Os gliomas estão entre os mais freqüentes e fatais tumores do sistema nervoso central. Apesar dos grandes avanços da Medicina nas áreas diagnósticas e terapêuticas, o tratamento desses tumores ainda é, na grande maioria dos casos, paliativo, sendo a extirpação cirúrgica do tumor o único recurso com potencial curativo e, ainda assim, apenas para os gliomas de baixo grau. Neste trabalho, foram analisados os perfis de expressão gênica diferencial entre linhagens de glioma de rato com diferentes graus de tumorigenicidade (linhagens ST1 e P7), visando identificar genes com potencial de aplicação na doença humana como marcadores moleculares e/ou novos alvos terapêuticos. Numa primeira abordagem, foi realizado um rastreamento de genes potencialmente diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7 de glioma de rato através da hibridização de macroarrays de cDNA comerciais. Um conjunto de três membranas comerciais foi hibridizado com alvos radioativos gerados a partir de mRNA obtido destas duas linhagens, totalizando aproximadamente 3.000 genes. Nestes experimentos, foram identificados aproximadamente 200 genes como sendo possivelmente diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7. Os níveis de expressão relativa de cerca de 40 destes genes foram analisados por Northern blot, sendo que seis deles foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem ST1 enquanto que 4 foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem P7. Num segundo momento, foi realizado um rastreamento de expressão gênica em larga escala, através do uso de microarrays de DNA contendo sondas que permitem a análise de expressão de aproximadamente 24.000 transcritos de rato. Esta análise levou à identificação de uma lista contendo aproximadamente 1.300 genes candidatos a diferencialmente expressos, que apresentaram razões de expressão relativa entre 2 e >3.000. Desta lista, -700 genes foram identificados como provavelmente mais expressos na linhagem ST1, e cerca de 500 genes com expressão maior na linhagem P7. A etapa de subseqüente de validação da expressão diferencial foi realizada através de PCR quantitativo em tempo real (Q-PCR). A expressão de 49 genes foi quantificada em quatro preparações independentes de RNA originárias das linhagens ST1 e P7, sendo que 27 destes genes foram identificados como possivelmente diferencialmente expressos através dos microarrays, 10 dos quais haviam sido previamente confirmados por Northern Blot e 12 genes diversos. Destes genes, 21 foram confirmados por Q-PCR como sendo diferencialmente expressos entre as linhagens ST1 e P7, além daqueles 10 genes cuja expressão diferencial havia sido anteriormente confirmada por Northern. Ao todo, oito genes foram confirmados como sendo mais expressos na linhagem ST1, e 23 genes o foram como sendo mais expressos na linhagem P7. Vários dos genes confirmados como sendo diferencialmente expressos na linhagem ST1 estão, direta ou indiretamente, relacionados a parada de crescimento e supressão de fenótipo tumoral. Em contrapartida, diversos dos genes confirmados como sendo diferencialmente expressos na linhagem P7 codificam para receptores de fatores de crescimento peptídicos e seus respectivos ligantes. Em particular, foi detectado maior expressão, na linhagem P7, de receptores e Iigantes relacionados ao fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento para fibroblastos (FGFs) e, também, do fatores de crescimento da família de pleiotrofina/midquina (PTN/MDK), e seus respectivos receptores. Sabidamente, vários destes genes estão envolvidos na neoangiogênese e na fechamento de alças autócrinas/parácrinas de estímulo da proliferação tumoral, em particular de gliomas humanos. Além disso, estes achados foram coerentes com o maior potencial tumorigênico (-2,5x) apresentado pela linhagem P7, quando injetadas s.c. no dorso de animais imunocomprometidos (p<O,01). As linhagens ST1 e P7 foram originalmente isoladas como sendo sublinhagens derivadas da linhagem C6, cuja origem é donal. Assim, uma possível interpretação para as diferenças marcantes dos perfis de expressão detectadas entre as linhagens ST1 e P7, é de que estas diferenças sejam, mais provavelmente, a conseqüência de algumas poucas alterações moleculares em genes-chave, e não de alterações extensas do genoma celular, uma vez que as duas linhagens têm, a priorí, o mesmo \"background\" genético. Assim, um número limitado de aberrações genéticas adicionais, particulares de cada linhagem, seria suficiente para uma modificação substancial dos perfis de expressão gênica, se os genes alterados forem capazes de modular a expressão de vários outros genes. Na busca de indícios que fortalecessem esta hipótese, foi quantificado, em seis linhagens humanas de glioma, a expressão dos mesmos genes cuja expressão foi originalmente quantificada nas linhagens ST1 e P7. Em seguida, foram realizados testes de correlação em pares (Teste de Pearson) entre os níveis de expressão relativos destes genes para as seis linhagens, buscando identificar conjuntos de genes que apresentassem expressão coordenada, que, por sua vez, sugeririam a existência de possíveis relações regulatórias entre os mesmos. Foi possível observar expressão significativamente correlacionada de seis genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN, PTPRZ1 e SCG2), sugerindo uma possível co-regulação recíproca entre diferentes vias de fatores de crescimento e/ou um novo fator remodelador de cromatina (CHD7). Pararelamente, o gene CHD7 foi, por sua vez, identificado como um novo fator remodelador de cromatina putativo, cujo cDNA completo pode ser amplificado, com êxito, através de RT-PCR longo. A expressão destes mesmos seis genes foi quantificada, por Q-PCR, em 64 amostras clínicas de glioma e cérebro humano não-tumoral. Com exceção do gene SCG2, os demais cinco (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN e PTPRZ1) são significativamente mais expressos em todos os graus de glioma, quando comparados com cérebro humano não-tumoral (p<0,05). Foi possível verificar, inclusive, que os níveis de expressão de vários destes genes estão altamente correlacionados nessas amostras. Em particular, observou-se correlação com alta significância entre os genes CHD7xPDGFRA (p=4,7x10-17), FGF1 xPTN (p=1, 1x10-19), do receptor PTPRZ1 contra todos os demais genes (100-6<p<10-9) e, especificamente, contra seu Iigante PTN (p=1,6x10-14). Como os loci dos genes PTN e PTPRZ1 se encontram relativamente próximos (-15 Mb) numa região do cromossomo 7 humano, a qual frequentemente se encontra amplificada em gliomas humanos (7q), é possível que estes dois genes, codificantes para um fator de crescimento e seu respectivo receptor, façam parte de um novo amplicon em gliomas humanos. Além disso, vários genes com maior expressão na linhagem P7 (ALK, FGFR1, RNF130 e ROS01) estão, também, significativamente mais expressos em certos graus de gliomas humanos, quando comparados com tecido cerebral humano não-tumoral. De um modo geral, estes dados indicam que foi possível obter, a partir de linhagens de glioma de rato, incursões aplicáveis para um entendimento mais amplo da biologia que envolve a patogênese da doença humana. Um destes dados extrapoláveis entre diferentes modelos inter-espécies é que a co-expressão de múltiplas vias autócrinas de crescimento parece ser um achado comum tanto em modelos experimentais de glioma em rato quanto em linhagens e amostras clínicas de gliomas humanos, e que estas vias estão, potencialmente, interconectadas ao nível transcricional. Além disso, foi possível verificar que um novo gene codificante para um fator de remodelamento de cromatina (CHD7), apresenta níveis de expressão relativos muito aumentados em amostras clínicas de glioma, quando comparado com cérebro humano não-tumoral. Analisados em conjunto, os resultados obtidos aqui têm o potencial para conduzir ao desenvolvimento racional de novas estratégias terapêuticas e diagnósticas/prognósticas para gliomas humanos. A análise do papel funcional destes genes em glioma, e das vias moduladas por seus produtos, se constituirá de um passo fundamental para o estabelecimento destes genes como potenciais novos alvos terapêuticos e/ou marcadores moleculares. / Gliomas are among the most frequent and fatal tumors of the central nervous system. Despite the recent and important advances in the diagnostic and therapeutic fields, treatment of these tumors still is, in the vast majority of the cases, palliative. Surgical ressection of the tumor remains as the sole potentially curative resource, but only for the low grade gliomas. In the present work, differential gene expression profiles were analyzed between rat glioma cell lines differing in tumorigenic potential (ST1 and P7 cell lines), aimed at identifying genes with potential to become novel molecular markers and therapeutic targets for the human disease. As a first approach, a commercial macroarray-based screening was undertaken in order to identify differentially expressed genes between ST1 and P7 rat glioma cell lines. Three different sets of commercial membranes comprising 3,000 genes were hybridized against radiolabeled targets that were synthesized from mRNA extracted from both cell lines. As a result, near 2,000 genes were identified as being possibly differentially expressed between ST1 and P7 celllines. The relative expression levels of 40 genes from this list were analyzed by Northern blot, and six genes were successfully confirmed as being expressed at higher levels in the ST1 cell line, whereas four genes confirmed heightened expression in P7 cells. As a second approach, a large-scale, Affymetrix microarray-based screening was performed, which allowed measuring the relative expression levels of about 24,000 rat transcripts. This analysis led to the identification of 1,300 candidate differentially expressed genes, for which the differential expression ratios ranged from 2 up to >3,000. From these, -700 genes displayed preferential expression in the ST1 cell line, while around 500 genes were more expressed in P7 cells. The following step, namely, validation of the differential expression, was achieved through Real-Time PCR (Q-PCR). Expression levels of 49 genes were measured in four independent RNA preparations from ST1 and P7 cell lines. About 27 of these genes were identified as putative differentially expressed , 10 of which had previously been confirmed by Northern blot as differentially expressed and 12 additional genes were also included. From this list, 21 genes were confirmed by Q-PCR as being diferentially expressed between the ST1 and P7 cell lines, in addition to those 10 whose differential expression was confirmed by Northern Slol. In total, eight genes were confirmed as being differentially expressed in the ST1 cell line, and 23 genes were confirmed as being expressed at higher leveis in the P7 cells. Many of the genes confirmed as being differentially expressed genes in the ST1 cell line are, directly or indirectly, related to growth arrest and suppression of the malignant phenotype. On the other hand, several of the genes displaying elevated expression in the P7 cell line code for growth factor ligands and receptors related to the PDGFs (platelet-derived growth factors), FGFs (fibroblast growth factors) and PTN/MDK (pleiotrophin/midkine) growth factor families. Many of these genes are already known as being related to neoangiogenesis and to the establishment of autocrine/paracrine loops in human gliomas. In addition, these findings are in keeping with the significantly higher (p<O.01) tumorigenic potential displayed by the P7 cellline (-2,5x), when both cell lines are injected s.c. in the dorsal region of immunodeficient nude mice. Moreover, ST1 and P7 celllines were originally isolated as clonal celllines from the C6 cell line which, in turn, is also acionai cell line. Therefore, a possible interpretation for the remarkably different gene expression profiles between ST1 and P7 cell lines is that those differences are, most Iikely, a consequence of a few molecular defects in key/master genes, rather than extensive aberrations of the cellular genome, given that those celllines have, a priori, similar genetic backgrounds. Thus, a limited number of genetic aberrations, characterisitic of each cell line, would be sufficient for a substantial modification of the gene expression profiles, provided that the altered genes are able to modulate the expression of each other. In an attempt to investigate theis point, the relative expression levels of the same genes were analyzed by Q-PCR, and pairwise correlation tests (Pearson correlation tests) were performed using expression data from the six human glioma cell lines, aimed at identifying gene sets that displayed coordinate expression whichwould suggest the existence of putative regulatory loops among them. It was possible to identify a c1uster of six genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN, PTPRZ1, SCG2) that displays coregulated expression, thus suggesting a possible reciprocal co-regulation among distinct growth factor pathways and a putative chromatin remodeling factor (CHD7). Furthermore, the CHD7 gene was identified as a novel, putative chromatin remodeling factor, and its full-Iength cDNA could be successfully amplified by means of long RTPCR. The expression levels of the same genes was quantified, by Q-PCR, in 64 clinicai samples, comprising gliomas and non-tumoral human brain tissue samples. Except for the SCG2 gene, the remaining five genes (CHD7, FGF1, PDGFRA, PTN and PTPRZ1) were expressed at significantly higher levels in glioma samples of all grades, when compared to non-tumoral human brain tissue samples (p<O.05). Likewise, we were able to verify that expression levels for many of these genes are strictly correlated in those samples. A particularly high levei of significance was found for the correlation of expression levels between CHD7xPDGFRA (p=4.7x10-17) and also for the FGF1xPTN gene pair (p=1.1x10-19). A strikingly high level of significance (p=1.6x10-14) was also found for the expression levels between the PTPRZ1 receptor and its PTN ligand. Given that the PTN and PTPRZ1 loei are relatively close to each other (-15 Mb) on the long arm of human chromosome 7, which, in turn, is frequently amplified in human gliomas, the genomic region including these two genes may well constitute a novel amplicon in human gliomas. In addition, several other genes with higher expression in the P7 cell line (ALK, FGFR1, RNF130 and ROB01) are also expressed at significantly higher levels in certain glioma grades, when compared to non-tumoral human brain tissue samples. Overall, these data indicate that starting from the rat glioma cell lines model, it was possible to obtain, insights applicable to a better understanding of the biology underlying the pathogenesis of human gliomas. Thus, co-expression of multiple autocrine loops seems to be a commonplace in the rat experimental glioma models as well as in the human glioma cell lines and in clinicai samples, where these pathways are potentially interconnected at the transcriptional leveI. Furthermore, we were able to detect increased mRNA expression levels of a novel putative chromatin remodelling factor (CHD7) in human glioma tissue samples, when compared to non-tumoral human brain tissue samples. Taken together, the results obtained in this work may potentially lead to the rational development of novel therapeutic, diagnostic and prognostic strategies for human gliomas. Functional analysis of these genes in glioma, and the pathways modulated by their products, will be a fundamental step for the establishment of these genes as potentially novel therapeutic targets and/or molecular markers.

Introdução: A periodontite é uma doença inflamatória crônica, de alta prevalência na população, que causa perda dentária. A progressão da doença ocorre por meio de surtos, com períodos de remissão e exacerbação. A análise da expressão gênica de lesões ativas na progressão das doenças periodontais pode demonstrar diferenças na resposta do hospedeiro e indicar processos relacionados à atividade destrutiva da doença. Metodologia: Foram selecionados 54 pacientes, sendo 18 com Doença Periodontal Agressiva (DPA), 25 com Doença Periodontal Crônica (DPC) e 11 com ausência de Doença Periodontal (Controle). Medidas clínicas de profundidade de sondagem (PS), nível de inserção relativo (NIR), sangramento à sondagem (SS) e índice de placa (IP) foram obtidas em dois tempos: inicial e após tratamento na reavaliação com dois meses. Nos pacientes com Doença Periodontal (DP), os sítios que apresentaram perda de inserção de um ou mais milímetros foram considerados ativos e os demais, não ativos. O perfil de expressão gênica, de sítios ativos e não ativos, foi obtido pela análise de biópsias gengivais com o Real Time PCR Array. Resultados: Após o tratamento periodontal não cirúrgico, houve melhora significante em todos os parâmetros clínicos (PS, SS, IP; p<0,05) exceto para o NIR (p>0,05). Dos 5112 sítios tratados, aproximadamente 4% apresentam perda de inserção mesmo após o tratamento com ou sem uso de antibiótico. As doenças DPA e DPC demonstraram diferentes perfis de expressão gênica, com sítios ativos apresentando um padrão significantemente up-regulated em relação aos sítios não ativos. Conclusão: A DPA e a DPC são condições clínicas que apresentam diferenças na resposta imune e a atividade destrutiva da lesão periodontal ativa pode ser reconhecida por um padrão inflamatório up-regulated de resposta. Considerando-se as diferenças observadas, abordagens terapêuticas individualizadas e capazes de modular a resposta poderiam potencializar o efeito benéfico da terapia anti-infecciosa e reduzir o número de sítios ativos da DP progressiva. / Aim: Evaluate the gene expression profile under healthy and periodontal disease conditions; identify possible differences in the gene expression profile between chronic and aggressive periodontal diseases; seek evidences of immune regulation differences in active and non active sites during periodontal destruction. Methods: Clinical parameters of probing depth, relative attachment level, bleeding on probing and plaque index were obtained in two stages: initial and two months. The sites that showed attachment loss 1mm were considered active and others non-active. The gene expression profile of active and non-active sites, was obtained by gingival biopsies analysis with Real Time PCR Array. Results: After non-surgical periodontal treatment, significant improvement in all clinical parameters were achieved (P <0.05), except for the relative attachment level (p> 0.05). The disease showed different gene expression profiles with active sites showing a pattern significantly up-regulated compared to non-active sites. Conclusion: Aggressive and Chronic Periodontitis are clinical conditions that showed differences in the immune response profile and that the progressive periodontal lesion can be recognized by an up-regulated inflammatory response. Considering the observed differences, it is possible that individualized therapeutic approaches that modulate the inflammatory response might enhance the efficacy of the anti-infective therapy and reduce active sites number after treatment.

HIPK2 (homeodomain interacting protein kinase 2) é uma proteína quinase nuclear, originalmente identificada por interagir com homeoproteínas. Sua atividade quinase contribui para a regulação de diversas vias, ativando o programa de morte celular em resposta a estímulos externos ou promovendo diferenciação celular por atuar como co-fator de homeoproteínas. A extensa similaridade estrutural com as outras proteínas da mesma família, HIPK1 e HIPK3, sugere que as três HIPKs possuem funções redundantes. Este trabalho pretendeu contribuir para a elucidação das funções de HIPK2 avaliando a expressão desta durante o desenvolvimento em camundongo. Observou-se ampla distribuição do transcrito desde o dia 9.5 pós-coito (dpc). Com o progresso do desenvolvimento, a expressão passou a se concentrar principalmente em tecidos nervosos, sugerindo uma participação de HIPK2 na morfogênese destes. Além disso, foi desenvolvido um sistema in vitro para se avaliar as funções de HIPK2 humana. A inibição de HIPK2 por RNAi em cultura celular humana levou ao aumento de expressão de genes HIPKs, indicando que possa haver um mecanismo de controle transcricional que ajuste os níveis de proteínas HIPKs na célula. O silenciamento de HIPK2 também provocou aumento de expressão de alguns genes homeobox avaliados, sugerindo que HIPK2 possa reprimir a expressão destes genes em humanos. A análise global de expressão gênica e proteômica nas células deficientes para HIPK2 poderá indicar as diferentes vias de atuação desta proteína. / HIPK2 is a nuclear protein kinase, originally identified because of its interaction with homeoproteins. Its kinase activity can regulate several pathways, triggering the apoptotic program in response to external stimuli or promoting differentiation by acting as a cofactor for homeoproteins. The extensive similarity with the other two proteins from the same family, HIPK1 and HIPK3, suggests that HIPKs have redundant functions. This work tried to contribute to the body of knowledge regarding the functions of HIPK2 addressing its expression during the mouse development. The transcript is broadly expressed in mouse embryos from day 9.5 post-coitum. As development progresses, its expression concentrates mainly in neural tissues, suggesting a role of HIPK2 in its morphogenesis. In addition, an in vitro system was developed to study HIPK2 functions in human cells. The HIPK2 silencing by RNAi in human cell culture led to a raise in expression of the other HIPKs genes, indicating that there might be a transcriptional mechanism controlling HIPKs proteins levels in the cell. HIPK2 inhibition also caused an increase in expression of some homeobox genes, suggesting that HIPK2 can negatively regulate their expression in humans. A global approach of gene expression and proteomics analysis in the HIPK2 deficient cells will help to identify different pathways in which HIPK2 participates.

Nesta dissertação consideramos um o modelo para um gene como sendo um sistema de dois estados, tipo spin, e apresentamos um modelo estocástico para a expressão gênica. As soluções estacionárias e, também, as dependentes do tempo, para o processo de transcrição, são obtidas e as distribuições de probabilidade, que descrevem o estado funcional do gene, são calculadas analiticamente. O valor médio e o ruído transcricional na população de mRNA são analisados. O efeito do ruído transcricional na síntese proteica é contemplado acoplando-se os processo de transcrição e tradução. / In this dissertation we present a two state stochastic model, spin-like, for gene expression. The steady-state solutions and also the time-dependente solutions for the transcription are probed and the probability distribution functions, which describe the functional state of the gene, are exactly calculated. The mean value and the transcriptional noise in the mRNA population are analyzed. The effects of the transcriptional noise in the protein synthesis are contemplated by coupling the transcription and the translation.

Abelhas adultas produzem vitelogenina, a principal proteína da hemolinfa. Ela está envolvida na reprodução, comportamento, imunidade, longevidade e regulação da organização social. A interferência por RNA interference é a mais promissora ferramenta para estudos de função gênica, baseada na introdução de duplex de RNA (dsRNA) que induz a degradação de transcritos alvo-específicos. Injeção de dsRNA altera a transcrição de vitelogenina, mas evidências apontam que a ativação do sistema imune em abelhas seja um efeito colateral destaa manipulação. Desenvolvemos um método para o silenciamento do gene codificador de vitelogenina no desenvolvimento pós-embrionário, que minimiza os efeitos da manipulação, onde 0,5 ?g de dsRNA de vitelogenina (dsVg) ou de GFP (controle exógeno, dsGFP) foi oferecido na dieta natural de larvas de segundo estágio, as quais foram mantidas na colônia. Nosso enfoque principal foi a compreensão dos efeitos do silenciamento pós-transcricional de rainhas e operárias de A. mellifera, em especial na fase larval. Operárias adultas reconhecem larvas tratadas e as remove. Mantemos certa distância entre as células de cria que recebiam o tratamento e a remoção de larvas tratadas diminuiu consideravelmente. A expressão de transcritos de vitelogenina em indivíduos sem tratamento e tratados foi analisada no quinto estágio larval de ambas as castas, bem como em operárias adultas de 7 dias e rainhas recémnascidas, utilizando-se PCR em tempo real e a expressão do gene codificador de actina como controle endógeno. Em adultos, controles sem tratamento e dsGFP expressaram quantidades similares de transcritos de vitelogenina. Os grupos alimentados com dsVg tiveram expressão reduzida de vitelogenina, a saber: quinto estágio larval de operárias (91%) e de rainhas (71%), operárias de 7 dias (88%) e rainhas recém-nascidas (70%). O silenciamento da vitelogenina não afetou a morfologia dos adultos, mas sim a fisiologia de larvas de ambas as castas, como nos títulos de hormônio juvenil e concentração de proteínas circulantes na hemolinfa. Concluímos que a ingestão de dsRNA é um método não-invasivo que induz silenciamento gênico e, assim, uma ferramenta eficiente para estudos funcionais pós-genoma. Os mecanismos regulatórios do gene codificador de vitelogenina e seu papel na diferenciação de castas estão em discussão. / Adult bees produce vitellogenin (Vg), the main protein in hemolymph; it is involved in honey bee (Apis mellifera) reproduction, behavior, immunity, longevity and regulation of social organization. Genetic interference mediated by injection of double-stranded RNA (dsRNA) is a powerful tool for the analysis of gene function in Apis mellifera. Injection of dsRNA effectively alters vitellogenin transcription; however, evidence has been found of immune system activation in treated bees, which could be a collateral effect of treatment. Consequently, we developed a non-invasive protocol for disruption of the A. mellifera genes exemplified by vitellogenin mRNA silencing, to understand it, mainly, in the female larval context. Second instar larvae were treated as follows: the treatment group received 0,5 ?g of double-stranded vitellogenin RNA (dsVg) mixed with larval food deposited in the worker brood cells; control group 1 was left to develop without treatment, while control group 2 received dsGFP (Green Fluorescent Protein), as an exogenous control. Treated and control larvae were maintained in the colony until adult emergence. Workers recognized dsRNAtreated larvae and frequently removed them. To circumvent this problem we increased the distance between the treatment groups. Vg gene expression were determined for fifth instar larvae of both castes and for 7 day-old workers and newly-emerged queens, evaluated by quantitative real time PCR, using actin as an endogenous control. For adults, we found that controls, dsGFP- and non-treated bees expressed similar amounts of Vg transcripts. The dsVg-fed groups had significantly reduced Vg gene expression in fifth instar larvae of workers (91%) and queens (71%) and, also, in 7 day-old workers (88%) and newly-emerged queens (70%). Disruption of the Vg gene did not affect adults morphology but physiological larval traits of both castes, as juvenile hormone titre and protein concentration. We conclude that dsRNA ingestion is an effective non-invasive method for inducing knockdown and an efficient approach for post-genome functional studies. The regulatory mechanisms of vitellogenin gene and its rules during caste differentiation are discussed.

Neste trabalho caracterizou-se a família das nucleotídeo pirofosfatases/ fosfodiesterases do parasita S. mansoni visando avaliá-los como antígenos vacinais. O parasita possui quatro proteínas desta família (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c e SmNPP-6), sendo que duas delas possuem maior expressão gênica nos estágios que infectam o homem. Dos anticorpos produzidos, apenas o anti-SmNPP-5a apresentou especificidade para a proteína nativa e utilizando-os demonstrou-se que a SmNPP-5a é uma glicoproteína associada às membranas do tegumento dos vermes adultos. Também se verificou que esses anticorpos inibiram parcialmente a atividade da enzima em parasitas vivos. Assim avaliamos a SmNPP-5a recombinante como antígeno vacinal juntamente com uma apirase (SmATPDase) e com a fosfatase alcalina (SmAP), outras duas nucleotidases presentes no tegumento de parasitas adultos. A SmNPP-5 e a SmNTDPase apresentaram menor imunogenicidade que a SmAP. Porém só verificamos a redução da carga parasitária em animais imunizados com a SmAP e tratados com doses subcurativas de praziquantel. / In this work the family of nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (NPP) from S. mansoni was characterized in order to evaluate them as vaccine antigens. The parasite has four proteins of this family (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c and SmNPP-6), whereas two of them present higher gene expression in stages that infect humans. Only anti-SmNPP-5a anitbodies showed specificity for the native protein. We use them to characterize SmNPP-5a as a glycoprotein associated with tegument membranes from adult worms. It was also found that these antibodies were able to partially inhibit the activity of the enzyme in live parasites. Thus we evaluated SmNPP-5a as recombinant vaccine antigen together with an apyrase (SmATPDase) and alkaline phosphatase (SmAP), two other nucleotidases involved in nucleotide metabolism and present in the tegument of adult parasites. SmNTDPase and SmNPP-5 were less immunogenic than SmAP. However, we only verified the reduction of parasite burden in mice immunized with SmAP, when the animals also received a subcurative treatment with praziquantel.

As plantas apresentam diversas adaptações fisiológicas à baixa disponibilidade de fósforo (Pi) do solo. Este trabalho discute os custos fisiológicos e energéticos associados com essas estratégias, focado nas respostas da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) à disponibilidade de Pi durante a simbiose com micorrizas arbusculares (Glomus clarum). Esses custos são importantes componentes para a adaptação a solos com baixo Pi, afetando a aquisição e conteúdo de fósforo; o crescimento e concentração de açúcares em tecidos vegetais. Plantas de cana-de-açúcar foram cultivadas em vasos com ou sem micorrizas (Glomus clarum), e sob a disponibilidade de baixo (20 mg kg-1) ou alto (202 mg kg-1) fósforo. Raízes e parte-aérea foram coletadas para as análises após 14, 30, 44 e 58 dias pós-inoculação (dpi) com Glomus clarum . A condição de BP causou a deficiência de Pi nas plantas, micorrízicas ou não. As plantas sob AP continham um teor foliar de Pi adequado, e partir dos 44 dpi acumularam pelo menos 6 vezes mais Pi parte-aérea, do que as cultivadas sob BP, efeito mais evidente nas micorrízicas. A eficiência de absorção, indicada pelo acúmulo de Pi na parte-aérea a uma dada biomassa da raiz, foi igual para todos os tratamentos, sugerindo que as eficiências radicular e micorrízica da absorção de Pi foram similares, independentemente da doses de Pi. A disponibilidade de fósforo não afetou a biomassa total das plantas, sendo as cultivadas sob BP mais eficientes na utilização deste nutriente. Por outro lado, as plantas micorrízicas suplementadas com BP apresentaram maior crescimento da raiz e redução na parte-aérea, resultando no aumento da proporção raiz:parte-aérea. Aos 58 dpi, a glicose, frutose e sacarose presente nas folhas de plantas micorrízicas foi 3,8, 2,3 e 2,4 vezes respectivamente mais concentrada do que nas não micorrízicas. Esses resultados sugerem que, nestas condições experimentais, o estabelecimento da simbiose não foi uma associação mutualística típica, afetando o perfil de crescimento e a alometria da cana cultivada com BP. As concentrações de fotoassimilados na folhas de planta micorrízicas indicam que houve aumentos nas taxas fotossintéticas, mas isso não resultou no maior crescimento do macrosimbionte. A tecnologia de amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-PCR) se tornou uma opção para a validação funcional de genes, com alta sensibilidade, acurada quantificação e eficácia. A quantificação relativa da expressão gênica é conseqüentemente fácil e determina a expressão de um gene em relação a outro expresso e relativamente constante. Neste trabalho foi analisada a variabilidade de expressão dos genes de cana-de-açúcar codificando a actina (Actina), gliceraldeido fosfato desidrogenase (GAPDH), tubulina (Tubulina), e ubiquitinas (UbiQ1 e UbiQ2) em diversos tecidos, e comparou-se a variabilidade obtida utilizando os programas Genorm e NormFinder. Em seguida, foram realizadas análises de expressão gênica utilizando o programa REST para a validação estatística da expressão de genes de cana-de-açúcar. O gene UbiQ1 foi mais estável nos tecidos ou órgãos testados: meristema, inflorescência, folha, colmo e raízes tratadas com alto e baixo fósforo. Tendo o gene UbiQ1 como referência, a expressão relativa dos genes transportadores de fosfato de alta afinidade de cana-de-açúcar PT7 e PT8 foi avaliada em amostras de raiz fertilizadas com alto ou baixo Pi, inoculadas ou não com fungo micorrízico e coletadas aos 58 dpi. Esses dois genes pertencem à família Pht1 de transportadores de fosfato e são similares aos ortólogos de arroz ORYsa;tPht1;7 e ORYsa;Pht1;8. Sob a deficiência de Pi, o transportador de fosfato PT7 foi induzido em raízes não colonizadas; já nas micorrízicas foi pouco expresso, sendo que altas taxas de colonização radicular suprimiram a expressão do PT7. O gene PT8 pouco variou sua expressão, sendo sutilmente mais expresso em plantas micorrízicas do que nas não micorrízicas sob o suprimento de BP. Estes resultados indicam que o PT7 é induzido em raízes sob estresse por fósforo e provavelmente associado à absorção radicular de Pi. Enquanto o gene PT8 possui uma modulação pouco variável provavelmente envolvido na manutenção do fluxo ou homeostase de Pi, possivelmente associado com a absorção radicular e micorrízica de fosfato. O PT7 e o PT8 foram expressos em tratamentos de médio/longo prazo, apresentando expressão ou indução em resposta a privação por Pi, o que é consistente com a função proposta de aquisição e mobilização de Pi para esta família de transportadores. A cana-de-açúcar micorrízica mostrou alta plasticidade de resposta ao BP / Plants display a wide array of physiological adaptations to low soil phosphorus (Pi) availability. This work discussed physiological and energetic costs associated with these strategies, focusing on sugarcane responses to Pi availability during the development of arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis. Such costs are important components of adaptation to low phosphorus soils affecting phosphorus acquisition and leve, growth and soluble sugars concentration in plant tissues. Sugarcane plants were grown in pots, with or without AM (Glomus clarum), and with low (20 mg kg-1) or high (200 mg kg-1) phosphorus supply. Roots and shoots were harvest for analysis after 14, 30, 44 and 58 days post-inoculation (dpi) with the fungus Glomus clarum,. The low Pi supply caused Pi deficiency in mycorrhizedl or non-mycorrhizedl plants. The efficiency of Pi absorption, indicated by shoot Pi accumulation in correlation to root biomass, suggested that root and mycorrhizal Pi absorption were similar, regardless of the Pi doses. Phosphorus availability did not affect the whole-plant biomass, and plants under low Pi supply, used more efficiently this nutrient. On the other hand, mycorrhized plants supplemented with low Pi presented the highest root growth and shoot reduction, resulting in high root:shoot ratio. At 58 dpi, glucose, fructose and sucrose concentrations in leaves of mycorrhized plants were 3.8, 2.3 and 2.4-fold higher respectively, than in non-mycorrhizedl plants. These results suggested that, under these experimental conditions, mycorrhizal symbiosis establishment was not a typical mutualistic association affecting sugarcane growth profile and allometry, when cultivated under low Pi. The photosynthate levels of leaves from mycorrhizd plants indicated an increase in photossynthetic rate but withut resulting in higher macrobiont growth. The quantitative amplification of reversed transcripts (RT-PCR) technology has become a method of choice for functional gene validation, with sensitiveness, accurate quantification and high-throughput. The relative quantification is easier determined by relative expression in comparison to a constitutively expressed refernce gene. Here, the expression variability of a sugarcane actin gene (Actin) glyceraldehydo phosphate dehydrogenase (GAPDH), tubulin (Tubulina), and ubiquitins (UbiQ1 and UbiQ2) from various tissues were analysed and compared based on the ranking list from the Genorm and NormFinder softwares. Expression analysis based on the REST software gave the proper statistic validation. UbiQ1 was the most stable gene among the candidate gen-references along the various tissues or organs tested: meristem, inflorescence, leaf, stem and roots treated with high and low phosphorus. Considering UbiQ1 as the reference gene, the relative expression of the sugarcane high-affinity phosphate transporters genes PT7 and PT8 were assessed from roots fertilized with low Pi or high Pi , inoculated or not with the mycorrhizal fungus, harvest 58 dpi. Both genes belong to the Pht1 Pi transporter and share similarity with the rice orthologs ORYsat;Pht1;7 and ORYsat;Pht1;8. Under Pi deficiency, the phosphate transporter PT7 was induced in non-colonized roots, but less expressed in mycorrhizedl ones, with high root colonization rate suppressing PT7 expression. PT8 showed low variability in expression, slightly more expressed in mycorrhized plants than in non-mycorhized plants under low Pi supply. These results indicated that PT7 was induced in Pi stressed roots, and possibly associated with the root Pi uptake, while PT8 had limited modulation in expression and probably involved on Pi fluxes or homeostasis, likely associated with both root and mycorrhizal phosphate uptake pathways. PT7 and PT8 were induced during medium/long-term treatments, showing induction or constant expression in both acquisition and mobilization of Pi in response to Pi deprivation, which is consistent with the proposed role of this tranporter family. Mycorrhizedl sugarcane showed a highly plastic response to low Pi

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) está associado etiologicamente à duas principais manifestações clínicas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 2 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem doenças associadas ao vírus, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Os linfócitos T CD4+ são os principais reservatórios do HTLV-1 in vivo e possuem uma participação importante na resposta imunológica dirigida a este retrovírus. Essas células são ativadas precocemente durante a infecção pelo HTLV-1 e auxiliam na resposta dos linfócitos T CD8 citotóxicos (CTLs), bem como na produção de anticorpos. No presente estudo, foi avaliado o perfil de expressão gênica global dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores assintomáticos (HAC), pacientes com HAM/TSP e de indivíduos sadios (CT) por meio da metodologia de microarray. Os linfócitos T CD4+ utilizados foram isolados por separação imunomagnética e foram realizados microarrays de doze amostras individuais: quatro amostras do grupo CT, quatro amostras do grupo HAC e quatro do grupo HAM/TSP. Os dois últimos grupos continham duas amostras com alta e duas com baixa expressão da proteína Tax. As análises de agrupamento hierárquico revelaram que o perfil de expressão gênica dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 difere dos indivíduos do grupo CT pela formação de dois agrupamentos distintos. Ademais, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 se agruparam de acordo com o estado clínico e independente da expressão de Tax. Foram realizadas as comparações entre os grupos CT vs. HAC, CT vs. HAM/TSP e HAM/TSP vs. HAC e os dados demonstraram que 221, 254 e 70 genes estavam diferencialmente expressos, respectivamente. Além disso, foram observados 86 genes presentes nas intersecções entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes entre CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC e apenas um gene entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. Estes genes diferencialmente expressos estavam associados à citocinas, lise e migração celular. Os achados foram validados por PCR quantitativo em um total de 23 indivíduos assintomáticos, 17 com HAM/TSP e 25 indivíduos sadios. A validação evidenciou o aumento da expressão dos genes PXN, CXCR4, PRF1 e Foxp3 no grupo HAM/TSP em relação ao grupo HAC, além do aumento de IL-27 nos indivíduos do grupo HAC comparados com os indivíduos do grupo HAM/TSP. Adicionalmente, foi realizada a quantificação dos níveis protéicos de PRF1, GZMB, CXCR4 por citometria de fluxo. Entretanto, nenhuma diferença foi observada entre os diferentes grupos analisados. Ainda, por meio de citometria de fluxo, a população de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+, bem como CD4+Foxp3+ foram analisadas e observou-se maiores níveis de expressão de CD4+Foxp3+ nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. A porcentagem de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ não mostrou diferença significativa entre os três grupos comparados. Os resultados evidenciados neste projeto ressaltam a importância das células CD4+ no controle da resposta imune contra a infecção pelo HTLV-1. O aumento na expressão gênica de PXN e CXCR4, que fazem parte da via de sinalização de CXCR4, sugere a ocorrência de migração celular nos indivíduos com HAM/TSP, provavelmente para o SNC. Além disso, o aumento das células Treg parecem suprimir a atividade das células T CD8+ pela via perforina/granzima, que por sua vez aumentaria a carga proviral, aumentando assim o risco de desenvolvimento de HAM/TSP. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) is etiologically associated with two major diseases: the adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and the HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). About 2 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1-related diseases, while the majority remains life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is not well elucidated. CD4+ T cells are the predominant subset of cells infected with HTLV-1 in vivo and they are also important as effector cells against the infection. These cells are early activated during infection with HTLV-1 and assist the response of CD8 cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and antibody production. To identify genes differentially expressed among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied the microarray using CD4+ T cells isolated from these individuals. The CD4+ T lymphocytes were isolated by magnetic cell separation system and twelve samples underwent microarray analysis, as follows: 4 CT, 4 HAC and 4 HAM/TSP samples. Two samples had high tax expression and two samples had low tax expression for both infected groups. The hierarchical clustering analysis showed that the gene expression profile of infected individuals is distinct from healthy individuals because two separate clusters were observed. HTLV-1-infected individuals clustering meets with patients clinical status. However, HTLV-1 CD4+ T cells clustering did not correlate with Tax protein expression. We found 221 genes differently expressed between CT and HAC groups, 254 genes between CT and HAM/TSP and 70 genes between HAC and HAM/TSP. Moreover, we observed 86 genes differently expressed in the intersections between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes between CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC and only one gene between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. These genes were associated with cytokines, cell lysis and cell migration. These results were validated by quantitative PCR in 23 HTLV-1 asymptomatic carriers, 17 patients with HAM/TSP and 25 healthy individuals. The validation revealed increased levels of expression of the genes PXN, CXCR4, PRF1, and Foxp3 in the HAM/TSP group compared with HAC group. IL-27 gene expression was increased in HAC group when compared with HAM/TSP group. Additionally, we performed the protein quantification of PRF1, GZMB, and CXCR4 by flow cytometry. However, no difference was observed among the three groups. We also analyzed CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ and CD4+Foxp3+ populations by flow cytometry. There was an increase of CD4+Foxp3+ expression in HTLV-1-infected individual. No differences were observed in CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ population among the three groups. The results shown in this project highlight the importance of CD4+ cells in controlling the immune response against HTLV-1. The gene expression profile of PXN and CXCR4 was increased. These genes are related to CXCR4 signaling pathway that can result in CD4+ T cells migration, probably to the central nervous system. It is also suggested that Treg cells can suppress the T CD8+ activity through perforin/granzyme pathway. This pathway enhances the proviral load increasing the risk of HAM/TSP development.

Apesar do intenso interesse na regulação metabólica e evolução das vias produtoras de ATP, o porquê de a maioria dos microorganismos multicelulares metabolizarem glicose através de respiração, ao invés da fermentação, ainda permanece sem resposta. Um desses microorganismos é o fungo celulolítico Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina. Usando análise EST e microarrays de cDNA, foi estabelecido, em T. reesei, que a expressão dos genes que codificam as enzimas do ciclo de TCA é programada de tal modo a favorecer a oxidação de piruvato pelo ciclo de TCA, ao invés de sua redução a etanol, através da fermentação. Além disso, os resultados indicam que acetaldeído pode ser convertido a acetato, e não a etanol, prevenindo a regeneração de NAD+, um produto chave requerido para o metabolismo anaeróbico. Os estudos também mostram que a maquinaria de controle regulatório por glicose, foi, provavelmente, objeto de pressão evolutiva, a qual dirigiu o fluxo metabólico à respiração, e não à fermentação. / Despite the intense interest in the metabolic regulation and evolution of the ATP-producing pathways, the long-standing question of why most multicellular microorganisms metabolize glucose by respiration rather than fermentation remains unanswered. One such microorganism is the cellulolytic fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina). Using EST analysis and cDNA microarrays, we find that in T. reesei expression of the genes encoding the enzymes of the TCA is programmed in a way that favors the oxidation of pyruvate via the TCA cycle rather than its reduction to ethanol by fermentation. Moreover, the results indicate that acetaldehyde may be channeled into acetate rather than ethanol, thus preventing the regeneration of NAD+, a pivotal product required for anaerobic metabolism. The studies also point out that the regulatory machinery controlled by glucose was most probably the target of evolutionary pressure that directed the flow of metabolites into respiratory metabolism rather than fermentation.

A avicultura brasileira tem alcançado altos índices de desempenho na produção de carne e ovos, como resultado da atualização constante de tecnologias no setor. A biotecnologia vem contribuindo nesse sentido, atuando especialmente em programas de seleção de animais com maior potencial de desenvolvimento e crescimento. Como toda a fisiologia animal é controlada direta e/ou indiretamente pela hipófise e hipotálamo, este trabalho propôs identificar e analisar genes expressos nestas estruturas de galinhas de duas linhagens divergentes quanto ao potencial de crescimento e avaliar a expressão dos genes correspondentes a transcritos cuja identidade não pôde ser revelada (sem similar nos bacos de dados), uma vez que estes podem representar possíveis genes novos. Para isto, foram construídas e analisadas bibliotecas a partir da hipófise e hipotálamo de aves de 21 dias de idade de uma linha macho de corte (TT) e uma linhagem de postura (CC), provenientes da Embrapa Suínos e Aves. Um total de 4.286 ESTs válidas foi obtido (no mínimo150 pb com qualidade PHRED acima de 20), correspondendo a 2.133 ESTs da biblioteca da linhagem TT e 2.153 ESTs da biblioteca da linhagem CC. O exercício de montagem, via programa Cap3, revelou 3.074 seqüências únicas, sendo 1.643 da biblioteca da linhagem TT e 1.649 da CC. Estas seqüências únicas foram automaticamente classificadas, de acordo com as categorias do GeneOntology, sendo que as seqüências de ambas as bibliotecas apresentaram uma distribuição similar entre os termos. Após montagem das ESTs e análise do padrão de expressão digital das seqüências constituintes, dos 389 contigs obtidos, 194 foram compostos por seqüências diferencialmente expressas entre as bibliotecas. Foram detectados 28 contigs contendo SNPs linhagem específicos, sendo 52 SNPs TT específicos e 25 CC específicos. Um total de 146 ESTs não pôde ter sua identidade revelada, porém destas, 133 puderam ser localizadas no genoma da galinha e apresentaram pelo menos uma fase de leitura aberta (ORF). Após análise de expressão gênica, os genes correspondentes a 78 destas ESTs sem identidade apresentaram-se diferencialmente expressos entre pelo menos dois dos tecidos de aves de uma linhagem comercial de corte de 21 dias de idade estudados: hipófise, hipotálamo, cérebro, fígado e músculo. Os resultados apresentados são promissores e merecem ser investigados em estudos futuros com o objetivo de identificar marcadores moleculares para programas de seleção e melhoramento animal. / The brazilian aviculture has reached a high development level in both meat and egg production as a result of constant technological atualization in the sector. Biotechnology can contribute in this way acting in selection programs of animals that show higher growth and development potential. The global animal physiology is direct or indirectly controlled by pituitary and hypothalamus. The aim of this work was to identify and analyse genes expressed in these structures of two divergent line chickens according to growth potential and evaluate the gene expression of corresponding transcripts classified as &#34;no hit&#34;, once these ESTs could represent new genes. In this way, two pituitary and hypothalamus libraries of 21 days broiler (TT) and a layer (CC) chickens supplied by Embrapa Swine and Poultry National Research Center were constructed and analysed. A total of 4,286 valid ESTs was obtained (showing at least 150 bp with PHRED quality above 20) corresponding to 2,133 ESTs of TT line library and 2,153 ESTs of CC line library. The clustering process by Cap3 resulted in 3,074 unique sequences corresponding to 1,643 TT library sequences and 1,649 of CC sequences. These unique sequences were automatically annotated according GeneOntology categories and both library sequences showed a similar distribution between the terms. After ESTs clustering and northern digital analysis, 389 contigs were obtained &#150; 194 of them showed differentially expressed sequences between the libraries. A total of 28 contigs showed line specific SNPs, corresponding to 52 TT specific SNPs and 25 CC specific SNPs. 146 ESTs were classified as &#34;no hit&#34; but 133 of these sequences were localized in chicken genome and showed open reading frame (ORF). After gene expression analysis, the genes of 78 &#34;no hit&#34; ESTs showed different expression level between the five tissues of commercial broilers with 21 days old: pituitary, hypothalamus, brain, liver and muscle. These results are promising and must be more investigated in future studies to identify molecular markers for use in animal selection and improvement programs.