Orientador: Raquel Mantuanelli Scarel Caminaga / Resumo: Estudos realizados por nosso grupo investigaram polimorfismos no gene Interleucina 8 (IL8) em 500 indivíduos com e sem periodontite e identificaram que o haplótipo ATC/TTC conferiu 2 vezes maior suscetibilidade à doença periodontal crônica (DP) em comparação com o haplótipo ATT/TTC. Estudos clínicos revelaram que indivíduos portadores do haplótipo no gene IL8 associado à DP, mesmo com baixo desafio microbiano, desenvolviam periodontite de maneira mais exacerbada quando comparados aos indivíduos portadores do haplótipo não associado à DP. No entanto, a funcionalidade biológica desses haplótipos no gene IL8 ainda não foi investigada por meio de controlados ensaios in vitro. A proposta deste estudo é avaliar a funcionalidade dos haplótipos no gene IL8 em células imunes, incluindo a investigação por meio da regulação da expressão do gene repórter presente em plasmídeos recombinantes construídos artificialmente (constructos). Foi coletado sangue periférico de pacientes que carregam cada haplótipo e estimulados com mediadores inflamatórios e bactérias periodontopatogênicas para se avaliar a expressão gênica (mRNA, RT-qPCR), proteínas secretadas (Multiplex), perfil fenotípico celular (Citometria de fluxo), fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por macrófagos (Citometria de fluxo) e potencial de migração de linfócitos e neutrófilos. Constructos contendo cada haplótipo foram transfectados em linfócitos T humanos (células JM) e a expressão do gene repórter GFP fo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Studies by this group investigated polymorphisms in the Interleukin 8 (IL8) gene in 500 individuals with and without periodontitis and identified that the ATC/TTC haplotype conferred 2-fold increased susceptibility to periodontal disease (PD) compared to the ATT/TTC haplotype. Clinical studies showed that individuals with IL8 haplotype associated with PD, even with low microbial challenge, responded in a more exacerbated manner when compared to individuals with not susceptible haplotype. However, the biological functionality of these haplotypes in the IL8 gene was not investigated by in vitro controlled assays. . The purpose of this study is to evaluate the functionality of haplotypes in the IL8 gene in immune cells including the investigantion of gene reporter expression present in the recombinant plasmids constructed artificially (constructs). Peripheral blood was collected from patients from each haplotype and stimulated with inflammatory mediators and periodontopathogenic bacteria to evaluate the gene expression (mRNA, RT-qPCR), secreted proteins (Multiplex), cellular phenotype profile (flow cytometry), phagocytosis and reactive oxygen species (ROS) by macrophages (flow cytometry) and migration potential of lymphocytes and neutrophils. Constructs containing each haplotype were transfected into Human lymphocytes (JM cells) and expression of the GFP reporter gene was evaluated using flow cytometry. The individuals with the susceptible haplotype (ATC / TTC) had higher levels... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-03T14:36:51Z No. of bitstreams: 1 2016_IsabelGarciaSousa.pdf: 4300650 bytes, checksum: f4e909f6055b9bc65b4d09b0e9497120 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-26T18:15:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IsabelGarciaSousa.pdf: 4300650 bytes, checksum: f4e909f6055b9bc65b4d09b0e9497120 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T18:15:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IsabelGarciaSousa.pdf: 4300650 bytes, checksum: f4e909f6055b9bc65b4d09b0e9497120 (MD5) / As células T CD3+ desempenham um papel importante nas respostas imunológicas associadas à doença autoimune e ao transplante de órgãos. Dados clínicos sugerem que a terapia anti-CD3 é uma opção de tratamento promissora para estas situações, entretanto o mecanismo imunoregulador ainda é incerto. O transplante de órgãos é uma terapia que vem se difundindo como o avanço da medicina. O desenvolvimento de novas técnicas cirúrgicas associadas a drogas imunossupressoras tornou rotineiro o transplante de órgãos. Não obstante, a sobrevivência do enxerto em longo prazo geralmente requer imunossupressão ao longo da vida, e raramente, os receptores exibem uma espontânea '' tolerância operacional '' com função do enxerto estável na ausência de imunossupressão. A falta de marcadores biológicos desse fenômeno se opõe a identificação de pacientes potencialmente tolerantes em que a imunossupressão poderá ser diminuída, e impede o desenvolvimento de novas estratégias de indução de tolerância. Em casos de transplantes de rins a tolerância operacional tem sido associada com a regulação de genes de diferenciação de células T e um aumento do número de células T periféricas totais, naïve e efetoras. Assim, o nosso objetivo foi avaliar biomarcadores de tolerância em diferentes grupos clínicos com transplantes renais: enxerto estável sob imunossupressão (ST), rejeição crônica do transplante renal (CR) e enxerto estável sem imunossupressão (OT). O perfil de expressão gênica de células T do sangue periférico de 15 pacientes renais transplantados (tolerantes operacional, rejeição crônica, função do enxerto estável com imunossupressão) e cinco indivíduos saudáveis foi analisado. Um subconjunto das amostras foi usado para análise de RNA-Seq. Três comparações entre os diferentes grupos de pacientes possibilitou a identificação de alguns genes diferencialmente expressos. Nós confirmamos a expressão desses genes por qPCR em tempo real. Estes biomarcadores foram aplicados na predição de tolerância por qPCR em tempo real em outros pacientes. Nós identificamos um pequeno painel de biomarcadores usando um perfil de expressão gênica em células T do sangue periférico de pacientes transplantados renais espontaneamente tolerantes. A rara coorte livre de drogas imunossupressoras com cinco pacientes transplantados de diferentes regiões do Brasil validaram específicos biomarcadores de tolerância periférica. A assinatura gênica aqui obtida sugere um padrão de apoptose por respostas das células T na rejeição crônica, bem como um viés de Treg na tolerância operacional. Estes genes podem também contribuir para o processo de tolerância, possivelmente através da regulação de fenótipos específicos de células Tregs periféricas ou alterando o limiar para a ativação de células T. Este conjunto de genes associados com a tolerância operacional podem ainda ter utilidade como uma ferramenta de monitoramento minimamente invasiva para guiar a titulação de imunossupressão. Além disso, a validação dessa ferramenta para a minimização da imunossupressão segura em ensaios clínicos prospectivos se justifica. Nas células T, os microRNAs (miRNAs) regulam várias vias, incluindo as associadas com a tolerância imunológica. Assim, o nosso objetivo foi também, avaliar as alterações na expressão de miRNAs em células T de dadores saudáveis, após o tratamento com anticorpos anti-CD3 humano. As células mononucleares do sangue periférico foram cultivadas na presença do anticorpo monoclonal OKT3, ou um fragmento recombinante do anticorpo humanizado anti-CD3. Após estes tratamentos, o perfil de expressão de 31 espécies de miRNAs foram avaliadas em células T utilizando ensaios TaqMan. Oito desses miRNAs testados (miR-155, miR-21, o miR-146 A de miR-210, miR-17, o miR-590-5p, miR-106 e miR-301A) foram regulados (estatisticamente significativos) negativa ou positivamente em relação a células não tratadas. Em conclusão, a estimulação de células T com anticorpos anti-CD3 humano altera os padrões de expressão de miRNAs, incluindo espécies associadas com vias de regulação do sistema imunológico. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / CD3+ T cells play a major role in immune responses associated with autoimmune disease and organ transplantation. Clinical data have suggested that anti-CD3 therapy is a promising treatment option for these situation, but it's immuno regulatory mechanism is still unclear. Organ transplantation is a therapy that has been disseminated to the advancement of medicine. The development of new surgical techniques associated with immunosuppressive drugs become routine organ transplantation. But, long-term allograft survival generally requires life long immunosuppression. Rarely, recipients display spontaneous ‘‘operational tolerance’’ with stable graft function in the absence of immunosuppression. The lack of biological markers of this phenomenon precludes identification of potentially tolerant patients in which immunosuppression could be tapered and hinders the development of new tolerance-inducing strategies. In kidney transplants operational tolerance has been associated with up regulation of T cell differentiation genes and an increased number of total, naïve and effector peripheral T cells. Thus our aim was evaluate tolerance biomarkers in different clinical groups with renal transplants: stable under immunosuppression (ST), chronic rejection of the renal transplant (CR) and stable renal transplant without immunosuppression (OT). The gene expression profile of peripheral blood T cells from 15 renal transplant patients (operational tolerance, chronic rejection, stable graft function in mmunosuppression) and five healthy individuals were analyzed. A subset of samples was used for RNA-Seq analysis. Three comparisons between different groups of patients allowed the identification of some differentially expressed genes. We confirm the differentially expression of genes by real-time qPCR. We have identified a small biomarker panel using gene expression profiling of T cell in the peripheral blood from spontaneously tolerant renal transplant recipients. The rare immunosuppressive drug free cohort of five transplant patients from different regions of Brazil, have validated specifics biomarkers of peripheral tolerance. The gene signature here obtained suggests a pattern of apoptosis by T cell cytotoxic responses in chronic rejection, well as T reg bias in operational tolerance. These genes may also contribute to the process of tolerance possibly by regulating specific phenotypes of peripheral regulatory T cells or altering the threshold for T cell activation. This set of genes associated with operational tolerance may have utility as a minimally invasive monitoring tool for guiding immunosuppression titration. Further the validation of this tool for safe immunosuppression minimization in prospective clinical trials is warranted. In T cells, microRNAs (miRNAs) regulate several pathways, including those associated with immune tolerance. Thus our aim was also evaluate changes in miRNA expression in T cells of healthy donors following treatment with anti-human CD3 antibodies. Peripheral blood mononuclear cells were cultured in the presence of the monoclonal antibody OKT3 or a recombinant fragment of humanized anti-CD3. Following these treatments, the expression profiles of 31 miRNA species were assessed in T cells using TaqMan arrays. Eight of the tested miRNAs (miR-155, miR-21, miR-146a, miR-210, miR-17, miR-590-5p, miR-106b and miR-301a) were statistically significative up- or downregulated relative to untreated cells. In conclusion, stimulation of T cells with anti-human CD3 antibodies alters miRNA expression patterns, including of miRNA species associated with immune regulatory pathways.

Tanto os androgênios quanto os estrogênios possuem um papel significativo na próstata e são indispensáveis para o crescimento normal prostático. A enzima aromatase catalisa a reação de conversão de androgênios para estrogênios. O papel dos estrogênios e seus receptores na etiologia e progressão do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB) é muito pouco compreendido. Objetivo: Analisar a expressão do mRNA dos receptores de estrogênio ER , ER 2, ER 5 e da enzima aromatase. Analisar a expressão protéica do ER e ER nos grupos CaP e HPB. Métodos: Tecidos prostáticos oriundos de câncer de próstata e de hiperplasia prostática benigna foram submetidos à extração de RNA total com o reagente Trizol, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando RT-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio , 2, 5 e aromatase. A expressão protéica de ER e ER foi analisada por Western blot. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão do mRNA ER (P<0,001) e da proteína (P<0,038) em amostras de câncer comparada a HPB. A expressão do mRNA do ER 5 foi significativamente aumentada nos tecidos hiperplásicos comparada ao grupo câncer. A expressão do mRNA do ER 2 e da aromatase não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Nossos resultados também mostraram que a expressão protéica do ER não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Conclusões: O presente estudo indicou que a expressão protéica e gênica do ER e a expressão gênica do ER 5 são diferentes entre os grupos sugerindo que o aumento dos níveis do ER no CaP e do mRNA ER 5 na HPB pode ser importante na progressão das doenças prostáticas. / Both androgens and estrogens play a significant role in the prostate and are critical for normal prostate growth. The aromatase enzyme catalyzes the reaction to conversion of androgens to estrogens. The role of estrogen and its receptors in the etiology and progression of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) is poorly understood. Objective: The purpose of this study was to evaluate the estrogen receptors ER , 2, 5 and aromatase enzyme mRNA expression and to investigate also the ER and ER protein expression in groups PCa and BPH. Method: Total RNA of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues was extracted from each sample by the Trizol method and cDNA was performed. ER , ER 2, ER 5 estrogen receptors and aromatase gene expression were quantified by RT-PCR. ER and ER protein expression was evaluated by Western blot. Results: Comparisons of the hyperplastic and tumor prostate tissues indicated an overexpression of ER mRNA (P<0,001) and protein (P<0,038) in tumor specimens. The mRNA expression of ER 5 was significantly increased in hyperplastic tissues compared to tumor group. The mRNA expression of ER 2 and aromatase was not different between BPH and PCa groups. Our results also showed that the protein expression of ER was not different between BPH and PCa groups. Conclusions: The present study indicated that gene and protein expression ER and gene expression ER 5 are different between the groups suggesting that the ER increased levels in PCa and mRNA ER 5 in BPH may be important in progression of prostate diseases.

Evidências sugerem que o transtorno bipolar esteja associado a uma toxicidade sistêmica, representada por alterações periféricas em marcadores de inflamação, estresse oxidativo e neurotrofinas, a qual parece estar associada aos episódios de humor e à progressão da doença levando a prejuízos sistêmicos e na neuroplasticidade. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo revisar estas alterações e explorar possíveis mecanismos responsáveis por estes achados, com enfoque em uma desregulação transcricional no transtorno bipolar. No primeiro capítulo, revisamos os biomarcadores periféricos associados aos episódios de humor, a relação destes com a toxicidade sistêmica e os possíveis mecanismos subjacentes a esta toxicidade. Seguimos ilustrando, no capítulo 2, um exemplo de alterações estruturais cerebrais em um paciente bipolar com experiência de múltiplos episódios, como um possível exemplo da neuroprogressão no transtorno bipolar. Em seguida, buscamos por vias de regulação transcricional disfuncionais no córtex pré-frontal de pacientes que poderiam estar associadas a essas alterações e neuroplasticidade prejudicada. A partir de abordagem inovadora de bioinformática, no capítulo 3, identificamos algumas unidades regulatórias (regulons) associadas com as duas assinaturas gênicas do transtorno bipolar avaliadas, obtidas a partir de bancos de dados de microarranjo de pré-frontal postmortem. Em uma análise mais rigorosa, identificamos apenas o regulon do gene early growth response 3 (EGR3) enriquecido nas duas assinaturas da doença em duas redes transcricionais do pré-frontal, estando reprimido no fenótipo bipolar. Nossos resultados sugerem o regulon do EGR3 como um alvo importante no transtorno bipolar. Considerando seu papel fundamental na resposta ao estresse e na translação de estímulos ambientas em mudanças na expressão gênica neuronal, propomos que uma disfunção em vias biológicas envolvendo EGR3 poderia levar a uma resposta prejudicada ao estresse e influenciar no risco para o transtorno bipolar. No quarto capítulo, então, caracterizamos o perfil de expressão gênica do modelo de células SH-SY5Y diferenciadas e avaliamos o comportamento do regulon do EGR3 de acordo com o protocolo de diferenciação. Além disso, identificamos moléculas com potencial de modular os regulons enriquecidos no transtorno bipolar visando testar o efeito destas drogas no referido modelo celular. Nossos resultados reforçam o fenótipo neuronal deste modelo in vitro e demonstram que o regulon do EGR3 está enriquecido nas células diferenciadas, sugerindo que ele é importante nesse processo e que este modelo experimental é adequado para estudar este regulon e as moléculas selecionadas pela análise de mapa de conectividade. Nós ainda avaliamos nas células SH-SY5Y o efeito do soro de pacientes bipolares, para investigar o papel da toxicidade sistêmica em células neuronais. O soro de pacientes, especialmente em estágio tardio da doença, causou toxicidade às células, reduzindo a densidade de neuritos e a viabilidade celular. Esses achados representam uma forma de desafio celular relacionado à toxicidade sistêmica do transtorno bipolar, propondo as células SH-SY5Y diferenciadas como um modelo in vitro para estudo desta doença. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a toxicidade sistêmica relacionada aos episódios recorrentes de humor pode influenciar nas alterações anatômicas cerebrais associadas com a progressão do transtorno bipolar, e a disfunção no regulon do EGR3 poderia estar envolvida com aspectos desta neuroprogressão considerando o papel de EGR3 na resposta ao estresse e na neuroplasticidade. Estas hipóteses, que também sugerem alvos interessantes para o desenvolvimento de novos tratamentos, devem ser apropriadamente validadas em modelos experimentais, como o modelo de células SH-SY5Y diferenciadas estudado neste trabalho. / Evidence suggests that bipolar disorder is associated with a systemic toxicity, represented by peripheral changes in markers of inflammation, oxidative stress and neurotrophins, which appears to be associated with mood episodes and illness progression leading to systemic damage and impaired neuroplasticity. The work presented in this thesis aimed to review these changes and explore possible mechanisms responsible for these findings, focusing on transcriptional regulation in bipolar disorder. In the first chapter, we review the peripheral biomarkers associated with mood episodes, their relationship with systemic toxicity and the possible mechanisms underlying this toxicity. We have shown, in Chapter 2, an example of structural brain changes in a bipolar patient with multiple episodes experience, as a possible example of ‘neuroprogression’ in bipolar disorder. Then we investigated dysfunctional transcriptional regulatory pathways in the prefrontal cortex of patients that could be associated with these changes and impaired neuroplasticity. Using innovative bioinformatics approaches, in Chapter 3, we identified some regulatory units (regulons) associated with the two gene signatures of bipolar disorder evaluated, obtained from microarray data sets from prefrontal postmortem studies. With a more rigorous analysis, we only identified the regulon of early growth response 3 gene (EGR3) enriched in the two bipolar signatures in the two transcriptional prefrontal networks evaluated, being EGR3 repressed in bipolar phenotype. Our results suggest the EGR3 regulon as an important target in bipolar disorder. Considering its key role in response to stress and translation of environmental stimuli into long-term changes in neuronal gene expression, we propose that a dysfunction in biological pathways involving EGR3 could lead to an impaired response to stress and influence on the risk for bipolar disorder. Then, in Chapter 4, we characterized the gene expression profile of differentiated SHSY5Y cells and evaluated the EGR3 regulon according to the differentiation protocol. Furthermore, we have identified molecules with potential to modulate the regulons enriched in bipolar disorder, using connectivity map analysis, in order to test the effect of these drugs on this cellular model in future studies. Our results consolidated the neuronal phenotype of this in vitro model and demonstrated that the EGR3 regulon is enriched in differentiated cells, suggesting that it is important in this process and that this experimental model is suitable for studying this regulon and molecules selected by connectivity map analysis. Moreover, in Chapter 5, we evaluated the effect of serum of bipolar patients on differentiated SH-SY5Y cells to investigate the role of systemic toxicity in neuronal cells. The serum of patients, especially at late stages of illness, caused toxicity to cells, reducing neurite density and cell viability. These findings represent a strategy of challenging cells related to the systemic toxicity of bipolar disorder, proposing differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model to study this disorder. Therefore, the results of this thesis suggest that systemic toxicity related to recurrent mood episodes may influence on the brain anatomical changes associated with the bipolar disorder progression, and dysfunction in EGR3 regulon could be involved with aspects of ‘neuroprogression’ considering the role of EGR3 in response to stress and neuroplasticity. These hypotheses, which also suggest interesting targets for the development of new treatments, should be further properly validated in experimental models such as the differentiated SH-SY5Y cells model studied in this work.

Resumo não disponível.

Introdução: O transplante renal (TR) é o tratamento de escolha para uma significativa porção de pacientes com perda crônica terminal da função renal. Apesar dos progressos obtidos, a disfunção inicial do enxerto (DIE) permanece como uma importante complicação precoce muitas vezes levando à necessidade da biópsia renal. Essa, apesar de suas limitações, riscos e custos, é considerada padrão ouro para a avaliação das disfunções dos enxertos renais. Assim sendo é imprescindível estudar e buscar biomarcadores não invasivos capazes de diagnosticar as agressões aos transplantes renais, em especial na fase de DIE, quando os parâmetros funcionais não estão disponíveis. Objetivo: Analisar e quantificar a expressão do micro Ácido Ribonucleico (miRNA) mi RNA-146a-5p em amostras de sangue periférico e tecido renal de pacientes que desenvolveram disfunção do enxerto associados a lesões de isquemia e reperfusão após transplante renal. Métodos: Trata-se de um estudo transversal. Os pacientes submetidos a transplante renal que necessitarem de biópsia devido à presença de DIE foram convidados a participar da pesquisa e a assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. As amostras foram armazenadas no período de março de 2013 a abril de 2017. Posteriormente foi avaliada a expressão do micro RNA (miR-146 a-5p) em tecido renal e em sangue periférico. Resultados: Em amostras de biópsia renal, encontramos um aumento estatisticamente significativo na expressão de miR-146a-5p no grupo de disfunção inicial do enxerto (DIE, n=33) versus grupo de pacientes estáveis (STA, n=13), P= 0,019 no grupo de pacientes com rejeição aguda (RA, n=9) versus grupo de DIE não observamos diferença significativa, P=0,106, assim como o grupo de pacientes estáveis versus RA não observamos diferença significativa, P= 1,000. Diferença na análise global P = 0,008. No entanto, em amostras de sangue periférico encontramos aumento na expressão gênica de miR-146a-5p no grupo de DIE versus pacientes STA , porém, não foi estatisticamente significativo, P= 0,083. Não houve correlação entre a expressão miR-146a-5p nos diferentes grupos de biópsia e sangue periférico, P=0,541. Conclusão: A expressão do miR 146a-5p apresentou expressão gênica distinta na disfunção inicial do enxerto em amostras de biópsias, podendo vir a ser considerado potencial biomarcador de lesão de isquemia e reperfusão renal. / Introduction: Kidney transplantation is the treatment of choice for a significant portion of patients with chronic terminal loss of renal function. Despite the progress achieved, delayed graft function DGF remains an important early complication. Graft biopsy, despite its limitations, risks and costs, is considered a gold standard for the diagnosis of graft dysfunction. Therefore, it is imperative to study and search for noninvasive biomarkers capable of diagnosing injuries to kidney transplants, especially in the DGF period when functional parameters are not available. The objective of the present study was to analyze and quantify the expression of miRNA-146a -5p ribonucleic micro-acids (miRNAs) in peripheral blood and renal tissue samples obtained from patients who underwent renal transplantation and developed DGF which is associated with lesions of ischemia and reperfusion injuries, after renal transplantation. Methods: This is controlled cross-sectional study involving transplant recipients, between March 2013 and April 2017, that underwent DGF and received a graft biopsy. Patients had their tissue and peripheral blood samples stored and latter analyzed for the expression of the micro-RNA: miR-146a-5p in renal tissue and blood. (Continuatiation) Results: In graft tissue samples a statistically significant increase in miR-146a-5p expression in the initial graft dysfunction group (DIE, n=33) was observed in the comparison with the group of stable patients (STA, n=13) group, P=0,019. The difference wasn’t significant in the comparison with the acute rejection (AR, n=9) group versus group DIE, P=0,106, as well stable patients group versus AR we didn’t observe a significant difference, P=1,000 . Overall group significance P=0.008. However, in peripheral blood samples we found an increase in miR-146a-5p gene expression in the DIE group versus STA patients, however, it was not statistically significant, P = 0.083. There was no correlation between expression miR-146a-5p in the renal tissue and peripheral blood samples, P=0,541. Conclusion: We concluded that miR-146a-5p expression has a distinct pattern of expression in the setting of DGF and has the potential of becoming a biomarker for ischemia and reperfusion injury in kidney transplant recipients.

A esquistossomose mansônica é a segunda maior endemia parasitária do mundo em termos de extensão das áreas endêmicas e do número de pessoas infectadas com 200 milhões de pessoas acometidas. Esta doença é causada pelo parasito trematódeo Schistosoma mansoni, o qual apresenta adequados mecanismos de resposta ao estresse envolvendo a regulação da expressão gênica e proteica, reparo ou substituição de moléculas danificadas, recuperação do balanço redox, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema ubiquitina- proteassoma é importante para manter a homeostase proteica durante o estresse celular. Inibidores do proteassoma podem interferir em processos como crescimento, progressão do ciclo celular e replicação, e os seus efeitos vem sendo caracterizados em muitos parasitos. Nosso laboratório demonstrou que MG132 reduz o número de esquistossômulos, a carga parasitária e a ovoposição em camundongos infectados com S. mansoni. Neste trabalho, são descritos os efeitos in vitro do estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico em vermes adultos de S. mansoni. Observou-se alteração no perfil de expressão proteica durante estresse oxidativo e térmico, sendo identificadas dezoito proteínas upreguladas nestas condições. Estas proteínas estão envolvidas em muitas vias intracelulares como dobramento de proteínas, proteólise, ligação a íons cálcio, regulação de proteínas e resposta a estresse. Além disso, o estresse oxidativo gerou mudanças em vermes adultos de S. mansoni em processos como produção de ovos, motilidade, morfologia do tegumento, viabilidade e pareamento dos vermes. O estresse químico induzido com Curcumina, IBMX e MG132 aumentou a produção de ROS intracelular e alterou o perfil de expressão de enzimas antioxidantes em S. mansoni. As enzimas SmGPx1 e SmPGx2 tiveram a expressão aumentada no estresse com Curcumina e IBMX, enquanto que SmSOD e SmTGR foram induzidas no estresse com Curcumina. As enzimas do proteassoma SmHul5 e SmUbp6 tiveram a expressão modulada durante o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico. Em adição, a análise de expressão no ciclo de vida de S. mansoni revelou que estes genes apresentam um nível alto de expressão em esporocistos, esquistossômulos e miracídios. Estes resultados sugerem que estas proteínas acessórias do proteassoma participam da resposta ao estresse e desenvolvimento do parasito. O nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6 foi cerca 9 e 16 vezes menor em relação ao controle no estresse químico induzido com IBMX, respectivamente, sugerindo a desmontagem do proteassoma. Por outro lado, Curcumina, MG132, estresse oxidativo e choque térmico aumentaram o nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6. Além disso, o nível de expressão da proteína de maturação do proteassoma (SmPOMP) aumentou no estresse com Curcumina, MG132 e estresse oxidativo, sugerindo a síntese de novas populações de proteassoma. Em relação ao estresse oxidativo, nós demonstramos o aumento no nível proteico de proteassoma 20S e da subunidade alfa-3 do proteassoma sugerindo que em S. mansoni as proteínas oxidadas são degradadas pelo proteassoma 20S. Além do mais, nós observamos que vermes adultos de S. mansoni parecem utilizar mecanismos de resposta similares para diferentes estresses. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico modificam o perfil de expressão de genes relacionados ao sistema ubiquitina-proteassoma e sugerem que o proteassoma é importante para as respostas celulares ao estresse neste parasito. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by blood flukes (genus Schistosoma) and affecting 200 million people worldwide. This disease continues to rank, following malaria, at the second position of the world\'s parasitic diseases in terms of the extent of endemic areas and the number of infected people. There are different types of stress and the organisms have many mechanisms to respond to these stressor agents. The responses involve the regulation of gene and protein expression and consist in events such as repair or substitution of damaged molecules, recovery of redox balance, cell cycle control and apoptosis. The proteasomal system is important to support the protein homeostasis during the cellular stress. Effect of proteasome inhibitors has been described in many protozoans, either inhibiting growth or cell cycle progression, or blocking replication. Our laboratory\'s results have shown that MG132 reduces the number of lung stage schistosomula, the worm burden and consequently decreases oviposition in S. mansoni-infected mice. Here, we describe the in vitro effects of oxidative stress, heat shock and chemical stress in S. mansoni adult worms. We report that the oxidative stress and heat shock cause drastic changes in the protein profile of S. mansoni adult worms, and we identified a total of eighteen upregulated proteins in these conditions. These proteins are involved with many intracellular pathways as protein folding, proteolysis, calcium ion binding, regulator proteins and stress response. In addition, oxidative stress induced with H2O2 generated significative changes in the adult worms concerning process such as egg production, motor activity, tegument morphology, viability and pairing of worms. Chemical stress induced with Curcumin, IBMX and MG132 increases ROS production and changes the gene expression profile of antioxidant enzymes of S. mansoni adult worms. The enzymes SmGPx1 and SmGPx2 were upregulated in Curcumin and IBMXinduced chemical stress, and both SmSOD and SmTGR were upregulated- Curcumin. The proteasomal enzymes SmHul5 and SmUbp6 had their gene expression modified during oxidative stress, heat shock and chemical stress. Besides of, expression analyses in the S. mansoni life cycle indicate that genes are different express in sporocyst, schistosomula and miracidia. These results suggest these accessory proteins proteasome participates of stress response and parasite development. The expression level of SmHul5 and SmUbp6 were 16 and 9 times less than the control in chemical stress induced by IBMX, and we suggest that these results are due to the proteasome disassembling. On the other hand, Curcumin, MG132, oxidative stress e heat shock increases the expression of SmHul5 and SmUbp6. Furthermore, the expression level of maturation proteasome protein (SmPOMP) increases in stress induced by Curcumin, MG132 and oxidative stress suggesting new proteasome synthesis. In addition, we demonstrate increase the both 20S level and alpha-3 subunit proteasome in the oxidative stress, suggesting that in S. mansoni oxidized protein formed due to oxidative damage are degrade by proteasome 20S. We observed that S. mansoni adult worms utilize similar mechanisms to respond different stresses. Ours results demonstrate that oxidative stress, heat shock and chemical stress modified the expression profile of genes related with the ubiquitinproteasome system and suggest that the proteasome is important to responses the cellular stresses in the parasite.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T14:31:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 277501.pdf: 951849 bytes, checksum: 8864dc9021f31277e5fe68c699447939 (MD5) / O óleo diesel é um potencial contaminante de estuários e mangues, especialmente porque ele é o principal combustível utilizado em embarcações. Além disso, a exploração de petróleo e transporte causam sérios riscos ao ambiente marinho. No capítulo 1, foram estudados aspectos químicos e bioquímicos no peixe Poecilia vivipara expostos a fração do óleo diesel acomodada em água (FAD). Os peixes expostos à concentração de 20% de FAD apresentaram um aumento na atividade GST, GR e EROD no fígado. As brânquias apresentaram um aumento na atividade GST nas concentrações de 10% e 20% da FAD, enquanto a atividade EROD aumentou nas concentrações de 2,5%, 10% e 20%. Esse aumento indica uma adaptação do sistema de biotransformação desses organismos para detoxificação dos hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos tipicamente encontrados no óleo diesel. No capítulo 2, foram estudados os aspectos moleculares e químicos no peixe Poecilia vivipara exposto a 10% FAD. Os resultados mostraram 27 genes diferencialmente expressos, sendo 12 induzidos e 15 reprimidos. Os resultados de qPCR confirmaram a indução dos genes Citocromo P4501A (CYP1A), Citocromo P4502P2 (CYP2P2), Metiltransferase (MET), Glutationa S-transferase (GST), Uridina Difosfato Glicoronosil Transferase (UDPGT1B) e a repressão do gene Vitelogenina A (VgA) em machos. A maioria dos genes induzidos validados por qPCR está envolvida nas duas primeiras etapas de biotransformação, enquanto o gene validado como reprimido, VgA, está envolvido com a vitelogênese. Juntos, os resultados mostram significativas mudanças bioquímicas e moleculares que são potenciais biomarcadores para compostos presentes na FAD. / Diesel oil is a potential contaminant of estuarine and mangrove areas, especially, because it is the main fuel used in vessels. In addition, offshore oil exploration, production and transport pose serious risks to the marine environment. In the chapter 1, biochemical and chemical aspects were studied in the fish Poecilia vivipara exposed to Diesel Oil Water Accommodated Fraction (FAD). Fish exposed to 20% of FAD showed an increase in the GST, GR and EROD enzymatic activity in liver. The gills showed an increase in GST activity in the 10% and 20% FAD concentrations, while EROD activity increased in the 2.5%, 10% e 20% FAD concentrations. These increases indicate a biotransformation system adaptation of these organisms to detoxify the aliphatic and aromatic hydrocarbons typically found in the diesel oil. In the chapter 2, molecular and chemical aspects were studied in the fish Poecilia vivipara exposed to 10% FAD. The SSH results showed 27 differentially expressed genes, 12 upregulated and 15 downregulated. The qPCR results confirmed the Cytochrome P4501A (CYP1A), Cytochrome P4502P2 (CYP2P2), Methyltransferase (MET), Glutathione S-transferase (GST), Uridine Diphosphate Glucuronosil Transferase (UDPGT1B) gene induction and Vitelogenin A (VgA) gene repression in male fish. The majority of the upregulated genes validated by qPCR is involved with the two biotransformation phases, while the gene validated as downregulated, VgA, is involved with vitellogenesis. Together, the results show significant biochemical and molecular changes that are potential biomarkers for FAD compounds.

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-07-05T12:08:57Z No. of bitstreams: 1 LisianeLB_TESE.pdf: 1488335 bytes, checksum: 7e4835cb992ca6077a7e0786238ae496 (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-07-18T15:03:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LisianeLB_TESE.pdf: 1488335 bytes, checksum: 7e4835cb992ca6077a7e0786238ae496 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T15:04:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LisianeLB_TESE.pdf: 1488335 bytes, checksum: 7e4835cb992ca6077a7e0786238ae496 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Carthamus tinctorius L. is promising specie for biodiesel production due to its better adaptation to low rainfall regions, moderate tolerance to salinity and good capacity to grow in different arid and semi-arid regions in the world. Meanwhile, its physiological, biochemical and molecular mechanisms involved in tolerance or susceptibility to salt and drought stresses are not yet fully understood. The aim of this work was to analyze growth and water status indicators as well as the possible contribution of inorganic and organic solutes in osmotic adjustment. Also, we have carried out semi-quantitative RT-PCR assays to detect P5CS, P5CR and BADH, enzymes involved in proline and glycine betaine pathways respectively in leaves and roots submitted to salt stress and drought. C. tinctorius responds differently to salt (50-100 mM NaCl) and water (-0.25 to -0.50 MPa PEG 6000) stresses. Treatments with NaCl and PEG 6000 have induced significant changes in growth, organic and inorganic solutes content and gene expression. However the intensity and type of response were different for each stress condition. Safflower was more sensitive to water stress. Salt stress has increased Na+ content in the leaves (8x in plants exposed to 100 mM NaCl and 2x in roots treated with NaCl 50 mM). Drought caused K+ accumulation in the leaves (Na+/K+ higher than 0.6) indicating a possible ionic toxicity. Organic solutes (sugar, protein, amino acid, proline and glycine betaine) have accumulated in leaves when submitted to water deficit as also in roots (proteins, amino acids and glycine betaine consider levels, and the roots accumulated proteins, amino acids and glycine betaine). Such effects show a possible osmotic adjustment. When treated with NaCl, the plants kept the content of organic solutes in the control. The gene marker expression shown that P5CS gene was expressed only in safflower leaves under salt and water severe stresses (100 mM NaCl and -0.50 MPa). P5CR was detected in all treatments and in the same level as well as in leaves and roots. BADH has been expressed in leaves only when subjected to drought. In roots, there was expression in both stresses (salt and water deficit). Safflower plants respond differently to the effects of salinity and water stress showing that plant response is treatment, dose and organ dependent / O Carthamus tinctorius L. vem se destacando nas pesquisas por ser uma espécie promissora para produção de biodiesel, ter boa adaptação a regiões de baixa pluviosidade, além de ser considerada uma cultura moderadamente tolerante a salinidade, podendo ser cultivada em diferentes regiões áridas e semiáridas do mundo. Como os mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares implicados na tolerância e/ou susceptibilidade aos estresses salino e déficit hídrico ainda não estão plenamente compreendidos para C. tinctorius, este trabalho teve como objetivo observar os indicadores de crescimento e status hídrico, a possível contribuição dos solutos inorgânicos e orgânicos no ajustamento osmótico, e o comportamento da expressão dos genes P5CS e P5CR, enzimas de síntese da prolina e BADH, enzima de síntese da glicina-betaína, em folhas e raízes de cártamo submetido aos estresses salino e déficit hídrico. Plantas de C. tinctorius responderam de forma diferenciada aos estresses salino e hídrico, induzidos por soluções de NaCl (50 e 100 mM) e por soluções de PEG 6000 (-0,25 e -0,50 MPa), respectivamente. Os tratamentos com NaCl e PEG 6000 foram capazes de induzir alterações significativas nos indicadores de crescimento e status hídrico, nos conteúdos de solutos orgânicos e inorgânicos e ainda na expressão dos genes. Contudo a intensidade e tipo de resposta foram diferentes em relação aos estresses aplicados. Para as variáveis de crescimento e status hídrico, o cártamo mostrou-se mais sensível ao estresse hídrico, possivelmente devido aos íons salinos manter o potencial osmótico. Com relação aos solutos inorgânicos, e em relação ao controle, o estresse salino provocou aumento do conteúdo de Na+ nas folhas, sendo de 8 vezes nas plantas tratadas 100 mM de NaCl, e de 2 vezes nas raízes tratadas com 50 mM de NaCl. Já o déficit hídrico provocou acúmulo de K+ nas folhas das plantas tratadas com PEG 6000. A relação Na+/K+ foi maior que 0,6 indicando uma possível toxidez iônica. Os solutos orgânicos acumularam-se quando as plantas foram submetidas ao déficit hídrico. As folhas acumularam açúcares, proteínas, aminoácidos, prolina e glicina betaína, e as raízes acumularam proteínas, aminoácidos e glicina betaína. Tais efeitos, evidenciam um possível ajustamento osmótico. Quando tratadas com NaCl, as plantas mantiveram o conteúdo de solutos orgânicos em relação ao controle. Quanto a expressão dos genes P5CS, P5CR e BADH, o cártamo respondeu de forma diferenciada. O gene P5CS expressou-se apenas nas folhas de cártamo, e somente sob os estresses salino e hídrico severos (100 mM de NaCl e -0,50 MPa). E o gene P5CR expressou-se em todos os tratamentos submetidos, como também nas folhas e raízes. BADH se expressou nas folhas somente quando submetidas ao déficit hídrico, e nas raízes, houve expressão em ambos estresses (salino e déficit hídrico). Plantas de cártamo respondem de forma diferenciada aos efeitos da salinidade e déficit hídrico, mostrando que a resposta das plantas é tratamento, dose e órgão dependente / 2017-07-05

A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) associa-se a RNA e transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polirribossomos. No SNC, tem um importante papel como reguladora traducional atuando na maturação e eliminação sináptica. A exclusão do éxon 14 de transcritos do FMR1, associada ao uso do terceiro sítio de splicing do éxon 15 do FMR1, acarreta mudança da fase de leitura dos códons subsequentes, produzindo potencialmente isoformas da FMRP com nova região C-terminal, sem o sinal de localização nuclear e o domínio RGG, principal efetor de sua associação a RNAs. Sua importância funcional ainda não foi estudada. Neste trabalho, avaliamos por RT-qPCR a expressão dos transcritos que incluem e excluem o éxon 14 do Fmr1 no SNC de ratos e identificamos o córtex cerebral no décimo nono dia embrionário (E19) e no segundo dia pós-natal (P2) como tecido e fases do desenvolvimento em que são observados transcritos do Fmr1 com junção entre o éxon 13 e o terceiro sítio de splicing do éxon 15. Demonstramos que transcritos com essa junção exônica associam-se à proteína 4E de iniciação da tradução de eucarioto (eIF4E), indicando sua estabilidade no citoplasma. Geramos um anticorpo que identifica proteína de fusão com nova região C-terminal da FMRP. Paralelamente, a triagem por elementos em cis (transcritos) e fatores proteicos em trans trouxeram candidatos a inibirem o splicing do éxon 14 do FMR1 / Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), encoded by the Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is an RNA-binding protein with nucleus-to-cytoplasm shuttling, and polyribosome association. In the central nervous system (CNS), FMRP is a translation regulator with important roles in synaptic maturation and elimination. In primary FMR1 transcripts, exon 14 skipping followed by selection of the exon 15 third splicing acceptor site, shifts the open reading frame of the downstream codons creating a putative FMRP isoform with a novel C-terminus, which lacks the nuclear localization signal and the major RNA binding domain, RGG box. The relevance of such isoform is as yet unknown. In the present study, we assessed, by RT-qPCR, the expression of rat Fmr1 transcripts in the CNS, relative to the inclusion of exon 14. We identified the cerebral cortex in the nineteenth embryonic day (E19) and the second postnatal day (P2) as the most prominent sources of transcripts bearing a splicing junction between exon 13 and the third splicing acceptor site in exon 15. Those transcripts are associated with the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E), indicating its cytoplasmic stability. We generated an antibody that recognizes a fusion protein carrying the novel FMRP C-terminus. Concurrently, a search for ci (transcript) and trans (protein) elements identified putative inhibitors of FMR1 exon 14 splicing