A infecção por citomegalovírus (CMV) tem efeito duradouro na distribuição dos subtipos de células T, mas pouco se sabe sobre o seu impacto na função celular. Foi realizada uma análise de expressão global gênica em células CD4+ purificadas em 38 recipientes de transplante de células tronco hematopoéticas (HSCT) (mediana de idade 48 anos; variação 20-65 anos) estudados em média cinco anos pós transplante (mediana 4.75 anos; variação 1-20 years). A população estudada incluiu 18 pacientes com GVHD crônico ativo (cGVHD) e 20 pacientes considerados tolerantes. Tolerância foi definida como ausência de sinais e sintomas de cGVHD, assim como ausência de tratamento imunossupressor (IST) por pelo menos 2 meses com seguimento de 1 ano sem tratamento imunossupressor. A expressão gênica foi medida por Illumina bead arrays. O seroestato do CMV foi definido pela sorologia pré transplante (por ELISA). Não havia evidência documentada de reativação do CMV no momento de coleta das amostras estudadas. Doze de 54 genes candidatos associados à função imune foram associados de maneira significativa com CMV+ em pacientes com cGVHD ativo (p<0.05) (PDCD-1; GZMH, IFNG, PRF1, CST7, IL18RAP, ITGAM, CTSW, ITGAL, GBP1, CDKN1B, CXCR4), sendo que somente três genes (CD14; CD86; IER3) foram associados a CMV+ entre os pacientes tolerantes. A expressão de PD-1 significativamente maior em pacientes CMV+ e com cGVHD ativo foi confirmada em uma população independente através de estudos de imunofenotipagem. Os pacientes CMV+/cGVHD ativos tiveram um perfil compatível com ativação de células T efetoras, não sendo detectado com a mesma intensidade em pacientes tolerantes e pacientes CMV-/cGVHD ativos. Tendo como objetivo a latência da infecção, o citomegalovírus tentará evadir-se das tentativas do sistema imune de depuração viral, criando modificações que vão desde mudanças nos subtipos de linfócitos até a remodelação de cromatina por uma série de enzimas e microRNA. O ambiente caracteristicamente inflamatório do cGVHD, a produção aumentada de citocinas, a terapia imunossupressora e a reconstituição imune defeituosa das células T podem aumentar o risco de reativação do CMV, mesmo indetectável, seguido por supra-regulação de genes relacionados à ativação de células T e função efetora. O gene PD-1 pode estar supra-regulado em ativação de células T e função efetora, mas tem papel essencial na prevenção da expansão e função das células T efetoras, sendo um candidato alvo para a prevenção e tratamento do cGVHD. Entender o impacto do CMV na regulação de PD-1 em pacientes com cGVHD seria instrumental na implementação de novas terapias; portanto mais estudos com populações maiores são necessários para entendermos o impacto da imunomodulação secundária à infecção prévia por CMV no funcionamento das células T durante cGVHD. / Cytomegalovirus infection (CMV) is known to have a life-long effect on the distribution of T cell subsets, but little is known about the impact on cell function. We performed a gene expression analysis in purified CD4+ T cells from 38 hematopoietic cell transplant (HCT) recipients (median age 48; range 20-65) studied on average 5 years after HCT (median 4.75; range 1-20 years). The study population included 18 patients with active chronic GVHD (cGVHD) and 20 tolerant (TOL) patients. Tolerance was defined by absence of signs, symptoms of cGVHD and immunosuppressive therapy (IST) for at least 2 months and 1 year follow-up without immunosupressive therapy . Gene expression was measured on Illumina bead arrays. CMV status was defined by pre-transplant recipient CMV serology (by ELISA). There was no recorded evidence of CMV reactivation at the time of study. Twelve of 54 candidate genes associated with immune function and inflammation were found to be associated CMV positive serostatus in cGVHD patients at a significance threshold of p<0.05 (PDCD-1; GZMH, IFNG, PRF1, CST7, IL18RAP, ITGAM, CTSW, ITGAL, GBP1, CDKN1B, CXCR4), but only three genes (CD14; CD86; IER3) were associated with CMV serostatus in TOL patients. The significant higher PD-1 expression on CD4+ cells of CMV+/active cGVHD patients was confirmed by immunophenotype testing in an independent population. CMV+/active cGVHD patients had a profile consistent with T effector cell activation that was not present in TOL and CMV serostatus negative/active cGVHD patients. Pursuing latency, cytomegalovirus will try to evade the immune system attempts of viral clearance creating modifications varying from changes in lymphocyte subsets to chromatin remodeling by several enzymes and microRNA. The chronic GVHD characteristic inflammatory environment, increased cytokine production, immunosuppressive therapy, and impaired T cell immune reconstitution, may increase the risk of CMV reactivation, even if not detectable, followed by up-regulation of genes related to T cell activation and effector function. The PD-1 gene can be up-regulated in T cell activation and effector functions, but it also has an essential role in preventing the expansion and function of effector cells, being a candidate target for the prevention or treatment of chronic GVHD. Understanding the CMV impact on the PD-1 regulation in active cGVHD would be key on the implementation of new therapies.Thus, more studies in larger populations are needed in order to understand CMV previous infection immunomodulation impact in T cell function during chronic GVHD.

O eucalipto é uma das espécies arbóreas mais plantadas no mundo atualmente, principalmente devido ao seu uso como matéria prima para as indústrias de celulose, papel e madeireira. Eucalyptus globulus e seus híbridos possuem baixos teores de lignina e despertam grande interesse da indústria, já que essa característica facilita e diminui o custo do processo de extração da celulose. Entretanto, essa espécie é recalcitrante ao enraizamento adventício, o que dificulta a propagação vegetativa de suas mudas. Com o objetivo de melhor entender os mecanismos moleculares envolvidos na recalcitrância ao enraizamento em E. globulus, o presente estudo envolveu análises de parâmetros morfológicos, anatômicos e moleculares durante a rizogênese adventícia nesta espécie. A exposição à auxina exógena reverteu o fenótipo recalcitrante em E. globulus, aumentando significativamente a porcentagem de enraizamento. O câmbio vascular foi identificado como uma região de acúmulo de auxina e local de origem das raízes adventícias. Através de análises da expressão gênica em células do câmbio, observou-se que TOPLESS e IAA12, repressores da sinalização de auxina, e ARR1, envolvido na rota de sinalização de citocininas, parecem atuar como reguladores negativos do enraizamento adventício. A alta expressão destes genes em plantas controle foi significativamente diminuída com aplicação de auxina exógena. Comparativamente, em espécie de fácil enraizamento, E. grandis, a expressão destes genes se manteve em níveis mais baixos em ambas as condições de tratamento, e a concentração de ácido indol-3-acético endógeno em plantas controle mostrou-se mais elevada. Análises do padrão proteico durante o enraizamento em plantas de E. globulus tratadas ou não com auxina exógena identificaram proteínas envolvidas em diversos processos biológicos, principalmente estresse oxidativo e metabolismo energético. Diferenças interessantes foram identificadas ao comparar as diferentes condições e fases do enraizamento. Várias proteínas foram claramente relacionadas com o respectivo fenótipo apresentado pela planta em cada situação, principalmente considerando plantas controle. Os resultados aqui apresentados representam avanços relevantes no conhecimento sobre a rizogênese adventícia em plantas lenhosas, podendo ser utilizados como ferramentas no desenho de estratégias visando melhorar o enraizamento em genótipos recalcitrantes de valor para a indústria. / Eucalyptus is one of the most planted tree species in the world today, mainly due to its use as raw material for paper, cellulose and wood industries. Eucalyptus globulus and its hybrids have low lignin contents and are of great interest to industry, as this feature facilitates and reduces costs of the cellulose extraction process. However, this species is recalcitrant to adventitious rooting, making vegetative propagation by cuttings difficult. Aiming at a better understanding of the molecular mechanisms involved in rooting recalcitrance in E. globulus, this study analyzed changes in morphological, anatomical and molecular patterns during adventitious rooting in this species. Exogenous auxin exposure reversed the recalcitrant phenotype in E. globulus, significantly increasing rooting percentage. The vascular cambium was identified as a region of auxin accumulation and also the site from where adventitious roots originated. Gene expression analysis in cambium cells indicated that TOPLESS and IAA12, auxin signaling repressors, and ARR1, involved in cytokinin signaling pathway, appear to act as negative regulators of adventitious rooting. The high expression of those genes in control plants was significantly decreased by exogenous auxin treatment. Comparatively, in an easy-to-root species, E. grandis, the expression of these genes was significantlylower in both treatment conditions, and the concentration of endogenous indole- 3-acetic acid in control plants was higher. Analysis of the protein pattern during rooting in E. globulus plants treated or not with exogenous auxin allowed the identification of proteins involved in diverse biological processes, mainly oxidative stress and energy metabolism. Interesting differences were identified when comparing different rooting conditions or phases. Several proteins were clearly associated with the respective plant phenotype in each situation, particularly considering control plants. These results represent relevant advances in the knowledge about adventitious rooting in woody plants and can be used as tools in the design of strategies aiming at improving adventitious rooting in recalcitrant genotypes of industrial value.

Introdução. A enzima iodotironina desiodase tipo 2 (D2) converte o pró-hormônio T4 em sua forma ativa, T3, um passo essencial no metabolismo da tiróide. O polimorfismo Tre92Ala no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações. Interessantemente, um estudo recente relatou que o polimorfismo D2 Tre92Ala interage com o polimorfismo Pro12Ala, no gene que codifica o fator de transcrição PPARγ2, na modulação da síndrome metabólica em indivíduos nãodiabéticos, sendo que os portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentam os piores fenótipos de síndrome metabólica e pressão arterial sistólica e diastólica. Objetivos. Avaliar o efeito isolado ou combinado dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação da resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Material e Métodos. Os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala foram genotipados em 711 pacientes com DM2 brancos, utilizando-se a técnica de discriminação alélica por PCR em tempo real. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um exame físico completo e a exames laboratoriais padrões. A resistência à insulina foi avaliada através do cálculo do índice HOMA (Homeostasis Model Assessment) em um subgrupo de 215 pacientes sem uso de insulina e com creatinina sérica < 1,5mg/dL. Resultados. As frequências dos alelos D2 92Ala e PPARγ2 12Ala foram 0,32 e 0,076, respectivamente, e suas frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy- Weinberg (p > 0,05). Pacientes com o genótipo D2 Ala/Ala apresentaram níveis mais altos de insulina plasmática no jejum e índice HOMA quando comparados com pacientes portadores dos genótipos Tre/Ala ou Tre/Tre (p = 0,015 e p = 0,001; respectivamente). Além disso, um efeito sinérgico significativo foi observado entre os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação do índice HOMA: portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentaram valores mais elevados de HOMA (mediana 8,5 [valor máximo 28,2 - valor mínimo 1,3]) do que os pacientes portadores das outras combinações genotípicas destes polimorfismos (4,0 [17,6-0,3] no grupo de pacientes com os genótipos D2 Tre/Tre - PPARγ2 Pro/Pro, 5,8 [35,2-0,9] no grupo D2 Ala/Ala - PPARγ2 Pro/Pro e 3,5 [17,2-0,5] no grupo D2 Tre/Tre- PPARγ2 12Ala), após ajuste para sexo, idade e índice de massa corporal (p da interação = 0,010). Conclusões. Pacientes com DM2 portadores dos genótipos D2 Ala/Ala e PPARγ2 12Ala apresentam níveis mais severos de resistência à insulina quando comparados aos pacientes com outras combinações genotípicas dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala. Isso sugere que esses dois polimorfismos interagem na modulação da resistência à insulina em indivíduos brancos, o que pode constituir um alvo terapêutico potencial.

Acinetobacter baumannii é um patógeno oportunista, geralmente resistente a muitos antimicrobianos, que causa surtos de infecções hospitalares. Assim, a sua habilidade de formar biofilme pode explicar a capacidade de sobreviver no ambiente hospitalar e em utensílios médicos. O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de duas cepas clínicas de A. baumannii obtido de hospitais de Porto Alegre, Brasil (abC e abH) e uma cepa controle ATCC 19606 (abA) formar biofilme e realizar a análise transcricional dos genes possivelmente envolvidos na produção e manutenção do biofilme: bap, abaI, ompA, bfmRS, csuAB, pgaA, pilZ, wspR, eal, eagg, IscRSU e csdA. A capacidade de formação de biofilme foi avaliada pelo método cristal violeta em superfície plástica a 25°C e 37°C nos meios LB, LB + 1% glicose, urina pura e LB + 10% sangue de carneiro. A análise transcricional foi feita por real time PCR. A cepas AbH, AbC e AbA foram fortes formadoras de biofileme em LB e LB+glicose à 25 e 37°C. Em LB+sangue, as cepas AbH e AbA foram fortes formadoras e AbC foi fraca formadora de biofilme. Em urina, a cepa AbH foi moderadamente formadora, AbC e AbA foram fracas formadoras de biofilme. Os genes wspR, pgaA, ompA, bap, abaI de AbA, csdA de AbH e o operon IscRSU foram superexpressos em biofilme; os genes eagg de AbH, pilZ e csuAB foram inibidos e os genes bfmRS, eal, eagg de AbA, csdA de AbA e abaI de AbH não possuíram uma variação significativa na expressão durante o biofilme. Portantanto, a regulação positiva dos genes wspR, pgaA, ompA, bap, csdA e do operon IscRSU é um indício de sua importância na formação e manutenção do biofilme por esse patógeno. / Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen which causes a wide range of nosocomial infections, being usually multirresistent to drugs. Their ability to form biofilm can explain the feature of surviving inside hospital environment and on medical devices. The aim of the present study was to evaluate the ability of two clinically isolated MDR A. baumannii strain, obtained from a general hospital of Porto Alegre, RS, Brazil (AbH and AbC), and the reference ATCC 19606 strain (AbA), to form biofilm and to analyze the relative expression of genes putatively involved in biofilm formation: bap, abaI, ompA, bfmRS, csuAB, pgaA, pilZ, wspR, eal, eagg, IscRSU e csdA. The biofilm formation capability was evaluated by the crystal-violet staining method on plastic surfaces at 25°C and 37°C using the broth LB, LB + 1% glucose, pure urine and LB + 10% sheep blood. The trancritional profiling of the genes was analyzed through real time PCR methodologies. The strains AbH, AbC e AbA were strong biofilm producers in LB e LB+glucose at 25 and 37°C. In the broth LB+blood, the strains AbH and AbA were strong biofilm producers and AbC was week biofilm producer. In urine, the strain AbH was moderated producer, AbC and AbA were week biofilm producers. The genes wspR, pgaA, ompA, bap, abaI from AbA, csdA from AbH and the operon IscRSU were overexpressed in biofilm; the genes eagg de AbH, pilZ e csuAB were suppressed and the genes bfmRS, eal, eagg from AbA, csdA from AbA e abaI from AbH did not vary their expression significantly during the biofilm condition. In conclusion, the factors wspR, pgaA, ompA, bap, csdA and of the operon IscRSU, that were positively regulated, appear to have an important role during the process of biofilm formation by A. baumannii.

Resumo não disponível.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:45:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A privacao de sono (PS) e um problema cada vez mais comum na sociedade moderna e esta diretamente relacionada a diversas alteracoes metabolicas, hormonais, neuroquimicas e comportamentais. Tem sido proposto que a falta de sono promove efeitos significativos nos padroes de expressao genica em cerebro em modelos animais. Entretanto, dados de expressao genica em humanos sao ainda incipientes, e o mesmo e valido para estudos em tecidos perifericos de roedores. Nesse sentido, a robusta tecnologia de microarray abriu uma nova janela para os estudos dos processos moleculares envolvidos no ciclo vigilia-sono. Os objetivos principais sao observacao da expressao genica global em tecidos perifericos de humanos (sangue) e camundongos (pulmao e coracao). Parte 1. Humanos: Avaliamos a expressao genica de 9 voluntarios submetidos a privacao de sono total, os quais permaneceram em alerta e ativos durante 60 horas consecutivas. As coletas de sangue para os experimentos de microarray foram realizadas na manha seguinte a noite de sono basal, na manha seguinte apos 48 horas de privacao de sono e, finalmente, na manha seguinte apos uma noite de sono rebote. Os resultados demonstraram a diminuicao da expressao de genes ligados ao sistema imune na PS, como por exemplo, os receptores de Natural killers, as granzimas A e B e os receptores de celulas T, os quais tem um importante papel na defesa do organismo. Um resultado interessante e que corrobora a literatura foi a alteracao da expressao de genes ligados ao reticulo endoplasmatico (RE), como genes codificadores de proteinas chaperonas. Parte 2. Camundongos: Os experimentos foram realizados em camundongos machos (C57BL/6J) com 10 semanas de idade pelo metodo de gentle-handling. Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e decaptacao seguindo 3, 6, 9, e 12 horas de privacao de sono total (N = 8 ou 9 em cada ponto de tempo). Em paralelo, um grupo de animais em que nao foram realizadas perturbacoes (grupo de animais de sono espontaneo, tambem foi eutanasiado nos mesmos pontos de tempo que os animais privados de sono (N=8 para cada tempo respectivamente). Um grupo de controle adicional (tempo basal 0) (N=10), que estava acordado espontaneamente, foi eutanasiado no tempo zero, isto e, no momento em que as luzes foram acesas, as 7 horas da manha. Os resultados em pulmao e coracao demonstraram que houve alteracao da expressao em genes de chaperonas e do RE endoplasmatico, estresse oxidativo e enxofre no pulmao, e degradacao de proteinas no coracao. Os dados dao suporte a hipotese de que a falta de sono pode levar a alteracoes moleculares que resultam em perturbacoes da imunidade celular, assim como na inducao de inflamacao e equilibrio homeostatico. Assim, o intuito deste estudo foi de contribuir para a identificacao de possiveis marcadores biologicos representativos das alteracoes moleculares ocorridas em tecidos perifericos como: sangue, coracao e pulmao, no sono e na privacao de sono em humanos e camundongos, a partir da caracterizacao dos eventos moleculares envolvidos nos processos homeostaticos do sono nao restritos ao Sistema Nervoso Central / FAPESP: 98/14303-3 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nesta tese de mestrado, apresentamos, de acordo com as recomendações da comissão especial do programa de Pós-Graduação em Endocrinologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), um trabalho em forma de manuscrito que será submetido à revista Clinical Endocrinology. Identificamos genes cuja expressão estava diminuída nas bibliotecas de carcinoma folicular de tiróide (FTC): TPO, TFF3, NR4A1 e IYD. O NR4A1 foi selecionado para uma análise mais profunda, por apresentar expressão potencialmente tecido-específica. Passamos então à validação do padrão diferencial de expressão em tecidos neoplásicos e não-neoplásicos, pela técnica de PCR em tempo real, assim como a realização de experimentos em linhagens celulares, com o uso de lítio. Estes são os focos desta tese e estão descritos no manuscrito “Downregulation of NR4A1 in follicular thyroid carcinoma cell line is restored after lithium treatment”, tendo como objetivos: 1) Validar a expressão de NR4A1 nos tecidos benignos e malignos da tiróide. 2) Avaliar a correlação dos genes CCND1 e FOSB com a expressão de NR4A1. 3) Verificar a expressão dos genes NR4A1, CCDN1 e FOSB nas linhagens de carcinoma tiroidiano disponíveis no laboratório, com objetivo de indetificar um modelo semelhante a expressão observada nos tecidos. 4) Verificar se a expressão dos genes NR4A1, FOSB e CCDN1 poderia ser restabelecida quando tratadas com lítio.. / Introduction: The identification of follicular thyroid adenoma-associated transcripts will lead to a better understanding of the events involved in pathogenesis and progression of follicular tumors. Using Serial Analysis of Gene Expression, we identified five genes that are absent in a malignant follicular thyroid carcinoma (FTC) library, but expressed in follicular adenoma (FTA) and normal thyroid libraries. Methods: NR4A1, one of the five genes, was validated in a set of 27 normal thyroid tissues, 10 FTAs and 14 FTCs and three thyroid carcinoma cell lines by real time PCR. NR4A1 can be transiently increased by a variety of stimuli, including lithium, which is used as adjuvant therapy of thyroid carcinoma with 131I. We tested if lithium could restore NR4A1 expression. The expression of other genes potentially involved in the same signaling pathway was tested. To this end, lithium was used at different concentration (10mM or 20mM) and time (2h and 24 h) and the level of expression was tested by quantitative PCR. We next tested if Lithium could affect cell growth and apoptosis. Results: We observed that NR4A1 expression was under-expressed in most of the FTCs investigated, compared to expression in normal thyroid tissues and FTAs. We also found a positive correlation between NR4A1 and FOSB gene expression. Lithium induced NR4A1 and FOSB expression, reduced CCDN1 expression, inhibited cell growth and triggered apoptosis in a FTC cell line. Conclusions: NR4A1 is under-expressed in most of FTCs. The loss of expression of both NR4A1 and the Wnt pathway gene FOSB was correlated with malignancy. This is consistent with the hypothesis that its loss of expression is part of the transformation process of FTCs, either as a direct or indirect consequence of Wnt pathway alterations. Lithium restores NR4A1 expression, induces apoptosis and reduces cell growth. These findings may explain a possible molecular mechanism of lithium’s therapeutic action. / FAPESP: 05/60330-8 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-30T17:50:23Z No. of bitstreams: 1 cp111463.pdf: 4432662 bytes, checksum: a585b229b3b920b2ee4fda25aa3206c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-30T17:52:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp111463.pdf: 4432662 bytes, checksum: a585b229b3b920b2ee4fda25aa3206c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T17:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp111463.pdf: 4432662 bytes, checksum: a585b229b3b920b2ee4fda25aa3206c7 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / OBJETIVO: Este estudo teve como objetivo verificar as modificações causadas na proliferação celular e na expressão gênica da glândula mamária de ratas com 21, 35, 50 e 100 dias que foram expostas à 2,3,7,8 tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) durante a gestação (tratamento pré-natal) ou durante a lactação (tratamento pré-pubertal). MÉTODOS: Para o tratamento pré-natal, ratas Sprague-Dawley prenhas receberam no 15º dia após a concepção dose única de 3,0µg de TCDD/kg através de gavagem. Para o tratamento pré-pubertal, ratas lactantes receberam no 14º e 17º dias pós-parto 6,67ng ou 20,0ng de TCDD/g. Animais controles receberam volume equivalente de óleo de gergelim. Ao atingiram 21, 35, 50 e 100 dias de idade, as filhotes fêmeas das ratas que receberam TCDD foram sacrificadas e tiveram as glândulas mamárias extraídas para estudo do índice de proliferação celular e expressão gênica. Para o cálculo de índice de proliferação celular, dez ratas por grupo receberam uma injeção intraperitoneal de 200 mg/kg de 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) e através de imunohistoquímica foram identificadas as células que estavam proliferando em cada estrutura da glândula mamária. Outras dez ratas por grupo tiveram o RNA da glândula mamária extraído, e este foi utilizado para o estudo de expressão gênica através de microarrays. Para determinar os genes diferencialmente expressos utilizou-se o teste-t bayesiano empírico moderado. Genes diferencialmente expressos (p<0,01) foram então categorizados de acordo com a função biológica ou via canônica de ação. Ainda, genes que se destacaram foram validados através de RT-PCR em tempo real. RESULTADOS: O tratamento pré-pubertal alterou a proliferação celular nas glândulas mamárias das ratas com 35, 50 e 100 dias, principalmente nos botões terminais (TEBs). A análise da expressão gênica demonstrou que o número máximo de genes diferencialmente expressos foi observado nos animais com 100 dias que receberam TCDD durante a gestação. No tratamento pré-pubertal, observou-se que a alta dose causou mais alterações do que a dose baixa. Cyp1b1 foi o gene que mais sofreu aumento de expressão em diferentes idades. A categorização dos genes desregulados de acordo com a função biológica mostrou que TCDD tem uma ampla ação, principalmente após o tratamento pré-pubertal com maior dose. As classes de genes mais afetadas foram proto-oncogenes, genes supressores de tumor e genes relacionados com o metabolismo de lipídeos. A via de sinalização mais atingida foi a via de sinalização do receptor de aril-hidrocarbono (AhR). Também se observou alterações na expressão de genes participantes da via de metabolização do estradiol, aumentando a produção de metabólitos prejudiciais ao DNA. CONCLUSÕES: O tratamento com TCDD resultou em mudanças na proliferação celular e na expressão gênica da glândula mamária das ratas. As mudanças gênicas observadas indicam que a célula mamária é submetida a estímulos genotóxicos ao mesmo tempo em que genes de reparo de DNA e supressores do crescimento tumoral ficam ativados no intuito de manter a estabilidade genômica. / PURPOSE: This work studied the modifications in cell proliferation and gene expression in the rat mammary gland of animals 21, 35, 50 and 100 days old that were exposed to 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) during pregnancy (prenatal treatment) or during lactation (prepubertal treatment). METHODS: For the prenatal treatment, pregnant Sprague-Dawley rats received on the 15th day post-conception, single dose of 3.0µg TCDD/kg through gavage. For the prepubertal treatment, lactate dams received on the 14th and 17th days post-delivery either 6.67ng or 20.0ng TCDD/g. Control group received equivalent volume of sesame oil. When the female offspring reached 21, 35, 50 and 100 days of age, they were sacrificed and their mammary gland extracted for cell proliferation and gene expression analyses. To calculate the cell proliferation index, ten rats per group received an intraperitoneal injection of 200 mg/kg of 5-Bromo-2'- deoxyuridine (BrdU) and through immunohystochemistry the cells in proliferation were identified in each mammary gland structure. Other ten rats per group had the RNA extracted from the mammary gland and used for gene expression analysis through microarrays. To determine the differentially expressed genes empirical Bayes moderated one sample t-test was performed. Differentially expressed genes (p<0.01) were categorized accordingly with biological function and canonical pathways. In addition, important genes were validated through real time RT-PCR. RESULTS: The prepubertal treatment modified the cell proliferation of 35, 50 and 100 days-old rat mammary gland, mainly in the terminal end buds (TEBs). The gene expression analysis showed that the maximum number of differentially expressed genes was reached in 100 days-old rats that received TCDD during pregnancy. The prepubertal treatment induced more changes with higher dose of TCDD. Cyp1b1 was the gene the most up-regulated genes at different ages. The categorization of the dysregulated genes according with their biological function showed that TCDD has a wide action, especially after the prepubertal treatment with high dose. The groups of genes more affected by TCDD were the proto-oncogenes, tumor suppressor genes and genes related to the metabolism of lipids. The most affected canonical pathway was the aryl hydrocarbon receptor signaling pathway. In addition, genes related to estradiol metabolism were modulated increasing the production of metabolites that damage the DNA. CONCLUSIONS: The TCDD treatment induced changes in the cell proliferation and gene expression of the rat mammary gland. The genomic changes observed indicate that the mammary cell is submitted to genotoxic stimuli and DNA repair genes as tumor suppressor genes are activated to keep the genomic stability. / CAPES: BEX 2829/05-3

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:51Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10930.pdf: 1566372 bytes, checksum: afc016849743bcd441d396462f730fec (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: A expressao de sistemas de efluxo tem sido reconhecida com um importante mecanismo de resistencia antimicrobiana entre isolados clinicos de P. aeruginosa. Este estudo investigou a expressao de sistemas de efluxo entre amostras clinicas de P. aeruginosa. Metodos: Sessenta amostras clinicas de P. aeruginosa isoladas de infeccao da corrente sanguinea de pacientes hospitalizados no Hospital Sao Paulo/UNIFESP entre julho e dezembro de 2005 foram avaliadas. O perfil de sensibilidade bacteriana foi determinado utilizando-se da tecnica de agar diluicao de acordo com as recomendacoes do CLSI 2006. A quantificacao da expressao genica foi determinada pela tecnica de qRT-PCR para os genes dos quatro sistemas de efluxo avaliadas bombas de efluxo (mexB, mexD, mexF, mexY), oprD and ampC e comparada a expressao desses genes nas cepas de P. aeruginosa ATCC 27853 e PAO1. A presenca de genes codificadores de metalo-ƒÀ-lactamases (MƒÀL) foi investigada atraves do teste de hidrolise enzimatica dos carbapenens e confirmada por PCR. A relacao genetica entre os isolados foi avaliada pela tecnica de PFGE. Resultados: O aztreonam (MIC50, 8 ƒÊg/mL; 65% de sensibilidade) demonstrou possuir a melhor atividade in vitro contra os isolados de P. aeruginosa testadas. Somente 48,4% dos isolados de P. aeruginosa eram sensiveis ao imipenem e meropenem (MIC50, 8 ƒÊg/mL). A presenca dos genes blaSPM e blaIMP, que codificam MƒÀL, foi detectada em 23,3% e 1,7% dos isolados de P. aeruginosa, respectivamente. A hiperexpressao do sistema de efluxo MexXY-OprM (60%) foi a mais frequente entre os isolados, seguida pela hiperexpressao dos sistema MexAB-OprM (31,7%) e MexCD-OprJ (18,3%). A hiperexpressao simultanea dos sistemas MexAB-OprM e MexXY-OprM foi observado em 16,7% dos isolados de P. aeruginosa. Nenhum dos isolados avaliados apresentaram hiperexpressao do sistema MexEF-OprN. A ƒÀ-lactamase AmpC estava hiperexpressa em 90% dos isolados clinicos avaliados, enquanto, a reducao da expressao de OprD foi observada em 35% das P. aeruginosa testadas e em 50% daquelas que apresentaram resistencia aos carbapenens. Conclusao: Esse estudo sugere que a hiperexpressao dos sistemas de efluxo em P. aeruginosa, esta associada a outros mecanismos de resistencia, como a hiperexpressao de AmpC e producao de MƒÀL, e contribui efetivamente para o fenotipo de resistencia a multiplos antimicrobianos em amostras clinicas de P. aeruginosa. / Multidrug efflux pumps have become increasingly recognized as a major component of resistance among P. aeruginosa. This study investigated the expression level of efflux systems among clinical isolates of P. aeruginosa. Sixty P. aeruginosa isolates were collected from patients with bloodstream infections hospitalized at a Brazilian teaching hospital between July and December 2005. Antimicrobial susceptibility profile was determined by CLSI agar dilution. Genetic relatedness among P. aeruginosa isolates was accessed by PFGE. Transcription levels of four efflux pumps (mexB, mexD, mexF, mexY), oprD and ampC were measured by real time PCR and compared to those of P. aeruginosa ATCC 27853. Detection of acquired metallo-â-lactamases (MâL) was carried out by PCR. Aztreonan (MIC50, 8 ìg/mL; 65% susceptible) exhibited the highest in vitro activity against P. aeruginosa. Only 48.4% of the P. aeruginosa strains were susceptible to imipenem (MIC50, 8 ìg/mL) and meropenem (MIC50, 8 ìg/mL). The MâL genes blaSPM and blaIMP were detected in 23.3% and 1.7% P. aeruginosa isolates, respectively. The overexpression of MexXY-OprM (60%) system was the most frequently detected followed by those of MexAB-OprM (31.7%) and MexCD-OprJ (18.3%) systems. Overexpression of both MexAB-OprM and MexXY-OprM efflux systems was observed in 16.7% of P. aeruginosa isolates. None of the strains overexpressed MexEF-OprN. Hyperexpression of AmpC beta-lactamase was observed in 90% of P. aeruginosa. In contrast, a decrease in the OprD expression was observed in 35% of P. aeruginosa tested and in 50% of the carbapenem-resistant P. aeruginosa isolates. This study shows that the overexpression of efflux systems coupled with AmpC and MâL production effectively contributes to the multi-drug resistant phenotype exhibited by P. aeruginosa clinical strains. / FAPESP: 2006/06171-8 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-01. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:18Z : No. of bitstreams: 1 Publico-13303.pdf: 1313842 bytes, checksum: a815351826def17993fe4bbc7282ccc1 (MD5) / Introdução: A melatonina é o principal produto liberado pela glândula pineal em diversas espécies de vertebrados, com importante função na regulação do sistema neuroendócrino, controlando o ritmo circadiano de processos fisiológicos, estado sono/vigília, pressão arterial sistêmica, resposta imunológica e apoptose, bem como o funcionamento do sistema reprodutor. Objetivos: Analisar os efeitos da melatonina sobre apoptose no útero de ratas submetidas à luz contínua. Material e Métodos: 20 ratas adultas e virgens (Rattus novergicus, Wistar), com ciclo estral regular, foram divididas em dois grupos: GContr, grupo controle que recebeu veículo e GExp tratado com melatonina (0,4 ug/ml), ambos submetidos à luz contínua por 90 dias. Todos os animais foram pesados na data inicial do tratamento e após 30, 60 e 90 dias, quando foram eutanasiados e o útero retirado e processado para técnicas de imunoistoquímica e biologia molecular (qRT-PCR). A evolução de peso corporal foi avaliada por teste estatístico ANOVA e teste de comparações múltiplas de Tukey e os ensaios imunoistoquímicos pelo teste t de Student com nível de rejeição da hipótese de nulidade fixado em 0,05 ou 5% (p< 0,05) para todos testes. Os resultados obtidos do qRT-PCR foram analisados por software específico SAbiosciences e expressos em fold change de expressão. Resultados: Após o período de 90 dias tratamento, todos os animais apresentaram ganho de peso em relação aos dados iniciais. Nos animais do GExp houve o predomínio da hiperexpressão de diversos genes próapoptóticos envolvidos tanto na via extrínseca quanto intrínseca comparados aos dados do GContr. A expressão das proteínas Bax, Faslg e caspase-3 clivada no tecido foi moderada e de localização citoplasmática em células epiteliais endometriais e no estroma nos dois grupos. Embora a proteína Fasestivesse predominantemente expressa no estroma no grupo GContr, não houve diferença estatística no nível de expressão de todas as proteínas entre os dois grupos. Conclusão: Nossos dados sugerem que a melatonina aumenta a expressão de genes pró-apoptóticos sem incremento das proteínas envolvidas com a apoptose. / TEDE