A elucidação dos eventos fisiológicos, pelos quais os esteroides ovarianos atuam no desenvolvimento endometrial de novilhas pré-púberes, é fundamental para o emprego de ferramentas de manejo reprodutivo que reduzam a idade ao primeiro parto e aumentem a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Objetivou-se com este estudo averiguar os efeitos de implante de liberação sustentada de progesterona (DIB) e da manipulação do crescimento folicular, através de aspiração folicular transvaginal (AFTV), sobre mecanismos moleculares de genes modulados pela progesterona (P4) e pelo estradiol (E2) no endométrio de novilhas Nelore pré-púberes. 60 novilhas com 13,9 ± 2,9 meses, peso de 273,6 ± 5,6 kg, escore de condição corporal 5,9 ± 0,7, em uma escala de 0 a 9, sem sinais de ovulação, foram aleatoriamente e equitativamente distribuídas em quatro estratégias hormonais: 1) AFTV1 sem DIB®: submetidas a aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassonografia um dia antes do abate (AFTV1), sem o emprego de DIB; 2) AFTV4 sem DIB: também sem DIB e submetidas a aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassonografia quatro dias antes do abate (AFTV4); 3) AFTV1 com DIB® submetidas a uso de dispositivo intravaginal de liberação sustentada de progesterona (DIB®, MSD Saúde Animal Brasil), usado previamente por duas vezes em vacas Bos indicus e AFTV1; Grupo 4; com DIB® e AFTV4. Ao final do experimento, 35 animais, que não apresentaram presença de corpo lúteo, foram abatidos e tiveram seus úteros dissecados no lado ipso e contralateral, levando-se em consideração o maior diâmetro de folículo um dia antes do abate. Para a extração do ácido ribonucleico (RNA) total foram selecionados tecidos intercarunculares, obtidos das porções do terço médio do corno uterino direito e esquerdo, de seis animais de cada tratamento, totalizando 48 amostras de RNA total. Após a extração do RNA total e síntese do ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA), a abundância dos transcritos foi avaliada empregando PCR em tempo real. Para estudar a regulação endometrial dos receptores de esteroides, foi mensurada a expressão relativa do: receptor de estrógenos alpha (ESR1) e beta (ESR2), receptor de progesterona isoformas A (PGR1), B (PGR2) e C (PGR3), receptor componente de membrana 1 (PGRMC1) e 2 (PGRMC2). Assim como de genes envolvidos em vias de resposta a P4 e ao E2: AQP4 (transporte de água), EGFR, FGF2, FGF2R, VEGFA, WNT5A (proliferação celular), OXTR, LPL, LTF, SERPINA14, SLC2A1 (atividade secretória), MMP2, MMP9 (remodelamento de matriz extracelular) e MUC1 (adesão celular). O GAPDH foi utilizado como gene constitutivo para correção dos resultados de expressão gênica. Os dados foram submetidos a análise de variância, utilizando o PROC MIXED do SAS 9.3. Houve interação entre os efeitos de corno uterino, DIB e AFTV sobre a expressão relativa de ESR1 (P = 0,05); EGFR (P = 0,05); PGR1 (P = 0,02); FGF2 (P = 0,01); FGFR2 (P = 0,10) e LPL (P = 0,04). Também foi verificado interação AFTV x corno uterino sobre a expressão relativa de PGR3 (P = 0,07); PGRMC1 e 2 (P = 0,02; P = 0,01), respectivamente; AQP4 (P = 0,09); MUC1 (P = 0,03); SLC2A1 (P = 0,09). Ocorreu interação DIB x corno uterino sobre a expressão relativa de PGRMC1 e 2 (P = 0,05; P = 0,03), respectivamente; AQP4 (P = 0,09) e OXTR (P = 0,08). E interação AFTV x DIB sobre a expressão de VEGFA (P = 0,09); MMP9 (P = 0,09); WNT5A (P = 0,01); SLC2A1 (P = 0,01). Enquanto que a expressão relativa da SERPINA14 foi influenciada pelo DIB (P = 0,02) e localização do corno uterino (P = 0,05). Estes resultados confirmam a complexa modulação dos receptores de esteroides ovarianos pela presença de DIB® e dia da AFTV, na alteração da ação biológica de genes alvos, no tecido endometrial de novilhas Nelore pré-púberes. Baixos diâmetros foliculares próximo ao abate, aumentaram a expressão relativa de MUC1 no corno contralateral, sugerindo uma menor receptividade neste. Ademais, o aumento do peso uterino em função da inclusão do DIB, possivelmente seja uma consequência da maior abundância de transcritos de SERPINA14 e AQP4, mediados principalmente pelo PGRMC1 e PGRMC2. / The elucidation of the physiological events by which ovarian steroids act on endometrial development of pre-pubertal Nellore heifers, is critical for the for the use of reproductive management tools that reduce the age of first calving and increase the slaughter rate of the Nellore herd. The objective of this study was to investigate the effects of progesterone sustained release implant (DIB) and manipulation of follicular growth, through transvaginal follicular aspiration (TFA), on molecular mechanisms of genes modulated by progesterone (P4) and estradiol (E2) in the molecular mechanisms involved in the endometrial development of pre-pubertal Nellore heifers. Sixty heifers with 13.9 ± 2.9 months of age, weight of 273.6 ± 5.6 kg, body condition score 5.9 ± 0.7, on a scale from 0 to 9, without signs of ovulation, were randomly and evenly distributed into four hormonal strategies: 1) TFA1 without DIB®: submitted to transvaginal follicular aspiration guided by ultrasonography one day before slaughter (TFA1), without the use of DIB; 2) TFA4 without DIB®: also without DIB and submitted to transvaginal follicular aspiration guided by ultrasound four days before slaughter (TFA4); 3) TFA1 with DIB®: Submitted to the use of intravaginal progesterone sustained release device (DIB®, MSD Animal Health Brazil), previously used twice in Bos indicus cows and TFA1; Group 4; with DIB® and TFA4. At the end of the experiment, 35 animals, which did not present a corpus luteum, were slaughtered and had their uterus dissected on the ipso and contralateral sides, taking into account the largest follicle diameter one day before slaughter. For the extraction of total ribonucleic acid (RNA), intercaruncular tissues were obtained from the middle third of the right and left uterine horns of six animals from each treatment, totaling 48 samples of total RNA. After extraction of total RNA and complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis, abundance of the transcripts was assessed using real-time PCR. To study the endometrial regulation of steroid receptors, the relative expression of: alpha (ESR1) and beta (ESR2) estrogen receptor, progesterone receptor isoforms A (PGR1), B (PGR2) and C (PGR3), membrane component receptor 1 (PGRMC1) and 2 (PGRMC2). As well as genes involved in P4 and E2 response pathways: AQP4 (water transport), EGFR, FGF2, FGF2R, VEGFA, WNT5A (cell proliferation), OXTR, LPL, LTF, SERPINA14, SLC2A1 (secretory activity), MMP2, MMP9 (extracellular matrix remodeling) and MUC1 (cell adhesion). GAPDH was used as a constitutive gene for the correction of gene expression results. The data were submitted to analysis of variance, using PROC MIXED of SAS 9.3. There was interaction between the effects of uterine horn, DIB and TFA on the relative expression of ESR1 (P = 0.05); EGFR (P = 0.05); PGR1 (P = 0.02); FGF2 (P = 0.01); FGFR2 (P = 0.10) and LPL (P = 0.04). It was also verified the TFA x uterine interaction on the relative expression of PGR3 (P = 0.07); PGRMC1 and 2 (P = 0.02, P = 0.01, respectively); AQP4 (P = 0.09); MUC1 (P = 0.03); SLC2A1 (P = 0.09). DIB x uterine interaction occurred on the relative expression of PGRMC1 and 2 (P = 0.05; P = 0.03, respectively); AQP4 (P = 0.09) and OXTR (P = 0.08). And TFA x DIB interaction on VEGFA expression (P = 0.09); MMP9 (P = 0.09); WNT5A (P = 0.01); SLC2A1 (P = 0.01). While the relative expression of SERPINA14 was influenced by DIB (P = 0.02) and location of the uterine horn (P = 0.05). These results confirm the complex modulation of ovarian steroid receptors by the presence of DIB® and TFA day in the alteration of the biological action of target genes in the endometrial tissue of prepubertal Nellore heifers. Low follicular diameters close to slaughter, increased the relative expression of MUC1 in the contralateral horn, suggesting a lower receptivity. In addition, increased uterine weight as a function of the DIB® inclusion is possibly a consequence of the greater abundance of SERPINA14 and AQP4 transcripts, mainly mediated by PGRMC1 and PGRMC2.

Tem se tornado evidente que a iniciação e a progressão do câncer depende de vários componentes do microambiente tumoral, incluindo células inflamatórias e imunes (linfócitos, macrófagos e mastócitos), fibroblastos, células endoteliais, adipócitos e matriz extracelular. De maneira geral, esses componentes são conhecidos como estroma. Tanto interações pró- como anti-tumor ocorrem entre um câncer e suas células vizinhas. Em um estudo prévio, avaliamos dados de bibliotecas SAGE de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) usando ferramentas estatísticas e de bioinformática e pudemos identificar os genes mais e menos expressos em tumores metastáticos versus não metastáticos e em tumores versus tecidos normais. Em outro estudo, avaliamos fatores parácrinos solúveis produzidos por células do estroma e por células neoplásicas que poderiam influenciar proliferação e expressão gênica e protéica. Ambos os estudos identificaram marcadores potenciais associados a respostas inflamatórias ou imunes. Dezenove desses genes foram selecionados por PCR em tempo real e o estudo foi realizado nas linhagens SCC-9 de células epiteliais neoplásicas e de fibroblastos isolados de um câncer oral, e em 40 amostras de carcinomas primários de cabeça e pescoço (6 amostras micro e 34 macrodissecadas). Nós também utilizamos eletroforese unidimensional para analisar a expressão protéica nesse conjunto de amostras. Como a microdissecção produziu baixas concentrações de RNA e proteínas, ciclos extras de amplificação de mRNA foram necessários para obter material suficiente para experimentos de PCR. Nossos dados mostraram que os perfis de expressão foram provavelmente pouco preservados durante os ciclos extras de amplificação. Em amostras macrodissecadas, nós consistentemente observamos que o nível de transcritos de MGLL, COX2, EP3, EP4 e LTAH4 estava reduzido, porém presente nas suas margens cirúrgicas. Os dados não confirmaram, em células de CECP, a hipótese de que MGLL produz menssageiros lipídicos oncogênicos, esta via pode não atuar nesses pacientes. Nós também observamos que metaloproteinases são expressas em níveis elevados em CECP e devem estar envolvidas na degradação da matriz extracelular. Células neoplásicas e do estroma desses carcinomas exibem uma ampla variedade de proteínas com níveis muito diferentes de expressão. Este resultado abre perspectivas para realização de experimentos de validação / It has become evident that cancer initiation and progression depends on several components of the tumor microenvironment, including inflammatory and immune cells (lymphocytes, macrophages and mastocytes), fibroblasts, endothelial cells, adipocytes, and extracellular matrix. Collectively, these components are known as the stroma. Both pro- and anti-tumor interactions occur between a tumor and its surrounding cells. In a previous study, we evaluated data from SAGE libraries of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) using statistical and bioinformatic tools and we could identify top-up and top-downregulated genes in metastatic versus non-metastatic tumors and in tumors versus normal tissues. In another study, we evaluated soluble paracrine factors produced by stromal and neoplastic cells which may influence proliferation and gene and protein expression. Both studies identified potential markers associated with immune or inflammatory response in head and neck tumorigenesis. Nineteen of these genes were selected for real-time polymerase chain reaction (PCR) and the study was carried out on the epithelial cancer cell line SCC-9 and on fibroblasts isolated from an oral cancer, and in 40 samples from primary HNSCC (6 micro and 34 macrodissected samples). We also used one-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry to analyze protein expression in this set of samples. As microdissection yielded low RNA and protein concentrations, extra rounds of mRNA amplification were necessary to obtain sufficient material for PCR experiments. Our data showed that expression profiles were probably scantily preserved during the extra rounds of amplification. In macrodissected samples, we consistently observed that the level of MGLL, COX2, EP3, EP4 e LTAH4 transcripts was low in most tumors but present in their surgical margins. The data do not confirm in HNSCC the hypothesis that MGLL produces oncogenic lipid messengers, this pathway may not act in these patients. We also observed that metalloproteinases are overexpressed in HNSCC and should be involved in extracellular matix degradation. Neoplastic and stromal cells from HNSCC exhibit a wide variety of proteins with very different levels of expression. This result opens the perspective to perform validation experiments.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-05-10T13:31:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Joao_Rincon.pdf: 556226 bytes, checksum: 4a007415811b4e9e1e48111cf2119070 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-05-10T13:42:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Joao_Rincon.pdf: 556226 bytes, checksum: 4a007415811b4e9e1e48111cf2119070 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T13:42:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Joao_Rincon.pdf: 556226 bytes, checksum: 4a007415811b4e9e1e48111cf2119070 (MD5) Previous issue date: 2015-02-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Estudos sugerem que a enzima paraoxonase-1 (PON1) pode exercer efeito antioxidante nas membranas celulares, o que poderia melhorar a competência do oócito, principalmente por reduzir o estresse oxidativo. Baseado nisso, objetivou-se avaliar o efeito da adição de diferentes níveis de PON1 recombinante humana (rPON1) ao meio de maturação (MIV), sobre os índices de desenvolvimento embrionário e expressão gênica em oócitos e embriões bovinos. Em 8 repetições, 1600 complexos cumulus oócitos (COCs) foram coletados de ovários bovinos provenientes de abatedouros locais e divididos aleatoriamente em quatro grupos de 50 COCs: 0,0; 0,02; 0,04 e 0,08mg/mL de rPON1 no meio de MIV. A maturação ocorreu em estufa com 5% de CO2 e 39 °C durante 24 horas. Após a seleção espermática, com a utilização do mini percoll®, foi procedida a fecundação (FIV) com concentração de 1x106 espermatozóides/mL. Decorridas 18 horas os prováveis zigotos foram cultivados durante 7 dias no meio de cultivo adicionado de 10% de SFB em condições controladas (5% CO2, 5% O2 e 90%N2) à 39 °C. Foram coletados oócitos desnudos e células do cumulus (600 COCs, 3 repetições) e embriões D7 (8 repetições) para extração de RNA e análise da expressão gênica (Bax, Bcl-2 e MnSOD). A atividade de PON1 foi avaliada às 0 e 24hs de maturação mediante espectrofotometria. A atividade média de PON1 no meio de MIV foi de 2,15±0,38; 15,51±1,48; 30,24±2,96 e 57,94±5,03 U/mL de acordo à adição de rPON1 ao meio de MIV (0; 0,02; 0,04 e 0.08 mg/mL respectivamente). Não houve diferença (P>0,05) nas taxas de clivagem: 81,7%, 85,1%, 81,0%, 82,5% respectivamente. No entanto, a adição de rPON1 no meio de MIV melhorou o desenvolvimento embrionário de maneira linear (P<0,0001) de acordo com a quantidade de proteína adicionada, resultando na produção de embriões em D7 de 22,1%; 29,2%; 31,7% e 33,8% respectivamente. Além disso, este efeito foi suportado pela correlação positiva entre o nível de rPON1 no meio de MIV e a taxa de blastocisto no D7 (r=0,35; P=0,04). Não foi observada diferença na expressão dos genes avaliados nos oócitos, células do cumulus e embriões. Conclui-se que a adição de rPON1 no meio de MIV tem um efeito positivo na PIV de embriões bovinos, indicando que a PON1 promove uma melhor taxa de desenvolvimento embrionário. / Some studies suggest that the enzyme paraoxonase-1 (PON1) can exert antioxidant effects on cell membranes, thereby improving the competence of the oocyte, particularly by reducing oxidative stress. Based on this, the aim of the current study was to evaluate the effect of different levels of human recombinant PON1 (rPON1) in the maturation medium, on embryo development and gene expression in bovine oocytes and embryos. The study was performed in 8 repetitions, using 1600 cumulus oocyte complexes (COCs) collected from bovine ovaries at local slaughterhouses and divided randomly into four groups of 50 COCs each containing 0.0; 0.02; 0.04 and 0.08 mg/mL rPON1 in the IVM medium. Maturation occurred in the incubator at 5% CO2 and 39 °C for 24 hours. After the sperm selection using the mini Percoll®, IVF was performed with a sperm concentration of 1x106/ml. After 18 hours, presumptive zygotes were cultured for 7 days using IVC medium with the addition of 10% FBS under controlled conditions (5% CO2, 5% O2 and 90% N2) at 39˚C. In addition, denuded oocytes and cumulus cells (600 COCs, 3 repetitions) and D7 embryos (8 repetitions) were collected for RNA extraction and gene expression analysis (Bax, Bcl-2 and MnSOD). PON1 activity was evaluated at 0 and 24 hours of maturation by spectrophotometry. The average PON1 activity in the IVM medium was 2.15±0.38; 15.51±1.48; 30.24±2.96 and 57.94±5.03 U/mL according to the addition of 0.0; 0.02; 0.04 and 0.08 mg/mL of rPON1 in the IVM medium. There was no difference (P>0.05) in cleavage rates among treatments: 81.7%; 85.1%; 81.0%. 82.5% respectively. However, the addition of rPON1 to the IVM medium improved embryo development linearly (P<0.0001), resulting in D7 embryo production of 22.1%, 29.2%, 31.7% and 33.8%, respectively. Moreover, this effect was supported by the positive correlation between the level rPON1 in the IVM medium and the D7 blastocyst rate (r=0.35; P=0.04). There was no difference in gene expression in oocytes, cumulus cells and embryos. Finally, the addition of rPON1 in the IVM medium had a positive effect on the IVP of bovine embryos, indicating that PON1 improves embryo rate.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-02Bitstream added on 2014-06-13T19:00:56Z : No. of bitstreams: 1 queiroga_mr_dr_rcla.pdf: 2000308 bytes, checksum: 50e869bf9200e48db5cc5fe6f2f5f876 (MD5) / Estudos experimentais revelam que uma baixa aptidão cardiorrespiratória (VO2máx) está associada a distúrbios moleculares e bioquímicas que influenciam a sensibilidade e a secreção de insulina. Contudo, não está bem definido se esta associação é confundida por fatores genéticos. Utilizando o modelo de controle de casos (gêmeos monozigóticos (MZ) discordantes) este estudo, de caráter transversal, avaliou 38 pares de gêmeos MZ com idade entre 11 a 18 anos, dos quais nove pares demonstraram diferença média intra-par para o VO2máx de 13,5±3,7 ml.kg-1.min-1 (30,6±9,5%). O objetivo foi investigar o impacto da discordância no VO2máx nas concentrações bioquímicas de glicose, insulina, lipídios, leptina, interleucina 6 e na expressão do mRNA dos genes SUR1, KIR6.2, IL6, LEPTINA e PPARg, independente de efeitos genéticos. Foram obtidas as medidas antropométricas de massa corporal, estatura, circunferência da cintura (CC) e espessuras de dobras cutâneas (EDC). Um teste de esforço máximo em esteira rolante com análise direta dos gases foi utilizado para a determinação do VO2máx e uma colheita de sangue em jejum e pós-carga de glicose (TOTG) para a realização de exames laboratoriais, extração dos genes e estimativa do índice HOMA-RI e HOMA-β. A expressão do mRNA dos genes foi quantificada e avaliada por RT-PCR enquanto as variáveis laboratoriais foram determinadas por kits específicos. Os resultados revelaram maior adiposidade corporal (soma de 6 EDC), índice HOMA (RI e β), concentração sanguínea de leptina, insulina em jejum e pós-carga (2 h) favorecendo as meninas, enquanto os meninos demonstraram maior VO2máx. Correlação negativa foi observada entre o VO2máx e os indicadores de obesidade (IMC, CC e adiposidade), índice HOMA (RI e β) e concentração sanguínea de leptina, insulina em jejum e pós-carga (2 h)... / Experimental studies have shown that low cardiorespiratory fitness (VO2max) is associated with molecular and biochemical disturbances that influence insulin sensitivity and secretion. However, it is not defined whether this association is confounded by genetic factors. Using the monozygotic co-twin case-control, this cross-sectional study evaluated 38 MZ twins pairs from 11 to 18 years of age, of which nine pairs presented a mean intrapair difference in VO2max of 13.5 ± 3.7 ml.kg-1.min-1 (30.6 ± 9.5%). The objective was to investigate the impact of the discordances of VO2max on biochemical concentrations of glucose, insulin, lipids, leptin, and interleukin 6, as well as in genes SUR1, Kir6.2, IL6, leptin and PPARgamma mRNA expression, independent of genetic effects. We obtained the anthropometric measures of body weight, height, waist circumference (WC) and skinfold thickness (ST). The maximal treadmill test with direct analysis of inhaled and exhaled gases was used for determination of VO2max, as well as fasting and oral glucose tolerance tests (OGTT) blood sample collections for laboratory analysis, gene extraction and estimation of HOMA-IR and HOMA-β indexes. mRNA genes expression was quantified and evaluated by RT-PCR, while laboratory variables were determined using specific kits. The results showed greater body adiposity (sum of 6 STs), HOMA (IR and β) indexes, blood leptin concentration and fasting and post load (2 h) insulin levels in girls, while boys showed greater VO2max. Negative correlation was found between VO2max and indicators of obesity (BMI, WC and fatness), HOMA (IR and β) indexes and blood leptin concentration and fasting and post load (2 h) insulin levels and positive correlation with PPARgamma gene expression. Regarding the discordant pairs, we observed that the co-twins with the highest VO2max values (45.9 ± 10.0 ml.kg-1.min-1) had significanty... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-05-20Bitstream added on 2014-06-13T18:41:10Z : No. of bitstreams: 1 marcarini_jc_dr_rcla_parcial.pdf: 265800 bytes, checksum: c6fbdf9127d68f8975699df1a232d5e7 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:00:57Z: marcarini_jc_dr_rcla_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:19Z : No. of bitstreams: 1 000728824_20161231.pdf: 225457 bytes, checksum: 79edd21e91fa8d3d9aa45c8fb9480f5f (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:49Z: 000728824_20161231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:07Z : No. of bitstreams: 1 000728824.pdf: 1493773 bytes, checksum: 9b305297fa111e5b9636e58999da953b (MD5) / Há um interesse crescente na investigação de substâncias de origem natural como os flavonóides, devido ao grande número de evidências dos benefícios que eles proporcionam para a saúde, principalmente reduzindo o desenvolvimento de doenças crônicas. Nesse contexto, a rutina é um flavonóide que tem sido bem caracterizado na literatura por apresentar uma variedade de atividades farmacológicas incluindo propriedades antiinflamatória, antialérgica, antimutagênica, imunomoduladora e hepatoprotetora. Estes efeitos protetores atribuídos a rutina estão relacionados, em grande parte, à sua propriedade antioxidante direta, no entanto, as vias moleculares e os mecanismos de ação desses processos são pouco conhecidos. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos citotóxicos, genotóxicos e protetores do flavonóide rutina em concentrações fisiológicas relevantes in vtiro. Para isso, foram utilizadas quatro linhagens de células tumorais: HTC (hepatoma de Rattus norvegicus); HepG2 (hepatoma humano); HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano) e 786-O (carcinoma renal humano). Os resultados obtidos com as células HTC mostraram que a concentração de 810 uM de rutina não foi citóxica, apresentou efeito genotóxico e não alterou a expressão dos genes GSTa2 e p38, relacionados ao metabolismo de drogas e controle do ciclo celular, respectivamente. Além disso, a análise dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN H1) dos metábolitos das células expostas a concentração genotóxica da rutina (810uM), revelou menores níveis de fosfocolina, glicerofosfocolina, creatina, lactato, acetato e glutationa. A análise dos resultados das linhagens HepG2 e HT-29 revelou que 100 μM de rutina foi citotóxica e reduziu a expressão e a atividade das principais enzimas antioxidantes endógenas: superóxido dismutase... / There is growing interest in the investigation of naturally occurring substances such as flavonoids, due to the large volume of evidence of the benefits they provide for health, mainly by reducing the development of chronic diseases. In this context, rutin is a flavonoid that has been well characterized in the literature by presenting a variety of pharmacological activities including antiinflammatory, antiallergic, antimutagenic, immunomodulating and hepatoprotective. These protective effects attributed to rutin are related in large part to their direct antioxidant properties, however, the molecular pathways and mechanisms of action of these processes are poorly understood. Thus, the objective of this study was to investigate the cytotoxic, genotoxic and protective flavonoid rutin in the relevant physiological concentrations in vtiro. Therefore, it was using four different strains: HTC (Rattus norvegicus hepatocellular); HepG2 (Human carcinoma), HT-29 (human colon adenocarcinoma) and 786- O (human kidney carcinoma). The results obtained with HTC cells showed that the concentration of 810 UM genotoxic effect of rutin showed no changes in gene expression GSTa2 and p38, related to drug metabolism and cell cycle control, respectively. In addition, NMR analysis of cells exposed to the genotoxic concentration rutin (810 UM) revealed lower levels of phosphocholine, glicerphosphocholine, creatine, lactate, acetate and glutathione. The results of the lines HepG2 and HT-29 revealed that 100 UM of rutin was cytotoxic and reduced the expression and activity of the major endogenous antioxidant enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (Gr). On the other hand, 10 UM of rutin did not alter the viability and kinetics of cell proliferation, significantly increased the... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Banca: Henk W. Hilhorst / Banca: Julio Maia de Oliveira / Banca: Renato Delmondez de Castro / Banca: Maria Laene Moreira de Carvalho / Resumo: O Brasil é o segundo maior produtor de soja do mundo e maior parte da produção se encontra nas áreas tropicais do país, mais propensas à ocorrência de seca e de altas temperaturas. Sob tais condições estressantes é comum a ocorrência de retenção de clorofila nas sementes ao final da maturação. Muito pouco se sabe a respeito do papel da clorofila em sementes em desenvolvimento, mas a presença de tal pigmento em sementes oleaginosas aumenta a oxidação do óleo extraído, resultando em redução na vida de prateleira, aparência desagradável e consequentemente preços mais baixos pagos ao produtor. A qualidade fisiológica das sementes também é severamente afetada. Além das condições ambientais, fatores genéticos também controlam a susceptibilidade à retenção de clorofila. Caracterização detalhada da produção de sementes verdes por duas cultivares conduzidas sob condições de estresse e os efeitos sobre a qualidade fisiológica das sementes foi realizada. Na tentativa de determinar os mecanismos moleculares da degradação de clorofila em sementes e consequentemente sua retenção, uma análise de transcriptoma foi conduzida utilizando-se sementes estressadas (verdes) e não estressadas (amarelas) de soja em três estádios de maturação; R6, R7 and R8. Múltiplas ontologias foram significativamente afetadas pelo estresse. Entre as mais alteradas estão os processos fotossintéticos, particularmente a categoria fotossistema II. A análise de expressão gênica sugere aumento na expressão das proteínas D1 (psbA), D2 (psbD), A1 (psaA) e A2 (psaB), subunidades principais dos fotossistemas II e I, em sementes estressadas/verdes. Atenção especial também foi dada a enzimas do catabolismo de clorofila e a genes stay-green, dentre os quais, distúrbios na expressão de PPH2, D1 e D2 podem ser a principal causa da retenção de clorofila em sementes de soja / Abstract: Brazil is the second largest soybean producer in the world and most of its production is located in the tropical area of the country which is prone to drought and high temperature. Under such stressful conditions it is common to observe the retention of chlorophyll at the end of seed maturation. Very little is known about the role of chlorophyll in developing seeds, but its presence in oilseeds enhances oxidation of the extracted oil, resulting in reduced shelf life, unappealing appearance and a lower price for the producer. Also seed quality for propagation is severely affected by chlorophyll retention. Besides environmental conditions, there are also genetic components controlling the sensitivity of different cultivars to retain chlorophyll. A detailed characterization of green seed production by two different cultivars under stressed conditions and its effect on seed lot quality was carried out. In an attempt to determine the molecular basis of chlorophyll degradation and, consequently, its retention, a transcriptome analysis was performed using stressed (green) and non-stressed (yellow) soybean seeds at three stages of maturation: R6, R7 and R8. Multiple ontologies were enriched in soybean seeds produced under stress. Among the top-ranking was the photosynthetic process, particularly the photosystem (PS) II category. The expression analysis suggests higher levels of the proteins D1 (psbA), D2 (psbD), A1 (psaA) and A2 (psaB) core subunits of PSII and PSI, in stressed/green seeds. Special attention was also given to chlorophyll catabolic enzymes and to stay-green genes, among which, disturbances in expression of PPH2, D1 and D2 caused by environmental stresses appears to be the major cause for chlorophyll retention in soybean seeds. / Doutor

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Banca: Renato Ferretti / Banca: Francis Lopes Pacagnelli / Banca: Célia Regina Nogueira / Banca: Maeli Dal Pai Silva / Resumo: Os microRNAs (miRNAs) representam uma classe de pequenos RNAs não codificantes reconhecidos como importantes reguladores pós-transcricionais da expressão de genes durante o desenvolvimento e em doenças como a insuficiência cardíaca (IC). Embora não haja um consenso de que terapias adjuvantes para as doença cardiovasculares sejam capazes de aumentar a qualidade de vida e as taxas de sobrevivência; uma terapia não-farmacológica, como o treinamento físico (TF) pode reduzir a uma série de fatores de risco cardiovasculares e tem sido reconhecida como uma estratégia segura para a prevenção e tratamento da IC. Portanto, avaliamos o efeito do TF prescrito durante a transição da hipertrofia cardíaca para IC no perfil global de miRNAs cardíacos. A hipertrofia ventricular e a IC foi induzida a partir da bandagem da aorta (estenose aórtica-EA) por um grampo de aço inoxidável (n=10). Os animais utilizados como Controle (CT) foram operados sem a colocação do clip (n = 5). Dezoito semanas após a cirurgia, quando os animais com EA apresentavam disfunção ventricular, detectada por ecocardiograma, os ratos foram aleatoriamente separados em dois grupos: 10 semanas de treinamento físico supervisionado (IC-TF, n = 5) ou grupo sedentário controle (IC-S, n = 5). Por fim a IC, foi confirmada pelos dados clínicos e da remodelação cardíaca por dados morfológicos e funcionais obtidos por ecocardiograma. Os níveis de expressão de 373 miRNAs do ventrículo esquerdo foram avaliados por PCR quantitativa em tempo real usando TLDA (TaqMan Rodent microRNA Array - cartões de A + B) no Sistema ABI ViiA7 (Life Technologies, EUA) e a quantidade relativa média (RQ) foi calculada utilizando-se do método do Ct comparativo. Os miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos foram os que apresentaram alteração > 1,5 vezes e P <0,05 (teste t de Student). No final do experimento (28 semanas), o TF atenuou os sinais clínicos ... / Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that have gained status as important regulators of post-transcriptional gene expression during development and in certain diseases such as heart failure (HF). Although there is no consensus that adjuvant therapies for cardiovascular disease are able to increase patients' quality of life and survival rates a non-pharmacological therapy, exercise training (ET) can reduces a number of cardiovascular risk factors and has been recognized as an important and safe strategy for preventing and treating heart failure. Therefore, we evaluate the effects of ET prescribed during the transition from cardiac hypertrophy to heart failure on cardiac micro-RNA profile. We employed ascending aortic stenosis (AS) to induce heart failure in Wistar male rats (n=10) by a stainless-steel clip. Sham-operated animals (n=5) were used as controls. Eighteen weeks after surgery, when AS animals presented ventricular dysfunction, detected by echocardiogram, rats were randomized to 10 weeks of supervised exercise training (HF-ET, n=5) or to a control sedentary group (HF-S, n=5). At the end of the experiment, heart failure was evaluated by clinical data and the cardiac remodeling by morphologic and functional data obtained by echocardiogram. The expression levels of 373 miRNAs from left ventricles were measured by real-time quantitative PCR using TaqMan Rodent microRNA Array (cards A + B) on an ABI ViiA7 Sequence Detection System and the mean relative quantity (RQ) was calculated and miRNAs differentially expressed between groups were defined as those with >1.5-fold change and P<0.05 (two sample, two tailed Student's t-test). At the end of the experiment (28th wks), exercise training attenuated the clinical and pathological signs of HF. It also attenuated cardiac remodeling with maintenance of systolic and diastolic function. Moreover, miRNAs analysis revealed that thirty-five ... / Mestre

Orientador: Cesar Martins / Coorientador: Guilherme Targino Valente / Banca: Marcelo Ricardo Vicari / Banca: Danilo Pinhal / Resumo: Cromossomos B, também conhecidos como supernumerários, são considerados elementos dispensáveis ao organismo. Porém, alguns estudos têm apresentado evidências de uma possível funcionalidade destes cromossomos extras. São encontrados em muitas espécies de eucariotos, entre elas, Astatotilapia latifasciata, ciclídeo africano que possui de 1 a 2 cromossomos B. Os ciclídeos têm sido muito utilizados como organismos modelo para estudos genéticos e genômicos. Análises genômicas em larga escala prévias envolveram sequenciamento por next generation (Illumina HiSeq sequencing) de genomas sem cromossomo B (B-) e com cromossomo B (B+) de A. latifasciata e uma forma variante do gene hnRNP Q-like (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q-like) foi identificada. Esta sequência apresenta um alto número de cópias e características de retrogene no cromossomo B. Diante disso, foi objetivo do presente trabalho compreender a organização genômica, identificar os mecanismos de retro-inserção e fazer análises de expressão desta sequência, possibilitando um melhor entendimento da origem, evolução e possíveis efeitos deste cromossomo na espécie estudada. A partir de análises de bioinformática foram identificadas cópias variantes do gene hnRNP Q-like no genoma B+ e as regiões mais representativas foram selecionadas, de acordo com o grau de mutações, para demais estudos. Análises de fragmentos sequenciados e qPCR confirmaram que o gene possui maior número de cópias e ausência de íntrons no cromossomo B. Evidências de resquícios de domínios da transcriptase reversa de elementos transponíveis sugerem que o gene foi retroinserido no cromossomo B. Dados de qPCR em cDNA mostraram que, apesar de possuir mais cópias no genoma B+, o gene hnRNP Q-like não é diferencialmente expresso nos genomas B+ e B- / Abstract: B chromosomes, also known as supernumerary, are considered dispensable elements to organisms. However, some studies have presented evidences of a possible functionality of this extras chromosomes. They are observed in many eukaryote species, such as in the African cichlid, Astatotilapia latifasciata, which might have one or two B chromosomes. Cichlids have been used as model organisms to genetics and genomics studies. Previous genomic analyses based on next generation sequencing (Illumina HiSeq sequencing) were realized in the whole genome without B chromosome (B-) and with B chromosomes (B+) of A. latifasciata and a variant form of hnRNP Q-like (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q-like) gene was identified. This sequence presented a high copy number and characteristics of a retrogene in B chromosomes. Thus, the aim of this study consists in comprehend genomic organization, identify retroinsertion mechanisms and perform expression analyses of the hnRNP Q-like gene, making it possible a better understanding of origin, evolution and possible effects of this chromosomes in the studied species. Bioinformatics analyses identified variant copies of hnRNP Q-like gene in B+ genome and the higher and lower variable regions of the gene were selected, based in mutation rates, for further analysis. Analyses from sequenced fragments and qPCR confirmed gene has a higher number of copies and do not present introns in B chromosome. Evidences of transposable element relics with reverse transcriptase domains suggest gene was retroinserted in B chromosome. The data of qPCR in cDNA showed that the hnRNP Q-like gene is not differentially expressed in both genomes (with and without B chromosome) / Mestre

Orientador: Adriana Camargo Ferrasi / Coorientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Banca: Patrícia Pintor dos Reis / Banca: Marcelo Lima Ribeiro / Resumo: O câncer gástrico é mundialmente a segunda causa de morte por câncer. No Brasil está entre os cinco neoplasias mais incidentes, mostrando-se como um grave problema de saúde pública. O conhecimento do padrão de expressão gênica de genes supressores tumorais e protooncogenes é fundamental para o esclarecimento dos mecanismos desta carcinogênese. O gene FOXE1 (forkhead box E1) pertence a uma grande família de fatores de transcrição envolvidos em processos de crescimento e diferenciação celular. Pesquisas recentes têm demonstrado o papel determinante de FOXE1 na gênese de certos tipos de neoplasias. Assim, a análise da expressão gênica de FOXE1 em amostras de tumores gástricos faz-se necessária para esclarecer seu possível envolvimento neste carcinogênese. O DNA foi extraído de 89 amostras de tumores gástricos, com seus respectivos tecidos normais adjacentes. Após o tratamento com bissulfito de sódio, o padrão de metilação foi determinado por PCR específica para metilação (MSP-PCR) com a visualização dos resultados em poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. 86,5% das amostras apresentaram metilação em FOXE1, sendo o mesmo padrão encontrado em tecidos normais adjacentes 74,2%. Não houve significância estatística quando os resultados foram agrupados de acordo com o sexo, tipo histológico e estadiamento. A expressão gênica foi avaliada através de qPCR para 13 dos 89 pacientes incluídos no estudo. Obteve-se para cada paciente a razão (T/N) comparando a expressão gênica da amostra de tecido tumoral (T) em relação à expressão do tecido normal adjacente ao tumor (N). 8 amostras (61,5%) apresentaram um aumento da expressão do FOXE1, com uma média de 1,6. Dentre as 5 (38,5%) amostras com QR abaixo de 1, isto é, com expressão do FOXE1 abaixo do tecido normal, a média foi de 0,7. Quanto à concordância entre o estado de metilação em FOXE1 e a sua expressão ... / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Maeli Dal Pai / Banca: Luís Fernando Marins / Banca: Ian Porto Gurgel Amaral / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Danilo Pinhal / Resumo: O pacu (Piaractus mesopotamicus) apresenta excelentes características zootécnicas como rápido crescimento, parâmetro que está diretamente relacionado com o aumento da musculatura estriada esquelética. Pesquisas envolvendo a caracterização de genes musculares têm sido realizadas utilizando-se tecnologias moleculares, em espécies de peixes modelo como o Zebrafish que possui o genoma sequenciado. No pacu, espécie que não possui o genoma sequenciado, esta falta de informação genética dificulta a realização de pesquisas relacionadas com a identificação das vias de sinalização que regulam o desenvolvimento, o crescimento e a manutenção do fenótipo muscular. Além disso, a falta de informação promove uma limitação para o desenvolvimento de programas de melhoramento para esta espécie. Os principais objetivos do presente estudo foram: 1) aumentar os recursos genéticos disponíveis para a espécie, 2) comparar os transcriptomas dos tipos de músculo, vermelho e branco explorando as vias de sinalização que controlam os tipos de fibras musculares 3) investigar a expressão de deubiquitinas pertencente a família do sistema de Proteases ubiquitinas-específicas (USP) no músculo branco em resposta ao jejum e realimentação. Com o sequenciamento, obteve-se aproximadamente 0.6Tb de leituras a partir de bibliotecas do músculo esquelético vermelho e branco. Aproximadamente, 665 milhões de leituras foram utilizadas para a realização da montagem, resultando em 504.065 contigs com um comprimento médio de 1,334bp e N50 = 2,772bp; 47% do transcriptoma foi anotado com êxito, onde pode-se identificar cerca de 15.000 genes considerados únicos e aproximadamente 8000 sequências com região codificante completas. Dentre os genes identificados destacam-se 319 genes de vias metabólicas e 380 microssatélites. Novecentos e ciquenta e seis e 604 genes foram diferencialmente expressos entre o músculo vermelho e branco, respectivamente. / Abstract: Pacu (Piaractus mesopotamicus) has excellent husbandry features like rapid growth. This parameter is directly related to the increase of skeletal muscle. Researches involving the characterization of muscle genes have been performed using molecular technologies, in species of fish such as zebrafish model that has sequenced the genome. In pacu, a species that does not have the sequenced genome, this lack of genetic information makes it difficult to conduct research related to the identification of signaling pathways that regulate development, growth and maintenance of muscle phenotype. Moreover, the lack of information promotes a limitation for the development of breeding programs for this species. The main objectives of this study were: 1) to increase the available genetic resources for the species, 2) compare the transcriptomes of red and white muscle types, exploring the signaling pathways that control the types of muscle fibers 3) to investigate the expression of deubiquitins belonging to the family of ubiquitin-specific proteases system (USP) in muscle in response to fasting and feedback. With the sequencing, it was obtained approximately 0.6Tb readings from red skeletal muscle and white libraries. Approximately 665 million readings were used to perform the assembly, resulting in 504 065 contigs with an average length of N50 = 1,334bp and 2,772bp; 47% of the transcriptome was noted successfully, which can be identified about 15,000 genes considered as unique and approximately 8000 sequences coding complete region. Among the identified genes, we could observe 319 metabolic pathways genes and 380 microsatellite. Nine hundred fifty six and 604 genes were differentially expressed between red and white muscle, respectively. We identified 442 pairs of paralogs genes resulting from genomic duplication at the base source of teleost fish. It was possible to identify differential expression of paralogous genes include the types of fibers... / Doutor