No description available.

La importància de la quiralitat és ben coneguda principalment en relació al fet que la major part dels productes bioactius naturals són quirals i que les seves propietats fisiològiques i farmacològiques depenen del seu reconeixement per part de macromolècules diana quirals, les quals interaccionaran només amb l'enantiòmer del producte bioactiu d'una configuració absoluta determinada.Anàlogament, en el cas de fàrmacs quirals se solen observar diferències importants d'activitat entre els dos enantiòmers. L'enantiòmer més actiu d'un fàrmac quiral es denomina eutòmer i el menys actiu distòmer.Així, la legislació farmacèutica internacional és cada cop més restrictiva respecte a l'ús de fàrmacs com a barreges racèmiques. Realment, la utilització de fàrmacs enantiopurs és actualment un requisit fonamental per a pràcticament totes les indústries farmacèutiques. Així doncs, el desenvolupament de nous mètodes sintètics per obtenir compostos enantiopurs s'ha convertit en un punt clau per a la indústria farmacèutica. La síntesi asimètrica constitueix una de les principals estratègies per tenir accés a compostos enantiopurs, utilitzant auxiliars, reactius o catalitzadors quirals.Tenint en compte els excel·lents resultats dels auxiliars quirals (R)- i (S)-2a en reaccions de desracemització, resolució cinètica dinàmica en la reacció d'ALFA-haloèsters amb diversos nucleòfils i en reaccions de Diels-Alder asimètriques ens vam plantejar: 1. Posar a punt un procediment per obtenir noves pantolactames en forma racèmica, a partir de les quals es podrien preparar els corresponents enantiòmers pel procediment descrit per a (R)- i (S)-2a. 2. L'aplicació de l'(R)- o (S)-N-fenilpantolactama, (R)- o (S)-2a o d'alguna de les noves pantolactames en noves reaccions de desracemització d'àcids carboxílics alfa,alfa-disubstituïts com a etapes clau per a la síntesi en forma enantiopura de compostos amb potencial activitat farmacològica o de fàrmacs establerts com àcids alfa-aril-gamma-aminobutírics anàlegs del GABA (àcid gamma-aminobutíric) o l'antiepilèptic levetiracetam. 3. L'aplicació de l'(R)- o (S)-N-fenilpantolactama, (R)- o (S)-2a, o d'alguna de les noves pantolactames a addicions de Michael diastereoselectives amb acceptors contenint l'auxiliar quiral, com a etapa clau per a la síntesi dels dos enantiòmers del fàrmac baclofè.4. L'aplicació de l'(R)- o (S)-N-fenilpantolactama, (R)- o (S)-2a, o d'alguna de les noves pantolactames a cicloaddicions 1,3-dipolars diastereoselectives amb dipolaròfils contenint l'auxiliar quiral, com a etapa clau per a la síntesi en forma enantiopura d'N,O-psiconucleòsids amb potencial activitat antivírica. / We have developed two alternative one-pot procedures for the preparation of N-substituted pantolactams in low to medium yields starting from pantolactone and primary amines under acid catalysis. In one procedure the reaction is performed in a pressure reactor at 250 ºC for 4h, while in the other one the reaction takes place in minutes under microwave irradiation. alpha-aryl-substituted GABA derivatives (R)- and (S)-23, 26 and 27 of potential biological interest have been prepared in enantiopure form (ee > 99%) from the readily available methyl arylacetates 16, 31 and 37, through a seven-step synthetic sequence, involving as the key step the deracemization of cyano acids ()-18, 33 and 39 using (R)- or (S)-N-phenylpantolactam as chiral auxiliaries. In sharp contrast with the reported absolute lack of efficiency of (R)-pantolactone as chiral auxiliary in the deracemization of this kind of cyano acids, the use of (R)- and (S)-N-phenylpantolactam led to the corresponding pantolactam esters in almost quantitative yields, with high levels of diastereoselectivity (dr up to 93:7), and with predictable sense of asymmetric induction. Moreover, pantolactam esters in hihgly diastereoenriched form (dr > 98:2 or 97:3) were obtained by column chromatography of the diastereoenriched crude materials resulting from the deracemization reactions. Hydrolysis of these esters under essentially nonracemizing conditions, followed by recrystallization of the resulting crude cyano acids or their cyclohexylammonium salts, and subsequent reisolation of the carboxylic acids in the last cases, led to enantiopure alpha-aryl-beta-cyano acids (R)- and (S)-18, 33 and 39, which were transformed in good yields into the N-Boc-alpha-aryl-substituted GABA derivatives (R)- and (S)-23, 26 and 27 through a standard procedure.We have developed a synthesis of levetiracetam by deracemization of racemic 2-bromobutyric acid 50 to the (R)-enantiomer with (S)-N-phenylpantolactam, followed by nucleophilic substitution with the sodium salt of 2-pyrrolidinone to give (S)-2-(2-oxopyrrolidin-1-yl)butyric acid, a known precursor of levetiracetam. The key points of the synthesis are: (1) the good diastereomeric ratio (9:1) in the esterification of ()-50 with the chiral auxiliary and the easy purification of the main diastereomer by column chromatography, (2) the LiOH/H2O2 hydrolysis of the diastereopure ester to give acid (R)-50 without racemization and (3) the SN2 transformation of (R)-50 to the immediate acid precursor of levetiracetam. This sequence has also been applied to the preparation of the enantiomer of levetiracetam.(R)- and (S)-baclofen hydrochloride have been prepared in enantiopure form (>99% ee) from the readily available racemic nitro acid (±)-71, through a three-step synthetic sequence, involving the resolution of the above acid via diastereomeric esters derived from the chiral auxiliaries (R)- and (S)-N-phenylpantolactam, (R)- and (S)-2a, followed by hydrolysis and hydrogenation (Ra-Ni) of the nitro group. The chiral auxiliaries were conveniently recovered in enantiopure form after the hydrolysis step.Finally, we have developed a synthesis of N,O-psiconucleosides involving as the key step the 1,3-dipolar cycloaddition of phenylnitrone and methyl phenyltioacrilate. The key points are: (1) esterification with the resolution agent, (R)- and (S)-N-phenylpantolactam, (R)- and (S)-2a , (2) nucleosidation with timine and 5-fluoruracile as nucleobases and the efficiently column cromatography to led the corresponding esters of pantolactam in diasteropure form (dr > 98:2), (3) reduction of transesterification products with Vitride and recovery of (R)- and (S)-N-phenylpantolactam with high yield and in enantiopure form (ee > 99%).

L'olomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc d'unió de l'ATP. Presenten una alta especificitat "invitro"davant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüència, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant d'una via extrínseca d'apoptosi, dependent de l'activació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no s'expressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a l'olomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental d'una via extrínseca canònica d'apoptosi va ser descartada. D'altra banda, la inhibició de la síntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de l'apoptosi. Curiosament, vam observar l'existència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria l'existència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de l'apoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, l'isoolomoucina, un isòmer inactiu de l'olomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats d'iso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens d'apoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a l'olomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. D'altra banda, l'olomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a l'apoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f-armac inductor de la via p53. / La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad"in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3. / Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit "in vitro"selectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions. / Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose.Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer.J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

Se estudia la acción analgésica de la TRH comparativamente con la morfina. La TRH es un potente analgésico frente a estímulos mecánicos y químicos pero no sobre estímulos térmicos. No posee acción sobre receptores y opiáceos ni "in vivo" ni "in vitro". La acción analgésica de la TRH no está relacionada con su transformación metabólica en histiclil prolina diceto piperacina. La acción analgésica de la TRH es central e independiente de sus acciones endocrinas y analépticas.La reserpina disminuye la acción analgésica de la morfina no modificando la de la TRH. El 5-HTP tiende a potenciar la acción analgésica de la TRH. La apomorfina a dosis bajas potencia la acción analgésica de la TRH. Por otra parte, la estimulación colinérgica central antagoniza el efecto analgésico, mientras que el bloqueo colinérgico central potencia su acción, hecho que puede tener trascendencia clínica.

En los últimos años ha habido un incremento en la aparición de nuevas enfermedades infecciosas y en la reemergencia de otras que se consideraban ya controladas. La situación actual es preocupante porque muchos de estos nuevos agentes patógenos causan enfermedades graves. En muchas de estas infecciones, la resistencia a los fármacos se está convirtiendo en uno de los obstáculos principales para su control, con la aparición de cepas multiresistentes a los antibióticos normalmente utilizados. ¿Cuales son las claves para el éxito de estas bacterias patógenas? Para responder esta pregunta, se realizan estudios sobre los mecanismos por los cuales los microorganismos causan la enfermedad, es decir, la patogénesis. Pero también existen cuestiones importantes sobre la evolución de la patogénesis de estos microorganismos que continúan siendo una incógnita: ¿cuales son los factores que determinan la emergencia de un nuevo patógeno?, ¿cuando se desarrollan determinados clones patógenos?, ¿porqué cepas no patógenas presentan genes asociados a la virulencia? Los estudios de genética de poblaciones contribuyen a este conocimiento, proporcionando información sobre la estructura poblacional y la naturaleza de la variación genética que existe en las poblaciones naturales ya que la cantidad de variación genética de una población es un parámetro fundamental, debido a que determina el potencial evolutivo de ésta. Los cortos períodos de generación de la mayoría de las bacterias y el enorme tamaño de sus poblaciones, hace que los cambios evolutivos sean muy rápidos. La dinámica de aparición y selección de mutantes o la importancia relativa de la mutación y de la recombinación en estas poblaciones, son efectos esenciales para comprender los cambios epidemiológicos que se producen en ellas. Estudiar las poblaciones bacterianas también nos permite caracterizar las cepas de las especies patógenas; pero también es importante comprender las relaciones genéticas existentes entre cepas patógenas, causantes de la enfermedad, y cepas no patógenas de una misma especie bacteriana. La comparación entre ambas poblaciones puede ayudarnos a explicar los orígenes de las cepas patógenas e identificar las diferencias genéticas entre las dos. Se ha observado que, generalmente, se da una asociación aparente entre determinados clones de la bacteria, que se encuentran en pequeña proporción, y el desarrollo de una enfermedad; por tanto, esto sugiere que hay una menor diversidad en las cepas patógenas que en las de vida "libre". Estas observaciones han sugerido que la mayoría de las bacterias presentan una estructura poblacional clonal. Más recientemente, el aumento del número de bacterias estudiadas y la aplicación de técnicas moleculares, han dado lugar a la observación de que la estructura clonal de las poblaciones se puede "romper" por acción de la recombinación genética, aunque su papel no es igual en todas las especies bacterianas. La transferencia horizontal de genes tiene una gran relevancia en la epidemiología de las enfermedades causadas por bacterias patógenas. Se ha observado una marcada diferencia en el grado de recombinación entre cepas patógenas y cepas no patógenas, aunque no se conocen las causas. La adquisición de material extracromosómico tiene consecuencias importantes en la evolución de las bacterias, tanto a corto plazo, por la distribución horizontal de genes de resistencia, como a largo plazo, por la adquisición de nuevos determinantes de virulencia o propiedades metabólicas que puedan producir un cambio significativo en la patogenicidad o que afecten al hábitat ecológico donde residen. Por tanto, la variación genotípica en las poblaciones de los microorganismos patógenos, plantea importantes dificultades en el control de les enfermedades infecciosas (emergencia de nuevas cepas patógenas, aparición de poblaciones de bacterias resistentes a los antibióticos, dificultades asociadas a la obtención de vacunas contra microorganismos antigénicamente diversos o variantes).P. aeruginosa es una bacteria Gram negativa y cosmopolita, y es una de las principales causas de infecciones en cáncer, transplantes, quemados y en pacientes con fibrosis cística. Estas infecciones son muy difíciles de erradicar ya que este microorganismo presenta una elevada resistencia intrínseca a múltiples antibióticos, lo que lo hace responsable de infecciones nosocomiales de difícil tratamiento y de elevada morbi-mortalidad. En los últimos años se ha observado un incremento progresivo en la incidencia de cepas resistentes a diversos antibióticos de última generación como por ejemplo el imipenem y de cepas que presentan una sensibilidad disminuida simultáneamente a diversos grupos de antibióticos como penicilinas, cefalosporinas con actividad anti-pseudomónica, quinolonas y aminoglicósidos, situación que ha agravado notablemente la dificultad terapéutica que habitualmente comportan las infecciones causadas por este patógeno. ¿Tienen las cepas patógenas que viven en el interior de los hospitales alguna relación genética con las cepas que viven libremente en el entorno de éstos? ¿Qué mecanismos de resistencia han utilizado estas cepas patógenas para "evadir" la acción de los antimicrobianos utilizados contra ellas? En este trabajo hemos tratado de hacer una aproximación a la respuesta de estas preguntas, centrándonos en las poblaciones de Pseudomonas aeruginosa del hospital de Bellvitge y su entorno.La línea principal de investigación de nuestro grupo de trabajo se centra en los mecanismos moleculares de extensión de los caracteres de resistencia de las bacterias Gram negativas a los agentes antimicrobianos. La presente tesis se inscribe en el núcleo de la actividad del grupo. Se ha pretendido explorar las relaciones existentes entre aislamientos clínicos y ambientales de Pseudomonas aeruginosa en relación a la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.Este objetivo de carácter general se puede subdividir en los siguientes apartados: 1. Aislar cepas ambientales y seleccionar cepas clínicas aisladas en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Bellvitge.2. Determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de los distintos aislamientos y comparar las posibles diferencias de susceptibilidad entre los grupos.3. Explorar la contribución de las propiedades de la membrana externa a los perfiles de susceptibilidad a los antimicrobianos. 4. Analizar la variabilidad fenotípica y genotípica de los aislados en base a la información obtenida de metodologías moleculares como: perfiles electroforéticos de las proteínas de la membrana externa (OMPs), electroforesis en campo pulsante (PFGE) y amplificación de fragmentos de DNA con cebadores aleatorios (RAPD). 5. Elaborar un modelo aproximativo de la estructura de las poblaciones de P. aeruginosa en el ambiente "Hospital Universitario de Bellvitge" (Hospital y entorno).6. Estudiar la eventual presencia de integrones en los dos grupos de bacterias y determinar los genes que incorporan.7. Estudiar las mutaciones de la proteína OprD y su relación con la resistencia a los antibióticos en las cepas estudiadas.8. Realizar una aproximación al modelo estructural de la proteína OprD.Las conclusiones obtenidas después de llevar a cabo los experimentos para la consecución de los diversos obtenidos, son las siguientes: 1. Las cepas clínicas son más resistentes a los antibióticos que las cepas ambientales, debido a la fuerte presión que existe en el entorno hospitalario, y que favorece a las cepas que desarrollan mecanismos para evadir la acción de diferentes antimicrobianos. Estas diferencias en la susceptibilidad sugieren, además, cierto grado de aislamiento ecológico entre las dos poblaciones, ya que las cepas clínicas se encontrarían en un hábitat, que presenta una elevada presión selectiva por parte de los antibióticos y desinfectantes, y en cambio las cepas ambientales estarían en otro hábitat separado donde esta presión no existe.2. Técnicas que miden la variabilidad fenotípica y genotípica como las proteínas totales (PT), proteínas de membrana externa (OMPs), la electroforesis de campo pulsante (PFGE) y la amplificación de polimorfismos de DNA al azar (RAPD) utilizando el primer 208, confirman la distancia entre los aislados de los dos orígenes.3. El conjunto de los resultados nos sugiere que la población de P. aeruginosa en nuestro entorno (Hospital de Bellvitge y alrededores), podría ser una población clonal epidémica, en la cual todas las cepas provienen de una población ambiental muy diversa, y de la que un clon ha emergido para dar lugar a la población clínica que, una vez establecida, vuelve a diversificarse.4. La ausencia/presencia de la proteína OprD en la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa, no explica totalmente los patrones de resistencia/susceptibilidad observados en las cepas investigadas. 5. La existencia de cepas sensibles al imipenem que no presentan OprD en sus membranas externas, sugiere la presencia de otro mecanismo secundario de entrada del imipenem a las células, independiente de OprD.6. A falta de un modelo estructural basado en la cristalización, nuestro modelo tridimensional de la proteína OprD confirma las predicciones, anteriormente realizadas, de la estructura del heterómero del que está constituido esta porina.

En els darrers anys s´ha consolidat l´enfoc translacional en l´abordatge del càncer. Aquest es basa en la voluntat de comprendre la biologia tumoral i implementar clínicament aquest coneixement dissenyant nous fàrmacs capaços d´inhibir específicament molècules oncogèniques.En aquest context, s´han descobert els receptors tirosina-quinasa (RTK) com a proto-oncogens crucials en la diferenciació i proliferació cel·lular i com a molècules amb un gran paper en carcinogènesi. KIT i PDGFR són dos exemples paradigmàtics de RTK pels que s´han desenvolupat fàrmacs inhibidors, amb gran èxit terapèutic en aquells tumors, com el GIST, on aquestes proteïnes tenen un paper patogenètic crucial.L´enfoc translacional ha tingut un gran impacte en el camp dels tumors renals que representen un 3% dels tumors de l´economia i dels quals s´en reconeixen diferents subtipus. Els avenços en biologia molecular han permès definir la patogènia d´algunes entitats, sobretot del Carcinoma renal de cèl·lula clara (CRCC), un dels subtipus tumorals freqüents i més agressiu per l´alt nombre de pacients que desenvolupen malaltia metastàtica (30-50%) i pels quals s´estan buscant noves eines terapèutiques.Pel valor oncogènic i com a dianes terapèutiques del KIT i PGFR, aquest treball té com a objectiu estudiar l´expressió d´aquestes proteïnes per immunohistoquímica sobre teixit de tumors de cèl·lules renals. A més a més, en base a aquests resultats i la literatura es pretén discutir el seu valor com a dianes terapèutiques.En el nostre estudi es va demostrar expressió de KIT de forma específica en Carcinoma renal Cromòfob (ChRCC) i Oncocitoma (OR). També es va trobar sobreexpressió de KIT i PDGFRα en la diferenciació sarcomatoide de carcinomes renals (SRCC) sense que aquesta s´associès amb mutacions en els exons 9, 11, 13, 17 del KIT ni en els exons 11, 12, 17, 18 de PDGFRα; que són els més freqüent mutats en el GIST .Alhora vam observar expressió inespecífica en cèl·lules tumorals de PDGFRα i PDGFRβ en un baix nombre de casos i de forma dèbil en diferents subtipus de tumors renals. Per contra, vam evidenciar sobreexpressió de PDGFRβ vascular de forma característica en un alt percentatge de CRCC. En base als nostres resultats, proposem la utilitat de KIT com a marcador en el diagnòstic diferencial de diferents subtipus tumorals. Alhora, hem demostrat que l´expressió de KIT i PDGFRα en els SRCC no segueix el mateix model patogenètic que el GIST. La literatura sosté la necessitat de demostrar la implicació patogènica d´una proteïna en un tumor per plantejar l´efectivitat de la seva inhibició selectiva, essent l´expressió immunohistoquímica per si mateixa insuficient per sostindre aquest principi.Fins al moment, no es coneix si KIT i PDGFR tenen un paper oncogènic en el ChRCC, OR i en SRCC.Per tant, no hi ha suficients dades per proposar l´us d´inhibidors proteics contra aquestes proteïnes en ChRCC i SRCC disseminats.Per altra banda l´expressió vascular de PDGFRβ en CRCC si que té una base patogenètica ja que el seu lligand (PDGF) s´ha implicat directament en la seva biologia. Alhora aquesta expressió vascular és coherent amb els estudis que relacionen la isoforma beta del PDGFR amb la maduració dels pericits i en la promoció de l´angiogènesi.Per tant, els nostres resultats sostenen la relació del PDGFRβ en la patogènia del Carcinoma renal de cèl·lula clara i el valor terapèutic dels fàrmacs contra aquest receptor amb finalitat antiangiogènica.En conclusió, en el context de l´enfoc translacional del càncer i la necessitat d´implementació de nous fàrmacs inhibidors proteics pel tractament del carcinoma renal metastàtic, l´anàlisi d´expressió de RTK en tumors renals permet juntament amb la integració d´altres estudis, la discussió del valor diagnòstic i sobretot terapèutic d´aquestes dianes moleculars. / Renal Cell Neoplasms (RCN) represent 3% of cancer incidence and comprise different clinicopathologic entities. Malignant subtypes, specially the most frequent one Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CRCC), remain the most lethal of urologic cancers due to the high rate of patients (30-50%) developing metastatic disease for whom new therapies are needed.Great advances in molecular biology have led to the identification of tyrosine-kinase receptors (TKR) as relevant proteins in tumorigenesis. Moreover the advent of selective inhibitors against them has raised interest on its expression in different tumors.PDGFR and KIT are two examples of TKR that have an oncogenic role in numerous neoplasms and can be inhibited pharmacologically. Because of its potential role as proto-oncogens and therapeutic targets; We aimed to study its immunohistochemical expression in RCN and to discuss its possible role as molecular targets.Our results highlight specific expression of KIT in Chromophobe renal cell carcinoma (ChRCC) and Renal Oncocytoma (RO). Overexpression of KIT and PDGFRα was found in sarcomatoid differentiation of renal tumours (SRCC) without mutations in KIT exons 9,11,13,17 nor PDGFR exons 11,12,17,18 which are the most commonly mutated in GIST.Moreover inespecific and low expression of PDGFRα and PDGFRβ was evidenced in tumoral cells in different RCN. In contrast, vascular expression of PDGFRβ was seen caracteristically in half of CRCC cases.According to our results, we propose KIT as a useful marker for differential diagnosis among RCN.Moreover we demonstrate that expression of KIT and PDGFR in SRCC doesn´t follow the same pathogenetic mecanism as GIST.Scientific community claims that immunohistochemical expression of a protein in a tumor is not enough to propose it as a therapeutic target and that demonstation of its pathogenetic role is needed. So as, there is still no evidence of participation of KIT-PDGFR in ChRCC, OR nor SRCC oncogenesis, there is not enough data to propose them as therapeutic targets.Conversely, in different studies PDGFRβ has been involved in CRCC pathogenesis and has been related to tumor angiogenesis by perycite recruitment. So that, vascular expression of PDGFRβ in CRCC favours its consideration as a therapeutic target in this tumor subtype.

S'han estudiat els efectes de dos fàrmacs intercalants al DNA, Daunorubicina (usat com antitumoral) i Criptolepina (amb elevada citotoxicitat i usat com antimalàric), en el llevat "S.cerevisiae".Ambdues molècules s'uneixen al DNA però amb diferent preferència de seqüència: mentre que la Daunorubicina reconeix preferentment regions 5'(A/T)CG3', la Criptolepina s'uneix a 5'GG3'. S'han descrit nombroses regions reguladores riques en aquest tipu de seqüències, pel que ambdós fàrmacs podrien competir amb factors de transcripció nuclears, modificant l'expressió gènica.Els principals objectius del nostre estudi foren:1.Determinar l'efecte citotòxic dels dos fàrmacs en diferents soques de S.cerevisiae: BY4741, BY4741-delta-erg6 (soca amb major permeabilitat de la membrana plasmàtica als fàrmacs), BY4741-delta-rad52 (soca amb un gen de la maquinària de reparació delecionat):- En primer lloc, s'analitzaren els efectes sobre el creixement cel·lular de les soques tractades amb diferents concentracions de cada molècula, tant amb glucosa com galactosa com a fonts de carboni. Els nostres resultats. Els nostres resultats demostren que la permeabilitat de la membrana és necessària per aconseguir la concentració de Daunorubicina que desencadena el seu efecte citotòxic. En canvi, la maquinària de reparació del dany al DNA pot ser una diana potencial de la Criptolepina.- Mitjançant una anàlisi semiquantitativa de l'expressió d'alguns dels principals gens del metabolisme de la galactosa, es va observar un efecte diferencial dels fàrmacs, ja que el factor regulador dels gens de la galactosa presenta en la seva seqüència consens, la diana per a la Daunorubicina i no per a la Criptolepina. Aquest solapament de seqüència explica el patró repressor induït per la Daunorubicina, però no per a la Criptolepina, resultat que està d'acord amb el major efecte citotòxic de la Daunorubicina en cèl·lules crescudes en galactosa.2.Avaluar la resposta transcripcional a nivell global de cada intercalant en la soca BY4741-delta-erg6, utilitzant la glucosa com a font de carboni.- Mitjançant l'ús de microarrays, es va identificar els perfils d'expressió gènica diferencial per a cadascun dels tractaments (Daunorubicina o Criptolepina), en funció de la concentració i del temps. A partir d'aquests experiments es va confirmar que l'efecte de la Daunorubicina sobre la transcripció és pronunciat, mentre que els canvis observats per a la criptolepina són lleus.- A partir dels resultats obtinguts, es van classificar els gens en diferents categories funcionals i es varen validar els resultats obtinguts per RT-PCR a temps real. Es va observar que tot i que la Daunorubicina reprimeix l'expressió dels gens glicolítics, la criptolepina està associada principalment a la inducció dels gens de resposta a estrès. D'una manera menys significativa, la Criptolepina altera també la transcripció de gens implicats en el transport del ferro i de gens mitocondrials.- Mitjançant un estudi in silico, es va confirmar que les variacions en els perfils d'expressió gènica es deuen a un efecte directe dels fàrmacs sobre els factors de transcripció que regulen aquests gens, degut a que competeixen per les mateixes dianes d'unió al DNA.A partir de la identificació dels mecanismes d'acció de cada fàrmac en S.cerevisiae, els nostres resultats plantegen noves vies en el disseny de nous fàrmacs antitumorals i antiparasitaris. / The main objective of this thesis is to analyse the effects of two DNA interacting drugs, Daunorubicin (used as antitumoral) and Cryptolepine (with elevated cytotoxicity and used as an antimalarian) in Saccharomyces cerevisiae. Both drugs intercalate in CG rich regions, the preferent sequence for Daunorubicin being 5'(A/T)CG3' and for Cryptolepine being 5'GG3'. These sites are common in consensus sequences of transcription factors and the competition of drugs for those sites can alter gene expresion.First, we evaluated the effects in cellular proliferation in yeast strains of different genetic backgrounds (related to membrane permeability and DNA lesion repair), in glucose and galactose as carbon source. We observed that permeability of plasma membrane is necessary in order to reach a citotoxic concentration of Daunorubicin. On the other hand, the DNA repair machinery seems to be a potential target of Cryptolepine. By a semiquantitative analysis of expression of GAL genes, we observed a differential effect of both drugs. Daunorubicin caused a decrease in GAL genes expression while Cryptolepine did not. This can be due to the fact that the main regulatory protein of galactose metabolism has the preferent binding site for Daunorubicin in the consensus sequences.The effect of Daunorubicin and Cryptolepine on yeast transcriptome was studied in the most permeable yeast strain using glucose as carbon source. Using microarrays, we identified different gene expression patterns for each drug. Genome wide results were grouped into functional categories and confirmed by real time RT-PCR. We observed that Daunorubicin downregulates glycolytic genes and Cryptolepine induces a stress response and decreases the transcriptional levels of specific genes related to iron transport (siderophores) and mitochondrial genes. We used in silico assays to correlate the expression patterns induced by both drugs with a direct effect in the regulatory proteins involved in the transcription of these genes. Results confirm different action mechanisms for each intercalating drug tested. Daunorubicin may alter the regulatory complex Gcr1p-Gcr2p responsible of upregulation of glycolytic genes, and Cryptolepine may induce a pleiotropic effect.Overall, these results can raise new approaches in the development of new antitumour and antiparasit drugs.

ANTECEDENTES: La administración crónica de fármacos antiepilépticos disminuye la intensidad del efecto de los fármacos bloqueantes neuromusculares (BNM), aunque existe cierta discrepancia a la hora de explicar si esta interacción se produce a nivel farmacocinético (PK) y/o farmacodinámico (PD). La cuantificación de fármaco en biofase podría clarificar los posibles mecanismos que producen la interacción entre los BNM y los fármacos antiepilépticos. La microdiálisis tisular es una técnica relativamente nueva que se ha utilizado para determinar concentraciones de sustancias en el fluido extracelular de los tejidos. Podría ser una buena alternativa para explorar de qué forma los BNM alcanzan la unión neuromuscular y de cómo los antiepilépticos pueden afectarla.OBJETIVOS: Los objetivos de este trabajo fueron: en primer lugar definir la relación entre dosis, concentración y efecto bloqueante neuromuscular en el caso del rocuronio utilizando modelos PKPD y posteriormente evaluar la influencia de la terapia crónica con fenitoína (TCF) sobre este modelo. El segundo objetivo fue determinar la posibilidad de recuperar rocuronio desde el tejido intersticial muscular mediante la técnica de la microdiálisis, para explorar las posibles discrepancias entre los pacientes debidas a la TCF.MATERIAL Y MÉTODOS: Se han realizado dos estudios para tratar de abordar el problema: el primero basado en la aproximación poblacional utilizando modelos PKPD y el segundo basado en la técnica de la microdiálisis. En el primer estudio, se incluyeron 21 pacientes sometidos a cirugía intracraneal, 10 de los cuales se encontraban en TCF. Se les administró rocuronio intravenoso, se extrajeron muestras plasmáticas y se registró el efecto obtenido mediante electromiografía. Se utilizó NONMEM para construir, evaluar y validar los modelos PKPD. En el caso de la microdiálisis, se realizó un estudio "In Vitro" para conocer la velocidad de infusión óptima así como el tiempo de extracción entre muestras y se estimó la tasa de recuperación para el rocuronio, utilizando la infusión de diferentes concentraciones de este fármaco. En la siguiente fase se estudiaron 17 pacientes sometidos a cirugía intracraneal (incluidos en el estudio previo), 8 de los cuales se encontraban en TCF.RESULTADOS: En el primer articulo se ha descrito el PKPD del rocuronio utilizando un modelo tricompartimental asociado a un modelo de compartimento del efecto. Se ha observado que la TCF produce un incremento del aclaramiento plasmático de 0,26 hasta 0,75 L·min-1, mientras que el resto de parámetros PK no se afectan. Las estimaciones de los parámetros del modelo PD han sido las siguientes: ke0 = 0,073 min-1, Ce50 = 836 ng·mL-1 y γ = 3,13. En el segundo estudio destaca que la tasa de recuperación estimada para el rocuronio es del 36% para una velocidad de la bomba de microdiálisis de 1 μL·min-1. Se han podido cuantificar las concentraciones de bromuro de rocuronio en el músculo en 25 muestras. Las concentraciones de rocuronio tisular fueron similares en los pacientes con TCF que en los pacientes control, sin embargo, las dosis requeridas con TCF fueron significativamente mayores. Estos resultados confirman a los hallados en el primer estudio, ya que un mecanismo exclusivamente PK podría explicarlos.CONCLUSIONES: Ha sido posible definir la relación entre dosis, concentración y efecto de BNM inducido por el rocuronio mediante modelos PKPD. Nuestros resultados sugieren que únicamente mecanismos PK podrían explicar la mayor dosis requerida en el caso de pacientes con TCF. La TCF incrementa el aclaramiento del rocuronio pero no tiene efecto sobre el resto de parámetros PK ni sobre los parámetros PD. Por otro lado, la cuantificación de fármacos gracias a la microdiálisis es técnicamente posible en el entorno clínico y podría ser de ayuda en el estudio de los mecanismos que producen el efecto de los fármacos. / summary:BACKGROUND: Chronic administration of antiepileptic drugs decrease the intensity of the effect of neuromuscular blocking agents (NMBA), although there is some discrepancy to explain if this interaction occurs on pharmacokinetic and/or pharmacodynamic level. Tissue microdialysis is a relatively new technique used to determine the concentrations of substances in the extracellular fluid of tissues. It could be a good alternative to explore how NMBA could reach the neuromuscular junction and how antiepileptics could affect it.OBJETIVES: The objectives of this study were first to define the relation between dose, concentration and effect of neuromuscular blocking in the case of rocuronium using PKPD models and then to evaluate the influence of chronic phenytoin therapy (CPT) on this model. The second objective was to determine the ability of microdialysis to recover rocuronium from muscle interstitial tissue, to explore possible discrepancies between patients due to CPT.MATERIAL AND METHODS: We performed two studies in order to solve the problem: the first one is based in population approach using PKPD models and the second one is based in the technique of microdialysis. In the first study a total of 21 patients undergoing intracranial surgery were enrolled. In all cases, rocuronium was administered intravenously. Arterial blood samples were drawn and the response derived from electromyogram was continuously recorded. NONMEM software was used to construct, evaluate and validate PKPD models. To know the optimal speed of infusion and microdialysis sampling scheme and estimate the recovery ratio for rocuronium an "In Vitro" study was performed. In the next phase, 17 patients undergoing brain surgery were enrolled (they were included in the previous study). RESULTS: In the first study the PKPD of rocuronium was described using a three-compartment PK model linked to an effect compartment. The CPT therapy was found to affect only total plasma clearance. In the second study the recovery rate for rocuronium was estimated to be 36% at a pump rate of 1 L·min-1. Rocuronium concentrations were similar in patients treated with phenytoin and in controls, although the doses required to obtain a similar effect were significantly higher in patients on CPT. This findings confirm the results in the first study, due to a PK mechanism could be explain them.CONCLUSIONS: We defined the relation between dose, concentration and effect of rocuronium using PKPD models. Our results suggest that only PK mechanisms could explain the biggest dose required in case of CPT. CPT increases the clearance of rocuronium but has no effect on the remaining PK or PD parameters. On the other hand, the quantification of microdialysis is technically feasible in the clinical setting and it might help in studying pharmacologic mecanisms of drug action.

La cromatografia líquida micel·lar (MLC) ha estat aplicada amb èxit a la monitorització de fàrmacs. La MLC és un mode de la cromatografia líquida en fase inversa (RPLC) que conté micel·les, generalment de dodecil sulfat sòdic, que actuen com a modificadors de la fase mòbil, i un solvent orgànic o alcohol de cadena curta, que millora l'eficàcia i permet controlar la força eluent i la selectivitat de la fase mòbil. Les fases mòbils micel·lars, en comparació amb les aquó-orgàniques, tenen l'avantatge de permetre l'injecció directa de mostres biològiques (sèrum, orina, saliva, suor, etc.), i a més són més ecològiques, barates i estables. L'objectiu fonamental de la monitorització dels fàrmacs consisteix en millorar l'assistència terapèutica del pacient, tant en patologies agudes com en les cròniques, i això es du a terme mitjançant l'ajust de la dosi del fàrmac en funció de les concentracions plàsmiques, de manera que puga combinar la màxima eficiència del fàrmac i el mínim risc de toxicitat. També la monitorització és útil en la determinació de paràmetres químics i farmacològics, tals com el temps de vida mitja i d'altres. Els grups de substàncies amb els que s'han dut aquests tipus d'estudis han estat el dels antiarrítmics, antiepilèptics, antidepressius tricíclics, anàlgèsics, broncodilatadors i drogues d'abús, que inclouen a les amfetamines, barbiturats, benzodiazepines i opiacis.

INTRODUCCIÓ:La depressió és el trastorn psiquiàtric amb major prevalença a la població general. S'estima que en el futur la depressió seguirà sent una patologia rellevant. Així, Murray i López, en l'informe elaborat per la Organització Mundial de la Salut, estimen que l'any 2020 la depressió serà la segona causa de Anys de Vida Perduts per Discapacitat, amb la probabilitat de que augmenti la seva importància en les properes dècades. La Depressió Major reb un tractament basat eminentment en la prescripció de fàrmacs antidepressius des d'àmbits no especialitzats, i comporta uns costos econòmics que no han parat d'augmentar. Aquests fets, juntament amb la constatació d'uns recursos escassos i que molta gent no reb atenció, ha ajudat a la presa de consciència dels decisors sanitaris i els responsables econòmics sobre la necessitat de fer un l'ús més racional possible dels recursos. Davant la creixent demanda i la limitació dels recursos cal fer una distribució equitativa dels recursos per tal que arribin a tothom que ho necessiti.METODOLOGÍA: Es revisen les publicacions més rellevants sobre la farmacoeconomia dels antidepressius i es presenten resultats de dos estudis farmacoeconòmics comparant antidepressius al nostre país.RESULTATS:Serrano-Blanco A, Gabarron E, Garcia-Bayo I, Soler-Vila M, Caramés E, Peñarrubia-Maria MT, Pinto-Meza A, Haro JM and the DAPGA group. Effectiveness and cost-effectiveness of antidepressant treatment in primary health care: a six month randomised study comparing fluoxetine to imipramine. J Affect Disord 2006 Apr; 91 (2-3): 153-63.En aquest article es compara mitjançant un estudi aleatoritzat prospectiu el cost-efectivitat d'imipramina respecte imipramina segons la prescripció dels metges de Atenció Primària de Catalunya. Malgrat no existeixen diferències estadísticament significatives en quant a l'efectivitat, els pacients que van iniciar tractament amb imipramina presenten uns costos totals associats al tractament menors que en aquells que van iniciar el tractament amb fluoxetina. Les diferències s'expliquen fonamentalment per uns menors costos indirectes en aquells que van iniciar tractament amb imipramina.Serrano-Blanco A, Pinto A, Suárez D, Peñarrubia Maria MT, Haro JM. Cost-utility of mental health interventions for Depression in primary care in Catalonia. Acta Psychiatr Scand 2006: 114 (Suppl. 432): 39-47.En aquest estudi no aleatoritzat amb seguiment naturalístic s'analitza el cost-utilitat de diferents inhibidors de la recaptació de serotonina en el tractament dels trastorns depressius en Atenció Primària de Catalunya.Fluoxetina és el fàrmac presenta millors índex de cost-utilitat respecte paroxetina, sertralina i citalopram.CONCLUSIONS:Imipramina suposa una opció més cost-efectiva que fluoxetina en el tractament dels trastorns depressius en Atenció Primària a Catalunya. Fluoxetina suposa una opció més cost-útil que paroxetina, citalopram i sertralina en el tractament dels trastorns depressius en Atenció Primària a Catalunya.