O objetivo do trabalho foi relacionar a baixa produtividade com perdas corporais lactacionais, caracterizando o perfil das fêmeas propensas ao risco, estudar detalhadamente este grupo de fêmeas e avaliar possíveis alternativas para minimizar os efeitos do catabolismo. O primeiro experimento analisou fêmeas de diferentes ordens de parto (OP) e perda de peso na lactação. Houve efeito da interação entre ordem de parto e perda de peso na taxa de parto das fêmeas (P<0,05) em fêmeas OP1 e OP2. Não houve interação da classe de OP com classe de perda de peso (P>0,05) para IDE e total de leitões nascidos. Fêmeas OP1 apresentaram IDE mais longo e menor tamanho da leitegada no parto subsequente (P<0,05) em comparação às fêmeas OP2 e OP3-5. As perdas corporais na lactação não afetaram o IDE (P>0,05), mas reduziram o tamanho da leitegada do parto seguinte (P<0,05). Os resultados sugerem que as fêmeas mais jovens são mais sensíveis ao catabolismo, afetando o desempenho reprodutivo após o desmame. Além disso, perdas corporais lactacionais reduzem o tamanho da leitegada subsequente. O segundo experimento estudou o efeito do peso ao parto (PP) e consumo energético em relação à mantença (CEM) na lactação de fêmeas OP1 e OP2 no desempenho reprodutivo. O baixo CEM afetou as perdas corporais em ambas as OP (P<0,05). O peso ao parto não afetou o consumo alimentar em fêmeas OP1, mas influenciou a ingestão de OP2. A concentração sérica de NEFA foi influenciada pelo CEM em OP1 e OP2. Alto CEM de OP1 implicou em aumento de ureia. Em OP1, o tamanho da leitegada não foi afetado pelo PP ou CEM, mas foi reduzida em OP2 com baixo PP ou CEM. O terceiro trabalho investigou o efeito de atrasar o primeiro serviço de OP1 após o desmame com tratamento com altrenogest (ALT) ou cobertura do segundo estro após o desmame (SKIP), comparado à inseminação no primeiro estro (CON). A restrição alimentar de 60% na última semana de lactação induziu uma perda média de peso corporal de 17kg. Quanto maior foi o intervalo desmame-serviço, maior foi a recuperação do peso à inseminação. O grupo ALT foi mais síncrono na entrada ao estro após a retirada do produto. A taxa de prenhez foi maior no SKIP e CON. ALT teve maior peso de corpora lutea e níveis de progesterona até 120h pós-ovulação. Não foi observada diferenças na taxa de ovulação, embriões viáveis, sobrevivência embrionária, tamanho dos embriões ou volume de fluido placentário. Dependendo do sistema de produção, estas estratégias podem trazer benefícios econômicos, quando aplicadas com critério em fêmeas com maior risco à baixa produtividade, uma vez que custo deve ser considerado. / The aim of this work was to relate low productivity to lactational weight loss, identifying the profile of females with more risk, study in details this cohort of sows and evaluate possible alternatives to minimize the effects of catabolism. The first trial evaluated females of different parity order (PO) and weight loss during lactation. There was interaction effect between parity order and weight loss on farrow rate (P<0.05) in PO1 and PO2 females. There was no interaction between PO and weight loss class (P>0.05) on WEI and subsequent total born. PO1 females presented longer WEI and lower litter size on subsequent farrowing compared to PO2 and PO3-5 females. Weight loss did not affect WEI (P>0.05), but it was related to a decrease of litter size in the subsequent farrowing (P<0.05). Results suggest young females are more sensitive to catabolism, affecting reproductive performance post weaning. The second experiment studied the effect of body weight at farrowing (BWF) and energy intake related to maintenance (MEIM) during lactation on subsequent reproductive performance of PO1 and PO2 sows. Low MEIM affected body weight loss in both PO (P<0.05). BWF did not affect energy intake in PO1 sows but influenced the consumption in PO2 sows. Serum NEFA concentration was influenced by MEIM in PO1 and PO2 sows. High MEIM PO1 sows showed higher urea concentration. In PO1, litter size was not affected by BWF or MEIM but was reduced in PO2 with Low BWF or MEIM. Third trial investigated the effect of delayed breeding in weaned PO1 sows with altrenogest treatment (ALT) or breeding at second estrus after weaning (SKIP), compared to breeding at first estrus after weaning (CON). Feed restriction at 60% during last week of lactation induced 17kg of body weight loss. The longer weaning to service interval resulted in greater recover of body weight at breeding. ALT group was more synchronized in estrus after altrenogest withdrawal. Pregnancy rate was greater in SKIP and CON. ALT had higher corpora lutea weight and progesterone levels at 120h post-ovulation. No differences in ovulation rate, live embryos, embryo survival, embryo size, or placental fluid volume were detected. Depending on the production system, these strategies may offer economic benefits, when carefully applied in a cohort of females with more risk to low productivity, since costs must be considered.

Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear. / Understanding the cellular and molecular processes that determine the oocytes quality is one of the main challenges that persist in biology of reproduction. The acquisition of oocyte competence, and the role played by the follicular environment surrounding the gamete in its development potential are phenomena to be better understood. Follicular cells, especially the cumulus cells, certainly play a role in the oocyte competence acquisition in vivo. During in vitro maturation (IVM) of oocytes was observed expansion and mucification of granulosa cells forming the cumulus-oocyte complex (COC), due to the intense synthesis of extracellular matrix components. These changes in the appearance of cumulus are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization to occur. The expression of proteins associated with the extracellular matrix of cumulus cells may be under the influence of oocyte origin, and may also be related to the composition of the IVM medium. The aim of this work were 1) to evaluate the expression of gene transcripts coding for proteins hyaluronic acid synthase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and actin-b (ACTB) in bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) not matured or submitted to IVM in media with different proteic supplements, and 2) assess the rates of nuclear maturation of oocytes subjected to different conditions of IVM. The COCs were obtained from ovaries collected from cows immediately after slaughter, morphologically selected and divided into three groups: G1: not matured COCs; G2: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with fetal calf serum (FCS); and G3: COCs submitted to IVM in TCM supplemented with bovine serum albumin (BSA). IVM was performed at 39°C in 5% CO2 and maximum relative humidity for 22 to 24 hours. For extraction of total RNA of COCs samples, TRIzol® reagent was used. Total RNA was subjected to capture of specific mRNA by magnetic separation (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). The mRNAs were reverse-transcribed into cDNA using the RT-PCR to evaluate the expression patterns of transcripts. Some of the oocytes from G2 and G3 was stripped of cumulus cells, and subjected to staining with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The analysis of relative abundance of interest mRNAs showed a significant difference between the different groups tested for transcripts of HAS2 (p = 0.000), link protein 1 (p = 0.001), connexin 43 (p = 0.007) and actin-b (p = 0.011), being higher in the groups of COCs submitted to IVM in medium supplemented with FCS. The evaluation of nuclear morphology showed no significant differences between maturation rates of G2 and G3. In conclusion, the IVM in media supplemented with FCS or BSA showed differeces in HAS2, link protein 1, connexin 43 and actin-b transcripts expression of bovine COCs. However, the nuclear maturation rates of oocytes subjected to IVM in media with different proteic supplements was not affected.

Orientador: Luis Artur Loyola Chardulo / Coorientador: Pedro de Magalhães Padilha / Banca: Simone Cristina Méo Miciura / Banca: Henrique Nunes de Oliveira / Banca: Saulo da Luz e Silva / Banca: Rogerio Abdallah Curi / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação da expressão gênica e proteômica com a maciez da carne de bovinos da raça Nelore. A partir de uma população de 90 animais foram selecionados três grupos experimentais por meio da análise de força de cisalhamento (FC) e índice de fragmentação miofibrilar (MFI), sendo: carne moderadamente macia, carne moderadamente dura e carne muito dura. A expressão dos genes foi avaliada por meio da análise de PCR em tempo real e a análise proteômica foi realizada com base na separação de proteínas por meio da eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e caracterizção por espectrometria de massas com ionização eletrospray (ESI-MS/MS). A expressão da isoforma da calpastatina (CAST2) mostrou-se up regulated (P<0,05) nos grupos de carne moderadamente dura e muito dura. Os genes HSP90AA1, DNAJA1 e HSPB1, os quais representam as proteínas de choque térmico Hsp90, Hsp40 e Hsp27, respectivamente, mostraram expressão down regulated (P<0,05) no grupo de carne moderadamente macia em relação ao grupo de carne muito dura. Na análise proteômica, a expressão do spot protéico das enzimas metabólicas TPI e PGM1, proteína estrutural PFN1 e aminiopeptidase LAP3 se mostraram up regulated (P<0,05) no grupo de carne moderadamente macia, enquanto que a expressão das proteínas estruturais (ACTA1, ACTB, ACTG1 e MLC1), estresse oxidativo (PRDX6, PRDX2, PRDX1 and PARK7), proteínas de choque térmico (HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPD1 e HSPB1), e co-... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate the association of gene expression and proteomics with meat tenderness in Nellore cattle. From population of 90 animals three experimental groups were selected by shear force (SF) and/or myofibrillar fragmentation index (MFI): moderately tender meat, moderately tough meat and very tough meat. Gene expression was evaluated by real-time PCR and proteomics analysis was performed based on protein separation by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and characterisation by eletrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS/MS). Expression of the calpastatin isoform (CAST2) was up-regulated (P<0.05) in the moderately tough and very tough meat groups. Expression of the HSP90AA1, DNAJA1 and HSPB1 genes, wich represent the heat shock proteins Hsp90, Hsp40 and Hsp27, respectively, were down-regulated (P<0.05) in the moderately tender meat in relation to the very tough group. In the proteomics analysis, the expression of the protein spots of metabolism TPI1 and PGM1, structural protein PFN1, and aminopeptidase LAP3 were up regulated (P<0.05) in the moderately tender meat, while the expression of structural proteins (ACTA1, ACTB, ACTG1 and MLC1), oxidative stress (PRDX6, PRDX2, PRDX1 and PARK7), heat shock protein (HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPD1 and HSPB1) and co-chaperones and cellular regulatory (CD37, STIP1 and ARHGDIA) were down regulated (P>0.05) in the same experimental group. The present results suggest an importa... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Banca: Vivian Boter Bergamasco / Banca: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida das proteínas Cry1Ia10 e Cry8 contra larvas de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), buscando por potencial sinérgico. Para tanto, o gene cry8 foi amplificado por PCR a partir de um clone previamente construído, obtendo-se um fragmento de aproximadamente 3531 pb e subclonado no vetor de expressão pET-SUMO. Para a expressão dos genes cry1Ia10 e cry8, os DNAs recombinantes foram inseridos em células de Escherichia coli BL21 (DE3) e induzidos por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), resultando em proteínas de 94 kDa e 143 kDa, respectivamente, visualizadas em SDS-PAGE. As proteínas foram quantificadas através do software ImageQuant TL 8.1" (GE Healthcare), para que fosse possível a realização dos cálculos de diluição nas respectivas concentrações incorporadas à dieta artificial, a fim de estimar a CL50 e CL90 das duas proteínas testadas sozinhas e em conjunto. Com base na sequência de aminoácidos de proteínas da classe Cry8, análises filogenéticas foram realizadas para investigar proximidade evolutiva da proteína Cry8 utilizada neste trabalho com as demais proteínas na mesma classe. Através dessas análises, sugerimos que a proteína em questão pertence à subclasse Cry8Pa devido a elevada proximidade filogenética e similaridade com a proteína Cry8Pa2. Observou-se que as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 apresentaram ação inseticida contra larvas neonatas de A. grandis, obtendo-se as CL50 de 7,232 µg ml-1 e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this work was to evaluate the insecticidal effect of Cry1Ia10 and Cry8 proteins against Anthonomus grandis Boheman larvae (Coleoptera: Curculionidae), searching for synergistic potential. To do so, the cry8 gene was amplified by PCR from a previously constructed clone, obtaining a fragment of approximately 3531 bp and subcloned into the pET-SUMO expression vector. For the expression of the cry1Ia10 and cry8 genes, the recombinant DNAs were inserted into Escherichia coli BL21 (DE3) and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) cells, resulting in 94 kDa and 143 kDa proteins, respectively, visualized on SDS-PAGE. The proteins were quantified using ImageQuant TL 8.1 software (GE Healthcare) to allow the calculation of dilution in the respective concentrations incorporated into the artificial diet in order to estimate the LC50 and CL90 of the two proteins tested alone and together. Based on the amino acid sequence of Cry8 class proteins, phylogenetic analyzes were performed to investigate evolutionary proximity of the Cry8 protein used in this work with the other proteins in the same class. Through these analyzes, we suggest that the protein in question belongs to the subclass Cry8Pa due to its high phylogenetic proximity and similarity to the Cry8Pa2 protein. It was observed that the proteins Cry1Ia10 and Cry8 showed insecticidal action against neonatal larvae of A. grandis, obtaining the LC50 of 7.232 μg ml-1 and 4.422 μg ml-1 for Cry1Ia10 and Cry8 respectively. When combined the proteins at LC50 is reduced to 2,664 μg ml-1 and CL90 to 13,535 μg ml1 showed synergism, potentiating the insecticidal action of the same. This study concludes that A. grandis larvae are susceptible to Cry1Ia10 and Cry8 proteins and that the combination between them increa... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo não disponível.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-12T18:26:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477435 bytes, checksum: 54c26ccf8c22f331c25e937b81f9b585 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T18:26:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477435 bytes, checksum: 54c26ccf8c22f331c25e937b81f9b585 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Infecções que acometem o trato respiratório de suínos levam a significativas perdas econômicas na suinocultura mundial. Um dos principais patógenos respiratórios em suínos é a bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae, o principal agente causal da pleuropneumonia. Atualmente podem ser encontrados 16 sorotipos de A. pleuropneumoniae com virulência distinta e complexa, sendo os principais fatores de virulência: exotoxinas Apx, lipopolissacarídeo (LPS), cápsula e a capacidade de formação de biofilme. O controle da doença é baseado no uso de antibióticos e cuidados no manejo da granja. A profilaxia pela imunização passiva ainda é ineficiente devido à dificuldade na obtenção de uma vacina contra todos os sorotipos encontrados. Assim, novas abordagens experimentais na elaboração de uma vacina eficiente associada a uma resposta imune protetora são essenciais porque podem representar novas alternativas na estratégia de controle da doença. A proteína Hfq é um componente central de regulação global pós-transcricional e participa diretamente na regulação da expressão de genes por facilitar a interação de RNAs pequenos com mRNAs alvos, sendo esta uma abordagem atual e relacionada ao controle da virulência em diversas bactérias patogênicas. Neste sentido, o estudo da chaperona de RNA Hfq é de extrema importância, uma vez que já foi demonstrado seu efeito pleiotrópico e impacto na virulência, na resposta a diferentes tipos de estresse e no crescimento celular de vários patógenos, incluindo A. pleuropneumoniae. Portanto, esse trabalho teve como objetivos: caracterizar in silico a proteína Hfq em A. pleuropneumoniae e analisar a expressão e a fase de maior abundância desta proteína ao longo do crescimento de A. pleuropneumoniae. As análises filogenéticas realizadas foram baseadas em análises de comparação de sequências de aminoácidos da proteína Hfq de diferentes membros da classe Gammaproteobacteria, na qual A. pleuropneumoniae está inserida. As demais análises foram conduzidas utilizando os sorotipos 1, 8 e 15 de A. pleuropneumoniae, sendo utilizadas as linhagens do tipo selvagem (WT) e hfq::3XFLAG. O alinhamento de sequências da proteína Hfq revelou uma identidade de 98% entre as proteínas Hfq de A. pleuropneumoniae de diferentes sorotipos, além de demonstar que Hfq de espécies de uma mesma família possuem maior relação filogenética. A análise da estrutura tridimensional da proteína em A. pleuropneumoniae demonstrou a presença de estruturas características da proteína presente em outos patógenos Gram-negativos, como uma α-hélice e folhas β. A análise da velocidade específica de crescimento por ANOVA entre as linhagens WT e hfq::3XFLAG do mesmo sorotipo revelou que não há diferença de crescimento entre essas linhagens do mesmo sorotipo. Quanto à expressão de Hfq, foi detectado um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, no período de 6-8 horas, dependendo do sorotipo investigado, e que a expressão de Hfq foi diferencial entre os sorotipos analisados. Esses resultados revelaram que a proteína Hfq é conservada entre os sorotipos de A. pleuropneumoniae e possui estrutura tridimensional característica. Além disso, a inserção da etiqueta FLAG em Hfq não alterou o perfil de crescimento celular e hà um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, sendo que os sorotipos apresentaram distribuição das formas diferencial entre os sorotipos e dinâmica de acordo com a fase de crescimento. Essa diferença pode estar relacionada aos diferentes perfis de virulência e de resposta a diferentes condições investigadas previamente, uma vez que a abundância nestes sorotipos apresentou distribuição temporal distinta. / Infections that affect the respiratory tract of pigs lead to significant economic losses in the swine industry worldwide. One of the major respiratory pathogen in pigs is the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae, the main causal agent of the pleuropneumonia. Currently, 16 serotypes can be found of A. pleuropneumoniae with distinct and complex virulence, with the main factors of virulence: exotoxin Apx, lipopolysaccharide (LPS), capsule and the biofilm formation capacity. Control of the disease is based on the use of antibiotics and care in the management of the farm. Prophylaxis by passive immunization is still inefficient because of the difficulty in getting a vaccine against all serotypes found. Thus, new experimental approaches in the development of an effective vaccine associated with a protective immune response are essential because they can represent new alternatives in the disease control strategy. The Hfq protein is a key component of the global post-transcriptional regulation and directly participates in the regulation of gene expression to facilitate the interaction of small RNAs with target mRNAs, which is a current approach and it relates to the control of virulence in many pathogenic bacteria. In this sense, the study of Hfq RNA chaperone is of extreme importance, since it has already demonstrated its pleiotropic effect and impact on virulence in response to different types of stress and cellular growth of various pathogens, including A. pleuropneumoniae. Therefore, this study aimed: to characterize in silico the Hfq protein in A. pleuropneumoniae and to analyze the expression and phase greater abundance of this protein throughout the growth of A. pleuropneumoniae. The phylogenetic analyzes were based on comparative analysis of amino acid sequences of protein Hfq of different members of the class Gammaproteobacteria, which A. pleuropneumoniae is inserted. The other analyzes were conducted using the serotypes 1, 8 and 15 of A. pleuropneumoniae, being used strains of wild-type (WT) and hfq::3XFLAG. The sequence alignment of Hfq protein sequences showed an identity of 98% between Hfq proteins of A. pleuropneumoniae of different serotypes, also demonstrating that Hfq species of the same family have a greater phylogenetic relationship. The analysis of the three-dimensional structure of the protein in A. pleuropneumoniae demonstrated the presence of specific structures of protein present in other Gram-negative pathogens, how one α-helix and β-strands. The analysis of the specific growth rate by ANOVA between strains WT and hfq::3XFLAG of the same serotype showed that there is no difference in growth between the strains. As the expression of Hfq, a greater accumulation of protein in the stationary growth phase was detected in the period of 6-8 hours, depending on the serotype investigated, and the expression of Hfq was differential between serotypes analyzed. These results demonstrate that Hfq is conserved among serotypes of A. pleuropneumoniae and has a three-dimensional structure conserved. Moreover, the insertion of the FLAG tag on Hfq did not affect the cell growth profile and there is a greater accumulation of the protein in the stationary phase of growth, whereas serotypes showed the distribution of forms differential between serotypes and dynamically according to the growth stage. This difference may be related to different profiles of virulence and response to different conditions previously investigated, since these abundant serotypes showed distinct temporal distribution.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-12T11:09:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1226647 bytes, checksum: 9e3237bb24db4758f26f774a630a1f7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T11:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1226647 bytes, checksum: 9e3237bb24db4758f26f774a630a1f7e (MD5) Previous issue date: 2002-10-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína SBP (Sucrose Binding Protein) foi inicialmente identificada pela sua capacidade de se ligar a sacarose e parece estar envolvida na via de translocação de sacarose em plantas superiores. Nesta investigação, foram isolados de uma biblioteca genômica de soja, propagada em λZAPII, dois clones genômicos, que correspondem às formas alélicas do gene SBP2. O número de cópias gênicas da família SBP foi estimado por Southern blot e por FISH (Fluorescence in situ Hibridization), utilizando o cDNA SBP e o clone genômico SBP2 como sondas, em lâminas com núcleos interfásicos de soja. O padrão de hibridização demonstrou a existência de dois pares de genes homólogos, com razão de hibridização diferente, representando os dois genes distintos, SBP e SBP2. Para investigar a funcionalidade da sequência do promotor SBP2, aproximadamente 2,0 quilobases da região 5’ foram sequenciadas e fusionadas aos genes repórteres GUS (beta-glucuronidase) e GFP (Green Fluorescent Protein) e analisados em plantas de tabaco transgênicas. Os ensaios histoquímicos demonstraram que ambos os promotores exibem expressão tecido- específica. Estes resultados foram confirmados pela fluorescência tecido- específica da expressão de GFP. Consistente com seu envolvimento no transporte de sacarose a longa distância, os promotores SBP2 dirigiram a expressão dos genes repórteres com alta especificidade para o floema de todos os órgãos analisados, como meristema, caule, folha e raiz. Entretanto, altos níveis de expressão foram observados predominantemente no meristema e em folhas- dreno. Foi também demonstrado que o promotor SBP2 é regulado de modo dependente da forma e da concentração de açúcar disponível no meio de cultura de células de tabaco transgênico em suspensão. Deleções no promotor SBP2 foram feitas para a identificação de regiões contendo elementos regulatórios em cis. Ensaios histoquímicos com plantas transgênicas contendo as construções quiméricas com as deleções do promotor demonstraram que o padrão tecido-específico do gene SBP2 é coordenado pela interação entre elementos regulatórios positivos e negativos. A região contida entre as posições -2000 até -490 possui elementos positivos que potencializam a expressão no floema, uma vez que a deleção dessa região causou um decréscimo substancial na atividade do promotor. A deleção adicional do promotor até a posição -364 restaurou a atividade do promotor em todos os tecidos analisados. Como conseqüência, a atividade quantitativa de GUS foi muito superior àquela observada para o promotor intacto. Estes resultados indicam a presença de um elemento silenciador, na região delimitada pelas posições -489 a -364. Além disso, a região de -363 a -132 possui um elemento positivo, responsável pela expressão no meristema radicular, uma vez que a deleção deste fragmento silencia a expressão de GUS no meristema radicular. O padrão de expressão tecido- específico, das construções quiméricas das deleções do promotor, se correlaciona com a distribuição dos elementos DOF na seqüência do promotor, em associação com os elementos O2 e GCN4. Coletivamente, estes resultados mostram que o promotor SBP representa uma poderosa ferramenta biotecnológica útil para o direcionamento da expressão de genes alvos para o tecido vascular de plantas de soja e tabaco transgênicas. / Tese importada do Alexandria, apresenta somente resumo em português.

ALENCAR, Nara Lídia Mendes. Mobilização de reservas endospérmicas de pinhão-manso durante a germinação e desenvolvimento da plântula sob condições de estresse salino. 2014. 113 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T18:59:30Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T18:41:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T18:41:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) Previous issue date: 2014 / Jatropha curcas L. is an oilseed species belonged to Euphorbiaceae family, whose seeds are recognized as promising source for biodiesel production. Its ability to survive in adverse conditions, such as water stress and poor nutritional soil, is noteworthy, which favors its cultivation in arid and semiarid regions. Here we evaluate the negative effects promoted by NaCl salt stress on seed germination, reserve mobilization of J. curcas through biochemical, physiological and ultrastructural analysis. The seed germination parameters were significantly affected by salt stress, being observed that the main parameters affected were germination percentage and germination speed index. Similarly, the embryo and endosperm dry mass were reduced by Na+ and Cl- increase in the medium. Considering the reserve compounds, the most abundant reserve of these seeds were the lipids, which corresponded to 64.0% of endosperm seed quiescent dry mass. They showed a stronger delay in reserve mobilization under saline conditions. Proteins were the second most important reserve (21.3%), being severally affected by salinity. The starch was detected in little amount (5.5% of quiescent seed dry mass), however there was a transient increase in this contents at 5 DAI (days after imbibition), which was correlated to the intense lipid mobilization, in control conditions. On the other hand, in salinity, it was observed that starch mobilization was reduced. The seed reserve products (mainly non-reducing sugars and free amino acids) were increased in endosperm in control in relation to quiescent seed, during germination, whereas for salt conditions, these products were few changed. Additionally, cytochemical and ultrastructural analyses confirmed the large amount of protein and lipid bodies in endosperm cells, reaching the identification of a huge amount of protein and lipid bodies. Salt stress promoted morphological and ultrastructural changes in endospermic cells, during germination and seedling development confirming the biochemical analyses. The present study also evaluated the lipid metabolism, using the fatty acid composition analysis and enzymatic and expression genic analyses for lipase, isocitrate liase, malate sintase. The unsaturated fatty acids were the most abundant, highlighting oleic (C18:1) and linoleic-linolenic (C18:2; C18:3), showing increase in their contents, in control conditions, during the evaluated period. However, the fatty acids practically were not changed in salinity conditions. Lipase showed increase in their activity during germination, which corresponded to intense mobilization in lipids in control. In similar way, the reduction of this activity happened in salinity, correlating to lipid delay mobilization. The evident delay of protein and oil body mobilization could strongly affect initial seedling development. The liase isocitrate activity did not show significant differences between treatments until 96 hours after imbibition (HAI), however, following this period, it was verified the strongest reduction in salt stress condition. The activity of malate synthase was not significantly higher in control conditions until 144 HAI, however, following this period, this activity was higher in salinity. It were verified reductions in enzymatic activity due to salt stress, which were correlated to gene expression changes of lipase and isocitrate lyase. Therefore, salinity contributed negatively to lipid mobilization, the main reserve of J. curcas seeds, which was correlated to reduction in activity of the enzymes involved in lipid metabolism. / O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma planta oleaginosa, pertencente à família Euphorbiaceae, cujas sementes são reconhecidas como matéria-prima com potencial para a produção de óleo. Essa planta também é considerada tolerante a condições adversas, tais como déficit hídrico e deficiência nutricional do solo, o que favorece o seu cultivo em regiões áridas e semiáridas. Objetivou-se avaliar os efeitos do estresse salino sobre a germinação e a mobilização das reservas de sementes e plântulas de pinhão-manso, por meio de análises bioquímicas, fisiológicas e ultraestruturais. Os parâmetros germinativos foram negativamente afetados pelo estresse salino, observando-se reduções significativas principalmente no percentual de germinação e no índice de velocidade de germinação. Similarmente, a matéria seca, avaliada no eixo embrionário e no endosperma, foi reduzida pela salinidade. Com relação aos compostos de reserva, os lipídios foram os mais abundantes, correspondendo a 64,0% da matéria seca do endosperma da semente quiescente. Estes compostos apresentaram forte retardo em sua mobilização em condição de estresse salino. As proteínas, a segunda reserva mais abundante (21,3%), também tiveram sua mobilização severamente afetada pelo tratamento salino. O amido foi detectado em pequena quantidade (5,5%), porém, verificou-se o aumento transiente de seu teor aos 5 dias após a semeadura (DAS), que coincidiu com a intensa mobilização de lipídios, em condições controle. Entretanto, em condições de estresse salino, o amido foi pouco mobilizado. Os produtos da mobilização das reservas, em condições controle, principalmente os açúcares não-redutores e aminoácidos livres aumentaram no endosperma, enquanto que, sob condições de salinidade, eles foram pouco alterados. Além disso, as análises citoquímicas e ultraestruturais confirmaram a abundante quantidade de lipídios e proteínas, sendo detectados inúmeros corpos proteicos e lipídicos no citoplasma das células endospérmicas dessas sementes. A salinidade também promoveu alterações morfológicas e ultraestruturais nas células endospérmicas durante a germinação e desenvolvimento de plântulas. O presente estudo também avaliou o metabolismo lipídico através da análise da composição dos ácidos graxos do endosperma e da análise da atividade enzimática e da expressão gênica das enzimas lipase, liase do isocitrato e sintase do malato. Os ácidos graxos insaturados foram os mais abundantes, destacando-se o oleico e o linoleico-linolênico, que apresentaram incrementos em seus teores, em condições controle, ao longo do período avaliado, porém, sob estresse salino foram pouco alterados. A lipase apresentou incremento na sua atividade ao longo da germinação, que coincidiu com a intensa mobilização de lipídios observada no controle. Similarmente, a redução dessa atividade foi correspondente ao retardo na mobilização dos lipídios em condição de estresse salino. A atividade enzimática da liase do isocitrato não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos até às 96 horas após a semeadura (HAS), porém após esse período, verificaram-se as maiores reduções na condição de estresse salino, quando comparado ao controle. Já a atividade da sintase do malato foi significativamente maior em condições controle até às 144 HAS, entretanto, a partir desse período, essa atividade se mostrou superior em condições salinas. Verificaram-se reduções na atividade dessas enzimas em decorrência do estresse, o que teve correlação com as mudanças na expressão dos genes da lipase e liase do isocitrato. Portanto, pode-se concluir que a salinidade contribuiu para o retardo na mobilização dos lipídios, a principal reserva encontrada nas sementes de J. curcas, o que foi correlacionado a redução na atividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo.

OLIVEIRA, Antônio Edson Rocha. Perfil de expressão e análise filogenética dos genes da proteína desacopladora mitocondrial durante o desenvolvimento e estresse em soja [Glycine max (L.) Merr.]. 2015. 185 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T19:11:22Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_aeroliveira.pdf: 4201041 bytes, checksum: ccb8c82104b3b19d3f225dd39473e820 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T17:44:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_aeroliveira.pdf: 4201041 bytes, checksum: ccb8c82104b3b19d3f225dd39473e820 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T17:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_aeroliveira.pdf: 4201041 bytes, checksum: ccb8c82104b3b19d3f225dd39473e820 (MD5) Previous issue date: 2015 / Several studies have evidenced that the main function of the mitochondrial uncoupling protein in plants (pUCP) is related to reactive oxygen species (ROS) regulation. In silico analysis suggests the existence of multigenic families to pUCPs codification, however further studies are yet needed to establish the pUCPs genetic expression profile, just like the gene amount in each species and their phylogenetic relations. The current work had as objective to characterize, analyze phylogeneticly and evaluate the expression profile of the pUCP multigenic family in different tissues during the soybean development [Glycine max (L.) MERR.] and in stress conditions. It has been performed an in silico analysis on the soybean genome and on other legumes available in the database WGS, revealing a codifier multigenic family for pUCP, UCP1 and 2 with 9 exons, UCP3 with 2 exons, and UCP4 and 5 with only 1 exon. Amongst the legumes analyzed, the soybean stood out with the greater number of genes, 10 genes in total, giving four GmUCP1 genes, one GmUCP2, one GmUCP3, two GmUCP4 and two GmUCP5, along with the presence of an alternative splicing on GmUCP1b1 gene. Specific primers have been designed for each GmUCP member in order to analize the expression profiles in different tissues (dry and doused seed, flowers, pods, cotyledons, unifoliate and trifoliate leaves, roots, hypocotyl and epicotyl) during the soybean development. For the assays in stress conditions have been used soybean leaves and roots with thirteen days after sowing (DAS) which have been subjected to osmotic stress caused by the application of polyethylene glycol (PEG) and biotic stress caused by salicylic acid (SA). The total RNA from each sample has been extracted in order to perform the RT-qPCR. The ct values have been obtained through the realplex program and analyzed through the GeNorm program. The genetic expression profile has shown that all genes were expressed in every tissue/organ analyzed during the soybean development, with the exception on some genes in dry seeds and epicotyl. The different expression profiles of each gene during the development of each tissue/organ suggest that occurs a spatial/temporal gene regulation among the GmUCP members. The expression profiles of the GmUCP genes in soybean during the stress conditions have varied, once 2 genes have shown steady expression in both tissues/ stress, 7 genes have shown a drop in the expression profile, while only 4 genes have shown an increase of the transcript levels. / Diversos estudos têm evidenciado que a principal função da proteína desacopladora mitocondrial de plantas (pUCP) está relacionada a regulação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Análises in silico sugerem a existência de famílias multigênicas para a codificação de pUCPs, porém novos estudos ainda são necessários para estabelecer o perfil de expressão gênica das pUCPs, assim como a quantidade de genes em cada espécie e suas relações filogenéticas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar, analisar filogeneticamente e avaliar o perfil de expressão da família multigênica da pUCP em diferentes tecidos durante o desenvolvimento da soja [Glycine max (L.) MERR.] e em condições de estresse. Foi realizada uma análise in silico no genoma da soja e de outras leguminosas disponíveis no banco de dados WGS, revelando uma família multigênica codificadora da pUCP, UCP1 e 2 com nove éxons, UCP 3 com 2 éxons, e UCP 4 e 5 com apenas um éxon. Dentre as leguminosas analisadas a soja se destacou com o maior número de genes, 10 genes no total, sendo quatro genes GmUCP1, uma GmUCP2, uma GmUCP3, dois GmUCP4 e dois GmUCP5, além da presença de um splicing alternativo no gene GmUCP1b1. Primers específicos foram desenhados para cada membro da GmUCP a fim de analisar os perfis de expressão em diferentes tecidos (semente seca e embebida, flores, vagens, cotilédones, folhas unifolioladas e trifolioladas, raízes, hipocótilos e epicótilos) durante o desenvolvimento da soja. Para os ensaios em condições de estresse foram utilizadas folhas e raízes de soja com treze dias após a semeadura (DAS) que foram submetidas a estresse osmótico promovido pela aplicação de polietileno glicol (PEG) e estresse biótico através de ácido salicílico (AS). O RNA total de cada amostra foi extraído para a realização de RT-qPCR. Os valores de ct foram obtidos pelo programa realplex e analisados pelo programa GeNorm. O perfil de expressão gênica mostrou que todos os genes GmUCP foram expressos em todos os tecidos/órgãos analisados durante o desenvolvimento da soja, com exceção de alguns genes em semente seca e epicótilo. Os diferentes perfis de expressão de cada gene durante o desenvolvimento de cada tecido/órgão sugerem que ocorra uma regulação gênica espacial/temporal entre os membros da GmUCP. Os perfis de expressão dos genes GmUCP em soja durante as condições de estresses foi diversificado, visto que 2 genes apresentaram expressão estável em ambos tecidos/estresse, 7 genes apresentaram queda do perfil de expressão, enquanto apenas 4 genes apresentaram aumento dos níveis de transcritos.