Orientador: Ana Elizabete Silva / Coorientador: Eny Maria Goloni Bertollo / Banca: Patricia Pintor dos Reis / Banca: Cristiane Damas Gil / Resumo: Alterações nos níveis de expressão de moduladores da resposta inflamatória, como a Anexina-A1 (AnxA1/ANXA1) e a Galectina-1 (Gal-1/LGALS1) têm sido observadas em diversos tipos de câncer. O câncer colorretal, um dos modelos da associação inflamação-câncer progride, na sequência, do epitélio normal para adenoma (AD) e adenocarcinoma (ADC). Objetivos: Avaliar a expressão gênica e proteica da AnxA1 e Gal-1 e o índice de proliferação celular (IP) em amostras de AD, ADC esporádico e das mucosas normais adjacentes, assim como investigar a ocorrência de correlação entre os níveis de expressão de ambos os mRNA e de associação com fatores de risco (idade, gênero, tabagismo e etilismo) e sítio anatômico de origem da lesão. Materiais e Métodos: As análises foram realizadas pelas técnicas de PCR quantitativa em tempo real (qPCR), para quantificar os níveis de mRNA de ANXA1 e LGALS1 em 70 biópsias de lesão (27AD e 43ADC) e 58 de mucosa normal adjacente (19 e 39 respectivamente), e de imuno-histoquímica, para caracterizar a expressão proteica da AnxA1 e Gal-1 em 25 biópsias de lesão (10AD e 15ADC) e 16 de mucosa normal adjacente (6 e 10 respectivamente), como também investigar o IP pela detecção do antígeno Ki-67 em 44 biópsias de lesão (19AD e 25ADC) e 16 de mucosa normal adjacente (8 em ambas). Resultados: A expressão relativa de ANXA1 apresentou-se elevada em comparação à mucosa normal tanto no AD (RQ=1,11; P=0,040), como no ADC (RQ=2,33; P<0,001). Contudo, LGALS1 apresentou expressão relativa aumentada apenas no ADC em comparação à mucosa normal (RQ=1,85; P<0,001), enquanto no grupo AD foi observada expressão basal (RQ=0,90; P=0,319). A comparação entre as lesões mostrou que ambos os genes apresentam-se significantemente mais expressos no ADC em comparação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Changes in expression levels of inflammatory response modulators, such as Annexin-A1 (AnxA1/ANXA1) and Galectin-1 (Gal-1/LGALS1) have been observed in several types of cancer. Colorectal cancer, one of the models of inflammation-cancer association, progresses, in sequence, from normal epithelium to adenoma (AD) and adenocarcinoma (ADC). Objectives: To evaluate the gene and protein expression of AnxA1 and Gal-1 and the cell proliferation index (IP) in samples of AD, sporadic ADC and adjacent normal mucosa, as well as to investigate the occurrence of correlation between the mRNA expression levels and association with risk factors (age, gender, smoking and drinking habits) and anatomic site of lesion origin. Materials and Methods: The analyzes were performed by quantitative real-time PCR (qPCR) technique to quantify the levels of ANXA1 and LGALS1 mRNA in 70 biopsies of lesions (27AD and 43ADC) and 58 adjacent normal mucosa (19 and 39 respectively), and immunohistochemistry technique to characterize the protein expression of AnxA1 and Gal-1 in 25 biopsies of lesions (10AD and 15ADC) and 16 adjacent normal mucosa (6 and 10 respectively), and also to investigate the IP by detection of Ki-67 antigen in 44 biopsies of lesions (19AD and 25ADC) and 16 adjacent normal mucosa (8 in both). Results: The relative expression of ANXA1 showed higher compared to adjacent normal mucosa in both AD (RQ=1.11; P=0.040) and ADC (RQ=2.33; P<0.001). However, LGALS1 mRNA showed overexpression only in ADC compared to normal mucosa (RQ=1.85; P<0.001), while in AD group it was observed basal expression (RQ=0.90; P=0.319). The comparison between lesions showed that both genes were significantly more expressed in ADC compared to AD (ANXA1: P=0.039; LGALS1: P=0.019). In both lesion groups it was observed positive correlation between the mRNA expression of these genes... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O controle da contaminação de alimentos por Listeria monocytogenes é um desafio para a indústria, pois a bactéria é tolerante a muitas condições adversas que são empregadas para conservação de alimentos. L. monocytogenes é uma bactéria patogênica e pode causar doença de natureza não entérica grave, em pessoas imunocomprometidas, idosas e durante a gestação. No presente estudo foi avaliada a expressão gênica de duas linhagens L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a mais comumente isoladas de alimentos e L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b mais comumente encontradas em surtos hospitalares, utilizando caldos modelos formulados a partir de extratos de carne e peptona de peixe, suplementados ou não com glicose, cloreto de sódio, orégano, pimenta do reino e uma mistura desses ingredientes. Os caldos modelos formulados e suplementados ou não com os ingredientes foram incubados por 1 hora a 25ºC e em seguida, foi realizada extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA). O cDNA foi amplificado e quantificado por PCR em tempo real, com primers para os genes alvos prfA, inlA, actA e hly, que codificam respectivamente o fator regulador positivo, internalina A, actina e hemolisina, relacionados à virulência desta bactéria. L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a cultivada em caldo de carne acrescido de glicose diminuiu a expressão de prfA, actA e hly, enquanto que em caldo de peixe acrescido do mesmo ingrediente, foi observada maior expressão para os genes inlA, actA e hly. Nos caldos de carne acrescidos de cloreto de sódio houve aumento da expressão de hly em L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, mas o mesmo ingrediente causou redução da expressão dos genes inlA, actA e hly em L. monocytogenes IAL 633. Em caldo de peixe adicionado de cloreto de sódio, houve concordância no efeito observado para as duas culturas de L. monocytogenes avaliadas, com menor expressão dos genes inlA e prfA. Com pimenta do reino em caldo carne foi observado aumento da expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115 e redução dos genes prfA, inlA, actA e hly para L. monocytogenes IAL 633. Já em caldo de peixe acrescido de pimenta do reino, a modulação gênica ocorreu somente para L. monocytogenes ATCC 19115, com redução do gene prfA e aumento inlA e actA. O orégano foi o ingrediente que mais afetou a expressão gênica de L. monocytogenes nas condições estudadas, com aumento da expressão de actA em caldo de carne e redução de hly, para L. monocytogenes ATCC 19115. Em contrapartida, para L. monocytogenes IAL 633 ocorreu a repressão dos mesmos genes e também de inlA e prfA, enquanto que em caldo de peixe ocorreu redução somente para o gene prfA. Ainda, em caldo de peixe acrescido de orégano foi observado redução da expressão dos genes prfA e inlA, porém aumento na expressão de actA e hly para L. monocytogenes ATC 19115. A combinação de todos os condimentos também afetou a expressão gênica, sendo que em caldo de carne houve aumento da expressão dos genes prfA e inlA, porém foi reduzida a expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115. Para a mesma linhagem (ATCC 19115), em caldo de peixe ocorreu a redução da expressão dos genes prfA, inlA e actA. L. monocytogenes IAL 633 em caldo de carne com a mistura de ingredientes teve reduzida a expressão dos genes inlA e actA, essa redução também foi detectada em caldo de peixe para o gene prfA. No presente estudo foi possível observar uma repressão de todos os genes alvos estudados para L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a quando incubada em caldo de carne suplementado com os diferentes ingredientes, mas o mesmo padrão não foi observado para L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, indicando a complexidade da expressão gênica em função dos componentes de alimentos. / The control of food contamination by Listeria monocytogenes is a challenge for the industry because the bacterium is tolerant to many adverse conditions applied in food preservation. L. monocytogenes can cause serious non-enteric disease in immunocompromised persons, in the elderly and during pregnancy. In the present study it was evaluated the gene expression of two strains, L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a (most commonly isolated from food) and Listeria monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b (more common in clinical cases). Model broths were prepared with meat extract and fish peptone, supplemented or not with glucose, sodium chloride, oregano, black pepper and a mixture of these ingredients. The formulated model broths supplemented or not with the ingredients were incubated for 1 hour at 25° C and next, RNA extraction was performed and complementary DNA (cDNA) was synthesized. The cDNA was amplified and quantified by Real Time PCR with primers for the target genes: positive regulatory factor (prfA), internalin A (inlA), actin (actA) and hemolysin (hly). L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a grown in meat broth plus glucose decreased expression prfA, actA and hly, while in fish broth, increased expression was observed for inlA, hly, and actA genes. In meat broth added sodium chloride, increased hly expression was observed for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b but the same ingredient caused a decrease of the expression of genes inlA and hly in L. monocytogenes IAL 633. In fish broth added sodium chloride, for the two cultures of L. monocytogenes evaluated there was a lower expression of inlA and prfA gene in comparison with the control. With meat broth containing black pepper, it was observed an increased actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115 and lower expression of prfA, inlA, actA gene; for L. monocytogenes IAL 633 lower expression of hly was observed in this broth formulation. In fish gravy plus black pepper, modulation of gene expression occurred only in L. monocytogenes ATCC 19115 that showed decrease for prfA and increase for inlA and actA. Oregano was the ingredient that affected most the gene expression of L. monocytogenes under the conditions studied, with increased actA expression in broth and hly reduction for L. monocytogenes ATCC 19115. However, for L. monocytogenes IAL 633 there was repression of the inlA and prfA genes, in fish stock was reduced only for prfA gene. Also in fish stock plus oregano was observed reduction of prfA and inlA genes, but increased expression of the actA and hly for L. monocytogenes ATC 19115. The combination of all the condiments also caused different effects on gene expression, and in broth increased the expression of genes prfA and inlA, but reduced the actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115, for the same strain (ATCC 19115) broth fish was a reduction of prfA, inlA and actA genes. L. monocytogenes IAL 633 in broth with the mixture of ingredients reduced the expression of inlA and actA genes, this reduction were also seen in fish broth for the prfA gene. L. monocytogenes has complexity of the modulation of the expression of virulence factors in food, but in the present study it was possible to observe a repression in the modulation pattern of all target genes studied L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a when incubated in broth supplemented with different ingredients, which did not occur for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b.

Gramíneas do gênero Brachiaria apresenta importância econômica como forrageiras no Brasil. O melhoramento genético, entretanto, é restrito devido a diferenças de ploidia entre os genótipos e a reprodução por apomixia. A indução de haplóides e duplo-haploides pelo cultivo in vitro de anteras ou de micrósporos isolados é relatada em diversas espécies. Além da criação de novos genótipos linhagens duplo-haplóides podem ser utilizadas como ferramentas para o estudo de marcadores moleculares. Dentre os fatores essenciais para o sucesso da técnica está o estádio do desenvolvimento do micrósporo, sendo o estádio uninucleado, geralmente, o mais responsivo. Um dos objetivos deste trabalho foi contribuir para a definição de parâmetros para a cultura de haplóides em Brachiaria. Flores e anteras isoladas de B. brizantha (B105) em diferentes estádios de desenvolvimento foram processadas para microscopia de luz. Os eventos observados foram associados a marcadores morfologicos. Experimentos de cultura de anteras foram estabelecidos e estruturas semelhantes a calos ocorreram em pouco explantes. Secções histológicas revelaram a ocorrência de micrósporos com divisão simétrica, indicando um possível desvio da rota do micrósporo para a rota esporofítica. Genes definidos como marcadores de embriogênese como SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE), podem ser utilizados para identificar o potencial embriogênico de células ou grupo de células, possibilitando monitorar a resposta in vitro. Duas seqüências parciais de cDNA isoladas de B. brizantha apresentaram alta identidade com homólogos de SERK1 e SERK2 de monocotiledôneas. Análise filogenética confirmou a alta similaridade sugerindo serem os possíveis ortólogos de SERK em Brachiaria, sendo nomeados como BbrizSERK1 e BbrizSERK2. Clones parciais da seqüência genômica foram obtidos. Análise de Southern blot identificou duas cópias deste gene tanto na planta apomítica como na sexual. A análise da expressão de BbrizSERK2 por RT-qPCR na planta apomítica e sexual e durante a embriogênese somática revelou que este gene não é específico de tecidos reprodutivos. Expressão diferencial de BbrizSERK entre ovários apomíticos e sexuais, especialmente durante a megasporogênese, foi observada por hibridização in situ. Detectou-se forte sinal na célula-mãe do megásporo em ovários sexuais e ausência de sinal em ovários apomíticos. Após a antese, a expressão na planta apomítica foi observada apenas na região micropilar e proembriões. Na sexual, foi observada nas antípodas e aparato da oosfera. Em anteras o mesmo padrão de expressão foi observado entre a planta apomítica e sexual, com forte expressão no tapete e nas células-mãe do grão de pólen, o que sugere um importante papel deste gene na esporogênese em Brachiaria. Em calos embriogênicos forte sinal foi observado em massas proembriogênicas, em embriões globulares e também em embriões somáticos mais desenvolvidos, confirmando a função de SERK como marcador de embriogênese em Brachiaria. Em anteras cultivadas in vitro, forte sinal foi observado em micrósporos binucleados com divisão simétrica e em alguns micrósporos vacuolados. Experimentos futuros com genes desta família poderão contribuir para monitorar processos in vitro em Brachiaria, indicando células ou grupos de células com potencial embriogênico, ajudando na definição das melhores condições de cultivo para a embriogênese e também para o estudo da reprodução neste gênero / Brachiaria, gramineae present economic importance as forage in Brazil. The genetic breeding, however, is restricted by differences in ploidy among the genotypes and the apomixis. The development of a haploid and double haploid production has been reported for several species. Besides the production of new genotypes the development of double haploid lineages may be used for studies with molecular markers. Among important factors for the success of haploid plant development relies on the microspore developmental stage, with the uninucleate stage being usually the most responsive. One of the objectives of this work was to contribute for the definition of parameters for the development of haploid cultures in Brachiaria. B. brizantha (B105) flowers and isolated anthers were collected in different stages of development and processed for light microscopy. The events observed were associated to morphological markers. Anther culture experiments were established and calli formation ocurred to a few explants. Histological sections of anthers cultivated in vitro, however, revealled the occurrence of microspores with symmetrical divisions, indicating a possible alternative to the sporophytic route. Genes defined as markers of embryogenesis, such as SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE), may be utilized to identify the embryogenic potential of cells, or cell clusters, in an attempt to monitor the in vitro response. Two partial sequences of cDna isolated from B. brizantha (B30) showed high identity of these two sequences to SERK1 and SERK2 homologs from monocots. The phylogenetic analysis confirmed high similarity with these genes, indicating that these sequences are possible orthologs of SERK in Brachiaria, hence these were named BbrizSERK1 and BbrizSERK2. Partial clones of genomic sequences were obtained. Southern blot analysis suggested two copies of this gene in both apomictic and sexual B. brizantha. The expression analysis of BbrizSERK2 by RT-qPCR revealed that this gene is not specific to reproductive tissues. Differential expression of BbrizSERK between apomictic and sexual ovaries, especially during megasporogenesis, was observed by in situ hybridization. A strong signal was detected in the megaspore mother cell in sexual ovaries, with absence in apomictic ovaries. After anthesis, the expression in the apomictic plant was observed only in the micropylar region and proembryos, however, in the sexual plant, the expression was observed in the antipodals and egg apparatus. In anthers, the same in situ pattern was observed in the apomictic and the sexual plant, with a strong expression in the tapetum and the pollen grain mother cell, suggesting an important role of this gene in the sporogenesis in Brachiaria. In embryogenic calli, strong signal was observed in proembryogenic masses, globular embryos and somatic embryos in later stages of development, confirming the role of SERK as an embryogenic marker in Brachiaria. In cultivated anthers, a strong signal was observed in binuclear microspores with symmetric division and vacuolated microspores. Further studies with this gene family may contribute to monitoring the in vitro processes in vitro in Brachiaria, defining cells or cell clusters with an embryogenic potential, helping for the definition of culture conditions for embryogenesis and also for reproductive studies in this genus

A puberdade é o momento quando um mamífero, macho ou fêmea, se torna capaz de produzir gametas viáveis e exibir comportamento sexual completo. Trata-se do resultado do ajuste gradativo entre o aumento da atividade gonadotrófica e a habilidade das gônadas em assumir simultaneamente a esteroidogênese e a gametogênese. Um dos principais fatores que influenciam o início à puberdade é o genético. A puberdade é uma característica fisiológica originada por muitos fatores (orgânicos e ambientais), que relacionam-se com a expressão de diversos genes, muitos dos quais ainda com funções desconhecidas. Metodologias para a análise da expressão gênica diferencial em tecidos, em particular a Análise Serial de Expressão Gênica (SAGE), incluem ferramentas que permitem a análise global e simultânea de vários transcritos de um determinado tecido, sejam eles conhecidos ou não, fornecendo informações sobre o padrão de expressão gênica de um determinado tipo celular de maneira qualitativa e semi-quantitativa. O objetivo do presente projeto foi analisar, por meio da técnica de SAGE, a expressão gênica diferencial no folículo ovariano de fêmeas bovinas da raça Nelore púberes e pré-púberes, segundo o critério da apresentação ou não de ondas de crescimento folicular que culminavam com a ovulação.. Um total de 14.531 e 14.285 tags tiveram sua seqüência de DNA determinada, revelando a existência de 6.840 e 6.386 genes únicos (biblioteca das novilhas pré-púberes e púberes respectivamente). A comparação entre as duas bibliotecas revelou um total de 127 tags diferencialmente expressos (P<0,05). Os folículos ovarianos de novilhas púberes apresentaram expressão mais elevada de algumas enzimas esteroidogências (CYP11A1 e CYP19) e do transportador de colesterol para a mitocôndria (StAR) indicando intensa atividade esteroidogência (produção de estrógeno) quando comparada ao folículo das bezerras pré-púberes. Além disso, o CTGF (fator de crescimento do tecido conectivo) e o TIMP2 (inibidor tecidual de metaloproteinases) foram mais abundantes nos folículos dos animais púberes, indicando que os mesmos já iniciaram o processo de luteinização, sem entrentanto iniciar o processo de ruptura da matriz extracelular que ocorre na ovulação. A maior expressão de genes relacionados ao metabolismo da matriz extracelular e do citoesqueleto (como por exemplo a osteonectina, a actina e proteínas relacionadas à actina) sugere que os folículos dos animais púberes estão se preparando para a remodelação tecidual. A maior expressão de conexina 43 (gap junction protein) nos folículos dos animais púberes sugere uma intensa comunicação das células da granulosa entre si e com o oócito quando comparadas aos folículos das bezerras pré-púberes. Dentre os genes diferencialmente expressos e mais abundantes no folículo das bezerras pré-púberes, destacou-se o gene da proopiomelanocortina (POMC), que codifica vários fatores hipofisários. Os conhecimentos gerados por este trabalho poderão ser úteis para a identificação de marcadores genéticos para aplicação em programas de seleção assistida por marcadores / Puberty is the stage where any mammal, male or female, becomes able to produce viable gametes and manifest complete sexual behavior. These are results from the gradative adjustment between the increase in gonadotrophic activity and the ability of gonads in undergoing simultaneously both steroidogenesis and gametogenesis. One of the major factors interferring with puberty initiation is the genetics. Puberty is a physiological process controlled by several factors (organic and environmental) related with the expression of several genes, most of them with unknown function. Differential gene expression approaches, in particular the Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), include tools that allow the global and simultaneous analysis of several transcripts from a given tissue, being known or unknown, providing qualitative and semi-quantitative information about the genetic profiles of any cellular type of interest. Using the SAGE approach, the aim of the present study was to analyse the differential gene expression profiles of ovarian follicles from pubertal and pre-pubertal Nelore breed females, observed for the presence or not of follicular growth waves ending in an ovulation, A total of 14,531 and 14,285 tags had their DNA sequences determined, revealing the existence of 6,840 and 6,386 unique tags (pre-pubertal and pubertal follicle libraries respectively). Comparison between the two SAGE libraries revealed 127 differentially expressed genes (P<0,05). Follicles from pubertal heifers showed increased expression of some steroidogenic enzymes (CYP11A1 and CYP19) and StAR, the mitochondrial cholesterol transporter, which together indicates a marked steroidogenic activity (oestrogen production), when compared with follicles from pre-pubertal heifers. Furthermore, connective tissue growth factor (CTGF) and TIMP2 (tissue inhibitor of metalloproteinases 2) were shown to be increased in pubertal follicles, indicating the starting of luteinization proccess, without however initiating the rupture of extracellular matrix, which takes place in ovulation. Higher levels of expression presented by extracellular matrix and cytoskeletal related genes (as examples osteonectin, actin and actin-related proteins) also indicate that the follicle from pubertal heifers is at the verge of tissue remodelation. The higher expression of connexin 43 (gap junction protein) indicated that this follicle shows a more intense communication among granulosa cells and between these and the oocyte, as compared to the pre-pubertal calves follicle. Among the differentially expressed genes more abundant in the pre-pubertal follicle is the proopiomelanocortin gene (POMC), which codifies to some hypophiseal factors. The knowledge generated by this study may contribute to the identification of genetic markers to be used in marker assisted selection programmes

Introdução: As células tronco podem contribuir na patogênese da endometriose. Os objetivos deste estudo foram avaliar e comparar a expressão de genes relacionados à atividade das células tronco no endométrio tópico (Et), peritônio normal (PN) e nos implantes de endometriose peritoneal superficial e profunda (EPS/EPP) de mulheres inférteis com endometriose. Métodos: Vinte e quatro amostras de Et, PN, EPS e EPP foram obtidas durante laparoscopia de seis pacientes. A expressão de 84 genes relacionados à atividade de células tronco foi avaliada pela técnica de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase (RT-PCR). Resultados: Todos os genes foram expressos no Et, PN, EPS e EPP. Não houve diferença entre o PN, EPS e EPP. Não houve diferença quando as lesões de EPS e EPP foram comparadas entre si. Comparados ao Et, 24, 49 e 45 genes foram diferencialmente expressos no PN, EPS e EPP, respectivamente. Destes genes diferencialmente expressos 23 eram comuns. A análise funcional dos 23 genes evidenciou 5 genes comumente superexpressos (genes reguladores do ciclo celular; comunicação celular e marcador de células embrionárias) e 18 subexpressos (fatores de crescimento; marcadores de células neurais; marcador de auto-renovação; marcador de células embrionárias; divisão celular simétrica e assimétrica; marcadores de células hematopoiéticas; comunicação celular, via de sinalização Notch; via de sinalização Wnt; marcador de células mesenquimais; marcador metabólico e moduladores do cromossomo e da cromatina). Conclusões: Os genes relacionados à atividade de células tronco estavam expressos no endométrio tópico, nas lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda e no peritônio normal. A expressão gênica foi mais semelhante no peritônio normal e nas lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda, comparadas ao endométrio tópico. Não se observaram diferenças significantes na expressão gênica entre as lesões de endometriose peritoneal superficial e profunda / Introduction: Stem/progenitor cells may contribute to the pathogenesis of endometriosis. The objective of this study was to identify and compare expression of genes regulating SPCs function in eutopic endometrium (EuE), normal peritoneum (NP) and peritonea superficial and deep infiltrative endometriosis (SE/DIE) of women with pelvic endometriosis. Methods: Twenty-four biopsies from EuE, NP, SE and DIE were obtained during laparoscopy from 6 patients. The expression of 84 stem cell-related genes was performed using a RT-PCR-based analysis. Results: All genes analyzed were expressed in the EuE, NP, SE and DIE. No difference was shown between SE, DIE and NP. There was no difference when the SE and DIE were compared to each other. Compared to EuE, 24, 49 and 49 genes were differentially expressed in the NP, SE, and DIE, respectively. Of these differentially expressed genes 23 were the same. Funcional analisis demonstrated that 5 genes were commonly overexpressed (cell cycle regulators; cell communication and embryonic cell marker) and 18 underexpressed (growth regulators; neural cell markers; self-renewal marker; embryonic cell marker; symmetric and asymmetric stem cell division; hematopoietic cell markers; cell communication; Wnt pathway; Notch pathway; mesenchymal cell marker; metabolic marker; chromosome and chromatin modulators). Conclusions: Stem cell related genes were expressed in the human endometrium, peritoneal superficial and deep endometriosis lesions and in the normal peritoneum. There was no difference when superficial and deep endometriosis were compared to each other.

Estudos têm relatado o potencial de aplicação cosmética de classes de proteínas que conferem resistência aos diferentes tipos de estresse sobre a pele. Nesse contexto, as proteínas de estresse - proteínas de choque térmico, metalotioneínas e sirtuínas - enquadram-se entre as proteínas de grande potencial no combate ao fotoenvelhecimento. Diversos extratos vegetais tem mostrado potencial de induzir uma ou mais proteínas de estresse. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos in vitro da aplicação isolada dos extratos de Anadenanthera colubrina (Angico branco), Rhodiola rosea (Rodiola), Pfaffia paniculata (Pfaffia), sobre a expressão gênica das proteínas do choque térmico (Heat shock proteins, HSP32 e HSP72), metalotioneína (MT-I) e da sirtuína isoforma SIRT1, em condição basal e mediante exposição aguda das culturas celulares à radiação UV. Como resultados de maior relevância o extrato de Anadenanthera colubrina foi capaz de modular positivamente as expressões gênicas de HSP72, SIRT-1 e MT-I, em fibroblastos sob condição basal. Já o extrato de Pfaffia paniculata foi capaz de elevar a expressão gênica de SIRT-1, em fibroblastos irradiados por UVA após incubação com o extrato vegetal e sob condição basal, além de induzir MT-I em culturas não irradiadas. Por fim, o extrato de Rhodiola rosea elevou as expressões de HSP32 e MT-I, em fibroblastos sob condição basal. Devido à capacidade indutora das proteínas de estresse pelos extratos vegetais avaliados, sugere-se que os mesmos apresentam potencial para utilização em produtos cosméticos, especialmente, com finalidade antienvelhecimento. / Studies have reported the potential for cosmetic application of proteins classes that confer resistance to different types of stress on the skin. In this context, stress proteins - heat shock proteins, metallothioneins and sirtuins - fall between the proteins of great potential in the fight against photoaging. Several plant extracts have been shown potential to induce one or more stress proteins. Thus, the objective of this study was to evaluate the in vitro effects from the isolated application of the extracts Anadenanthera colubrina (Angico-branco), Rhodiola rosea (Rodiola), Pfaffia paniculata (Fáfia) on the gene expression of heat shock proteins, HSP32 and HSP72, metallothionein (MT-I) and the sirtuin, isoform SIRT1, in basal conditions and upon acute exposure of cell cultures to UV radiation. As most relevant results, Anadenanthera colubrina extract was able to positively modulate the gene expression of HSP72, SIRT-1 and MT-I in fibroblasts under basal conditions. The Pfaffia paniculata extract was able to increase the gene expression of SIRT-1 in fibroblasts irradiated by UV after incubation with plant extract and in basal conditions, in addition to induce MT-I in non-irradiated cultures. Finally, the extract of Rhodiola rosea increased HSP32 and MT-I gene expressions in fibroblasts under basal conditions. Considering the plant extracts ability to induce stress proteins, it is suggested that they have potential for use in cosmetic products, especially, for anti-aging purposes.

As infecções humanas com Leishmania spp dão origem a um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde lesões tegumentares até compromisso visceral. O fenótipo da doença está intimamente relacionado com o tipo de resposta do hospedeiro mamífero à infecção do parasito e à variabilidade genética entre as espécies. Neste contexto, a identificação e caracterização de genes que regulam a virulência no fenótipo de Leishmania são essenciais para a compreensão dos mecanismos patogênicos do hospedeiro-parasita. Estudos anteriores realizados no laboratório mostraram a atenuação da virulência através da superexpressão do SL RNA em transfectantes de Leishmania (L.) major e Leishmania (V.) braziliensis em modelo murino. Para entender as mudanças fenotípicas encontradas em Leishmania (L.) major, a análise do perfil de expressão de genes permitiu identificar seis genes down-regulados e up-regulados, que poderiam contribuir individualmente com um padrão de virulência. Seis genes foram selecionados, os quais estão diferencialmente expressos entre as linhagens controle e transfectante. Para identificar genes específicos que poderiam compensar parcialmente a perda de virulência, foram analisados o fenótipo da infecção in vivo em camundongos suscetíveis. O conjunto de nossos dados sugerem que os genes estudados (LmjF 12.066 proteína fosfatase serina/treonina (PP2A); LmjF 36,5640 semelhante a ciclina; LmjF 36,4740 PIG-P (fosfatidilinositol N-acetilglucosaminil transferase - subunidade P) podem afetar negativamente a virulência de Leishmania (L.) major in vivo. Foram observadas diferenças significativas (p<0,005) entre os transfectantes contendo o vetor vazio e os transfectantes superexpressores, embora a caracterização do crescimento em condições axênicas não mostrou alterações. A localização destas proteínas superexpressas sugerem uma localização citoplasmática. Os resultados apresentados indicam que os altos níveis de expressão destes genes comparado com as linhagens controle afetam negativamente a capacidade de linhagens virulentas, induzam lesões quando são injetadas em camundongos susceptíveis. / Human infections with Leishmania spp give rise to a spectrum of clinical manifestations ranging from tegumentary lesions to a visceral disease. The phenotype of the disease isclosely related to the type of parasite mammalian host response to infection and genetic variability among species. In this context, the identification and characterization of genes that regulate virulence in Leishmania phenotype is essential to the understanding of the pathogenic mechanisms of host-parasite. Previous studies conducted in the laboratory showed attenuation the virulence due to overexpression of the SL RNA in transfectants of Leishmania (L.) major and Leishmania (V.) braziliensis in a murine model. To understand the phenotypic changes found in Leishmania (L.) major, analyzes gene expression profile allowed to identify genes over- or under-expressed that may individually contribute to the virulence pattern. Six genes were selected which are differentially expressed between the control lines and transfectant. To identify specific genes can partly compensate for the loss of virulence, were analyze the phenotype of infection in vivo susceptible mice. Our results suggest that the studied genes (LmjF. 12.0660- Serine/threonine protein phosphatase (PP2A); LmjF. 36.5640 cycline-like; LmjF. 36.4740 PIG-P (phosphatidyl inositol N-acetylglucosaminyl transferase subuni P) had a negative effect over virulence of Leishmania (L.) major in vivo. Significant differences were observed p=<0.005 between parental; transfectants with vector alone and overexpressor, although growth profile in axenic conditions has not shown any change. All the proteins were detected in the cytoplasm. The results presented here indicate that high levels of these proteins affect negatively the ability of a virulent line to induce lesions when injected in susceptible mice.

INTRODUÇÃO: O grau histológico é um dos principais fatores prognósticos em câncer de mama. Entretanto, os carcinomas pouco diferenciados ainda constituem um grupo bastante heterogêneo de tumores, pois podem corresponder a qualquer um dos subgrupos segundo a classificação genética: basal-símile, HER2, luminal ou mama-normal. OBJETIVOS: Neste estudo nós analisamos a freqüência dos perfis imunoistoquímicos básicos quanto à expressão de receptores de estrógeno e progesterona e HER2 em carcinomas de mama com menos de 10% de formação tubular e suas relações com fatores prognósticos clássicos e com a expressão de p63, c- Kit, EGFR, VEGF-A e citoqueratinas basais e luminais. MATERIAL E MÉTODOS: Este estudo retrospectivo incluiu 134 carcinomas de mama selecionados dos arquivos da Divisão de Patologia Cirúrgica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, de 2000 a 2003. Os tumores foram revistos e classificados quanto à expressão imunoistoquímica de receptor de estrogênio, receptor de progesterona e HER2 nos perfis luminal (receptores hormonais positivos), HER2 (HER2 positivo e receptores hormonais negativos) e triplo-negativo. O subgrupo luminal foi subdividido quanto à expressão ou não de HER2. O exame imunoistoquímico para p63, citoqueratinas basais 5, 14 e 17,VEGF-A, EGFR, c-Kit e citoqueratinas luminais 8/18 foram feitos em bloco construídos pela técnica de arranjo em matriz de amostras teciduais. As variáveis prognósticas clássicas: idade da paciente, tamanho do tumor, estado linfonodal, grau nuclear, necrose tumoral, contagem mitótica e embolização vascular linfática, foram comparadas nos diferentes subgrupos. RESULTADOS: Os carcinomas mamários invasivos pouco diferenciados confirmaram sua heterogeneidade. O subtipo luminal foi o mais freqüente (73 casos), seguido pelo subtipo triplonegativo (39 casos) e do subtipo HER2 (22 casos). O subgrupo triplonegativo apresentou a maior proporção de tumores maiores que 2,0 cm , maior freqüência de necrose e a maior taxa de expressão de citoqueratinas basais. Este subgrupo juntamente com o subgrupo HER2 expressaram maiores índices de proliferação celular. O subgrupo HER2 mostrou maior número de casos associados à presença de componente in situ e maior freqüência de detecções de embolização vascular linfática. O subgrupo luminal apresentou o maior número de casos com expressão de citoqueratinas luminais 8/18 e o menor número de tumores maiores que 2,0 cm. Quanto à expressão de citoqueratinas basais, 81 casos não as expressaram e 53 expressaram pelo menos uma delas, a maioria destes casos pertencentes ao subgrupo triplo-negativo. O fenótipo triplo-negativo esteve intimamente relacionado à expressão de citoqueratinas basais. Dentre todas as variáveis estudadas, o único fator preditivo independente associado ao perfil triplo-negativo foi a expressão de citoqueratinas basais (p<0.0001) e o único fator preditivo independente associado à expressão de citoqueratinas basais foi a presença do fenótipo triplo-negativo (p<0,0001). O subgrupo basal-símile (tumores triplo-negativo com expressão de pelo menos uma citoqueratina basal) mostrou a maior freqüência de tumores > 2,0 cm e conjuntamente com o subgrupo triplo-negativo não basal-símile, a maior freqüência de tumores com presença de necrose e com alta contagem mitótica. A comparação entre os carcinomas HER2(+) quanto à expressão de receptores hormonais mostrou maiores indicadores de atividade proliferativa no grupo de receptores hormonais (-). Por outro lado, tumores positivos para os receptores de estrógeno e/ou progesterona com o sem expressão HER2 não mostraram qualquer diferença. CONCLUSÕES: O subgrupo de tumores com receptores hormonais positivos foi o mais freqüente e com características morfológicas e imunoistoquímicas mais favoráveis que os outros subgrupos, independente da expressão de HER2, sugerindo que carcinomas de mama pouco diferenciados com expressão de pelo menos um dos receptores hormonais correspondem ao subtipo luminal B genético. Os carcinomas pouco diferenciados com imunofenótipo triplonegativo e HER2(+) são similares quanto às características morfológicas associadas à doença com potencial agressivo. No entanto, a expressão das citoqueratinas basais diferenciam os dois subgrupos, e pode sugerir o fenótipo basal-símile e o padrão de doença associado a este fenótipo. Nosso estudo mostrou que entre os carcinomas de mama pouco diferenciados de mama, o painel imunoistoquímico clássico (receptores hormonais e HER2) associado à expressão de pelo menos uma das citoqueratinas basais permitem a identificação dos distintos subtipos, equivalentes aos vistos na classificação genética / INTRODUCTION: Histological grade is one of the main prognostic factors for breast cancer. However, poorly differentiated carcinomas still make up a quite heterogeneous group of tumors since they can belong to any of the subgroups according to genetic classification: basal-like, HER2, luminal or normal breast. OBJECTIVES: In this study we have analyzed the frequency of the basic immunohistochemical profiles as for the expression of estrogen and progesterone receptors and HER2 in breast cancer with less than 10% of tubular formation, and their relation with classic prognostic factors, expression of p63, c-Kit, EGFR, VEGF-A, basal and luminal cytokeratins. MATERIAL AND METHODS: This retrospective study included 134 breast carcinomas dated between 2000 and 2003, selected from the files from the Division of Surgical Pathology, University of São Paulo Medical School. All slides were revised and classified according to immunohistochemical expression of estrogen receptor, progesterone receptors and HER2 in luminal (positive hormonal receptors), HER2 (positive HER2 and negative hormonal receptors) and triple-negative. The luminal subgroup was further divided according to expression or absence of HER2. Immunohistochemical marking for p63, cytokeratins 5, 14 and 17 and 8/18, VEGF-A, EGFR, c-Kit was done through tissue microarray. The classical prognostic variables: age, tumor size, lymph node state, nuclear grade, tumor necrosis, mitotic count and lymphatic vascular embolization were compared among the different subgroups. RESULTS: The poorly differentiated invasive breast carcinomas confirmed their heterogeneity. The luminal subtype was the most frequent (73 cases), followed by the triple-negative (39 cases) and HER2 (22 cases). The triple-negative subgroup presented the highest proportion of tumors bigger than 2.0 cm, necrosis and higher basal cytokeratin rate expression. This subgroup as well as HER2 subgroup expressed higher cellular proliferation scores. The HER2 subgroup presented the highest number of cases associated with in situ component and higher frequency of lymphatic vascular embolization detection. The luminal subgroup presented the highest expression of luminal cytokeratins 8/18 and the least number of tumors larger than 2.0 cm. As for basal cytokeratin expression, 81 cases did not present any cytokeratin at all and 53 at least one, most of them belonging to the triple-negative subgroup. The triple-negative phenotype was intimately related to the expression of basal cytokeratins. Among all the variables studied, the only independent predictive factor associated with triple-negative profile was the presence of basal cytokeratin (p<0.0001), and the only independent predictive factor associated with basal cytokeratin expression was the presence of triple-negative phenotype (p<0.0001). The basal like subgroup (triple-negative tumors with the expression of at least one basal cytokeratin) showed the highest frequency of tumors larger than 2.0 cm, and together with the non-basal like, the highest frequency of tumors with necrosis and high mitotic count. The comparison between HER2 (+) carcinomas as far as hormonal receptors, showed higher proliferative activity in the group of negative hormonal receptors. On the other hand, tumors positive for estrogen and/or progesterone receptors with or without HER2 expression did not present any difference. CONCLUSIONS: The tumor subgroup with positive hormonal receptors was the most frequent and with more favorable morphological and imunohistochemical characteristics than the other subgroups, independent of HER2 expression, suggesting poorly differentiated breast carcinomas with the expression of at least one of the hormonal receptors correspond to luminal B genetic subgroup. The poorly differentiated carcinomas with triple-negative and HER2(+) immunophenotype are similar in relation to morphological characteristics associated to the disease with aggressive potential. However, the expression of basal cytokeratins differs the two subgroups and can suggest the basal-like phenotype and the disease evolution associated with it. Our study showed that among poorly differentiated breast carcinomas, the classic immunohistochemical panel (hormonal receptors and HER2) associated with the expression of at least one of the basal cytokeratins, allow the identification of the specific subtypes, similar to the ones seen in genetic classification

A embriogênese somática é uma técnica alternativa com potencial aplicação na propagação clonal de plantas, além de ser uma excelente ferramenta para estudos básicos e análise dos eventos moleculares e bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal. Contudo, apesar de várias pesquisas relativas a embriogênese somática, a falta de conhecimento sobre os fatores que controlam o fenômeno, comprova que existem ainda muitos pontos a serem entendidos sobre o processo. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de estudar a embriogênese somática de duas espécies de citros, as quais apresentam diferentes graus de eficiência na produção de embriões somáticos. Inicialmente, buscou-se avaliar comparativamente o processo de embriogênese somática de duas espécies de citros, observando-se as diferenças estruturais através de análises histológicas e histoquímicas, e as diferenças na expressão do gene AtSERK1 nos calos, através de hibridização in situ. Para instalação dos experimentos, foram utilizados calos provenientes de nucelos de duas espécies, Citrus sinensis L. Osbeck, variedade Valência, e Citrus limonia Osbeck, variedade limão ‘Cravo’. Amostras de calos em meio de multiplicação, em meio de obtenção de embriões, e embriões somáticos nas diferentes fases de desenvolvimento foram coletados para observações anatômicas e histoquímicas através de microscopia óptica e realização de estudo da expressão gênica através de hibridização in situ. Com relação à morfologia, os principais resultados obtidos demonstraram que existem diferenças anatômicas e histoquímicas entre calos de limão ‘Cravo’ e ‘Valência’. Em relação à expressão gênica, os resultados evidenciaram a expressão do gene AtSERK1 em calos das duas espécies de citros, tanto em meio de multiplicação, com sacarose, como em meio de indução, com maltose, indicando que o potencial embriogênico já está instalado no calo em meio de multiplicação. Pode-se concluir também que este gene é conservado entre Arabidopsis e Citrus. Desenvolveram-se, também, experimentos para estudar os efeitos de alguns tratamentos (frio, dessecação, agrupamentos celulares) na otimização da indução e sincronização da embriogênese somática de C. sinensis, var. Valência. Neste sentido, calos nucelares de laranja ‘Valência’, procedentes do meio de multiplicação foram mantidos no mesmo meio líquido em agitador orbital a 200 rpm durante 24h e posteriormente peneirados de acordo com os tratamentos. As peneiras utilizadas apresentaram malhas de 150 µm (P1), 300 µm (P2) e 600 µm (P3). Além do efeito das peneiras também foram observados os efeitos de exposição ao frio (4 o C por quatro semanas, ausência de luz) e dessecação (27 o C, em placas de Petri na ausência de meio de cultura, seis dias, ausência de luz), sendo posteriormente mantidos em B.O.D., a 26 ± 1 o C e intensidade luminosa de 300 lux. Os resultados obtidos permitiram concluir que em relação ao desenvolvimento e produção de embriões somáticos o fator peneira foi superior ao fator estresse na freqüência embriogênica. O desenvolvimento de embriões somáticos em Citrus sinensis ocorre mais eficientemente a partir de agrupamentos celulares de tamanhos específicos. / Somatic embryogenesis is an alternative technique with potential application for clonal propagation of plants, and an excellent tool for basic studies and analysis of the molecular and biochemical events that occur during embryogenesis. However, although many studies have been done, the factors that control somatic embryogenesis are not completely understood. Thus, the present study proposes to evaluate aspects of somatic embryogenesis of two citrus species, which differ in efficiency for the production of somatic embryos. Initially, a comparison of the embryogenic process was done in terms of structural and histochemical analysis and evaluation of the expression of the gene AtSERK1 in callus cultures through in situ hybridization. For the experiments, callus cultures obtained from nucelli of two species, Citrus sinensis L. Osbeck, cv. Valencia, and Citrus limonia Osbeck, cv. Rangpur lime were used for anatomical and histochemical observations, callus samples from cultures in multiplication medium, in embryo induction medium, and somatic embryos in different stages of development were collected. Callus and embryo samples were also collected for analysis of gene expression through in situ hybridization. The anatomical and histochemical analysis showed differences between Rangpur lime and Valencia callus cultures. The in situ hybridization results evidenced the expression of the gene AtSERK1 in cultures of both citrus species, and also in both culture conditions: multiplication medium, with sucrose, and embryo induction medium, with maltose, indicating that the embriogenic potential is already installed in the callus cultures in multiplication medium. The results also lead to the conclusion that the gene is conserved between Arabidopsis thaliana and Citrus. Experiments aiming to synchronize the somatic embryogenesis formation in C. sinensis, cv. Valencia, were installed testing the effect of cold, desiccation and cell cluster size on somatic embryo formation. For that, callus cultures of ‘Valência’ sweet orange were cultivated in liquid medium in an orbital shaker, at 200 rpm, for 24h, and sieved through the following screens: 150 µm (P1), 300 µm (P2) and 600 µm (P3). The cell aggregates were then exposed to cold (4 o C, for four weeks, in the dark) and desiccation (27 o C, in Petri plates without culture medium, six days, in the dark) treatments, and cultured in incubators at 26 ± 1 o C and 300 lux of light intensity. The results lead to the conclusion that the separation of cultures in clusters of different sizes and the stress treatments were effective for synchronization and embryogenesis frequency. The size of cell clusters was the most important factor.

Introdução. A enzima iodotironina desiodase tipo 2 (D2) converte o pró-hormônio T4 em sua forma ativa, T3, um passo essencial no metabolismo da tiróide. O polimorfismo Tre92Ala no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações. Interessantemente, um estudo recente relatou que o polimorfismo D2 Tre92Ala interage com o polimorfismo Pro12Ala, no gene que codifica o fator de transcrição PPARγ2, na modulação da síndrome metabólica em indivíduos nãodiabéticos, sendo que os portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentam os piores fenótipos de síndrome metabólica e pressão arterial sistólica e diastólica. Objetivos. Avaliar o efeito isolado ou combinado dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação da resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Material e Métodos. Os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala foram genotipados em 711 pacientes com DM2 brancos, utilizando-se a técnica de discriminação alélica por PCR em tempo real. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um exame físico completo e a exames laboratoriais padrões. A resistência à insulina foi avaliada através do cálculo do índice HOMA (Homeostasis Model Assessment) em um subgrupo de 215 pacientes sem uso de insulina e com creatinina sérica < 1,5mg/dL. Resultados. As frequências dos alelos D2 92Ala e PPARγ2 12Ala foram 0,32 e 0,076, respectivamente, e suas frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy- Weinberg (p > 0,05). Pacientes com o genótipo D2 Ala/Ala apresentaram níveis mais altos de insulina plasmática no jejum e índice HOMA quando comparados com pacientes portadores dos genótipos Tre/Ala ou Tre/Tre (p = 0,015 e p = 0,001; respectivamente). Além disso, um efeito sinérgico significativo foi observado entre os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação do índice HOMA: portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentaram valores mais elevados de HOMA (mediana 8,5 [valor máximo 28,2 - valor mínimo 1,3]) do que os pacientes portadores das outras combinações genotípicas destes polimorfismos (4,0 [17,6-0,3] no grupo de pacientes com os genótipos D2 Tre/Tre - PPARγ2 Pro/Pro, 5,8 [35,2-0,9] no grupo D2 Ala/Ala - PPARγ2 Pro/Pro e 3,5 [17,2-0,5] no grupo D2 Tre/Tre- PPARγ2 12Ala), após ajuste para sexo, idade e índice de massa corporal (p da interação = 0,010). Conclusões. Pacientes com DM2 portadores dos genótipos D2 Ala/Ala e PPARγ2 12Ala apresentam níveis mais severos de resistência à insulina quando comparados aos pacientes com outras combinações genotípicas dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala. Isso sugere que esses dois polimorfismos interagem na modulação da resistência à insulina em indivíduos brancos, o que pode constituir um alvo terapêutico potencial.