Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-10. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:54:55Z : No. of bitstreams: 1 000863160.pdf: 2766481 bytes, checksum: c82e010be8ff17e9bea4e42451484ce0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Vários experimentos têm comprovado que compostos naturais podem ter sua atividade biológica alterada devido à presença ou ausência de halogênios ligados. Os antibióticos glicopeptídicos, como a vancomicina e teicoplanina são produtos naturais halogenados que apresentam destacada importância. Halogenases são enzimas que catalizam a transferência de halogênios para um determinado substrato, porém são muito pouco estudadas, principalmente aquelas envolvidas na biossíntese de produtos naturais, como antibióticos glicopeptídicos, mesmo com o seu potencial de aplicação em biologia sintética. Cepas produtoras de glicopeptideos foram obtidas da coleção NRRL e crescidas em meio TSB. O DNA foi extraído e os genes de 3 diferentes halogenases (staI e staK de Streptomyces toyocaensis, composto 47934 and Orf8* de Actinoplanes teichomyceticus, Teicoplanina) foram clonados em pET28a e pET20a. Um gene sintético foi obtido para enzima ComH (biossíntese de complestatina) e clonado em pET28a. A expressão desses genes foi induzida por IPTG e a purificação se deu em colunas de afinidade e gel filtração. Foram realizados estudos biofísicos (CD e DLS da StaI), bem como modelagem molecular e ensaios de complementação para proteínas StaK e StaI. Três halogenases foram purificadas, StaI, StaK e ComH e apresentaram coloração amarela indicando a co-purificação com FAD. Orf8* apresentou-se somente na fração insolúvel. Análises de CD indicam a presença de -hélices e folhas-β e foi possível observar o estado de oligomerização e polidispersividade em diferentes condições para halogenase StaI. Os modelos moleculares deram insights sobre uma possível diferença de padrão de halogenação catalizada pela StaI e StaK, devido à diferença de resíduos hidrofóbicos que formam os sulcos do sítio ativo. Tentativas de ensaios de cristalização para as enzimas StaI, StaK e ComH foram realizadas. No entanto, apenas a... / Various experiments have shown that natural compounds may have their biologic activity altered by presence or absence of halogens. Glycopeptide antibiotics, such as vancomycin and teicoplanin are halogenated natural products and they have substantial importance in the medicine. Halogenases, are enzymes that catalyses the attachment of halogens to a substrate, howerver they are not well understood mainly those ones in glycopeptide biosynthesis. Producing glycopeptides strains were obtained from NRRL collection, they were grown in liquid TSB medium and the DNA was extracted. Three different genes for halogenases [(staI and staK from Streptomyces toyocaensis (compound 47934) and Orf8* from Actinoplanes teichomyceticus (Teicoplanin)] were amplified and cloned into pET28a and pET20a. A synthetic gene for comH from the biosynthesis of complestatin was obtained and also cloned in the pET28a. The expression of these four genes was carried out with the induction by IPTG and the purification was performed by affinity and molecular exclusion. Samples of soluble and insoluble fractions and chromatographic peaks were analyzed on SDS-PAGE gel. Circular Dichroism (CD) and Dynamic Light Scattering (DLS) studies were performed for StaI and ComH. We have also performed molecular modelling for StaI and StaK enzymes because attempts to crystallise all the soluble halogenases did not return any result (only StaI had a single crystal which showed not reproduzible). ComH, StaI and StaK were purified and they had an yellow colour indicating the co-purification with FAD.Orf8* was predominantly insoluble. SDS-PAGE gel showed that StaI had high purity already after the affinity purification and the molecular exclusion indicates that it had a tendency to aggregate. By the analysis of CD was possible to observe the structural integrity of StaI and ComH, which shows, as expected, the presence of -helixes and β-sheets. The DLS analysis shows the oligomerization ...

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-19Bitstream added on 2015-04-09T12:48:25Z : No. of bitstreams: 1 000819205.pdf: 7820938 bytes, checksum: b4045f963c89f07ea3405904f9001074 (MD5) / O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial e ataca uma ampla gama de espécies comerciais de citros, causando perdas significativas nos países produtores. A espécie de laranja doce Hamlin (Citrus sinensis) é suscetível ao cancro cítrico, enquanto a espécie de tangerina Satsuma (Citrus unshiu) é resistente. Para compreender os mecanismos moleculares relacionados aos sistemas de defesa ativados pela planta é importante identificar as alterações transcricionais de cada espécie vegetal sob estresse fitopatogênico, a fim de desvendar os elementos moleculares que são específicos de cada espécie. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma análise comparativa temporal do transcriptoma de duas espécies cítricas contrastantes em resposta à Xac, pela técnica do RNA-Seq (Illumina). Um total de 5.673 e 6.231 transcritos diferencialmente expressos foi induzido nos tempos 24, 48 e 72 horas após a inoculação de Xac em Satsuma e Hamlin, respectivamente, enquanto 3.982 e 7.944 transcritos foram reprimidos. Deste total, 52 transcritos foram induzidos em comum, nas duas espécies, em todos os tempos de inoculação. Estes genes estão relacionados com a defesa basal da planta contra o ataque de Xac, pois apresentam genes que participam na percepção e reconhecimento do patógeno, genes que codificam fatores de transcrição e genes que participam na defesa da planta, como glucanases e proteinases. Entre os genes induzidos exclusivamente na espécie resistente Satsuma destacou-se uma proteinase aspártica. Esta proteína apresentou a maior expressão gênica no tempo 24 horas e pode estar envolvida na resistência desta espécie, visto que na espécie suscetível Hamlin, a expressão desta proteína foi menos expressiva e tardia, no tempo 48 horas. Outra resposta oposta entre as espécie foi na expressão de genes relacionados à ... / Citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a one of the most important disease affecting citrus production worldwide and attacks a wide range of commercial species of citrus trees, causing significant losses in producing countries. Hamlin sweet orange (Citrus sinensis) is canker-sensitive, while Satsuma mandarin (Citrus unshiu) is canker-resistant. To understand the molecular mechanisms underlying the differences in responses to Xac, transcriptional profiles of these two genotypes following Xac attack were compared by RNA-Seq (Illumina). The purpose of this study was to examine simultaneous changes in gene expression profile during the early stages (24, 48 and 72 hpi) of citrus canker infection in Satsuma and Hamlin. A total of 5673 and 6231 up-regulated transcripts were identified at 24, 48 and 72 hpi in Satsuma and Hamlin, respectively, while 3982 and 7944 were down-regulated. Of these, 52 transcripts were up-regulated in common between both genotypes. These genes in common are related to basic defense against Xac, because there are genes involved in patogen perception and recognition, transcription factors and genes related to plant defense, such as glucanases and proteinases. Among up-regulated genes expressed only in Satsuma, aspartic proteinase was highlighted. This protein presented the highest gene expression 24 hpi and it can be involved in Satsuma resistance, since the expression of this protein was less pronounced and delayed in Hamlin. Another opposite response between these two genotypes was the expression of genes related to cell wall. Such genes were pectato lyase, extensin, cellulose sinthase, and xiloglucano endotransglycosilase. The genes were up-regulated in Satsuma, while in Hamlin, they were down-regulated. For genes related to plant defense, both genotypes up- regulated pathogenesis-related proteins, especially 72 hpi. However, the expression of these genes did not prevent the symptoms in ...

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-04-09T12:48:25Z : No. of bitstreams: 1 000817619.pdf: 1071654 bytes, checksum: ea5ed62894b9a1e43e3eac685a926413 (MD5) / A ORF XAC1201 de Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) codifica uma proteína hipotética que, quando nocauteada por inserção de transposon, leva a alterações na patogenicidade da bactéria em citros. A ORF possui 819 pb e codifica a proteína XAC1201 que possui uma massa molecular de 29,1 kDa. A região codificadora foi clonada no vetor de expressão pET SUMO e a proteína de fusão His-SUMO-XAC1201 foi expressa na Escherichia coli linhagem BL21(DE3) pLysS. A melhor condição para expressão da proteína na forma solúvel foi a 28ºC e 250 rpm por 4h na presença de 0,2 mM IPTG. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) em coluna de Ni2+-Sepharose e a proteína de não fusão foi obtida após digestão com SUMO protease e nova cromatografia em coluna de Ni2+-Sepharose. O rendimento final do processo foi de 3,18% da proteína total, tendo a proteína recombinante nativa sido isolada com alto grau de pureza e na forma nativa. A identidade de XAC1201 recombinante foi confirmada pelas análises de espectrometria de massas, com mais de 80% de cobertura da sequência. Foram realizados testes enzimáticos para verificar as prováveis atividades de fosfohidrolase e histidina quinase, porém, estes testes não foram conclusivos. A análise de frequência e diversidade da ORF XAC1201 em bancos de dados sugere que se trata de uma proteína ubíqua e com função ancestral, presente em diversos filos dentro do Domínio Bacteria. A obtenção desta proteína na forma pura, solúvel e nativa é o primeiro passo para os estudos de caracterização da sua função e, devido à presença de alta identidade desta sequência com muitos outros grupos bacterianos, a elucidação da função desta proteína será de grande interesse, não apenas para Xac, como também para outros microrganismos / The ORF XAC1201 of Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) encodes a hypothetical protein and when knocked out by transposon insertion leds to changes in the pathogenicity of the bacterium in citrus. The ORF XAC1201 has 819 bp and encodes a protein with a molecular mass of 29.1 kDa. The coding region was cloned into the expression vector pET SUMO and His-SUMO-XAC1201 fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS strain. The best condition for protein expression in soluble form was 28°C and 250 rpm for 4 hours in the presence of 0.2 mM IPTG. Purification was performed by immobilized metal ions affinity chromatography (IMAC) on a Ni2+-Sepharose column and the non-fusion protein was obtained after digestion with SUMO protease and new chromatography on Ni2+-Sepharose column. The final process yield was 3.18% of the total protein, and the protein was obtained highly pure and in the native form. The identity of the purified protein was confirmed by mass spectrometry analysis with sequence coverage above 80%. Enzymatic assays were made to verify phosphohydrolases and histidine kinase activities, however, the results are inconclusive. It is suggested that XAC1201 is a ubiquitous protein and plays an ancestral role, since it is found in several Phyla within the Bacteria Domain. Obtaining this protein in pure, soluble and native form is the first step towards characterization studies of its function. Since this protein is present not only in Xac but has a ubiquitous presence in many other bacterial groups, the understanding of its function is of great interest to many areas

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissGRRMS.pdf: 1511728 bytes, checksum: 7d61e2ac2b83bcccf28d5a1ace492dca (MD5) Previous issue date: 2007-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cysteine proteases are enzymes found in many organisms and are characterized by the presence of cysteine residue in their active site. These proteases play an important role in the organism metabolism. In pathogenic organisms, for example, cysteine proteases may be involved in the pathogenicity process by unbalancing of the biological functions of the host (biochemical and physiological regulation). Since they are involved in several diseases, these enzymes have been considered of great interest for many researchers. The current work aims to express in E. coli a recombinant form of an ORF XAC2853 predicted to be a cysteine protease by annotation of the genome of Xanthomonas axonopodis pv citri. This bacterium is responsible for citrus canker, an infection affecting citrus species which can be evidenced by superficial lesions and early fall of leaves and fruits, thus resulting in significant losses to world agriculture. After expression, the protein was purified by nickel column affinity chromatography and inclusion body solubilization, inasmuch as this protein is almost fully insoluble. The purified protein was used to investigate the activity against such synthetic substrates as Z-FR-MCA and Z-RR-MCA, and no proteolytic activity was found. However, studies in vivo using clones of E. coli expressing the recombinant protein evidenced proteolytic activity against casein. In an attempt to demonstrate the involvement of this probable protease in the pathogenicity of Xac, the knockout of the cromossomal gene in Xac was performed. A mutant having the disrupted gene was obtained and characterized. The assays of the mutant growth, when compared with the wild strain, indicate that the cysteine protease may be involved in the pathogenicity of Xac, since the inactivation of its gene by the transposon insertion resulted in a less virulent strain. In this sense, this protein may be a promising target for the combat of citrus canker. / As cisteíno proteases são enzimas presentes nos diferentes organismos e são caracterizadas pela presença de um resíduo de cisteína em seu sítio ativo. Essas proteases apresentam relevante papel no metabolismo desses organismos. No caso de organismos patogênicos, por exemplo, podem estar envolvidas no processo de patogenicidade por gerar o desequilíbrio das funções biológicas do hospedeiro (regulação bioquímica e fisiológica). Por esta razão, essas enzimas tem sido alvo de grande interesse por parte dos pesquisadores, uma vez que se encontram envolvidas em diversas doenças. Neste trabalho visamos à expressão em E. coli da forma recombinante de uma ORF XAC2853 predita como uma cisteíno protease na anotação do genoma de Xanthomonas axonopodis pv citri. Esta bactéria é responsável pelo cancro cítrico, uma infecção que afeta citros, caracterizando-se pelo aparecimento de lesões superficiais e queda precoce de folhas e frutos, resultando em grandes perdas para a agricultura mundial. Uma vez expressa a proteína, a mesma foi purificada por afinidade em coluna de níquel assim como pela solubilização dos corpos de inclusão, pois esta proteína encontra-se quase que exclusivamente insolúvel. A proteína purificada foi utilizada nos estudos de atividade contra os substratos sintéticos Z-FR-MCA e Z-RR-MCA não sendo verificada atividade proteolítica. No entanto, estudos de atividade realizados in vivo, com clones de E. coli expressando a proteína recombinante, demonstraram atividade proteolítica contra a caseína. Na busca de demonstrar o envolvimento desta provável protease na patogenicidade de Xac, foi realizado o nocaute do gene cromossomal que a codifica na bactéria. Um mutante com o gene inativado pela inserção de um transposon foi obtido e caracterizado, e os ensaios de crescimento desse mutante, comparado com o crescimento da linhagem selvagem, permitem concluir que a cisteíno protease estudada pode estar envolvida na patogenicidade de Xac, uma vez que a inativação do seu gene pela inserção do transposon gerou uma linhagem menos virulenta. Desta forma, esta proteína pode ser um alvo promissor para o combate ao cancro cítrico.

Orientador: Patrícia Monteiro Seraphim / Banca: Sidney Barnabe Peres / Banca: Giovana Rampazzo Teixeira / Resumo: Mudanças no padrão alimentar e aumento do sedentarismo na sociedade moderna se tornou uma questão de saúde pública. Uma medida cabível para atenuar o balanço energético positivo seria a prática de treinamento físico, destacando-se o treinamento resistido como um método utilizado para melhorar o desempenho anaeróbico. O objetivo do presente estudo foi investigar respostas lactacidêmicas e composição corporal após treinamento crônico em ratos Wistar submetidos a dois modelos de treinamento intermitente de alta intensidade e após a verificação avaliar o efeito do treinamento e do destreinamento sobre a expressão de genes do metabolismo energético em músculo esquelético de ratos Wistar. Foram utilizados noventa e seis ratos Wistar divididos em duas levas, pesando 250g mantidos em biotério em gaiolas plásticas coletivas, temperatura e ciclo claro/escuro controlados, divididos em seis grupos (n=7 animais por grupo): S=sedentário, E1=Exercitado1, E2=Exercitado2, alimentados com ração para roedores, OS=Induzido à obesidade, OE1=Obeso exercitado1, OE2=Obeso exercitado2, alimentados com dieta hiperlipídica. D - Ratos exercitados e destreinados alimentados com ração padrão. S5 - Ratos sedentários de cinco meses de idade, alimentados com ração padrão. OD - Ratos induzidos à obesidade, exercitados e destreinados. O5 - Ratos de cinco meses de idade induzidos à obesidade e sedentários. Grupos E1, OE1 treinados com protocolo proposto por Tamaki 1992 e grupos E2 e OE2 treinados com protocolo proposto por Tamaki 1992 com modificações. Para determinação da intensidade do estímulo foi utilizado um lactimetro Yellow Spring 1500. Para a quantificação dos genes a técnica utilizada foi RT-PCR. Anova one way e teste t de student foram utilizados para analisar as diferenças estatísticas entre os grupos. Valores de p inferiores a 5% foram considerados significativos... / Abstract: Changes in the pattern of feed in the increased sedentary lifestyle in modern society has become a matter of public health. A measure to mitigate the positive energy balance would be the practice of physical excercise, be with an emphasis on training weights, such as a method used to improve the anaerobic performance. The objective of the present study was to investigate the variables lactacidêmicas answers to body composition after chronic training in Wistar rats submitted to two models of high-intensity intermittent training to select the best training model and after to evaluate the effect of training and detraining about the genes expression of energy metabolism in skeletal muscle of Wistar rats. Ninety-six Wistar rats weighing 250 g remained in vivarium in plastic cages collective, with cycle day and night and temperature controlled, divided into six groups (n 7 animals per group). S - sedentary, E1 - exercise 1, E2 - exercise 2, ration fed to rodents, OS - Obese Sedentary, OE1 - Obeso Exercise 1, OE2 - Obeso Exercise 2, fed with high-fat diet. D - Rats exercised and untrained fed on standard ration. S5 - Sedentary Mice of five months old, fed with standard ration. Od - Induced Obesity Rats, exercised and untrained. O5 - five-month-old Rats induced obesity and sedentary. E1, OE1 groups trained with protocol proposed by Tamaki 1992 and groups E2... / Mestre

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Banca: Francisco Javier Enguita / Banca: Patrícia Pintor Reis / Resumo: MicroRNAs (miRNAs) constituem uma classe de pequenos RNAs não codificadores de 17 a 25 nucleotídeos de comprimento envolvidos em uma grande variedade de processos celulares. Os microRNAs regulam a expressão gênica pós-transcricionalmente, primariamente pela associação com a região 3' e/ou 5' não traduzida (3' UTR, 5' UTR) de seus RNAs mensageiros alvos geralmente reprimindo e, em alguns casos, estimulando a tradução. Atualmente, embora o número de genes relacionados com o desenvolvimento de doenças musculares aumente a cada ano, as vias moleculares envolvidas permanecem pobremente compreendidas. Porém, estudos recentes demonstram a importância da regulação mediada por microRNAs em diversos processos biológicos e em algumas doenças do músculo esquelético. A Insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica associada à disfunção cardíaca, diminuição da expectativa de vida e intolerância aos exercícios físicos. Essa intolerância aos exercícios físicos, bem como a redução da atividade locomotora, estão associados aos principais sintomas dos pacientes com IC: a fadiga e a fraqueza muscular. Esse fenômeno é decorrente, em parte, da mudança no metabolismo de oxidativo para glicolítico e da presença de atrofia e alterações nos tipos de fibras musculares. Nesse estudo, analisamos a expressão de 303 microRNAs no músculo sóleo da ratos Wistar macho com IC induzida por monocrotalina (60 mg/kg). O músculo sóleo dos animais com IC apresentaram uma alteração na expressão relativa de 19 microRNAs, com diminuição na expressão de 05 microRNAs (< 50%; P<0,05) e aumento na expressão de 14 microRNAs (> 150%; P<0,05) quando comparado com o grupo controle. Nossos dados mostram que os miRNAs miR-29b, miR-27a-5p, miR-434-3p, miR-539, miR-489, miR-214, miR-632 e miR-146b são regulados na miopatia esquelética que ocorre na insuficiência cardíaca, sugerindo que essas moléculas possam atuar ... / Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are small (~17-25 nt) non-coding RNAs regulating mRNAs involved in various biological processes, including the pathophysiology of striated muscles. miRNAs suppress gene expression through their complementarity to the sequence of one or more mRNAs, usually at a site in the 3′ untranslated region. The formation of an miRNA-target complex results either in inhibition of protein translation or in degradation of the mRNA transcript. There is no doubt that the formation, maintenance, and physiological and pathophysiological responses of skeletal muscles, with all their complex regulatory circuits, are subject to regulation by non-coding RNAs. Heart failure (HF) is characterized by a skeletal muscle myopathy with increased expression of fast myosin heavy chains (MyHCs) and atrophy. The skeletal muscle-specific molecular regulatory mechanisms controlling MyHC expression during HF have not been described and microRNAs may be related to these alterations. Using RT-qPCR TaqMan Low Density Arrays, we measured the expression of 303 microRNAs in soleus skeletal muscle from Wistar rat with monocrotaline (60 mg/kg)-induced HF. RNA isolated from soleus muscle of rat with HF showed increased expression of 14 microRNAs (> 150%; P<0,05) compared with controls. Similarly, HF-induced atrophy were accompanied by reduced expression of 05 microRNAs (< 50%; P<0,05). Interestingly, we outline the miRNAs miR-29, miR-214, and miR-489 that have been found to be dysregulated in diseases associated with skeletal muscle or are changed during muscle adaptation. These microRNAs are involved in important molecular pathways such as the NF-kB-YY1-miR-29 regulatory circuit, the miR-214 and Ezh2 regulatory loop, and the posttranscriptional suppression of oncogene oncogene Dek by the miRNA-489 / Mestre

Orientador: Ivan de Godoy / Banca: Celso Luis Marino / Banca: Márcio José da Silva / Resumo: A franca expansão das florestas de eucalipto observada nos últimos anos em diferentes estados brasileiros aumentou a dependência tecnológica da cultura, tornando necessária a sua inserção no contexto biotecnológico. Para tal, a disponibilidade de ferramentas moleculares que viabilizem a produção de árvores geneticamente modificadas se faz necessária. Nesse contexto, o presente trabalho visou validar funcionalmente dois promotores de Eucalyptus grandis, o primeiro relacionado a um gene que codifica uma Lacase (denominado EgLac) com expressão específica em caule (câmbio), e o segundo relacionado a uma actina (denominado EgAct) com expressão ubíqua. Um cassete de expressão contendo o promotor EgLac em fusão transcricional com o gene repórter GUS (previamente construído) foi inserido em plantas de Arabidopsis thaliana, e uma expressão vascular foi constatada em testes histoquímicos. Em cortes histológicos observou-se que a expressão de GUS ficou restrita ao floema de raízes e folhas. Em paralelo, o gene EgAct teve a sua expressão ubíqua validada em diferentes órgãos/tecidos de eucalipto, e a sua região promotora foi amplificada. Um cassete de expressão contendo o promotor EgAct em fusão ao repórter GUS foi igualmente inserido em plantas de A. thaliana. Análises histoquímicas revelaram uma expressão vascular do gene repórter distribuída ao longo de toda a planta. Por outro lado, a quantificação da expressão de GUS em plantas transformadas revelaram níveis variáveis de acumulação de transcrição de acordo com a idade e o órgão/tecido analisado / Abstract: The rapid expansion of eucalyptus plantations observed in recent years in different Brazilian states increased the technological dependence of the culture, and its inclusion in the biotechnological context is an urgent need. For this, the availability of molecular tools that enable the production of genetically modified trees is necessary. In this context, the present work aimed to functionally characterize two promoters of Eucalyptus grandis, the first one related to a gene encoding a laccase (called EgLac) with specific expression in stem (cambium region), and the second one related to a gene encoding an ubiquitously expressed actin (called EgAct). An expression cassette containing the EgLac promoter transcriptionally fused to the GUS reporter gene was inserted into Arabidopsis thaliana, and a vascular expression pattern was observed in histochemical tests. Histological sections showed that GUS expression was restricted to the phloem of roots and leaves. In parallel, the ubiquitous expression of EgAct was validated using different eucalyptus organs/tissues, and its promoter region was amplified. An expression cassette containing the EgAct promoter fused to the GUS reporter was also inserted into A. thaliana. Histochemical analysis revealed a vascular expression of the reporter gene distributed throughout the plant. Moreover, quantification of GUS expression in transformed plants revealed variable levels of transcript accumulation according to the age and organ/tissue analyzed / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Banca: Aparecida Maria Fontes / Banca: Débora Aparecida Pires de Campos Zuccari / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Jane Lopes Bonilha / Resumo: O tumor ósseo de células gigantes (TCG) é um tumor benigno, que causa destruição osteolítica, com comportamento biológico incerto e com características particulares como um elevado número de células gigantes multinucleadas e comportamento agressivo. A recorrência local do TCG é freqüentemente observada em 20 a 50% dos casos. Mais agravante que a recorrência, é o fato de que após a recidiva, o paciente muitas vezes também apresenta metástases em outros órgãos, principalmente no pulmão. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi á investigação da expressão gênica para identificar genes diferencialmente expressos no TCG, que podem estar envolvidos na biologia molecular e desenvolvimento da doença. A hibridização subtrativa rápida (RaSH) foi utilizada para identificar novos genes diferencialmente expressos, como KTN1, NEB, ROCK1 e ZAK, que foram validados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e a imuno-histoquímica em amostras de TCG comparadas ao tecido ósseo normal. A anotação funcional indica que estes genes estão envolvidos em processos celulares relacionadas ao fenótipo tumoral. A expressão dos genes KTN1 e ROCK1 encontra-se aumentada e o gene ZAK tive sua expressão reduzida nas amostras de TCG analisadas. Pela presença de ilhas CpG na região promotora e baixa expressão no tecido tumoral, o padrão de metilação do gene ZAK foi analisado por MSP-PCR. Os genes identificados KTN1, ROCK1 e ZAK pode ser responsável pelas perda de homeostase celular no TCG uma vez que são responsáveis pela várias funções relacionadas com a tumorigênese, como a migração celular, organização do citoesqueleto, apoptose, controle do ciclo celular e, portanto esses resultados poderão contribuir para a compreensão das bases moleculares do TCG, assim ajudando a melhorar o diagnóstico, prognóstico e tratamento dos pacientes / Abstract: Giant cells tumors of bone (GCTB) are benign in nature but cause osteolytic destruction, with a number of particular characteristics. These tumors can have uncertain biological behavior, often contain a significant proportion of highly multinucleated cells, and may show aggressive behavior. We have studied differential gene expression in GCTB that may give a better understanding of their physiopathology, and might be helpful in prognosis and treatment. Subtractive hybridization (RaSH) was used to identify and measure novel genes that appear to be differentially expressed, including KTN1, NEB, ROCK1 and ZAK, using qRT-PCR and immunohistochemical in the samples of GCTBs compared to normal bone tissue. Normal bone was used in the methodology RaSH for comparison with the GCTB in identification of differentially expressed genes. Functional annotation indicated that these genes are involved in cellular processes related to their tumor phenotype. The differential expression of KTN1, ROCK1 and ZAK was independently confirmed by qRT-PCR and immunohistochemical. The expression of the KTN1 and ROCK1 genes were increased in samples by qRT-PCR and immunohistochemical and ZAK had reduced expression. Since ZAK have CpG islands in their promoter region and low expression in tumor tissue, their methylation pattern was analyzed by MSP-PCR. The genes identified, KTN1, ROCK1 and ZAK may be responsible for loss of cellular homeostasis in GCTB since they are responsible for various functions related to tumorigenesis such as cell migration, cytoskeletal organization, apoptosis, cell cycle control and thus may contribute at some stage in the process of formation and development of GCTB / Doutor

Orientador: Luciana Rossini Pinto / Coorientador: Marcos Cesar Gonçalves / Banca: Janete Apparecida Desidério / Banca: Ricardo Harakava / Resumo: A doença do mosaico da cana-de-açúcar, causada pelo Sugarcane mosaic virus (SCMV), é uma das principais doenças incidentes na cultura. Para compreender a base molecular dessa interação planta-patógeno o presente trabalho objetivou identificar potenciais genes candidatos à resistência ao mosaico através da técnica de cDNA-AFLP utilizando duas variedades contrastantes quanto a resistência ao SCMV (estirpe Rib-1). Plantas das variedades IACSP95-5000 (resistente) e IAC91-1099 (suscetível) obtidas por micromeristemas foram inoculadas com a estirpe Rib-1 em condições controladas de casa de vegetação para a identificação de fragmentos diferencialmente expressos (FDE) nos tempos de 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hpi). No total, foram obtidos 772 FDEs, dos quais 392 observados na variedade resistente e 380 na suscetível. As variedades apresentaram comportamento diferencial quanto ao número de FDEs induzidos e reprimidos ao longo dos tempos de amostragens (24, 48 e 72 hpi). A variedade resistente apresentou um número maior de FDEs, correspondentes a prováveis genes induzidos no tempo de 24 hpi em relação a suscetível, diminuindo com o passar do tempo de inoculação, enquanto o número de FDEs correspondentes a prováveis genes induzidos aumentou com o tempo de inoculação na variedade suscetível. Sessenta e seis FDEs foram identificados exclusivamente na variedade resistente, sendo que 9 foram reprimidos e 57 induzidos após a inoculação com o SCMV. Destes 57, 23 foram sequenciados e destes, 10 FDEs mostraram identidade com sequências conhecidas de plantas, sendo a maioria relacionada com mecanismos de defesa da planta contra o patógeno e 3 FDEs não apresentam identidades com sequências descritas e podem exercer papel importante no mecanismo de resistência. A técnica de cDNA-AFLP foi eficiente em revelar alterações do perfil de transcrição dentro ... / Abstract: The sugarcane mosaic disease caused by the Sugarcane Mosaic Virus (SCMV) is a major disease incident in this crop. To understand the molecular basis of the plant pathogen interaction, the present study aimed to identify potential candidate genes for mosaic resistance by cDNA-AFLP technique using two contrasting varieties for SCMV (Rib-1 strain) resistance. Plants of the varieties IACSP95-5000 (resistant) and IAC91-1099 (susceptible) obtained by micro-meristem were inoculated with the Rib-1 strain under greenhouse controlled conditions to the identification of differentially expressed fragments (DEF) at the sampling time points of 24, 48 and 72 hours after inoculation (hpi). In total, 772 DEFs were obtained, of which 392 were observed in the resistant variety and 380 in the susceptible. The varieties showed differential behavior in the number of induced and repressed DEFs during the sampling time points (24, 48 and 72 hpi). The resistant variety produced a higher number of DEFs at 24 hpi (probably corresponding to induced genes) decreasing over the time of inoculation, when compared to the susceptible, in which the number of DEFs increased over the hpi. Sixty-six DEFs were identified exclusively in the resistant variety, of which 9 were repressed and 57 induced after inoculation with SCMV. Of these 57, 23 were sequenced and 10 of them showed identity with known plant sequences, mostly related to mechanisms of plant defense against pathogen, while 3 DFEs have no identities with sequences described in the bank and probably may play an important role in the resistance mechanism. The cDNA-AFLP technique was effective in revealing changes in the transcription profile within and between contrasting varieties when challenged by the mosaic virus. The total set of DFEs can be an important tool in studies to understand the resistance mechanism, as well as for the development of molecular markers to be ... / Mestre

Orientador: Marlise Inês Klein / Resumo: A cárie representa a doença humana mais prevalente no mundo, sua etiologia é dependente de biofilme e da dieta. Os biofilmes são comunidades altamente dinâmicas e estruturadas de células microbianas que se encontram embebidas em uma matriz extracelular tridimensional (MEC). Esta estrutura age como uma barreira que limita a difusão e fornece estabilidade e proteção aos microrganismos. Streptococcus mutans tem um potencial acidogênico e acidúrico, orquestra a construção do biofilme e modula sua virulência, produzindo ácidos lipoteicóicos (LTA), DNA extracelular (eDNA) e exopolissacarídeos (EPS), promovendo assim a adesão e coesão microbiana. Ao mesmo tempo a MEC produzida dificulta a difusão de metabólitos no biofilme. O objetivo do estudo foi determinar por meio de RT-qPCR a dinâmica da expressão de genes de S. mutans associados ao metabolismo de LTA (dltABCD, SMU_775c), eDNA (lytST, lrgAB, ccpA) e exopolissacarídeos (gtfBCD, gbpB, dexA), durante o desenvolvimento da MEC de biofilmes mistos em um estudo longitudinal. Biofilmes mistos de S. mutans UA159 (cepa parental) ou ΔgtfB (mutante com deleção do gene gtfB), Actinomyces naeslundii ATCC 12104 e Streptococcus gordonii DL-1 foram formados em discos de hidroxiapatita revestidos de película salivar, e cultivados a 37° C e 5% de CO2 em caldo triptona e extrato de levedura contendo 25% de saliva e alternando 0,1% de sacarose (escassez) e 0,5% de sacarose + 1% de amido (abundância). O pH do meio de cultura manteve-se ácido durante... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dental caries represents the most prevalent human disease worldwide, its etiology is biofilm-diet dependent. Biofilms are highly dynamic and structured communities of microbial cells that are enmeshed in a three-dimensional extracellular matrix (ECM). This structure acts as a diffusion-limiting barrier providing stability and protection to the microorganisms. Streptococcus mutans is acidogenic, aciduric, and orchestrates the biofilm build-up process. It modulates the biofilm’s virulence by producing lipoteichoic acids (LTA), extracellular DNA (eDNA) and exopolysaccharides (EPS), thereby promoting microbial adhesion and cohesion. The resulting ECM hinders diffusion in the biofilm. The aim of the study was to determine via RT-qPCR the dynamics of expression of S. mutans genes associated with LTA (dltABCD, SMU_775c), eDNA (lytST, lrgAB, ccpA) and exopolysaccharides (gtfBCD, gbpB, dexA) metabolism, during ECM development in mixed-species biofilm by time-lapse studies. Mixed-species biofilms of S. mutans UA159 (parental strain) or ΔgtfB (mutant with deletion of the gene gtfB), Actinomyces naeslundii ATCC 12104 and Streptocsoccus gordonii DL-1 were formed onto saliva-coated hydroxyapatite discs. These biofilms were cultivated at 37°C and 5% CO2 in triptone with yeast extract containing saliva 25% and alternating 0.1% sucrose (scarcity) and 0.5% sucrose + 1% starch (abundance). The pH of the spent media remained acid during the experimental periods, and was lower after prolonged inc... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre