Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-05-16Bitstream added on 2014-08-13T18:01:28Z : No. of bitstreams: 1 000747183_20150516.pdf: 388655 bytes, checksum: 28bb4ca0fd35b64c1425eeff151db6dc (MD5) Bitstreams deleted on 2015-05-19T12:01:09Z: 000747183_20150516.pdf,Bitstream added on 2015-05-19T12:01:40Z : No. of bitstreams: 1 000747183.pdf: 1675711 bytes, checksum: 172952b37ea05e8baceeccb4e6e6ea8f (MD5) / A franca expansão das florestas de eucalipto observada nos últimos anos em diferentes estados brasileiros aumentou a dependência tecnológica da cultura, tornando necessária a sua inserção no contexto biotecnológico. Para tal, a disponibilidade de ferramentas moleculares que viabilizem a produção de árvores geneticamente modificadas se faz necessária. Nesse contexto, o presente trabalho visou validar funcionalmente dois promotores de Eucalyptus grandis, o primeiro relacionado a um gene que codifica uma Lacase (denominado EgLac) com expressão específica em caule (câmbio), e o segundo relacionado a uma actina (denominado EgAct) com expressão ubíqua. Um cassete de expressão contendo o promotor EgLac em fusão transcricional com o gene repórter GUS (previamente construído) foi inserido em plantas de Arabidopsis thaliana, e uma expressão vascular foi constatada em testes histoquímicos. Em cortes histológicos observou-se que a expressão de GUS ficou restrita ao floema de raízes e folhas. Em paralelo, o gene EgAct teve a sua expressão ubíqua validada em diferentes órgãos/tecidos de eucalipto, e a sua região promotora foi amplificada. Um cassete de expressão contendo o promotor EgAct em fusão ao repórter GUS foi igualmente inserido em plantas de A. thaliana. Análises histoquímicas revelaram uma expressão vascular do gene repórter distribuída ao longo de toda a planta. Por outro lado, a quantificação da expressão de GUS em plantas transformadas revelaram níveis variáveis de acumulação de transcrição de acordo com a idade e o órgão/tecido analisado / The rapid expansion of eucalyptus plantations observed in recent years in different Brazilian states increased the technological dependence of the culture, and its inclusion in the biotechnological context is an urgent need. For this, the availability of molecular tools that enable the production of genetically modified trees is necessary. In this context, the present work aimed to functionally characterize two promoters of Eucalyptus grandis, the first one related to a gene encoding a laccase (called EgLac) with specific expression in stem (cambium region), and the second one related to a gene encoding an ubiquitously expressed actin (called EgAct). An expression cassette containing the EgLac promoter transcriptionally fused to the GUS reporter gene was inserted into Arabidopsis thaliana, and a vascular expression pattern was observed in histochemical tests. Histological sections showed that GUS expression was restricted to the phloem of roots and leaves. In parallel, the ubiquitous expression of EgAct was validated using different eucalyptus organs/tissues, and its promoter region was amplified. An expression cassette containing the EgAct promoter fused to the GUS reporter was also inserted into A. thaliana. Histochemical analysis revealed a vascular expression of the reporter gene distributed throughout the plant. Moreover, quantification of GUS expression in transformed plants revealed variable levels of transcript accumulation according to the age and organ/tissue analyzed

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-01Bitstream added on 2014-08-13T18:00:50Z : No. of bitstreams: 1 000753101.pdf: 975433 bytes, checksum: 84c4949756389cfdc4a9ee74e6739737 (MD5) / Os microRNAs (miRNAs) representam uma classe de pequenos RNAs não codificantes reconhecidos como importantes reguladores pós-transcricionais da expressão de genes durante o desenvolvimento e em doenças como a insuficiência cardíaca (IC). Embora não haja um consenso de que terapias adjuvantes para as doença cardiovasculares sejam capazes de aumentar a qualidade de vida e as taxas de sobrevivência; uma terapia não-farmacológica, como o treinamento físico (TF) pode reduzir a uma série de fatores de risco cardiovasculares e tem sido reconhecida como uma estratégia segura para a prevenção e tratamento da IC. Portanto, avaliamos o efeito do TF prescrito durante a transição da hipertrofia cardíaca para IC no perfil global de miRNAs cardíacos. A hipertrofia ventricular e a IC foi induzida a partir da bandagem da aorta (estenose aórtica-EA) por um grampo de aço inoxidável (n=10). Os animais utilizados como Controle (CT) foram operados sem a colocação do clip (n = 5). Dezoito semanas após a cirurgia, quando os animais com EA apresentavam disfunção ventricular, detectada por ecocardiograma, os ratos foram aleatoriamente separados em dois grupos: 10 semanas de treinamento físico supervisionado (IC-TF, n = 5) ou grupo sedentário controle (IC-S, n = 5). Por fim a IC, foi confirmada pelos dados clínicos e da remodelação cardíaca por dados morfológicos e funcionais obtidos por ecocardiograma. Os níveis de expressão de 373 miRNAs do ventrículo esquerdo foram avaliados por PCR quantitativa em tempo real usando TLDA (TaqMan Rodent microRNA Array - cartões de A + B) no Sistema ABI ViiA7 (Life Technologies, EUA) e a quantidade relativa média (RQ) foi calculada utilizando-se do método do Ct comparativo. Os miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos foram os que apresentaram alteração > 1,5 vezes e P <0,05 (teste t de Student). No final do experimento (28 semanas), o TF atenuou os sinais clínicos ... / MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that have gained status as important regulators of post-transcriptional gene expression during development and in certain diseases such as heart failure (HF). Although there is no consensus that adjuvant therapies for cardiovascular disease are able to increase patients' quality of life and survival rates a non-pharmacological therapy, exercise training (ET) can reduces a number of cardiovascular risk factors and has been recognized as an important and safe strategy for preventing and treating heart failure. Therefore, we evaluate the effects of ET prescribed during the transition from cardiac hypertrophy to heart failure on cardiac micro-RNA profile. We employed ascending aortic stenosis (AS) to induce heart failure in Wistar male rats (n=10) by a stainless-steel clip. Sham-operated animals (n=5) were used as controls. Eighteen weeks after surgery, when AS animals presented ventricular dysfunction, detected by echocardiogram, rats were randomized to 10 weeks of supervised exercise training (HF-ET, n=5) or to a control sedentary group (HF-S, n=5). At the end of the experiment, heart failure was evaluated by clinical data and the cardiac remodeling by morphologic and functional data obtained by echocardiogram. The expression levels of 373 miRNAs from left ventricles were measured by real-time quantitative PCR using TaqMan Rodent microRNA Array (cards A + B) on an ABI ViiA7 Sequence Detection System and the mean relative quantity (RQ) was calculated and miRNAs differentially expressed between groups were defined as those with >1.5-fold change and P<0.05 (two sample, two tailed Student’s t-test). At the end of the experiment (28th wks), exercise training attenuated the clinical and pathological signs of HF. It also attenuated cardiac remodeling with maintenance of systolic and diastolic function. Moreover, miRNAs analysis revealed that thirty-five ...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-08-13T18:00:39Z : No. of bitstreams: 1 000756870.pdf: 4401994 bytes, checksum: 3fa324e27d9b06c347fb1e60c3086526 (MD5) / Espécies invasoras são altamente eficientes na competição por recursos, tem alta capacidade reprodutiva e de dispersão, o gênero Cichla é exemplo dessas características. Os espécimes desse gênero são amplamente utilizados no controle de espécies exóticas com alta prolificidade, além de sua indiscutível importância na alimentação humana e na pesca esportiva. No presente trabalho foi estudada a diferenciação cromossômica e genética entre as espécies Cichla kelberi e Cichla piquiti e seus prováveis híbridos naturais. Foram utilizadas técnicas citogenéticas e moleculares de PCR multiplex e PCR-­‐RFLP com genes nucleares e mitocondriais e, posteriormente, tais marcadores foram aplicados em exemplares coletados em reservatórios dos rios Paraná e Tietê, SP. As técnicas citogenéticas foram realizadas para exemplares coletados no rio Tietê, município de Uru, enquanto que para o estabelecimento e aplicação dos marcadores moleculares foram utilizadas amostras de ambas localidades, rio Paraná (Uru) e rio Tietê (Rubineia, Pauliceia e Ilha Solteira). Os resultados citogenéticos indicam uma conservação cariotípica entre as espécies Cichla kelberi e Cichla piquiti, tais espécies apresentam numero diploide de 2n=48 cromossomos do tipo acrocêntrico, região organizadora de nucléolo localizado no par 2 e heterocromática constitutiva em regiões centroméricas. Além disso, os genes ribossomais estão localizados nos mesmos pares cromossômicos para ambas as espécies, sendo o 5S DNAr localizado no terceiro par cromossômico, em posição intersticial, e 18S DNAr corroborando com as marcações da NOR. Já nas análises moleculares, foram estabelecidas diferenças genômicas entre as espécies C. kelberi e C. piquiti, que permitiram o estabelecimento de marcadores de eficiente aplicabilidade para diferenciação das duas espécie, fato confirmado pela aplicação dos mesmos em exemplares de quatro localidades do ... / Some invasive species are highly efficient in resource competition, have high reproductive capacity and dispersal, the genus Cichla exemplifies these characteristics. The specimens of this genus are widely used to control exotic species with high prolificacy, beyond its undeniable importance in food and sport fishing. In the present study, the chromosomal and genetic differentiation between species Cichla kelberi and Cichla piquiti and its likely natural hybrids. We used cytogenetic techniques and molecular markers PCR multiplex and PCR-­‐RFLP with nuclear and mitochondrial genes and, subsequently, the markers were applied to specimens collected in rivers Parana and Tiete in São Paulo. The cytogenetic techniques were performed for samples collected from the river Tiete, Uru city, while for the establishment and application of molecular markers were used samples of both cities, river Parana (Uru) and river Tiete (Rubineia, Pauliceia e Ilha Solteira). The cytogenetic results indicate a karyotype conservation between species Cichla piquiti and Cichla kelberi such species have diploid number of 2n=48 chromosomes acrocentric type, located nucleolus organizer regions in the pair 2 and constitutive heterochromatic centromeric regions. Furthermore, ribosomal genes are located on the same chromosome pairs for both species, but the 5S rDNA located on the third chromosome pair in interstitial position, and 18S rDNA corroborating markings NOR. Already in the molecular analysis, genomic differences were established between the species C. kelberi and C. piquiti, which allowed the establishment of efficient applicability markers for differentiation of the two species and in different populations, a fact confirmed by applying the same samples from four locations in the state of São Paulo. Furthermore, such genetic markers indicate that the samples identified as hybrid individuals of the species C. kelberi and C. piquiti are actually ...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-08-13T18:00:29Z : No. of bitstreams: 1 000758786.pdf: 2929334 bytes, checksum: 8f950f28035a7eb52265742b39b5b675 (MD5) / As condições ambientais existentes no Cerrado, como déficit hídrico e incidência solar, colaboram para o diversificado laboratório químico que sintetiza e seleciona os compostos produzidos por essas plantas. O contraste sazonal nas fitofisionomias do Cerrado entre a época seca e úmida é um dos fatores que podem alterar as concentrações de metabólitos secundários em plantas. Os compostos produzidos pelo metabolismo secundário podem ser fenilpropanoides, terpenos, alcaloides e esteroides que possuem atividade biológica e são responsáveis pela interação química entre as plantas. Os aleloquímicos são mediadores da comunicação química entre os vegetais e os mecanismos de ação estão relacionados com inúmeros processos bioquímicos e fisiológicos regulados por diferentes conjuntos de genes. Diversos processos biológicos relacionados com o desenvolvimento vegetal são regulados por genes específicos cuja expressão é controlada por microRNAs e outros RNAs regulatórios. O uso da Biologia Molecular pode elucidar os mecanismos de ação fitotóxicos responsáveis pelas respostas fisiológicas envolvidas na atividade alelopática e mostrar novos alvos bioquímicos e fisiológicos na alelopatia. A avaliação da atividade alelopática de frações enriquecidas e substâncias puras de extratos com reconhecida atividade alelopática pode elucidar mecanismos de ação e os efeitos a nível molecular associados às vias fisiológicas afetadas. O objetivo do trabalho foi avaliar o perfil químico e o potencial alelopático de extratos orgânicos de folhas de Copaifera langsdorffii coletadas em épocas seca e úmida. Para tanto foram verificados o índice de velocidade de germinação (IVG), o crescimento radicular e o padrão de expressão gênica [SHORT- ROOT (SHR); miRNA166; FT HOMEODOMAIN LEUCINE ZIPPER (HD ZIP III) com os genes REVOLUTA (REV), PHABULOSA (PHB) e PHAVOLUTA (PHV)] e características fenotípicas de plântulas ... / The environmental conditions in the Cerrado, like drought and solar incidence, collaborate to diverse chemical laboratory that synthesizes and selects compounds produced by these plants. The seasonal contrast in the Cerrado vegetation types between dry and wet season is one of the factors that can alter the concentrations of secondary metabolites in plants. The compounds produced by secondary metabolism can be phenylpropanoids, terpenes, alkaloids and steroids that have biological activity and are responsible for the chemical interaction between plants. The allelochemicals are mediators of chemical communication between plants and mechanisms of action are related to numerous biochemical and physiological processes regulated by different sets of genes. Specific genes whose expression is controlled by microRNAs and other regulatory RNAs regulate several biological processes related to plant development. The use of molecular biology may elucidate the mechanisms of action responsible for phytotoxic physiological responses involved in allelopathic activity and show new targets in biochemical and physiological allelopathy. The evaluation of the allelopathic activity of enriched fractions of extracts and pure compounds with known allelopathic activity may elucidate mechanisms of action and effects at the molecular level associated with physiological pathways affected. The objective of this study was to evaluate the chemical profile and allelopathic potential of organic extracts of leaves collected Copaifera langsdorffii in dry and wet seasons. Therefore, we checked the germination speed index (GSI), root growth and the pattern of gene expression [SHORT- ROOT (SHR); miRNA166; FT HOMEODOMAIN LEUCINE ZIPPER (HD ZIP III) with genes REVOLUTA (REV), PHABULOSA (PHB) e PHAVOLUTA (PHV)] and phenotypic characteristics of seedlings of Sorghum bicolor. A comparison of phytochemical profile observed in the chromatograms indicates no qualitative changes in ...

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Coorientador: João Paulo de Castro Marcondes / Resumo: A obesidade é uma doença de etiologia multifatorial, resultante de interações complexas entre fatores genéticos e ambientais. No entanto, o aumento acentuado de sua incidência, precocidade e severidade não foram ainda totalmente elucidados. Dentre os inúmeros fatores de risco, diversos achados sugerem, também, que estímulos estressores (p.ex. diabete, alterações nutricionais) na vida intrauterina podem promover alterações genéticas e epigenéticas, predispondo ao desenvolvimento tardio de doenças e disfunções metabólicas, como a obesidade. Assim, o presente estudo foi delineado com o objetivo de avaliar a possível relação entre o Diabetes melittus gestacional (DMG) e a predisposição do recém-nascido para o desenvolvimento de obesidade na vida adulta. Para tanto, foram incluídos no estudo gestantes saudáveis e gestantes diagnosticadas com DMG e seus respectivos recém-nascidos. Adicionalmente, adultos obesos e eutróficos foram incluídos como população de referência (controle). Considerando a relação entre o diabete e a obesidade com a disfunção mitocondrial, foi avaliado o perfil de expressão de gênica e proteica de SOD2 (superóxido desmutase 2), PPARα (receptor ativador da proliferação de peroxissomos alfa) e PPARGC-1β (receptor ativador da proliferação de peroxissomos gamma coativador 1 beta), relacionados ao metabolismo mitocondrial, em sangue do cordão umbilical e sangue periférico (população de referência), e o perfil de expressão gênica em células de placenta (faces materna e fetal). Primeiramente, nossos resultados demonstraram que indivíduos obesos apresentavam aumento da expressão gênica e proteica de SOD2, PPARα e PPARGC-1β no tecido sanguíneo quando comparados aos eutróficos (p < 0,05). No entanto, o mesmo não foi observado no tecido placentário (expressão gênica) e no sangue do cordão umbilical (expressão gênica e protéica) dos recém-nascidos das gestantes com DMG e... / Abstract: Obesity is a multifactorial disease involving complexes interactions between genetic and environmental agents. However, the increased incidence, early onset and severity of this disease, are still not well understood. Several findings have demonstrated that in utero stressors (diabetes, cigarettes, and/or alcohol consumption, etc) can promote genetic and epigenetic changes predisposing to late development of diseases and metabolic disorders, such as obesity. The present study was designed to evaluate the possible relationship between gestational Diabetes mellitus (GDM) and newborn predisposition to obesity his later life. Healthy and GDM pregnant women and their respective newborns were included. Additionally, obese and eutrophic adults were recruted as reference population. Considering the relationship between diabetes and obesity with mitochondrial dysfunction, gene and protein related to mitochondrial metabolism (SOD2 (superoxide dismutase 2), PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor alpha) and PPARGC-1β(peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivador beta) were evaluated in cells from cord and peripheral blood (reference population), and in placenta cells (gene expression profile in maternal and fetal sides). Our results showed an increased gene and protein expression (SOD2, PPARα and PPARGC-1β) in peripheral blood from obese compared to euthrophic subjects (p <0.05). However, the same result was not observed in the placental tissue (gene expression) and in umbilical cord blood cells (gene and protein expression) from GDM women and their respective newborn compared to the non diabetic group, i.e., GDM was not an effective agent to promote transcriptional changes in SOD2, PPARα PPARGC-1β in maternal and fetal sides of placenta, and transcriptional and translational changes in umbilical cord blood cells. In conclusion, SOD2, PPARα and PPARGC-1β gene and protein expression were confirmed as potential ... / Mestre

Orientador: Daisy Maria Favero Salvadori / Banca: Denise Fecchio / Banca: Maria Rita Marques de Oliveira / Resumo: A obesidade é uma desordem multifatorial que envolve agentes hereditários, ambientais e estilo de vida, e suas consequências não são apenas sociais ou psicológicas, mas também estão relacionadas à presença de comorbidades como a hipertensão arterial, diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares, sendo considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma epidemia global. A obesidade é definida como uma doença associada à inflamação crônica de baixo grau, caracterizada pelos elevados níveis circulantes de citocinas inflamatórias e proteínas de fase aguda e ao excesso de adipocinas no tecido adiposo. A cirurgia bariátrica, importante forma de tratamento para a obesidade mórbida, tem dentre seus efeitos positivos a melhora do perfil inflamatório devido à redução do tecido adiposo. Contudo, esse procedimento produz alterações na anatomia e fisiologia gastrointestinal, as quais têm consequências na absorção de alimentos, podendo resultar em deficiências de micronutrientes como vitaminas e sais minerais. Sabe-se que vários micronutrientes podem contribuir para a redução de distúrbios associados à obesidade devido à habilidade de regular a expressão gênica, modular a adipogênese e o processo inflamatório. Diante desse cenário, o presente estudo teve como objetivo avaliar a relação entre a ingestão de micronutrientes, o perfil de citocinas plasmáticas circulantes e o padrão de expressão dos genes IL-6, IL-10 e TNF-α em mulheres com obesidade mórbida (n =30), antes e após suplementação nutricional com as vitaminas A, B6, B12, C, E e D3, ácido fólico, ferro, selênio e zinco, e a cirurgia bariátrica. Os dados obtidos mostraram que apenas para as vitaminas C e D3 foram detectadas concentrações séricas abaixo dos valores de referência após a suplementação e cirurgia bariátrica. Com relação às citocinas TNF-α, VEGF e MCP-1, todas apresentaram concentrações mais altas nas mulheres... / Abstract: Obesity is a multifactorial disorder involving hereditary and environmental factors and lifestyle, its adverse effects are not only social or psychological, but are also related to the presence of comorbidities such as hypertension, type 2 diabetes and cardiovascular disease, being considered by World Health Organization as a global epidemic. Obesity is defined as a disease associated with chronic low-grade inflammation characterized by elevated levels of circulating cytokines and acute phase proteins and excess of adipokines in adipose tissue. Bariatric surgery, important treatment for morbid obesity, has among its positive effects the improvement of inflammatory profile promoted by the reduction of adipose tissue. However, this procedure leads to changes in the gastrointestinal anatomy and physiology and, consequently, alters the absorption process, which may result in micronutrient deficiencies such as vitamins and minerals. It is known that several micronutrients may contribute to the reduction of obesity-related disorders due to the ability to regulate gene expression, modulate adipogenesis and inflammation. In this context, the present study aimed to evaluate the relationship between micronutrient intake, the expression pattern of IL-6, IL-10 and TNF-α genes and the profile of circulating plasma cytokines in women with morbid obesity (n = 30) before and after dietary supplementation with vitamins A, B6, B12, C, D3, and E, folic acid, iron, selenium, zinc, and bariatric surgery. The data showed that only vitamin D3 and C serum concentrations were detected below reference values after supplementation and bariatric surgery. The circulation levels of TNF-α, VEGF and MCP-1 cytokines were significant higher in obese women compared to normal weight women, confirming the inflammatory state associated with obesity. IL-6, TNF-α and VEGF circulation levels were significant decreased after bariatric surgery. Gene expression data also showed ... / Mestre

Orientador : Christian Macagnam Probst / Coorientador : Daniela Parada Pavoni / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 29/08/2016 / Inclui referências : f. 133-147 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente da doença de Chagas, sendo um protozoário flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida. Este parasita está distribuído em 21 países. Possui um ciclo de vida bastante complexo com diferenças morfológicas ultra-estruturais, funcionais e bioquímicas, apresentando sob diferentes formas nos hospedeiros invertebrados e vertebrados. A forma epimastigota é não infectiva e proliferativa, encontrada naturalmente no trato digestivo do inseto vetor, podendo ser cultivada in vitro. Um importante passo para melhor entendimento desse parasita é estudo das suas características celulares e moleculares apresentadas durante a sua curva de crescimento. Nesse trabalho foi apresentada uma visão global do perfil de expressão gênica a partir das frações de mRNA total e polissomal ao longo de 10 dias da curva de crescimento de epimastigotas de T. cruzi. Usando a metodologia de RNA-seq, 2491 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados, dos quais 768 foram modulados em ambas as frações. De acordo com os padrões de modulação encontrados, os DEGs foram agrupados em 13 clusters e alguns destes apresentaram enriquecimento de termos de ontologia gênica (GO) indicando os processos biológicos e moleculares envolvidos. Análises do perfil polissomal podem revelar quais genes estão sendo traduzidos em uma determinada condição, assim o padrão de expressão desses mRNAs pode ser diferente nas frações de total e polissomal. No entanto, foi encontrada uma extensa sobreposição dos padrões de modulação para a maioria dos clusters. Claramente durante a fase estacionária o conteúdo de polissomos apresentou uma forte diminuição associado ao surgimento de grânulos de mRNA. Isto sugere que durante esta fase a maioria dos transcritos isolados a partir do colchão de sacarose está provavelmente associada a complexos de mRNA invés de polirribossomos. Isto pode indicar que os mRNAs da fase estacionária podem estar sendo protegidos por esses grânulos para posterior tradução quando o ambiente se tornar novamente favorável. Vários aspectos da curva de crescimento deste parasita foram destacados, principalmente em relação as alterações pelas quais o parasita transita ao longo da fase estacionária. Além disso, foi investigada uma possível via de controle através da concentração de glicose a qual foi proposta a partir de comparações com estudos de Saccharomyces cerevisiae. Para um estudo complementar da curva de crescimento foi realizada uma abordagem de proteômica. Os dados preliminares mostraram uma boa identificação de grupos de proteínas (3.249), a maioria representando uma proteína por grupo. Algumas proteínas diferencialmente expressadas (DEPs) foram detectadas, apesar do baixo poder estatístico das análises. Dentre 68 DEPs identificadas, 21 mostraram correlação no padrão de modulação com os dados de transcritômica. Também foi apresentada uma análise de transcritômica preliminar de epimastigotas em fase estacionária inicial submetidos a diferentes condições nutricionais (PBS, TAU e TAU3AAG) por 1, 2, 4, 6 e 24 horas. Foram identificados 612, 804 e 941 supra-genes diferencialmente expressos nos meios PBS, TAU e TAU3AAG, respectivamente. A maioria dos supra-genes modulados foram comuns nas três condições. Juntos, esses estudos representam uma etapa importante na obtenção de dados em larga escala que geração de conhecimento sobre o comportamento e resposta do parasita em diferentes condições ambientais. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, curva de crescimento, RNA-seq, polissomos, proteômica e estresse. / Abstract: The Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoa that belongs to the Kinetoplastida order and is the etiologic agent of Chagas disease, an endemic illness distributed in 21 countries. The T. cruzi life cycle is complex including morphological, functional and biochemical changes. The epimastigote form is proliferative and non-infective, founded naturally in the insect vector gut and can be cultivated in vitro. An important step to comprehend the T. cruzi biology is the study of cellular and molecular features presented during its growth curve. Here, we show a global view of gene expression profile for total and polysomal RNA fractions along 10 days of the T. cruzi epimastigote growth curve in vitro. A total of 2491 differential expressed genes (DEGs) were established using RNA-Seq approach, of which 768 were modulated in both fractions. According to the modulation pattern, these DEGs were grouped into 13 clusters and some of them show enrichment to important GO terms, indicating molecular and cellular biological processes involved. The polysomal profile might reveal mRNAs that are being translated and their expression pattern could be different from the total RNA fraction, nevertheless, in most clusters we see remarkable overlapped modulation. Moreover, at the stationary phase the polysomal content greatly decline while the RNA granules seems to increase. This suggests that most of mRNAs isolated from sucrose cushion at this growth stage should be associated with granules instead with polyribosomes. This possible indicates that stationary phase mRNAs are being protected by granules for further translation when the environment becomes favorable. We highlight some views on the T. cruzi growth curve, mainly related to the alteration that the parasite pass along the stationary phase. Moreover, a possible sensing pathway for glucose depletion was suggested for T. cruzi based on Saccharomyces cerevisiae studies comparison. Growth curve complementary study was performed using proteomic approach. Preliminary data shows the identification of 3,249 protein groups, mostly representing one protein per group. Some differential expressed proteins (DEPs) were identified, besides the limited statistical power. Among the 68 DEPs identified, 21 showed correlation in their proteomic and transcriptomic modulation pattern. Preliminary transcriptomic analysis of epimastigote in early stationary phase under three nutritional different conditions (PBS, TAU, TAU3AAG) during 1, 2, 4, 6 and 24 hours were also present here. Total of 612, 804 and 941 differential expressed supra-genes were identified in PBS, TAU and TAU3AAG conditions, respectively. Most of supra-genes were common to all treatments. Together, these works represent an important step for large scale data generation that will provide insights into the parasite behavior and response to different environmental conditions. Key-words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, growth curve, RNA-seq, polysomes, proteome and stress.

O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) está associado etiologicamente à duas principais manifestações clínicas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 2 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem doenças associadas ao vírus, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Os linfócitos T CD4+ são os principais reservatórios do HTLV-1 in vivo e possuem uma participação importante na resposta imunológica dirigida a este retrovírus. Essas células são ativadas precocemente durante a infecção pelo HTLV-1 e auxiliam na resposta dos linfócitos T CD8 citotóxicos (CTLs), bem como na produção de anticorpos. No presente estudo, foi avaliado o perfil de expressão gênica global dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores assintomáticos (HAC), pacientes com HAM/TSP e de indivíduos sadios (CT) por meio da metodologia de microarray. Os linfócitos T CD4+ utilizados foram isolados por separação imunomagnética e foram realizados microarrays de doze amostras individuais: quatro amostras do grupo CT, quatro amostras do grupo HAC e quatro do grupo HAM/TSP. Os dois últimos grupos continham duas amostras com alta e duas com baixa expressão da proteína Tax. As análises de agrupamento hierárquico revelaram que o perfil de expressão gênica dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 difere dos indivíduos do grupo CT pela formação de dois agrupamentos distintos. Ademais, os indivíduos infectados pelo HTLV-1 se agruparam de acordo com o estado clínico e independente da expressão de Tax. Foram realizadas as comparações entre os grupos CT vs. HAC, CT vs. HAM/TSP e HAM/TSP vs. HAC e os dados demonstraram que 221, 254 e 70 genes estavam diferencialmente expressos, respectivamente. Além disso, foram observados 86 genes presentes nas intersecções entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes entre CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC e apenas um gene entre CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. Estes genes diferencialmente expressos estavam associados à citocinas, lise e migração celular. Os achados foram validados por PCR quantitativo em um total de 23 indivíduos assintomáticos, 17 com HAM/TSP e 25 indivíduos sadios. A validação evidenciou o aumento da expressão dos genes PXN, CXCR4, PRF1 e Foxp3 no grupo HAM/TSP em relação ao grupo HAC, além do aumento de IL-27 nos indivíduos do grupo HAC comparados com os indivíduos do grupo HAM/TSP. Adicionalmente, foi realizada a quantificação dos níveis protéicos de PRF1, GZMB, CXCR4 por citometria de fluxo. Entretanto, nenhuma diferença foi observada entre os diferentes grupos analisados. Ainda, por meio de citometria de fluxo, a população de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+, bem como CD4+Foxp3+ foram analisadas e observou-se maiores níveis de expressão de CD4+Foxp3+ nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. A porcentagem de células CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ não mostrou diferença significativa entre os três grupos comparados. Os resultados evidenciados neste projeto ressaltam a importância das células CD4+ no controle da resposta imune contra a infecção pelo HTLV-1. O aumento na expressão gênica de PXN e CXCR4, que fazem parte da via de sinalização de CXCR4, sugere a ocorrência de migração celular nos indivíduos com HAM/TSP, provavelmente para o SNC. Além disso, o aumento das células Treg parecem suprimir a atividade das células T CD8+ pela via perforina/granzima, que por sua vez aumentaria a carga proviral, aumentando assim o risco de desenvolvimento de HAM/TSP. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) is etiologically associated with two major diseases: the adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and the HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). About 2 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1-related diseases, while the majority remains life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is not well elucidated. CD4+ T cells are the predominant subset of cells infected with HTLV-1 in vivo and they are also important as effector cells against the infection. These cells are early activated during infection with HTLV-1 and assist the response of CD8 cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and antibody production. To identify genes differentially expressed among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied the microarray using CD4+ T cells isolated from these individuals. The CD4+ T lymphocytes were isolated by magnetic cell separation system and twelve samples underwent microarray analysis, as follows: 4 CT, 4 HAC and 4 HAM/TSP samples. Two samples had high tax expression and two samples had low tax expression for both infected groups. The hierarchical clustering analysis showed that the gene expression profile of infected individuals is distinct from healthy individuals because two separate clusters were observed. HTLV-1-infected individuals clustering meets with patients clinical status. However, HTLV-1 CD4+ T cells clustering did not correlate with Tax protein expression. We found 221 genes differently expressed between CT and HAC groups, 254 genes between CT and HAM/TSP and 70 genes between HAC and HAM/TSP. Moreover, we observed 86 genes differently expressed in the intersections between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP, 25 genes between CT vs. HAM/TSP x HAM/TSP vs. HAC and only one gene between CT vs. HAC x CT vs. HAM/TSP. These genes were associated with cytokines, cell lysis and cell migration. These results were validated by quantitative PCR in 23 HTLV-1 asymptomatic carriers, 17 patients with HAM/TSP and 25 healthy individuals. The validation revealed increased levels of expression of the genes PXN, CXCR4, PRF1, and Foxp3 in the HAM/TSP group compared with HAC group. IL-27 gene expression was increased in HAC group when compared with HAM/TSP group. Additionally, we performed the protein quantification of PRF1, GZMB, and CXCR4 by flow cytometry. However, no difference was observed among the three groups. We also analyzed CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ and CD4+Foxp3+ populations by flow cytometry. There was an increase of CD4+Foxp3+ expression in HTLV-1-infected individual. No differences were observed in CD3+CD4+CD25hiFoxp3+ population among the three groups. The results shown in this project highlight the importance of CD4+ cells in controlling the immune response against HTLV-1. The gene expression profile of PXN and CXCR4 was increased. These genes are related to CXCR4 signaling pathway that can result in CD4+ T cells migration, probably to the central nervous system. It is also suggested that Treg cells can suppress the T CD8+ activity through perforin/granzyme pathway. This pathway enhances the proviral load increasing the risk of HAM/TSP development.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores, de cerca de 20 bases de comprimento, capazes de regular negativamente a expressão gênica após a transcrição. A ação regulatória destas moléculas é indispensável para o funcionamento adequado de diversos processos biológicos, dentre eles o desenvolvimento e a manutenção da musculatura esquelética. Com o objetivo de caracterizar a população de miRNAs presentes na musculatura esquelética adulta de frangos, foi construída uma biblioteca de miRNAs a partir do músculo peitoral de indivíduos jovens (21 dias pós-eclosão). Um total de 576 clones foi sequenciado e as sequências obtidas foram agrupadas por similaridade em 98 grupos, dentre os quais 47 corresponderam à miRNAs conhecidos, 30 à outros tipos de RNA e seis à possíveis novos miRNAs. Estes dados poderão subsidiar estudos funcionais subsequentes, que visem entender a função exercida por cada uma destas moléculas na musculatura esquelética. Buscando-se associar a ocorrência e expressão dos miRNAs ao controle da miogênese, foi analisada a expressão de três miRNAs identificados na biblioteca (miR-125b, miR-221 e miR-206), envolvidos na regulação do balanço entre proliferação e diferenciação celular, mecanismo determinante da miogênese. A análise foi realizada por PCR quantitativa em diferentes estádios do desenvolvimento (nove e 17 dias embrionário e 21 dias pós-eclosão) e entre duas linhagens de frango com potencial divergente para crescimento e ganho de massa muscular. Não houve diferença significativa na expressão dos miRNAs entre as linhagens em nenhum dos estádios aferidos, entretanto, foi possível traçar a ontogenia destas moléculas ao longo do desenvolvimento do animal, o que permitiu inferências sobre as condições morfológicas e fisiológicas das células musculares em cada um dos estádios analisados. Por fim, com o objetivo de associar os dados de expressão obtidos para os miRNAs, à variações na expressão de genes alvo, aferimos a expressão de três genes: SRF, Fstl e Pola1; onde o primeiro é regulado pelo miR-133a (cuja expressão não foi aferida devido à questões metodológicas) e os dois últimos pelo miR-206. A análise foi feita também por PCR quantitativa, entre as linhagens e em diferentes estádios do desenvolvimento. Foi possível visualizar, apenas nos estádios embrionários, a relação entre a expressão do miR-206 e seus genes alvo, com uma coerência entre o aumento na expressão do miR-206 e a diminuição na expressão de Pola1 e Fstl1. A determinação do perfil de expressão dos três genes ao longo do desenvolvimento muscular permitiu inferências sobre a ação destas moléculas no balanço entre proliferação e diferenciação nas linhagens de corte e postura / MicroRNAs (miRNAs) represent a class of small and noncoding RNAs, about 20-nucleotides long that negatively regulate gene expression posttranscriptionally. The regulatory action of these molecules is essential for the proper functioning of various biological processes, including the development and maintenance of skeletal muscles. To identify miRNAs that might be important for the skeletal muscle development, we constructed a miRNA library from pectoral skeletal muscle of 21º days after birth chickens. A total of 576 clones were sequenced and these sequences were collapsed into 98 clusters. Sequence analysis identified 47 small RNAs that show significant similarities with published miRNAs, 30 with others noncoding RNAs and six sequences clusters could be identified as potentially novel miRNAs. These data may support subsequent functional studies aimed at understanding the function performed by each of these molecules in skeletal muscle of chicken. To further associate the miRNA presence with the gene expression in the controlling of myogenesis the expression patterns of tree miRNAs identified in the library (miR-125b, miR-221 e miR-206) were analyzed. These miRNAs are involved in the balance between proliferation and differentiation mechanisms that control myogenesis. The expressions of these miRNAs were measured using quantitative RT-PCR. We analyzed samples from two embryos stages (9 and 17 days) and one adult stage (21º days after birth) in two chicken lines with different potential to growth and gain of muscle mass. There were no significant differences between the lines about these miRNAs expression. But, we could predict an overview of these miRNAs expressions during the muscle development of chicken, which allowed inferences about the physiologic and morphologic conditions of the muscles cells in each analyzed stage. Also, to further associate the miRNAs results to variations in the target genes expressions, we analyzed the expression of three genes: SRF, Fstl e Pola1. The first one is target of miR-133a (not analyzed due to methodological problems), and the others are target of miR-206. We analyzed by quantitative RT-PCR different stages and two chicken lines. It was possible to observe, only in the earlier stages, a relationship between the miR-206 expression and the Pola1 and Fstl1 expression, with a consistency between the increased expression of mir-206 and decrease in expression of Pola1 and Fstl1. The determination of the profile of these three gene expressions during the muscle development allowed inferences about the action of these molecules in the balance between proliferation and differentiation process in chicken strains for broiler and layer

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:54:36Z : No. of bitstreams: 1 000863483.pdf: 1230854 bytes, checksum: 5f969e218afa238395f61e6225eb65c2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Animais com alta população folicular (APF) antral possuem melhor desempenho reprodutivo quando comparados a animais de baixa população folicular (BPF). Essa variação no número de folículos antrais pode estar associada a diferentes perfis hormonais e de expressão de genes reguladores da ativação e crescimento folicular. Objetivou-se com o presente trabalho: 1) avaliar o perfil global de expressão gênica de folículos antrais em animais com APF e BPF nas raças Nelore (Bos indicus) e Aberdeen Angus (Bos taurus) e 2) identificar diferenças genotípicas através de um estudo de associação genômica (GWAS - Genome Wide Association Study) usando polimorfismos de nucleotídeo de sítio único (SNPs). Inicialmente foram avaliadas 155 novilhas da raça Nelore e 132 da raça Angus com idade e peso semelhantes. Os animais foram sincronizados e a contagem dos folículos realizada através de ultrassonografia 24 a 48 horas após o início do estro. Os grupos APF e BPF foram formados com base na média do número de folículos ± desvio padrão nas duas raças. Para avaliar o perfil global de expressão gênica usou-se a técnica do microarranjo. Um total de 15 novilhas Nelore (6 APF e 9 BPF) e 17 novilhas Angus (9 APF e 8 BPF) foram abatidas 12 a 24 horas após a ovulação e os ovários transportados ao laboratório. Foi realizado um pool de RNA extraído de três folículos (≤ 4 mm) individualmente (um pool por animal) dissecados do ovário. A análise dos dados procedeu-se no FlexArray 1.6.1.1 e os genes com fold change > 1,5 e P ≤ 0,05 foram considerados diferencialmente expressos. Para o estudo de GWAS 72 novilhas da raça Nelore (32 APF e 40 BPF) e 48 da raça Angus (21APF e 27 BPF) foram selecionadas. O DNA foi extraído do sangue e/ou bulbo capilar e a genotipagem foi realizada com o chip 777 HD bovine Illumina®. Os SNPs foram submetidos ao controle de qualidade usando como critérios de exclusão: call rate (IDCR) ≤ 90%,... / Animals with high antral follicle count (HFC) have a better reproductive performance when compared with animals with low follicle count (LFC). This variation in the number of antral follicles can be associated with different hormonal profiles and expression of genes regulating activation and follicular growth. The objective of the present work was: 1) to evaluate the global gene expression of antral follicles in animals with HFC and LFC in Nelore (Bos indicus) and Aberdeen Angus (Bos taurus) heifers and 2) to identify genotypic differences through a genomic wide association study (GWAS) using single nucleotide polymorphisms (SNP). Initially, 155 Nelore heifers and 132 Angus heifers with similar body weight and age were selected. The animals were synchronized and follicle count was done through ultrasound 24 to 48 h after estrus. The groups LFC and HFC were formed using the average of follicles ± standard deviation in both breeds. To evaluate the global gene expression profile we use a microarray chip. A total of 15 Nelore heifers (6 HFC and 9 LFC) and 17 Angus heifers (9 HFC and 8 LFC) were slaughter 12 to 24 h after ovulation and ovaries were transported to the laboratory. A pool of RNA from three follicles (< 4 mm) from each animal was used to the analysis using FlexArray 1.6.1.1 and the genes with fold change > 1.5 and P ≤ 0.05 were considered differentially expressed. For the GWAS study 72 Nelore heifers (32 HFC and 40 LFC) and 48 Angus heifers (21 HFC and 27 LFC) were selected. The DNA was extracted from blood and hair bulb and genotyping was done using the 777 HD Illumina chip. The SNPs were submitted to a quality control test using an exclusion criteria: call rate (IDCR) ≤ 90%, MAF ≤ 0.02, call rate (SNPCR) ≤ 0.98 and HWE ≤ 1 x 10-5. After the quality control test the SNPs were submitted to the Cochran-Armitage test to the association of phenotype/genotype in both breeds. The genes differentially expressed and the genes ... / FAPESP: 11/17370-0