Vários genes já foram descritos com a capacidade de intervir na regulação do metabolismo energético, perda de peso, além da manutenção e estabilidade da gordura corporal, atuando no controle de diferentes vias metabólicas. Estudos têm mostrado claramente que a restrição energética é capaz de alterar a expressão gênica, influenciando a perda ponderal em pessoas com obesidade após diferentes tratamentos. Devido a maior facilidade no acesso por meio de biópsia, foi optado para o presente estudo a coleta de tecido adiposo subcutâneo. Portanto, o objetivo do presente estudo foi verificar a expressão dos genes ADRB3, UCPs, PLIN1, PPARG2 em tecido adiposo subcutâneo abdominal de mulheres com obesidade grau III, antes e após intervenção dietética hipocalórica e associar com variáveis antropométricas, taxa metabólica de repouso (TMR) e oxidação de substratos. A amostra foi composta por 11 mulheres com obesidade grau III submetidas à intervenção dietética por seis semanas e 10 mulheres eutróficas. Tratou-se de um estudo longitudinal, no qual foram coletadas medidas antropométricas de peso, estatura, índice de massa corporal (IMC) e circunferência abdominal (CA), composição corporal (massa corporal magra e massa gorda) por bioimpedância elétrica, TMR por calorimetria indireta e análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Houve diminuição significante de peso, IMC, massa corporal magra, massa gorda e TMR após intervenção dietética, porém, não verificou-se diferença estatisticamente significante quando a taxa metabólica de repouso foi ajustada pelo peso e massa corporal magra. Ao comparar os dois grupos do estudo, verificou-se diferença significante para os indicadores de peso, IMC, CA, massa corporal magra, massa gorda, TMR e oxidação de lipídio, tanto no momento pré como no pósintervenção dietética. A expressão do gene UCP3 apresentou redução significante após 6 semanas de intervenção dietética hipocalórica (p=0,004). Houve correlação positiva entre a expressão do gene UCP2 e perda de peso em quilogramas (r=0,645, p=0,032) e porcentagem (r=0,727, p=0,011) no grupo de mulheres que receberam dieta hipocalórica. Já a análise da correlação entre a expressão dos genes do estudo com a oxidação de substratos antes e após intervenção dietética, verificou-se resultados positivos dos genes UCP3, PLIN1 e PPARG2 na oxidação de carboidrato e negativos dos genes PLIN1 e PPARG2 na oxidação de lipídios. Conclui-se que a intervenção dietética hipocalórica proporciona perda de peso, diminuição de medidas antropométricas e influencia na expressão dos genes estudados em mulheres com obesidade grau III. / Several genes have been described with the ability to intervene in the regulation of energy metabolism, loss of weight and stability in addition to maintaining body fat, acting on the control of different metabolic pathways. Studies have clearly shown that caloric restriction can alter gene expression influencing the weight loss in people with obesity after different treatments. Due to easier access through biopsy was chosen for this study collecting subcutaneous adipose tissue. Therefore, the aim of this study was to investigate the expression of genes ADRB3, UCPs, PLIN1, PPARG2 in abdominal subcutaneous adipose tissue of women with obesity grade III before and after hypocaloric dietary intervention and associate with anthropometric, metabolic rate (RMR) and substrate oxidation. The sample consisted of 11 women with obesity grade III submitted to dietary intervention for six weeks and 10 healthy women. This was a longitudinal study in which anthropometric measurements were taken of weight, height, body mass index (BMI) and waist circumference (WC), body composition (lean body mass and fat mass) by bioelectrical impedance, TMR calorimetry indirect and gene expression analysis by real-time PCR. There was a significant decrease in weight, BMI, lean body mass, fat mass and TMR after dietary intervention, however, there was no statistically significant difference when the resting metabolic rate was adjusted for weight and lean body mass. When comparing the two study groups, there was difference for weight indicators, BMI, WC, lean body mass, fat mass, TMR and lipid oxidation in both the pre and post time dietary intervention. The expression of UCP3 gene showed a significant reduction after 6 weeks of hypocaloric dietary intervention (p=0,004). There was a positive correlation between the expression of UCP2 gene and loss of weight in kilograms (r=0,645, p=0,032) and percentage (r=0,727, p=0,011) in the group of women who received low-calorie diet. However, the analysis of the correlation between the expression of genes to study the oxidation of substrates before and after dietary intervention, there were positive results of UCP3 gene, PLIN1 and PPARG2 in carbohydrate oxidation and the negative PLIN1 and PPARG2 genes in lipid oxidation. We conclude that hypocaloric dietary intervention provides weight loss, reduction of anthropometric measures and influences the expression of genes studied in women with morbid obesity.

A obesidade surge como um distúrbio neuroendócrino, com atuação de fatores de risco ambientais e genéticos, e recentemente centenas de genes tem sido associados ao controle do peso corporal e metabolismo energético. Frente à alta incidência e prevalência de obesidade na população, empregam-se estratégias com a finalidade de elevar a eficácia de perda de peso, como por exemplo, o uso de compostos bioativos presentes nos alimentos, com destaque para 3-galato de epigalocatequina (GEGC) presente no chá verde. As dietas ricas em polifenóis apresentam efeitos antiobesogênicos, possivelmente por sua interação direta ou indireta com o tecido adiposo. O presente estudo teve como objetivo verificar a expressão de UCPs, PLIN1, PPARG2 e ADRB3 em tecido adiposo subcutâneo abdominal de mulheres com obesidade grau III antes e após oito semanas de suplementação com extrato de chá verde descafeinado e associar com variáveis antropométricas, taxa metabólica de repouso (TMR), oxidação de substratos e consumo alimentar. A amostra foi composta por 11 mulheres com obesidade grau III submetidas à suplementação de 450 mg de chá verde por oito semanas (grupo intervenção) e 10 mulheres eutróficas (grupo controle). Tratou-se de um estudo longitudinal e foram coletadas medidas antropométricas de peso e estatura para cálculo do Índice de Massa Corporal (IMC); circunferência abdominal (CA); composição corporal (massa livre de gordura e massa gorda) por bioimpedância elétrica; ingestão alimentar por recordatórios de 24h, TMR por calorimetria indireta e análise de expressão gênica por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR). Após oito semanas de suplementação, o grupo intervenção não apresentou alterações nas variáveis antropométricas, de composição corporal, TMR e oxidação de substratos. Ao comparar o grupo controle e intervenção, observou-se no primeiro valores menores de IMC, CA, massa livre de gordura, massa gorda, TMR e oxidação de lipídios. Dos genes analisados, houve aumento da expressão de UCP3 após o período de suplementação (p=0,026). As análises de correlação e regressão linear mostraram que as mulheres com obesidade grau III antes da suplementação de chá verde que expressavam mais UCP2 possuíam menor peso (p=0,043) e massa gorda (p=0,045). Ainda, às que ingeriam mais calorias por dia, exibiram maior expressão de UCP2 (p=0,045). Conclui-se que a suplementação de extrato de chá verde descafeinado, por 8 semanas, em mulheres com obesidade grau III, não altera a expressão de UCP1, UCP2, PLIN1, PPARG2 e ADRB3, o que poderia explicar a manutenção das variáveis antropométricas, composição corporal, taxa metabólica de repouso e oxidação de substratos. Por outro lado, há o aumento da expressão de UCP3 após a intervenção, sugerindo um possível mecanismo de adaptação desse gene atuando na manutenção do peso. / Obesity emerges as neuroendocrine disorder, with action of environmental and genetic risk factors, and recently hundreds of genes have been associated with management of body weight and energy metabolism. As obesity rates continue to climb in population, an increased number of strategies are employed in order to improve effectiveness of weight loss, such as use of bioactive compounds in foods, especially Epigallocatechin gallate (EGCG) present in green tea. Polyphenol-rich foods have anti-obesogenic effects, possibly by its direct or indirect interaction with adipose tissue. This study aimed to verify expression of UCPs, PLIN1, PPARG2 and ADRB3 in abdominal subcutaneous adipose tissue of women with obesity grade III before and after eight weeks of supplementation with decaffeinated green tea extract and associate with anthropometric, metabolic rate (RMR), substrate oxidation and energy intake. The sample consisted of 11 women with obesity grade III submitted to supplementation of 450 mg of green tea for eight weeks (intervention group) and 10 women eutrophic (control group). This was a longitudinal study and were collected anthropometric measurements of weight and height to calculate body mass index (BMI); abdominal circumference (AC); body composition (fat-free mass and fat mass) by bioelectrical impedance analysis; energy intake by 24-hour dietary recalls; TMR by indirect calorimetry and gene expression analysis by real-time PCR (RT-qPCR). After eight weeks of supplementation, the intervention group showed no changes in anthropometric variables, body composition, TMR and substrate oxidation. When comparing control group and intervention, is noted that first had lower values of BMI, WC, fat-free mass, fat mass, RMR and oxidation of lipids. Genetic analysis show an increased expression of UCP3 gene after the supplementation period (p = 0.026). The correlation and linear regression analysis revealed that women with obesity grade III before green tea supplementation that expressed more UCP2 had lower weight (p = 0.043) and fat mass (p = 0.045). Still, those that had higher energy intake, exhibited increased expression of UCP2 (p = 0.045). We conclude that the decaffeinated green tea extract supplementation for 8 weeks in women with obesity grade III, does not alter the expression of UCP1, UCP2, PLIN1, PPARG2 and ADRB3, which could explain maintenance of anthropometric variables, composition body, resting metabolic rate and substrate oxidation. Moreover, there is increased UCP3 expression after supplementation, suggesting a possible adjustment mechanism of this gene acting in weight management.

O presente projeto analisou a expressão gênica de Amblyomin -X, uma proteína com potencial terapêutico expressa em Escherichia coli BL21(DE3), por intermédio de um vetor de expressão plasmideal induzido por IPTG ( Isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside). A quantificação da expressão gênica foi realizada utilizando a técnica de RT-qPCR absoluta. A molécula Amblyomin-X corresponde a um inibidor de serino protease do tipo Kunitz, que apresenta atividade antitumoral e anticoagulante. Devido a sua importância terapêutica, fez-se necessário implementar um protocolo de escalonamento de produção, utilizando biorreatores. A informação sobre expressão gênica pode ajudar a interpretar o funcionamento do microrganismo durante os cultivos em frascos agitados e biorreatores, auxiliando na obtenção de protocolos de cultivo. A partir do momento da indução do gene Amblyomin-X, a bactéria Escherichia coli recombinante direciona grande parte de seu metabolismo para a expressão e produção dessa proteína, que é expressa em forma de corpos de inclusão insolúveis. As proteínas em forma de corpos de inclusão insolúveis permitem uma fácil extração do produto, porém, dificulta na quantificação por técnicas cromatográficas, por esse motivo, buscou-se também uma correlação entre a expressão gênica e a síntese protéica de Amblyomin-X, com o objetivo de validar a quantificação por RT-qPCR como uma forma indireta de quantificação desse tipo de produto protéico. Poucos estudos abordam a correlação existente entre a expressão gênica e a síntese protéica de um gene e sua proteína, e essa comparação poderia, também, revelar aspectos importantes entre a transcrição e a tradução de proteínas heterólogas em microrganismo. Foram realizados experimentos em frascos agitados em duas diferentes temperaturas indução (37°C e 30°C), com a concentração do indutor IPTG de 1 mM e concentração da biomassa (X) de 0,2 g/L. Para os experimentos em biorreatores utilizou-se o ponto central do planejamento experimental com concentração de IPTG 1mM e mais duas condições com concentração de IPTG 0,1 mM e 2mM. Foi encontrada uma grande similaridade entre os gráficos das análises cinéticas referentes a expressão gênica e a velocidade específica de formação do produto (qP). Não foi possível Identificar uma semelhança entre o perfil referente a análise cinética da expressão gênica comparada com a síntese protéica. Esses resultados sugerem que a expressão gênica apresenta uma cinética semelhante a velocidade específica de formação do produto e não necessariamente a concentração de proteína. Não foram encontradas correlações significativas nas análises de cada momento após a indução, exceto pelo ponto t4 do biorreator 14, quando foram correlacionadas a expressão gênica e a velocidade de formação do produto (r=0,998 e valor P=0,03). / The present work analysed the gene expression of Amblyomin-X, a potential therapeutic protein expressed in a recombinant Escherichia coli with a plasmid vector inducible by IPTG ( Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside). The gene expression was quantified by absolute RT-qPCR method. Amblyomin-X is a Kunitz-type serine protease inhibitor which demonstrates antitumor and anticoagulant activity. Due to Amblyomin therapeutic importance, it was necessary to implement a production protocol using bioreactors. The information on gene expression can helps to understand the microorganism behavior during the cultures in shaken flasks and bioreactors. From the moment of the induction of the gene Amblyomin-X, the recombinant Escherichia coli directs its metabolism for expression and production of this protein. The Amblyomin-X protein is expressed as insoluble inclusion bodies. Insoluble inclusion bodies proteins can be easyly extracted from the cell, however it difficults its quantification by chromatographic techniques. Because of that, besides analysis of the gene expression, by RT-qPCR method, we tried to correlate the gene expression with their protein levels concentration, whose objective was implement the RT-qPCR as an indirect method to quantify these type of protein product. Few studies correlate the gene expression in their protein, and this comparison can contribute to reveal important aspects between transcription and translation of heterologous proteins in Escherichia coli, for the achievement of scale up process in biorreactors. Therefore, the quantification by RT-qPCR, represents a most secure way to understand the expression of heterologous proteins in recombinant systems. Experiments were performed in shaken flasks at two different induction temperatures (37 °C and 30 °C), 0,2 g/L of biomass (X) at the induction moment with IPTG 1mM. Biorreactors are performed with three different IPTG concentrations (0,1 mM, 1 mM and 2 mM). A great similarity was found between the graphs of the kinetic analyzes concerning gene expression and the specific rate of product formation (qP). It was not possible to identify a similarity between the profile concerning kinetic analysis of gene expression compared to protein synthesis. These results suggest that gene expression exhibits similar kinetics to the specific rate of product formation and not necessarily to the protein concentration. were found no significant correlations in the analyzes of each moment after induction, except for point t4 of the bioreactor 14, when the gene expression and the rate of the product formation were positively correlated (r = 0.998 and P value = 0.03).

A isoenzima citocromo P450 3A5 (CYP3A5) tem um papel importante na biotransformação de compostos endógenos e xenobióticos. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) do gene CYP3A5 foram associados com variações na expressão gênica e atividade enzimática que podem modificar o metabolismo de vários fármacos. Com a finalidade de investigar a influência de SNPs do CYP3A5 sobre a expressão de RNAm e a resposta a atorvastatina, foram selecionados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os pacientes HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). Amostras de sangue periférico foram coletadas antes e após o tratamento para análise do perfil lipídico sérico, e extração de DNA genômico e RNA total. Os SNPs CYP3A5*3C e CYP3A5*6 foram analisados por PCR-RFLP e o CYP3A5*1D por sequenciamento de DNA. A expressão de RNAm do CYP3A5 em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foi analisada por PCR em tempo real. No grupo HC, os alelos CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foram mais frequentes em brancos (*3C: 84,9% e *1D 84,8%) que em afro-descendentes (*3C: 47,8% e *1D: 55,2%, p<0,01). Os alelos *3C e *1D estavam em desequilíbrio de ligação. A frequência do alelo CYP3A5*6 foi maior em negros (6,8%) que em brancos (0,6%, p=0,002). Não houve associação entre os SNPs do CYP3A5 e o perfil lipídico basal nos grupos NL e HC. Os HC brancos portadores do haplótipo CYP3A5*3A/*3A (alelos *3C e *1D combinados) apresentaram menor redução de colesterol total e LDL-c após o tratamento com atorvastatina do que os portadores dos haplótipos não-CYP3A5*3A/*3A (p<0,05). A expressão de RNAm de CYP3A5 em CMSP aumentou em resposta a atorvastatina (p<0,05) somente nos portadores de haplótipo CYP3A5*3A/*3A. Esses resultados são sugestivos de que os SNPs CYP3A5*3C e CYP3A5*1D são associados com a expressão gênica do CYP3A5 e a resposta de redução de colesterol a atorvastatina. / The cytochrome P450 isoenzyme 3A5 (CYP3A5) has an important role on biotransformation of endogenous compounds and xenobiotics. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the CYP3A5 gene have been associated with variations on gene expression and enzyme activity that can modify the metabolism of several drugs. In order to evaluate the influence of CYP3A5 SNPs on RNAm expression and response to atorvastatin, 99 mormolipidemic (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC) individuals have been enrolled in this study. HC patients were treated with atorvastatin (10 mg/day/four weeks). Blood samples were collected before and after treatment for serum lipids analyses, genomic DNA and total RNA extraction. CYP3A5*3C, and CYP3A5*6 SNPs were analyzed by PCR-RFLP. CYP3A5*1D was analyzed by direct sequencing. CYP3A5 RNAm expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was evaluated by Real Time PCR. In HC group, the frequencies of CYP3A5*3C and CYP3A5*1D alleles were higher in white individuals (*3C: 84.9% and *1D 84.8%) that in blacks (*3C: 47.8% and *1D: 55.2%, p<0.01). CYP3A5*3C and *1D alleles were in linkage desequilibrium. CYP3A5*6 allelle frequency was higher in blacks (6.8%) that in white individuals (0.6%, p=0.002). There was no association between CYP3A5 SNPs and baseline lipid profile in NL and HC groups. White HC carriers of CYP3A5*3A/*3A haplotype (*3C and *1D combined alleles) have lower total cholesterol and LDL-c response to atorvastatin than non-CYP3A5*3A/*3A carriers (p<0.05). CYP3A5 RNAm expression on PBMC increased in response to atorvastatin (p<0.05) only in CYP3A5*3A/*3A haplotype carriers. These results are suggestive that CYP3A5*3C and CYP3A5*1D SNPs are associated with CYP3A5 gene expression and cholesterol-lowering response to atorvastatin.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores de proteínas presentes na maioria dos eucariotos. Esses RNAs regulam a expressão gênica em nível pós-transcricional através do silenciamento de mRNAs-alvo que possuem sítios complementares às suas sequências, atuando em praticamente todos os processos celulares. Embora a estrutura e função dos miRNAs estejam bem caracterizadas, aspectos relacionados à sua organização genômica, evolução e atuação em doenças são tópicos que apresentam enormes lacunas. Nesta tese, utilizamos abordagens computacionais para investigar estes temas em três trabalhos. No primeiro, processamos e integramos um vasto volume de dados publicamente disponíveis referentes aos miRNAs e genes codificadores de proteínas para cinco espécies de vertebrados. Com isso, construimos uma ferramenta web que permite a fácil inspeção da organização genômica dos miRNAs em regiões inter e intragênicas, o acesso a dados de expressão de miRNAs e de genes codificadores de proteínas (classificados em genes hospedeiros e não hospedeiros de miRNAs), além de outras informações pertinentes. Verificamos que a ferramenta tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica e acreditamos que ela possa facilitar a geração de hipóteses associadas à regulação dos miRNAs, principalmente quando estão inseridos em genes hospedeiros. No segundo estudo, buscamos compreender como o contexto genômico e a origem evolutiva dos genes hospedeiros influenciam a expressão e evolução dos miRNAs humanos. Nossos achados mostraram que os miRNAs intragênicos surgem preferencialmente em genes antigos (origem anterior à divergência de vertebrados). Observamos que os miRNAs inseridos em genes antigos têm maior abrangência de expressão do que os inseridos em genes novos. Surpreendentemente, miRNAs jovens localizados em genes antigos são expressos em um maior número de tecidos do que os intergênicos de mesma idade, sugerindo uma vantagem adaptativa inicial que pode estar relacionada com o controle da expressão dos genes hospedeiros, e como consequência, expondo-os a contextos celulares e conjuntos de alvos diversos. Na evolução a longo prazo, vimos que genes antigos conferem maior restrição nos padrões de expressão (menor divergência de expressão) para miRNAs intragênicos, quando comparados aos intergênicos. Também mostramos possíveis associações funcionais relacionadas ao contexto genômico, tais como o enriquecimento da expressão de miRNAs intergênicos em testículo e dos intragênicos em tecidos neurais. Propomos que o contexto genômico e a idade dos genes hospedeiros são fatores-chave para a evolução e expressão dos miRNAs. Por fim, buscamos estabelecer associações entre a expressão diferencial de miRNAs e a quimioresistência em câncer colorretal utilizando linhagens celulares sensíveis e resistentes às drogas 5-Fluoruracil e Oxaliplatina. Dentre os miRNAs identificados, o miR-342 apresentou níveis elevados de expressão nas linhagens sensíveis à Oxaliplatina. Com base na análise dos alvos preditos, detectamos uma significativa associação de miR-342 com a apoptose. A superexpressão de miR-342 na linhagem resistente SW620 evidenciou alterações na expressão de genes da via apoptótica, notavelmente a diminuição da expressão do fator de crescimento PDGFB, um alvo predito possivelmente sujeito à regulação direta pelo miR-342. / MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs found in most eukaryotic species. These RNAs regulate gene expression at post-transcriptional level by silencing target mRNAs through base-pairing of complementary sequences, thus acting on virtually all cellular processes. Although the structure and function of miRNAs are well understood, several aspects related to their genomic organization, evolution and involvement with diseases are largely underexplored. In this thesis, we employed computational methods to investigate such issues in three different studies. In the first one, we have processed and integrated a large amount of public data related to miRNAs and coding genes for five vertebrate species. Then, we developed a webtool to allow the analysis of the miRNA genomic context in inter and intragenic regions, the access of miRNA and gene expression data (classified as host and non-host genes), as well as other relevant information. We noticed that the webtool has been largely used by the scientific community, and we believe that it can facilitate hypothesis generation related to miRNA regulation, especially when they are within host genes. In the following study, we sought to understand how the genomic context and the evolutionary origin of host genes can affect the expression and evolution of human miRNAs. Our findings showed that intragenic miRNAs are preferentially embedded within old host genes (originated before the split of vertebrates). We observed that miRNAs within old genes are more broadly expressed than those within young genes. Surprisingly, young miRNAs within old genes were expressed in more tissues than their intergenic counterparts, suggesting an initial adaptive advantage which might be related to their hosts expression control, and as a consequence, exposing them to a more diverse cellular contexts and target genes. In the long run, we found that old host genes lead to expression constraints (lower expression divergence) between species for intragenic miRNAs, in respect to intergenic ones. We also showed possible functional associations related to miRNA genomic context, such as the enrichment of young intergenic miRNAs in testis, while young intragenic miRNAs were enriched in neural tissues. Thus, we propose that the genomic context and the age of the host genes are key factors in shaping the expression and evolution of miRNAs. Finally, we sought to establish associations between differential expression of miRNAs and chemoresistance in colorectal cancer using resistant and sensitive cell lines to 5-Fluoruracil and Oxaliplatin. Among differentially expressed miRNAs, miR-342 was highly expressed in sensitive cell lines to Oxaliplatin. Based on target prediction analysis, miR-342 is likely associated with apoptosis. The induced overexpression of miR-342 in SW620, a cell line resistant to Oxaliplatin, changed the expression levels of genes linked to the apoptosis pathway, notably the downregulation of PDGFB growth factor, which is a predicted target possibly subjected to direct regulation by miR-342.

Eimeria tenella é umas das principais espécies que causam a coccidiose aviária. Para se estudar o perfil de expressão gênico quantitativo em estágios infectantes bibliotecas de LongSAGE foram geradas a partir de merozoítos e esporozoítos. Mais de 35.000 tags foram obtidas, das quais, 9.516 eram únicas. Para a identificação e anotação de genes diferencialmente expressos, as tags foram extraídas, contadas e analisadas estatisticamente por um pacote desenvolvido pelo nosso grupo, SAGE Analysis. Um total de 197 seqüências foram reconstruídas e anotadas automaticamente. Foi observado uma expressão estágio-específica e perfil transcricional distinto entre os estágios. Em merozoítos, foram encontradas proteínas envolvidas na tradução e manutenção da conformação protéica e em esporozoítos, os resultados positivos foram relacionados à cromatina, transporte e atividade catalítica. Para validação da técnica, a expressão diferencial de um pequeno conjunto de genes foi quantificada por RT-qPCR. Os resultados demonstraram uma boa correlação entre estas duas plataformas. / Eimeria tenella is one of the most important causing agents of poultry coccidiosis. To study the quantitative gene expression profile in zoite stages of LongSage libraries were generated from merozoites and sporozoites. More than 35.000 tags were obtained, whose 9.516 were unique. For identification and annotation of differential expressed genes, tags were extracted, counted and submitted to statistical analysis by Sage Analysis, software developed by our group. A total of 197 tags were reconstructed and automatic annotated. Stage-specific expression genes and distinct transcriptional profile were observed between these stages. In merozoites the results were related to protein translation and folding, and in sporozoites the proteins were involved to chromatin structure, transport and catalytic activity. To LongSAGE validation, differential expression was quantified using RT-qPCR to a small group of genes. Good correlation was observed between these platforms.

Esquistossomose é uma doença crônica e debilitante. Schistosoma representa a única classe de trematódeos com vida dióica. Um contínuo pareamento com o macho é essencial para a maturação sexual do sexo feminino. Fêmeas adultas provenientes de infecções uni-sexuadas são subdesenvolvidas, apresentam atrofia do tamanho e um sistema reprodutivo imaturo. Para estudar os mecanismos envolvidos no pareamento de vermes adultos foram utilizadas duas plataformas de microarranjos distintas: uma composta por 4 mil sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisas e outra composta por 44 mil sondas de oligonucleotideos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com a plataforma de 4 mil sondas detectamos 113 transcritos diferencialmente expressos em fêmeas adultas mantidas separadas de seus respectivos pares durante 24 horas de cultivo in vitro quando comparadas com fêmeas adultas pareadas; para 10 destes genes obtivemos uma confirmação adicional da expressão diferencial por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Observamos também os efeitos do pareamento no perfil de expressão gênica de machos adultos mantidos separados de seus respectivos pares durante 24 horas de cultivo in vitro; foram encontrados 152 transcritos diferencialmente expressos. Com a plataforma de 44 mil sondas foi detectada a expressão de 5.798 genes transcricionalmente ativos em verme adulto, em um conjunto de 19.907 genes únicos representados nesta plataforma. A análise do conjunto de genes \"no match\" mostrou que em 156 genes ocorria expressão senso e anti-senso; para 6 destes transcritos obtivemos uma confirmação adicional da expressão nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 2717 transcritos diferencialmente expressos em fêmeas separadas de seus respectivos pares durante 13 dias de cultivo in vitro, quando comparadas com fêmeas mantidas pareadas. Para as análises com machos separados durante 13 dias foram encontrados 243 transcritos diferencialmente expressos. Por fim, realizamos estudos com o objetivo de observar os genes que podem estar correlacionados com o contato físico do pareamento (macho e fêmea) e genes que podem ser regulados pela possível difusão de proteínas e hormônios secretados no meio, para os quais a mudança do nível de expressão não dependa da necessidade de contato entre o macho e a fêmea. Sabe-se que o contato direto da fêmea com o macho é necessário para manter a atividade reprodutiva feminina e observamos que o re-pareamento pode restabelecer o perfil de expressão gênica de fêmeas ou machos separados. Além disso, observamos que fêmeas separadas e depois mantidas na presença do macho, porém sem re-pareamento, apresentam uma expressão gênica diferente das fêmeas separadas e depois mantidas na ausência de machos, sugerindo que algum fator secretado pelo macho no meio regula a expressão. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação macho-fêmea em nível molecular. / Schistosomiasis is a chronic and debilitating disease. Schistosoma represents the only class of trematodes with a dioecious life. A continuous pairing with the male is essential for female sexual maturation. Adult females from uni-sexual infections are underdeveloped, have body atrophy and an immature reproductive system. To study the mechanisms involved in pairing of adult worms two microarray platforms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another comprised by 44 000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With the 4000-probes platform we detected 113 transcripts differentially expressed in adult females kept separated from their mates during 24 hours in vitro when compared with paired adult females; for 10 of these genes we obtained additional confirmation of differential expression by Real Time RT-PCR. We also observed the effects of pairing on the gene expression profile of adult males kept separate from their mates during 24 hours in vitro, where we found 152 differentially expressed transcripts. With the 44 000-probes platform we detected the expression of 5798 genes in adult worms, out of a set of 19 907 unique genes represented on this platform. Analysis of the \"no match\" genes showed that 156 have transcription from the sense and anti-sense strands; for 6 of them we obtained additional confirmation of expression by strand specific Real Time RT-PCR. Additionally, we identified 2717 differentially expressed transcripts in females separated from their mates during 13 days in vitro when compared to females that remained paired. In the analysis of males separated for 13 days we found 243 differentially expressed transcripts. Finally, we performed a study aimed at observing genes which might be correlated to physical contact pairing (male and female) and compared to genes that might be regulated by the possible diffusion of secreted proteins and hormones in the medium, for which the change of expression level does not depend on physical contact between male and female. It is known that direct female-male contact is needed to keep the female reproductively activity and we observed that repairing can restore the gene expression profile of females or males that were kept separated. Furthermore, we observed that females separated and then maintained in the presence of male, but without re-pairing, have a different gene expression from the separated females kept without males, suggesting that some male secreted factors might be involved in gene regulation. This work represents an important contribution to the understanding of male-female relation at the molecular level

No presente estudo foram avaliados o perfil lipídico, inflamatório e expressão gênica antes e após cada fase de tratamento de indivíduos hipercolesterolêmicos (HC) com (n=47) e sem (n=37) DM2, e 36 normolipidêmicos (NL). No grupo DM2, foi avaliado o perfil glicêmico. O grupo HC foi orientado a fazer dieta e a não utilizar hipolipemiantes por 4 semanas (fase basal, B), a seguir, tratados com ezetimiba (E: 10mg/d/4sem), sinvastatina (S: 10mg/d/8sem) e sinvastatina e ezetimiba (SE: 10mg cada/d/4sem). O grupo DM2 foi tratado com S (10 ou 20mg/d/4sem) e SE. No plasma foi quantificado, TNF-&#945;, IL1&#946;, IL-6, IL-8, MMP9, MCP1, sICAM1, sVCAM1, e-selectina, leptina, PAI-1, resistina e adiponectina e PCRus. A expressão de mRNA de TNFA, MMP9, MCP1, IL6, IL1B, ICAM1, VCAM1, PAI1, LEP, RETN, ADIPOR1 e ADIPOR2 foi quantificada em células mononucleares por PCR em tempo real. No grupo HC, o colesterol total, LDL-c e apoB foram reduzidos em todas as fases, em comparação com o B (p<0,05). No grupo DM2, o tratamento com SE reduziu o colesterol total, LDL-c e apoB em comparação com S (p<0,05), o perfil glicêmico não foi alterado. No grupo HC, SE reduziu a concentração plasmática de adiponectina quando comparado com as outras fases (p<0,001). A expressão de IL6 foi maior no grupo HC que no grupo NL, e, ao contrário, a expressão de IL1B foi maior no grupo NL (p<0,05). A expressão de IL6 foi maior no tratamento S do grupo com maior resposta de LDL-c (tercil T3>50%, p=0,044) em comparação com o grupo com menor resposta (tercil T1<42%). No grupo DM2, PCRus, sICAM-1 e e-selectina foram reduzidos e sVCAM-1 aumentado, pelo tratamento SE (p<0,05). A expressão de MMP9 foi diminuída na fase SE (p<0,05). PAI1, ICAM1, RETN e ADIPOR1 tiveram maior, e IL6 menor, expressão no grupo que utilizou 20mg que no grupo de 10mg de sinvastatina (p<0,05). Observou-se também que o grupo com maior resposta (T3: redução de LDL-c>30%) teve menor expressão de LEP e ADIPOR1 na fase S, comparado com o grupo com menor resposta (T1: redução de LDL-c<20%) (p<0,05). A expressão de PAI1, VCAM1, RETN LEP, ADIPOR1 e ADIPOR2 foi maior nas fases S e SE, no grupo DM2 que no grupo HC (p<0,05). Em conclusão, a expressão de IL6 é maior em dislipidêmicos, e de IL1B maior em normolipidêmicos. A sinvastatina reduz a expressão de IL6 e a concentração de adiponectina em dislipidêmicos. Em diabéticos, a ezetimiba reduz a concentração de PCRus, sICAM-1 e e-selectina, e a expressão de MMP9, ADIPOR1 e LEP. Diabéticos tem maior expressão de PAI1, VCAM1, RETN, LEP, ADIPOR1 e ADIPOR2 que dislipidêmicos. / We evaluated lipid, inflammatory profiles, and gene expression before and after each treatment of hypercholesterolemic subjects (HC) with (n=47) and without (n=37) T2DM and 36 normolipidemics (NL). The glycemic profile was evaluated in T2DM group. The HC group had a low fat diet, without lowering-cholesterol drugs during four weeks (baseline). Afterwards, this group was treated with ezetimibe (E: 10mg/day/4weeks), sinvastatin (S: 10 mg/day/8weeks), and combined E and S (SE: 10mg each/day/4weeks). The T2DM group was treated with S (10 or 20mg/day/4weeks) and SE. Plasma levels of TNF-&#945;, IL1&#946;, IL-6, IL-8, MMP9, MCP1, sICAM1, sVCAM1, e-selectin, leptin, PAI-1, resistin and adiponectin and hsCRP were measured. TNFA, MMP9, MCP1, IL6, IL1B, ICAM1, VCAM1, PAI1, LEP, RETN, ADIPOR1 e ADIPOR2 mRNA expression in mononuclear cells were quantified by real time PCR. In the HC group, total cholesterol, LDL-C and apoB were reduced in all stages, compared with baseline (p<0.05). In T2DM group, SE treatment reduced total cholesterol, LDL-C and apoB compared with S (p<0.05), glycemic profile was not changed. In HC group, SE reduced plasma adiponectin compared to the other phases (p<0.001). IL6 expression was higher in HC group, and instead, IL1B expression was higher in NL group (p<0.05). IL6 expression was higher in S with higher LDL-c lowering group (tertile T3>50%, p = 0.044) compared with the lower LDL-c lowering group (tertile T1<42%). In the group DM2, hsCRP, sICAM and e-selectin were reduced and sVCAM increased by treatment SE (p<0.05). MMP9 expression was reduced in the SE (p<0.05). PAI1, ICAM1, RETN, ADIPOR1 and ADIPOR2 had higher, and IL6 lower, expression in the 20mg simvastatin group than 10mg group (p <0.05). It was also observed that the higher LDL-c lowering group (T3: reduction of LDL-C>30%) had lower LEP and ADIPOR1 expression in S phase, compared with the lower LDL-c lowering group (T1: reduction of LDL-C<20%) (p <0.05). PAI1, VCAM1, RETN LEP, ADIPOR1 and ADIPOR2 expression was higher in S and SE in T2DM group than in the HC group (p<0.05). In conclusion, IL6 expression is increased and IL1B decreased in dyslipidemia. Simvastatin reduces IL6 expression and adiponectin levels in dyslipidemic. In T2DM, ezetimibe reduces hsCRP, sICAM-1 and E-selectin levels and MMP9, ADIPOR1 and LEP expression. T2DM have higher PAI1, VCAM1, RETN, LEP, ADIPOR1 and ADIPOR2 expression of than dyslipidemics.

As proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) presentes na parede celular são capazes de limitar o potencial destrutivo da poligalacturonase (PG) fúngica e, assim, constituem um tipo importante dentre os diversos sistemas de defesa do tecido vegetal frente à infecção fúngica. No mamão, o ataque fitopatogênico é o principal causador de danos pós-colheita, e sua alta susceptibilidade pode estar relacionada com a baixa eficácia ou pouca abundância dos meios de defesa anti-fitopatogênica. Uma vez que isso pode estar relacionado com as PGIPs e nada se conhece sobre o papel dessas proteínas nesse fruto, o objetivo do trabalho foi clonar os genes das PGIPs de mamoeiro e definir seu padrão de expressão em diferentes órgãos e tecidos e ao longo do amadurecimento. Para tanto, foram identificadas no genoma do mamoeiro, a partir de critérios que definem a identidade de uma PGIP, duas prováveis sequências dentre 13 candidatas iniciais. Ambas foram clonadas a partir das sequências genômicas e de cDNA, sequenciadas e sua identidade confirmada, sendo denominadas Cppgip4 e Cppgip6. As análises de expressão relativa em diversos tecidos e idades fisiológicas do mamoeiro demonstraram que os dois genes apresentaram diminuição da expressão com o desenvolvimento dos frutos, sendo que com a polpa apresentou redução dos níveis de expressão relativa de Cppgip4 em até 18 vezes dos 30 dias pós-antese (DPA) ao 9 dias pós-colheita (DPC). Na casca também houve redução significativa da expressão com o desenvolvimento. Para a expressão absoluta, nos frutos, sementes, caules, raízes e folhas, o número de cópias de ambos os transcritos decresceu com o desenvolvimento, sendo cerca de cem mil vezes mais abundante para Cppgip6 que para Cppgip4. As tentativas de expressão de proteínas recombinantes em Pichia pastoris não geraram resultado positivo, provavelmente em virtude das condições ideais de indução ainda não terem sido estabelecidas corretamente para o ensaio. A atividade de PGIPs extraídas diretamente do tecido foi medida por análise de difusão em ágar empregando pectinase de Aspergillus niger e revelou uma tendência à diminuição da porcentagem de inibição à medida que os frutos se desenvolveram, em concordância com os resultados da análise por qPCR. O conjunto de resultados sugere que a expressão varia com o estádio de desenvolvimento do fruto e é tecido-específica, possivelmente em resposta à diferente susceptibilidade dos tecidos ao ataque fitopatogênico, indicando que menores níveis de transcritos e atividade no amadurecimento, período de maior susceptibilidade, poderiam sinalizar para a regulação do processo degradativo marcando o início da senescência. / Polygalacturonase inhibiting proteins (PGIPs) present in plant cell walls are able to inhibit the destructive action of fungal polygalacturonase (PG). In this way, they constitute an important type of plant defense system against fungal infections. In papaya fruit, the pathogenic attack is the main cause of post harvesting loss, and its high susceptibility may be related to the low efficiency or low abundance of anti-phytopathogenic defense. Since this fact could be related to PGIPs expression and little is known about the response of these proteins in the fruit, the aim of the present work was to clone the genes of PGIPs papaya fruit and set their expression pattern in different organs and tissues throughout fruit ripening. Thus, two probable PGIP sequences among 13 initial candidates were identified in the papaya genome by using specific criteria. Both sequences were cloned from cDNA and genomic samples, sequenced and confirmed its identity, and then being named Cppgip4 and Cppgip6. Analysis of relative expression in various tissues at different physiological stages demonstrated that both genes were down regulated during fruit development. The relative expression levels of Cppgip4 in papaya pulp was reduced by 18 times from the 30 days post-anthesis (DPA) to the 9 days post-harvest (DPH). Similarly, gene expression in papaya peel was significant down regulated during fruit development. Absolute expression analysis revealed gene expressions in the fruit pulp, seed, stem, root and leaf were also down regulated within development. Moreover, Cppgip6 gene expression was a hundred thousand times more abundant than Cppgip4. The recombinant protein expression in Pichia pastoris did not result positive, probably because of the ideal conditions of induction have not been properly established the yet. The activity of PGIPs extracted directly from the tissue was measured by the agar diffusion assay using pectinase from Aspergillus niger and showed decrease of inhibition during fruit developed in accordance with the results of the qPCR analysis. Based on the results it is possible to suggest the expression of these genes varies temporally with the developmental stage of the fruit and is tissue-specific, possibly in response to the different susceptibility of tissues to pathogenic attack. In addition, the lowest levels of PGIP expression were achieved at the fruit ripening, when the susceptibility to fungal infection is high and could signal for regulating the degradation process characterized by the onset of senescence.

São poucos os avanços obtidos em intervenções cirúrgicas ou terapias para melhora na qualidade de vida e/ou prognósticos dos pacientes acometidos por gliomas, que são os tumores mais comuns e fatais que acometem o sistema nervoso central. O modelo celular ST1 de glioma de rato responde ao tratamento com hormônio glicocorticóide (GC) com uma reversão fenotípica tumoral-normal in vitro e in vivo e o modelo celular P7 é resistente a este tratamento. Ambas as linhagens são utilizadas, no laboratório, como modelos de estudo de genes associados à origem de neoplasias e controle de proliferação celular, com potenciais aplicações na doença humana. Este trabalho possui dois objetivos gerais: a) clonagem e caracterização funcional do gene NRP/B de rato, previamente descrito no laboratório como sendo induzido durante o tratamento das células ST1 com GC; b) identificação de genes humanos no locus 22q13, frequentemente deletado e associado à progressão tumoral de gliomas. A identificação, clonagem e determinação da seqüência completa de NRP/B de rato, até então desconhecida, foi realizada neste trabalho e depositada no GenBank (número de acesso AY669396). Sua expressão parece ser cérebro-específica, sendo modulada positivamente durante o tratamento com GC nas células ST1. A superexpressão de NRP/B em células ST1 foi realizada para avaliar o papel do gene na reversão fenotípica tumoral-normal induzida por GC. Os resultados obtidos sugerem que NRP/B provoca diminuição da capacidade de crescimento independente de ancoragem em meio semi-sólido e do potencial tumorigênico das células ST1 em ensaios de tumorigênese in vivo. Experimentos preliminares sugerem o envolvimento da expressão de NRP/B no processo de progressão celular e em tumores humanos cerebrais e de mama. Para a identificação de genes humanos no locus 22q13 associados ao desenvolvimento de gliomas, foram adotadas duas estratégias: utilização do Banco de Dados do Transcriptoma para identificação de mRNAs e ESTs alinhadas no locus associado ao câncer cerebral 22q13 e utilização dos dados de genes localizados no cromossomo 22 diferencialmente expressos em microarrays entre as linhagens ST1 e P7, ambas tratadas com GC. Como resultado da análise in silico, foram selecionados alguns genes para análise por Q-PCR em linhagens celulares e amostras clínicas de gliomas humanos, o que evidenciou a existência de algumas correlações positivas ao nível transcricional entre os genes. Três genes (KIAA1644, SULT4A1 e PARVG) apresentaram maior expressão em amostras clínicas de cérebro não-tumoral quando comparadas com amostras de gliomas, o que sugere um possível envolvimento destes na progressão de gliomas humanos. A caracterização dos alvos moleculares na ação dos genes analisados neste estudo é importante para melhor entendimento dos mecanismos moleculares que controlam a proliferação celular e, futuramente, para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para estes tumores cerebrais. / Gliomas are the most fatal central nervous system tumors and to date, satisfactory results from chemotherapies or surgical interventions are still not available. The ST1 rat glioma cell line is hyper-responsive to treatment with glucocorticoids (GC), undergoing a complete tumoral to normal phenotypic reversion, both in vitro and in vivo. The P7 glioma cell line is resistant to the action of GC. Both cell models are used in our lab to search for targets which are important to understand the origin of tumors and the control of cell proliferation. For the present study, we aimed at: a) cloning and functional characterization of the rat NRP/B gene, which had previously been identified as being induced during GC-treatment of the ST1 cells; b) identification of human genes located at the 22q13 locus, known to be involved in gliomagenesis. The previously unknown cDNA for rat NRP/B was identified, cloned, sequenced, and deposited in the GenBank (Acc. Nº AY669396). It displays brain-specific expression and positive modulation during GC treatment of ST1 cells. The role of NRP/B in the tumoral to normal phenotypic reversion induced by GC was analyzed by its overexpression in ST1 cells. The results suggest that induction of NRP/B partially impairs cell growth in semi-solid substrate and lowers its tumorigenic potential in vivo. Preliminary studies suggest that NRP/B expression is involved in cell cycle progression and in brain and human breast tumors. To identify additional human genes located in the glioma-related 22q13 locus, two strategies were used: a) analysis of the Ludwig - Fapesp Transcriptome Project database to identify mRNAs and ESTs that align to the referred locus and b) analysis of microarray data of differentially expressed genes in ST1 and P7 cells (both treated with GC) that also localize in chromosome 22. To validate the in silico analysis, Q-PCR was used to evaluate the expression of several genes in human brain tumor cell lines and clinical samples, being possible to find some positive correlations between genes at the transcriptional level. Three genes (KIAA1644, SULT4A1 e PARVG) displayed significantly higher expression levels in non-tumoral clinical samples, when compared to their tumor counterparts suggesting their involvement in human glioma progression. A better understanding of the molecular mechanisms by which these genes are involved may contribute with important information to understand the control of cell proliferation and may lead, in the future, to the development of new therapeutical strategies for brain cancer therapy and diagnosis.