene expression was validated by quantitative PCR real time (qRT-PCR). It was observed a peak in cell culture proliferation at 10 days and a gradual increase in cell viability over the periods. Among the treated surfaces, we observed an increase in the amount of total protein in nanotextured when compared to nano+submicrotextured at 10 days of culture (p&le;0,05), and a progressive increase of alkaline phosphatase activity, with higher activity in nanotextured compared to nano+submicrotextured at 14 days of culture (p&le;0,05). There was no qualitative difference among the groups with regards to mineralized nodules, although the rough microtexture group showed higher amounts of calcium than the nanotextured group (p&le;0,05). Our results showed a differential expression of 716 mRNAs (fold change&ge;2,0 and p&le;0,05) and 32 microRNAs (fold change&ge;1,5 and p&le;0,01), with functions associated to the osteogenesis process, mainly mineralization, cell adhesion, apoptosis, cell proliferation and differentiation. The results suggest that, with the protocols used in this investigation, the treatments performed in the titanium surface induce changes in the metabolism of osteoblastic cells, both at the cellular as well as at the gene expression levels

Pubertal development is an outcome of genes\' interaction producing molecular signals that rule physiological mechanisms. Understanding the genetic changes surrounding the peripubertal period in Nellore heifers could unveil certain differences in age at puberty because they reach sexual maturity much later than European heifers. The adipose tissue regulates energy metabolism and is an endocrine organ with active participation in reproductive processes .The present study aimed at understanding the functions of the adipose tissue around pubertal time in Nellore heifers. Our strategy was to search for differences in gene expression between prepubertal and pubertal animals. We quantified gene expression in the adipose tissue for Nellore heifers who reached puberty according to either the early or late pattern. This research was done on 30 Nellore heifers monitored weekly from 230 kg bodyweight until the onset of puberty through gynaecological ultrasound examination. The onset of puberty was defined by the presence of corpus luteum in the ovary and blood progesterone > 1 ng/ml. Adipose tissue was collected through subcutaneous biopsy; the first biopsy was done when heifers reached 230 kilos bodyweight and subsequently once a month until they entered puberty. Biopsies were collected of each heifer that reached puberty alongside its half-sister who had not reached puberty. We analysed samples of six early pubertal heifers and their six late pubertal sisters at two different stages: at the time of ovulation and approximately 50 days before ovulation. The RNA was extracted from the biopsies\' tissue and gene expression quantified through RNA sequencing. There were nine genes differentially expressed in pubertal heifers that have been found previously correlated with reproductive traits and/or processes in mammals on other studies. These genes were APOD, CYP17A1, DNMT3B, AKR1C4, TENM1/ODZ3, HPSE, SMPD3, FAM134B and CYP26B1, already found expressed in adipocytes, hypothalamus, ovaries and uterus, corroborating previous knowledge of a link among energy metabolism, reproductive organs and neural influence. By measuring the genetic changes and correlating them with known physiological mechanisms on the nervous system and reproductive organs during puberty, we detected genes expressed here that are related to modifications in the organism as a whole. Therefore the adipose tissue may be regarded as an instrument to indicate what is going on during reproductive processes. The results presented here may aid in a better understanding of genetic changes happening during peripubertal period. / O desenvolvimento púbere é o resultado da interação de genes que produzem sinais moleculares regulando os mecanismos fisiológicos. A compreensão das mudanças genéticas que permeiam o período peripuberal em novilhas Nelore (Bos indicus) poderia desvendar o porquê das diferenças em idade a puberdade, pois elas atingem a maturidade sexual mais tarde que o gado europeu (Bos taurus). O tecido adiposo regula o metabolismo de energia e é um órgão endócrino que tem participação ativa em processos reprodutivos. O presente estudo teve como objetivo entender as funções do tecido adiposo na época peripubertal em novilhas Nelore. Nossa estratégia foi procurar diferenças em expressão gênica entre animais pré-púberes e púberes. Nós quantificamos a expressão gênica no tecido adiposo de novilhas Nelores precoces ou tardias. A pesquisa foi feita em 30 novilhas Nelore, monitoradas semanalmente a partir do momento em que atingiram 230 kg de peso até a manifestação da puberdade por exame de ultrassom ginecológico. O momento da puberdade foi definido pela presença de corpo lúteo no ovário e concentração sanguínea de progesterona maior que > 1 ng/ml. O tecido adiposo foi coletado por biópsia subcutânea; a primeira biópsia foi feita quando as novilhas alcançaram 230 quilos de peso e subsequentemente uma vez por mês ate que elas entrassem em puberdade. As biópsias foram coletadas de cada novilha que atingiu a puberdade e de sua meia-irmã que não tinha atingido a puberdade. Nós analisamos amostras de seis novilhas púberes precoces e de seis novilhas púberes tardias em dois estágios diferentes: no momento da ovulação e aproximadamente 50 dias antes da ovulação. O RNA foi extraído do tecido das biopsias e a expressão genica quantificada através de sequenciamento de RNA. Encontramos nove genes diferencialmente expressos em novilhas púberes que foram previamente relacionados com características e/ou processos reprodutivos de mamíferos em outros estudos. Esses genes foram APOD, CYP17A1, DNMT3B, AKR1C4, TENM1/ODZ3, HPSE, SMPD3, FAM134B e CYP26B1, já encontrados expressos em adipócitos, hipotálamo, ovários e útero, comprovando conhecimento prévio da conexão existente entre metabolismo de energia, órgãos reprodutivos e influencia neural. Ao medir as mudanças genéticas e correlacioná-las com mecanismos fisiológicos conhecidos em sistema nervoso e órgãos reprodutivos durante a puberdade, nós conseguimos identificar genes expressos em adiposo que são relacionados a modificações no organismo como um todo. Sendo assim, o tecido adiposo pode ser considerado um instrumento para indicar o que está acontecendo durante os processos reprodutivos. .Os resultados apresentados aqui podem ajudar na melhor compreensão de mudanças genéticas durante o período peripuberal.

Diversas evidências demonstram que as diferentes fases do sono agem de maneira complementar e diferencial na consolidação de memórias. No entanto os mecanismos celulares e moleculares dessa relação não estão estabelecidos. Foi postulado que a melhor maneira para se entender como o sono facilita o aprendizado é contrastando evidências experimentais obtidas em presença ou ausência de informação adquirida recentemente; e que a plasticidade sináptica dependente de atividade é o melhor correlato celular para o aprendizado e memória. Portanto, analisamos a expressão dos genes relacionados à plasticidade sináptica Arc, Bdnf, Camk4, Creb1, Egr1, Egr2, Fos, Nr4a1, Ppp2ca e Ppp2r2d durante o sono de ratos adultos expostos ou não a um ambiente enriquecido. Nove dos 10 genes avaliados (Arc, Bdnf, Creb1, Egr1, Egr2, Fos, Nr4a1, Ppp2ca e Ppp2r2d) mostraram aumento da expressão após a exposição. A expressão de Bdnf no hipocampo estava aumentada durante os estágios marcados pela dessincronização da atividade elétrica do cérebro (vigília e sono REM) sugerindo que Bdnf poderia ser um marcador da homeostase do sono. Pela primeira vez demonstramos que exposição ao ambiente enriquecido promoveu aumento na expressão de genes (Ppp2r2d, Ppp2r2ca) que codificam para a proteína fosfatase 2A (PP2A). Dado o papel dessa proteína na plasticidade sináptica dependente de atividade sugerimos que esse evento seja importante para as modificações na morfologia e atividade neuronal observados após a exposição a um ambiente enriquecido. Por fim, o nosso trabalho mostra que ocorre a reindução de genes relacionados à potencialização sináptica durante SREM (Egr1, Fos). E, pela primeira vez, demonstrou-se que um gene que codifica para uma proteína relacionada à depressão da atividade sináptica também está reinduzido (Ppp2r2d) no hipocampo. Esses resultados reforçam a necessidade de uma reativação na atividade cerebral durante o sono e, pela primeira vez, mostram-se evidências experimentais que a potencialização e depressão da plasticidade sináptica ocorrem concomitantemente durante o sono. / Independent lines of evidence show differential and complementary roles of slow wave sleep and REM sleep in memory consolidation. However molecular and cellular mechanisms governing this relation are not known. It was suggested that comparison of experimental evidences obtained in presence or absence of recently acquired information is necessary to investigate sleep-dependent memory consolidation. It is well known that the activity-dependent synaptic plasticity is the best cellular and molecular correlate of learning and memory. Therefore we carried out experiments analyzing expression of synaptic plasticity-related genes (Arc, Bdnf, Camk4, Creb1, Egr1, Egr2, Fos, Nr4a1, Ppp2ca e Ppp2r2d) during sleep in adult rats exposed or not to a novel experience. Expression of nine out of 10 analyzed genes (Arc, Bdnf, Creb1, Egr1, Egr2, Fos, Nr4a1, Ppp2ca e Ppp2r2d) was increased following novelty exposure. Bdnf expression was increased in hippocampus during vigilance states marked by desynchronized brain electrical activity (waking and REM sleep). Hence, suggesting that Bdnf has a role as a homeostatic marker of sleep need. Here, we showed for the first time that exposure to novelty induces expression of protein phosphatase 2A (PP2A) coding genes (Ppp2r2d, Ppp2r2ca) in the hippocampus. Given PP2A role in activity dependant synaptic activity and its association to cytoskeleton proteins this could account for changes in neural activity and morphology observed after exposure to novelty. Finally, we found reinduction of synaptic potentiation related genes during REM sleep (Egr1, Fos). Furthermore, we also found reinduction of Ppp2r2d, which is related to synaptic depression. These results suggest the need for neural circuit reactivation during sleep and, for the first time, we provide experimental evidences that the synaptic potentiation and depression occur concurrently during sleep.

Orientador: Sergio Luis Felisbino / Resumo: O câncer de próstata (PCa) é o segundo tipo de câncer mais frequente e tem a segunda maior taxa de morbidade e mortalidade entre os homens. A cultura de células prostáticas LNCaP e PC3 tem sido utilizada para investigar possíveis alvos e vias de sinalização celular importantes para o crescimento e progressão do CaP. Trabalhos anteriores do nosso laboratório demonstraram que a presença de fibronectina no meio de cultura altera significativamente o padrão de expressão gênica dessas células. Também, bacteriófagos recentemente usados como agentes terapêuticos no tratamento de vários tipos de câncer, diretamente ou portadores de moléculas antitumorais, incluindo câncer de próstata, foram relatados. Estudos anteriores mostraram que bacteriófagos podem interagir com proteínas de membrana de células de mamíferos, incluindo integrinas que reconhecem sequências de RGD em proteínas virais, bem como fibronectina e outras moléculas da matriz extracelular. O objetivo deste projeto foi caracterizar a interação de três bacteriófagos com as duas linhagens celulares epiteliais prostáticas LNCaP e PC3. Estas duas linhas celulares foram cultivadas em seus meios de cultura, nos quais foram adicionados bacteriófagos com concentrações definidas. As células foram coletadas após 24 horas de tratamento. A expressão gênica de genes relacionados as vias integrinas ITGA5, ITGAV, ITGB1, ITGB3, ITGB5, AKT, PI3K, MAPK1, MAPK3, HSP27, HSP90, receptor de androgênio AR, STAT3, PGC1A foi analisada por qPCR. A a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Katia Denise Saraiva Bresciani / Resumo: Os protozoários do gênero Cryptosporidium spp. são parasitos intracelulares obrigatórios, pertencentes ao filo Apicomplexa. Estes parasitos são capazes de se desenvolver nas microvilosidades das células epiteliais do intestino delgado de hospedeiros vertebrados, sendo potencialmente letais em adultos e crianças imunodeficientes. Não existem medicamentos eficazes para controlar essa doença e o desenvolvimento de medicamentos é dificultado pela falta de métodos de cultura eficazes que atuam permitindo detecção completa do ciclo de vida do parasito. Uma lacuna fundamental existe em relação ao entendimento de como os esporozoítos de Cryptosporidium spp. interagem com as células para iniciar a invasão e sua replicação. Assim, foi estudada essa lacuna para explicar a distinção entre aspectos da biologia do Cryptosporidium spp. e a especificidade do hospedeiro. Por meio de um ensaio de imunofluorescência detectou-se separadamente parasitos ligados e que invadiram às células e qual foi sua evolução ao longo de 2, 24 e 48 horas do parasitismo nas células hospedeiras. Com base nos genes mais significativos nas análises LDA (análise linear discriminante) e RDA (análise de redundância) e com maior valor FPKM (fragmentos por quilobase de transcritos por milhão de leituras mapeadas), pode-se perceber uma diferença significativa na expressão gênica desse parasito extracelular e intracelular. Os genes que mais se expressaram em células incubadas por 48 horas após a infecção foram analisados ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The protozoa of the genus Cryptosporidium spp. are obligate intracellular parasites that belongs to the phylum Apicomplexa. These parasites are capable to develop in the microvilli of epithelial cells of the gastrointestinal tract of vertebrate hosts, being potentially lethal in immunodeficient adults and children. There are no effective medications to control cryptosporidiosis, and drug development is hampered by the lack of effective culture methods that act to allow the complete life cycle of the parasite. It is fundamental to understand how Cryptosporidium spp. sporozoites interact with cells to initiate invasion and replication. Thus, this subject has been studied to explain the distinction between Cryptosporidium spp. biology and host specificity. By an immunofluorescence assay we detected bounded parasites invading host cells and their evolution over two, 24 and 48 hours. Based on the most significant genes in the LDA (Linear Discriminant Analysis) and RDA (redundancy analysis) analysis and with higher FPKM value (fragments per kilobase of transcribed per million mapped readings), we can perceive a significant difference in the expression of this extracellular and intracellular parasite. The genes that most expressed in cells incubated for 48 hours after infection were analyzed for the biological species of Ontology of Genes (GO) that show significantly the enriched processes and functions of the intracellular parasite. The knowledge of the genes that are most expresse... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2016-07-28T17:28:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016AndressaDametto.pdf: 6437953 bytes, checksum: 108cd4db9bb8084327ccbeef547d5042 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2016-08-30T11:50:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016AndressaDametto.pdf: 6437953 bytes, checksum: 108cd4db9bb8084327ccbeef547d5042 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T11:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016AndressaDametto.pdf: 6437953 bytes, checksum: 108cd4db9bb8084327ccbeef547d5042 (MD5) Previous issue date: 2016-07 / FAPERGS / O arroz é uma das culturas mais importantes do mundo. No entanto, sua produtividade é muito afetada por diferentes estresses abióticos, incluindo a baixa temperatura, que pode ser prejudicial durante todas as fases de desenvolvimento, desde a germinação até o enchimento dos grãos. Durante a germinação, os sintomas mais comuns dos danos provocados pela baixa temperatura são o atraso e a menor porcentagem de germinação das sementes. No sul do Brasil, a maioria das cultivares de arroz pertence à subespécie indica, que apresenta germinação lenta e não uniforme em baixas temperaturas, resultando em plantações irregulares. A fim de identificar e caracterizar novos genes envolvidos na tolerância ao frio durante a fase de germinação, foram realizadas análises transcricionais (RNAseq) de dois genótipos de arroz da subespécie indica (linhagens irmãs previamente identificadas como tolerante e sensível ao frio) sob tratamento com baixas temperaturas (germinação à 13°C por 7 dias). Foram detectadas 1.361 sequências diferencialmente expressas. Destas, 758 sequências (56%) mostraram-se mais expressas no genótipo tolerante ao frio, enquanto que 603 (44%) mostraram-se mais expressas no genótipo sensível ao frio. Análises posteriores por RT-qPCR de onze sequências selecionadas foram utilizadas para confirmar a elevada qualidade dos resultados do RNAseq. Este estudo revelou que vários processos são mais ativos no genótipo tolerante, incluindo taxas de divisão celular e de crescimento, integridade e extensibilidade da parede celular, absorção de água e capacidade de transporte de membrana, síntese de sacarose, geração de açúcares simples, insaturação de ácidos graxos de membrana, biossíntese de cera, capacidade antioxidante e sinalização por hormônios e Ca+2, levando à adaptação e tolerância ao frio. Por outro lado, o genótipo sensível ao frio responde à baixa temperatura aumentando a síntese de proteínas de choque térmico (HSPs) e deidrinas, além de apresentar uma maior taxa de degradação proteica via ubiquitina/proteassoma e biossíntese de poliaminas. Nossos resultados revelaram características de expressão gênica no processo de germinação sob condições de estresse à baixa temperatura que podem ser úteis em futuras abordagens biotecnológicas visando a tolerância ao frio em arroz. / Rice is one of the most important crops in the world. However, productivity is greatly affected by different abiotic stresses, including low temperature which can be harmful during all developmental stages of rice plants, from germination to grain filling. During germination, the most common symptoms of cold temperature damage are delayed and lower percentage of germination. In southern Brazil, most rice cultivars belong to indica subspecies, which present slow and not uniform germination under cold temperature, resulting in irregular crop establishment. In order to identify and characterize novel genes involved in rice cold tolerance during the germination stage, we used two indica rice genotypes (sister lines previously identified as cold-tolerant and cold-sensitive) in parallel transcriptomic analysis (RNAseq) under cold treatment (germination at 13 oC for 7 days). We detected 1,361 differentially expressed sequences. From these, 758 sequences (56%) showed higher expression in the coldtolerant genotype, while 603 (44%) showed lower expression in the cold-sensitive genotype. Further analysis by quantitative RT-PCR of eleven selected sequences was used to confirm the high-quality of RNAseq results. This study revealed that several processes are more active in the cold-tolerant genotype, including cell division and growth rates, cell wall integrity and extensibility, water uptake and membrane transport capacity, sucrose synthesis, generation of monosaccharides, unsaturation of membrane fatty acids, wax biosynthesis, antioxidant capacity, and hormone and Ca+2-signaling, which ultimately lead to cold adaptation and tolerance. On the other hand, the cold-sensitive cultivar responds to low temperature stress increasing the synthesis of heat shock proteins (HSPs) and dehydrins, along with enhanced ubiquitin/proteasome protein degradation pathway and polyamine biosynthesis. Our findings revealed the gene expression characteristics in the process of germination under low temperature stress conditions, and can be useful in future biotechnological approaches aiming to cold stress tolerance in rice.

Orientador: Marcio Vinícius Bertacine Dias / Banca: Gabriel Padilla / Banca: Daniel Maragno Trindade / Resumo: Vários experimentos têm comprovado que compostos naturais podem ter sua atividade biológica alterada devido à presença ou ausência de halogênios ligados. Os antibióticos glicopeptídicos, como a vancomicina e teicoplanina são produtos naturais halogenados que apresentam destacada importância. Halogenases são enzimas que catalizam a transferência de halogênios para um determinado substrato, porém são muito pouco estudadas, principalmente aquelas envolvidas na biossíntese de produtos naturais, como antibióticos glicopeptídicos, mesmo com o seu potencial de aplicação em biologia sintética. Cepas produtoras de glicopeptideos foram obtidas da coleção NRRL e crescidas em meio TSB. O DNA foi extraído e os genes de 3 diferentes halogenases (staI e staK de Streptomyces toyocaensis, composto 47934 and Orf8* de Actinoplanes teichomyceticus, Teicoplanina) foram clonados em pET28a e pET20a. Um gene sintético foi obtido para enzima ComH (biossíntese de complestatina) e clonado em pET28a. A expressão desses genes foi induzida por IPTG e a purificação se deu em colunas de afinidade e gel filtração. Foram realizados estudos biofísicos (CD e DLS da StaI), bem como modelagem molecular e ensaios de complementação para proteínas StaK e StaI. Três halogenases foram purificadas, StaI, StaK e ComH e apresentaram coloração amarela indicando a co-purificação com FAD. Orf8* apresentou-se somente na fração insolúvel. Análises de CD indicam a presença de -hélices e folhas-β e foi possível observar o estado de oligomerização e polidispersividade em diferentes condições para halogenase StaI. Os modelos moleculares deram insights sobre uma possível diferença de padrão de halogenação catalizada pela StaI e StaK, devido à diferença de resíduos hidrofóbicos que formam os sulcos do sítio ativo. Tentativas de ensaios de cristalização para as enzimas StaI, StaK e ComH foram realizadas. No entanto, apenas a... / Abstract: Various experiments have shown that natural compounds may have their biologic activity altered by presence or absence of halogens. Glycopeptide antibiotics, such as vancomycin and teicoplanin are halogenated natural products and they have substantial importance in the medicine. Halogenases, are enzymes that catalyses the attachment of halogens to a substrate, howerver they are not well understood mainly those ones in glycopeptide biosynthesis. Producing glycopeptides strains were obtained from NRRL collection, they were grown in liquid TSB medium and the DNA was extracted. Three different genes for halogenases [(staI and staK from Streptomyces toyocaensis (compound 47934) and Orf8* from Actinoplanes teichomyceticus (Teicoplanin)] were amplified and cloned into pET28a and pET20a. A synthetic gene for comH from the biosynthesis of complestatin was obtained and also cloned in the pET28a. The expression of these four genes was carried out with the induction by IPTG and the purification was performed by affinity and molecular exclusion. Samples of soluble and insoluble fractions and chromatographic peaks were analyzed on SDS-PAGE gel. Circular Dichroism (CD) and Dynamic Light Scattering (DLS) studies were performed for StaI and ComH. We have also performed molecular modelling for StaI and StaK enzymes because attempts to crystallise all the soluble halogenases did not return any result (only StaI had a single crystal which showed not reproduzible). ComH, StaI and StaK were purified and they had an yellow colour indicating the co-purification with FAD.Orf8* was predominantly insoluble. SDS-PAGE gel showed that StaI had high purity already after the affinity purification and the molecular exclusion indicates that it had a tendency to aggregate. By the analysis of CD was possible to observe the structural integrity of StaI and ComH, which shows, as expected, the presence of -helixes and β-sheets. The DLS analysis shows the oligomerization ... / Mestre

Introdução: A periodontite é uma doença inflamatória crônica, de alta prevalência na população, que causa perda dentária. A progressão da doença ocorre por meio de surtos, com períodos de remissão e exacerbação. A análise da expressão gênica de lesões ativas na progressão das doenças periodontais pode demonstrar diferenças na resposta do hospedeiro e indicar processos relacionados à atividade destrutiva da doença. Metodologia: Foram selecionados 54 pacientes, sendo 18 com Doença Periodontal Agressiva (DPA), 25 com Doença Periodontal Crônica (DPC) e 11 com ausência de Doença Periodontal (Controle). Medidas clínicas de profundidade de sondagem (PS), nível de inserção relativo (NIR), sangramento à sondagem (SS) e índice de placa (IP) foram obtidas em dois tempos: inicial e após tratamento na reavaliação com dois meses. Nos pacientes com Doença Periodontal (DP), os sítios que apresentaram perda de inserção de um ou mais milímetros foram considerados ativos e os demais, não ativos. O perfil de expressão gênica, de sítios ativos e não ativos, foi obtido pela análise de biópsias gengivais com o Real Time PCR Array. Resultados: Após o tratamento periodontal não cirúrgico, houve melhora significante em todos os parâmetros clínicos (PS, SS, IP; p<0,05) exceto para o NIR (p>0,05). Dos 5112 sítios tratados, aproximadamente 4% apresentam perda de inserção mesmo após o tratamento com ou sem uso de antibiótico. As doenças DPA e DPC demonstraram diferentes perfis de expressão gênica, com sítios ativos apresentando um padrão significantemente up-regulated em relação aos sítios não ativos. Conclusão: A DPA e a DPC são condições clínicas que apresentam diferenças na resposta imune e a atividade destrutiva da lesão periodontal ativa pode ser reconhecida por um padrão inflamatório up-regulated de resposta. Considerando-se as diferenças observadas, abordagens terapêuticas individualizadas e capazes de modular a resposta poderiam potencializar o efeito benéfico da terapia anti-infecciosa e reduzir o número de sítios ativos da DP progressiva. / Aim: Evaluate the gene expression profile under healthy and periodontal disease conditions; identify possible differences in the gene expression profile between chronic and aggressive periodontal diseases; seek evidences of immune regulation differences in active and non active sites during periodontal destruction. Methods: Clinical parameters of probing depth, relative attachment level, bleeding on probing and plaque index were obtained in two stages: initial and two months. The sites that showed attachment loss 1mm were considered active and others non-active. The gene expression profile of active and non-active sites, was obtained by gingival biopsies analysis with Real Time PCR Array. Results: After non-surgical periodontal treatment, significant improvement in all clinical parameters were achieved (P <0.05), except for the relative attachment level (p> 0.05). The disease showed different gene expression profiles with active sites showing a pattern significantly up-regulated compared to non-active sites. Conclusion: Aggressive and Chronic Periodontitis are clinical conditions that showed differences in the immune response profile and that the progressive periodontal lesion can be recognized by an up-regulated inflammatory response. Considering the observed differences, it is possible that individualized therapeutic approaches that modulate the inflammatory response might enhance the efficacy of the anti-infective therapy and reduce active sites number after treatment.